Clase_11_Reaccion de la Cadena de Polimerasa y Secuenciacion

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REACCIÓN DE LA CADENA DE POLIMERASA PCR
BIO. MSC. CARMEN BARBA G.
DOCENTE
UNIVERSIDAD TÉCNICA DE AMBATO
OBJETIVOS
Conocer los fundamentos de amplificación de ADN por PCR
Establecer las ventajas y desventajas de la PCR
Reconocer el uso y aplicaciones de la PCR en la práctica clínica
REACCIÓN DE LA CADENA DE POLIMERASA (PCR)
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica de laboratorio utilizada para amplificar secuencias de ácidos nucleicos como: ADN, ARN.
La amplificación de ácidos nucleicos in vitro se realiza por medio de la polimerización de las cadenas de éstos ácidos en un equipo conocido como termociclador.
El propósito de la PCR es hacer muchas copias de un fragmento específico de ADN o ARN, se realiza esta amplificación teniendo un mínimo de material genético disponible.
Kary Mullis nacido en 1944, estadounidense, PhD en Bioquímica, en 1983 crea la técnica de la PCR(polymerase chain reaction) y en 1985 presenta su invento y utilizó la PCR para amplificar el gen de la Beta-hemoglobina, para el diagnóstico prenatal de la anemia falciforme. Por su descubrimiento gana el premio nobel de Química en 1993.
Termociclador
Un termociclador consta de las partes siguientes: tapa deslizante, placa de calentamiento, bandeja porta muestras (96 pocillos) pantalla con tecla de stop y teclas de función variable, interruptor, teclas direccionales, numéricas y puerto USB.
Preparación de la Mezcla Maestra (Master Mix)
Para iniciar el procedimiento se prepara la mezcla que esta compuesta de:
La polimerasa que se utiliza actualmente es la Taq polimerasa obtenida de la bacteria Thermus acuaticus.
Procedimiento
Se desarrolla en 3 pasos básicos que se repiten de 25 veces o más: Desnaturalización, Apareamiento o hibridación (Anneling) y Polimerización o extensión.
Reacción de la Cadena de Polimerasa PCR
Análisis de la Muestra
La detección del producto de la PCR se realiza por lo general mediante un corrido electroforético.
Dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución que deseamos, utilizamos diferentes medios (agarosa, poliacrilamida) a distintas concentraciones.
La posterior visualización se puede realizar por bromuro de etidio, syber safe, tinción de plata, fluorescencia, radioactividad en lámpara de luz UV o en el fotodocumentador (Chimidoc).
Ventajas
A partir de una muestra pequeña de ADN o ARN se puede obtener una cantidad suficiente para realizar un estudio.
El proceso se puede utilizar para clonar, secuenciar y analizar muestras de ácidos nucleicos.
Se puede amplificar el ADN de cualquier organismo vivo o muerto.
La PCR es la técnica que ofrece como principal ventaja general millones de copias de la región de interés a partir de un fragmento de ADN (ARN)
Es una técnica robusta debido a la capacidad de los oligonucleótidos iniciadores o primers de unirse firme y complementariamente a la región diana aislando fácilmente ésta molécula en medio de millones de fragmentos de ADN.
Desventajas
Se puede reproducir solamente partes del genoma, en donde se conoce por lo menos una mínima secuencia de 20 a 40 pb.
Se necesitan cebadores (primers) específicos que sean complementarios al fragmento que se desea amplificar.
Al momento de la polimerización puede darse errores al sintetizar el ADN.
Puede contaminarse con otro ADN o molécula (ARN o proteínas) que puede ser del mismo investigador o cualquier otro.
La principal desventaja es la necesidad de estandarizar la técnica para el organismo o la técnica de interés, lo cual puede ser tardado y costoso. 
Utilidad
La PCR es la técnica más importante en la biología molecular porque con ella se ha logrado la simplificación e innovación de muchas técnicas moleculares que permiten abordar nuevas líneas de investigación en diferentes ramas de la ciencia como: biotecnología, ecología, evolución, biología de la conservación, arqueología, patología, medicina clínica y forense, entre otras.
Sus aplicaciones son múltiples en la práctica clínica como: en el diagnóstico molecular, análisis prenatales, terapia génica, genotipificación, ancestría, filogenia, farmacogenómica, pruebas de paternidad y pruebas de identificación en criminalística.
PCR una visión de la aplicación de esta técnica
GRACIAS
POR
SU
ATENCIÓN
SECUENCIACIÓN
Bio. MsC. Carmen Barba G.
Docente
Universidad Técnica Ambato
OBJETIVOS
Definir el fundamento de la técnica
Explicar el procedimiento de la técnica. Secuenciación de Sanger
Conocer las aplicaciones
SECUENCIACIÓN
La secuenciación del ADN principalmente determina el orden de los nucleótidos de un fragmento de interés. 
Existen distintos métodos para la secuenciación: -Rotura química (método de Maxan y Gilbert).
Terminación de cadena (secuenciación de Sanger).
Secuenciación cíclica térmica.
Secuenciación Sanger
El principio de esta secuenciación es que el ADN polimerasa no puede añadir nucleótidos a una cadena de ADN en crecimiento una vez que se incorpora un análogo nucleotídico o sea un ddNPT que carece del grupo hidroxilo en posición 3’.
Los resultados de la secuenciación se leen en un electroferograma o cromatograma.
Interpretación de los resultados
Secuenciación de Sanger
Aplicaciones
Detección de mutaciones.
Secuenciación de ADN fósiles.
Diagnóstico de enfermedades genéticas.
Identificación de especies y control de cruces entre animales.
Proyecto de Genoma Humano.
VENTAJAS DE LOS TEST MOLECULARES
Análisis de desordenes en una muestra.
Igual técnica para el diagnóstico de patologías.
La presencia de una única mutación para algunas patologías facilita el diagnóstico.
Los resultados son objetivos y definitivos.
Se puede predecir el fenotipo desde el genotipo en algunos desordenes.
Estas técnicas no son afectadas por factores como: prematuridad, nutrición o edad.
Toma de muestra no invasiva.
Resultados relativamente rápidos.
Permite individualizar el tratamiento basado en el genotipo.
Posibilidad de realizar diagnóstico prenatal y estudio de portadores.
CUESTIONARIO
Explique el fundamento de la PCR
Elabore un protocolo de el proceso de la PCR
Describa las semejanzas y diferencias entre la PCR punto final y la PCR tiempo real
Diga ¿cuáles son las ventajas y desventajas de la PCR?
Fundamente las aplicaciones de la PCR
Explique en ¿qué consiste la Secuenciación?
¿Qué tipos de secuenciación existen y cuáles son la diferencia?
Enuncie las aplicaciones de la Secuenciación en la biología molecular y la clínica
Establezca semejanzas y diferencias entre las técnicas moleculares estudiadas
Gracias
Atención
por su
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