Identificación de Staphylococcus

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Facultad de Ciencias Veterinarias 
 
-UNCPBA- 
 
 
Identificación de Staphylococcus spp. y 
evaluación de la producción de biofilm 
 
 
 
Ibarguren Quesada Sofía; Juliarena, Marcela; Monteavaro Cristina 
 
 
 
Marzo, 2019 
Tandil 
 
 
 
 
Identificación de Staphylococcus spp. y evaluación de la 
producción de biofilm 
 
Tesis de la Carrera de Licenciatura en Tecnología de los Alimentos, presentada 
como parte de los requisitos para optar al título de grado de Licenciado del 
estudiante: 
Sofía Ibarguren Quesada 
 
 
 
 
Director: Dra. Cristina Monteavaro 
 
 
Codirector: Dra. Marcela A. Juliarena 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Evaluador: Lic. Juliana González 
 
 
 
RESUMEN 
Los biofilms son comunidades complejas de microorganismos que crecen 
inmersos en una matriz orgánica polimérica extracelular, que les permiten 
adherirse a superficies húmedas, vivas o inertes. Estas sustancias protegen a 
los microorganismos de agentes antimicrobianos, evitan la deshidratación y 
aumentan la viabilidad. La leche es una matriz con un alto contenido de materia 
orgánica lo cual predispone a la formación de biofilms. Staphylococcus es el 
género más frecuentemente aislado a partir de leche y se ha comprobado por 
varios autores su capacidad de formación de biopelículas ya sea en el tejido 
mamario como en los equipos e instalaciones donde se pasteuriza y procesa la 
leche. Existen distintas metodologías para la determinación de la producción de 
biofilm, como la prueba del Rojo Congo (cualitativa) y el método de la 
microplaca (semicuantitativa). También existen pruebas genotípicas mediante 
la detección de los genes involucrados tanto en la síntesis de la matriz 
extracelular como en la síntesis de proteínas que intervienen en el proceso de 
formación del biofilm. Como objetivo se propuso identificar 20 aislamientos de 
leche bovina y determinar la capacidad de formación de biofilm mediante 
pruebas fenotípicas y genotípicas. De los 20 aislamientos estudiados 4 
resultaron no pertenecer al género Staphylococcus. Los resultados obtenidos 
de la identificación fueron S. aureus, S. haemolyticus, S. sciuri, S. 
chromogenes, S. pseudointermedius, S. caseolyticus y S. hyicus. Con respecto 
a la producción de biofilm, 10 aislamientos fueron positivos y 6 negativos a la 
prueba del Rojo Congo, mientras que en la prueba de microplaca todos fueron 
positivos en diferentes grados. Además en seis de los aislamientos se 
detectaron al menos a uno de los genes analizados. De acuerdo con nuestros 
resultados y coincidente con la bibliografía el método de la microplaca es el 
más sensible para analizar la producción de biofilm. 
 
Palabras claves: Staphylococcus, biofilm, mastitis 
 
 
 
 INDICE 
INTRODUCCIÓN 1 
MARCO TEORICO 2 
Características de los biofilms 2 
Descripción de la formación de biofilm 3 
Biofilm estafilocóccico 7 
Importancia de las biopelículas en la Industria Alimentaria 13 
OBJETIVOS 17 
Objetivo General 17 
Objetivos Específicos 17 
MATERIALES Y MÉTODOS 18 
Población de estudio 18 
Identificación bioquímica bacteriana 18 
Determinación fenotípica de biofilm 19 
• Rojo Congo modificado 19 
• Método de microplaca 19 
Identificación genotípica bacteriana 21 
• Extracción de ADN 21 
• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 21 
RESULTADOS 23 
Identificación bioquímica y genotípica bacteriana 23 
Determinación fenotípica de biofilm 24 
Detección genotípica de genes de responsables de la adhesión 
intercelular 26 
DISCUSIÓN 28 
CONCLUSIÓN 31 
BIBLIOGRAFIA 32 
 
 
LISTA DE TABLAS: 
Tabla 1. Regla de clasificación de cepas formadoras de biofilm. 20 
Tabla 2. Características de los primers utilizados en este estudio. 22 
Tabla 3. Resultados de las pruebas bioquímicas de los aislamientos. 24 
Tabla 4. Resultados de la producción de biofilm y presencia 
de los genes relacionados en los aislamientos de Staphylococcus spp. 25 
 
LISTA DE FIGURAS: 
Figura 1. Descripción de la formación de biofilm. 7 
Figura 2. 
A. Tinción de Gram. 
B. Microfotografía. 
C. Colonia de Staphylococcus aureus (hemolítica) en Agar Sangre. 9 
Figura 3. Desarrollo de biopelículas estafilocócicas. 10 
Figura 4. Componentes predominantes de la matriz de biofilm 
estafilocócica. 13 
Figura 5. Foto del producto de amplificación del gen 16S rRNA. 23 
Figura 6. Placa de Rojo Congo modificado. 25 
Figura 7. Desarrollo de biofilm de los aislamientos estudiados en 
microplaca de poliestireno de fondo plano. 26 
Figura 8. Foto de los productos de amplificación de los genes 
icaA e icaD. 27 
 
 
1 
 
INTRODUCCIÓN 
Los biofilms o biopelículas son comunidades complejas de microorganismos 
que crecen inmersos en una matriz orgánica polimérica extracelular, que les 
permiten adherirse a superficies húmedas, vivas o inertes (Navia et al., 2010). 
Las biopelículas que se encuentran en la naturaleza consisten en comunidades 
de microorganismos primarios viables y no viables protegidos por sustancias 
poliméricas extracelulares polianiónicas fijadas a la superficie. Estas 
sustancias pueden contener polisacáridos, proteínas, fosfolípidos, ácidos 
nucleicos, ácidos teicoicos y otras sustancias poliméricas hidratadas con un 
porcentaje de agua entre 85 y 95% (Chmielewski y Frank, 2003). Sus 
principales funciones son proteger a los microorganismos de la biopelícula de 
los agentes antimicrobianos, evitar la deshidratación, reforzar la resistencia al 
estrés ambiental y permitir a los microorganismos mantener una reserva de 
nutrientes (Carpentier y Cerf, 1993). 
Un problema latente es la formación tanto a nivel industrial como doméstico de 
estas biopelículas. En la mayoría de los casos su crecimiento y formación es 
perjudicial, causando corrosión, obstrucción de tuberías, fallas en los equipos y 
deficiencia en la transmisión de calor (ej. intercambiadores de calor en los 
pasteurizadores), lo que resulta un elevado costo de limpieza y mantenimiento. 
Las esponjas húmedas utilizadas en la limpieza de las instalaciones ó utensilios 
destinados a la preparación de alimentos, se consideran un ambiente propicio 
para la formación de biofilm con microorganismos, tales como Staphylococcus 
aureus, Salmonella enteritidis y Campylobacter jejuni entre otros (Navia et al., 
2010). 
 
 
 
 
 
2 
 
MARCO TEÓRICO 
Características de los biofilms 
Los biofilms son comunidades bacterianas que pueden estar conformadas por 
una única especie o por múltiples especies microbianas englobadas en una 
matriz de exopolisacáridos producida por las bacterias y adheridas a una 
superficie viva o inerte (Lasa et al., 2005). En la naturaleza es la forma de 
crecimiento más frecuente de las bacterias e incluso de la mayoría de los 
patógenos. Este tipo de crecimiento permite la supervivencia de las bacterias 
en un medio hostil y en algunos casos es el origen de varios procesos 
infecciosos (Costerton et al., 1999). La presencia de biofilms es ubicua en la 
naturaleza, convivimos cotidianamente con ellos, tanto que quizás sea 
precisamente su ubicuidad la que les ha restado protagonismo (Uzcudun, 
2004). 
Este modo de crecimiento maximiza la obtención de nutrientes favoreciendo la 
colonización, permitiendo la cooperación entre las bacterias por medio del 
crecimiento en comunidad y beneficia a los microorganismos que lo forman, 
pues, el biofilm confiere protección frente a los mecanismos de defensa del 
hospedador y los protege de la acción de los agentes antimicrobianos 
(Jefferson, 2004). 
Aunque la composición de los biofilms es variable en función del sistema en 
estudio, en general, el componente mayoritario es el agua, que puede 
representar hastaun 97% del contenido total. Además de agua y de las células 
bacterianas, la matriz del biofilm es un complejo formado principalmente por 
exopolisacáridos secretados por las propias células que forman parte del 
mismo. En menor cantidad se encuentran otras macromoléculas como 
proteínas, ADN y productos diversos compuestos procedentes de lisis de las 
bacterias (Uzcudun, 2004). 
La formación de biofilms parece ser una estrategia adaptativa de supervivencia 
bacteriana (Götz, 2002), ya que las células del interior del biofilm son más 
resistentes a los factores ambientales desfavorables que sus homólogas 
planctónicas. El crecimiento en biofilm ofrece importantes ventajas a las 
bacterias para su proliferación: 
3 
 
• La matriz orgánica polimérica ofrece protección a los microorganismos 
ya que crea un microambiente en el que las condiciones ambientales 
son más estables. 
• Permite la supervivencia en nichos favorables, sin ser arrastrados de allí 
por el flujo de líquido. 
• Facilita el aprovechamiento del agua, reduciendo la posibilidad de 
deshidratación. 
• La matriz orgánica polimérica confiere resistencia frente a la acción de 
agentes adversos como los biocidas, anticuerpos y macrófagos. 
• Incrementa la disponibilidad de nutrientes para su crecimiento. 
• Se propicia por la cercanía las relaciones de comensalismo o 
cooperación entre organismos con aptitudes fisiológicas diferentes. 
• Posibilita la transferencia de material genético (ADN), la proximidad 
favorece la transferencia horizontal de genes. 
 
Debido a todos estos factores, los biofilms pueden tener graves consecuencias 
en la industria alimentaria. Por ello, es preciso eliminar todos los 
microorganismos de las superficies en contacto con los alimentos, antes de que 
las contaminen y establezcan un biofilm que puede servir de reservorio de 
microorganismos patógenos o alterantes (Piera, 2002). 
 
Descripción de la formación de biofilm 
El biofilm bacteriano empieza a formarse cuando alguna célula individual se 
une inicialmente a una superficie. La capacidad de la célula para realizar 
adherencia inicial depende de factores ambientales como la temperatura, 
sustancias orgánicas y el pH, entre otros, y de factores genéticos que codifican 
las funciones motrices, la sensibilidad ambiental, las adhesinas y otras 
proteínas. Aunque la combinación de los factores que influyen en el desarrollo 
del biofilm dependen en principio de la especie, algunas características son 
comunes a la mayoría de bacterias estudiadas hasta ahora (Costerton et al., 
1999). 
La formación de un biofilm, no es un proceso aleatorio sino que sigue una 
sistemática que permite su predicción. Se han identificado cinco fases: Una 
4 
 
adsorción reversible de la bacteria a la superficie, una unión irreversible, una 
primera fase de maduración con crecimiento y división, la segunda fase de 
producción del exopolímero, y el desarrollo final de la colonia con dispersión de 
células colonizadoras (Figura 1). 
Acondicionamiento de la superficie: El biofilm puede desarrollarse sobre casi 
cualquier tipo de superficie, gracias a que previamente entra en contacto la 
materia orgánica presente en el agua. En la interfase agua/superficie se 
deposita una capa orgánica, que cambia las propiedades químicas y físicas de 
la superficie y mejora las posibilidades de fijación de las bacterias (Piera, 
2002). 
La capacidad de unirse a diversos plásticos, cristales y metales aún el acero 
inoxidable, depende de las proteínas específicas de su cubierta y de los 
apéndices motrices. La acción del aire o de la humedad sobre el acero 
inoxidable, poco a poco crea una capa de óxido de cromo sobre el que se pega 
la materia orgánica y así se pre-acondiciona el sustrato para la adhesión de las 
bacterias (Piera, 2002). 
Adsorción y Fijación: La adhesión de los microorganismos a un sustrato puede 
ser activa (por los flagelos, pili, adhesinas, cápsulas y cargas de superficie) o 
pasiva (por gravedad, difusión y dinámica de fluidos). Las bacterias libres que 
encuentran la superficie acondicionada, forman con ella una unión reversible 
que depende de las cargas eléctricas de la bacteria. Son atracciones de tipo 
electrostático o hidrófobicas y fuerzas de Van der Waals, sin unión química. Si 
esta unión se mantiene suficiente tiempo, aparecen nuevas estructuras 
químicas y físicas que la harán permanente (Piera, 2002). 
En casos de gran densidad de población o ante la precariedad de nutrientes 
que hay en el agua potable, algunos microorganismos son capaces de 
responder individualmente con una alteración de su pared celular para hacerla 
hidrófoba y, por lo tanto, con más afinidad hacia las superficies (Mayette, 
1992). Cuando llegan a la capa base, más próxima a la pared de la tubería y 
casi sin flujo de agua, son atraídos por la superficie y se produce la unión. 
Durante la etapa de unión reversible las células bacterianas aún muestran 
movimiento Browniano, y se eliminan fácilmente mediante la acción mecánica 
5 
 
de limpieza. La unión “irreversible” significa el anclaje de apéndices bacterianos 
y la producción de exopolímeros. La acción mecánica necesaria para eliminar 
será mayor cuanto más tiempo lleve activo el biofilm (Piera, 2002). 
Para adaptarse a la vida del biofilm, las bacterias sufren variaciones radicales. 
El cambio del medio donde se encuentran activa diferentes genes que codifican 
nuevas proteínas estructurales y enzimas. Estos genes y proteínas son los que 
explican la fijación y la resistencia de las bacterias incluidas en las biopelículas 
ante los antibióticos o los desinfectantes. Se han podido identificar 800 
proteínas que cambian de concentración a lo largo de las cinco fases de 
desarrollo. Así mismo se dan las condiciones para que se produzca el 
intercambio de material genético (Singh et al., 2002). 
Maduración: Las condiciones de estabilidad presentes en este ambiente, 
favorecen el crecimiento y la división de las células y permite iniciar la 
fabricación de una mezcla de polímeros polianiónicos, limosa y pegajosa, que 
se excreta al exterior y mantiene unidas las bacterias entre ellas y con la 
superficie (Piera, 2002). 
La composición del exopolímero es poco conocida, pero consta de 
polisacáridos o glicoproteínas de diversos azúcares, como glucosa, fructosa, 
manosa, N- acetilglucosamina y otros. También puede contener proteínas 
libres, fosfolípidos, ácidos nucleicos o ácidos teicoicos. Su estructura, a partir 
de grupos de polisacáridos neutros o portadores de cargas eléctricas, actúa 
como un sistema de intercambio iónico para atrapar y concentrar los nutrientes 
que encuentren (Chmielewski y Frank, 2003). 
En un biofilm maduro, la mayor parte de su volumen está ocupado por la matriz 
laxamente organizada (75-95%) alrededor de unas pocas bacterias (5-25%), 
que proporciona una cubierta gelatinosa y deslizante a la superficie colonizada, 
con un considerable volumen de agua disponible (Piera, 2002). 
Cooperación entre especies: Al cabo de pocos días de la primera colonización, 
otros microorganismos quedan atrapados en la biopelícula por captación física 
y atracción electrostática. Hongos o bacterias sin movilidad propia serán 
capaces de aprovechar materiales residuales de los primeros habitantes, y de 
6 
 
producir sus propios residuos que serán aprovechados por otros 
microorganismos (Piera, 2002). 
Desde el biofilm más simple, como puede ser una colonia bacteriana en agar 
nutritivo, al más complejo, la comunidad metabólica coopera de una manera 
compleja. Las diferentes especies viven en un nicho mínimo, especializado y 
hecho a medida. Si una especie genera residuos tóxicos, otra los eliminará. Así 
se consigue coordinar los recursos bioquímicos de todos los habitantes del 
biofilm; se reúnen las diferentes enzimas de los que disponen numerosas 
especies de bacterias para abastecerse de aportes nutritivos queninguna 
especie sola podría digerir. También servirán para responder a la acción de 
diversos biocidas (Piera, 2002). 
Crecimiento y dispersión: La colonia, en división continua, libera 
periódicamente unas pocas células que se repartirán corriente abajo. La 
formación de nuevos biofilm a partir de estas células se ve favorecida porque 
desde el biofilm original se liberan residuos y nutrientes que prepararan la 
nueva superficie con la cubierta orgánica de acondicionamiento y sirve para 
alimentar las bacterias. Esta colonización está relacionada con la evolución y la 
supervivencia de la bacteria a largo plazo (Mayette, 1992). 
El nivel de estrés ambiental y la transición entre entornos diferentes son unos 
de los factores principales que influyen en esta liberación celular. Las 
condiciones del flujo hídrico son uno de los principales factores. Si se, 
establece un equilibrio entre el crecimiento de la colonia y el movimiento del 
agua se liberan pocas células del biofilm mientras que si el flujo es intenso o 
turbulento aumenta la liberación de células e incluso pueden desprenderse 
partes enteras del biofilm (Piera, 2002). 
 
7 
 
 
Figura 1. Descripción de la formación de biofilm (obtenida en: 
http://sedici.unlp.edu.ar). 
 
 
Biofilm estafilocóccico 
En el mismo momento en que se acaba la limpieza de un depósito o en una 
conducción de agua, empieza a desarrollarse el biofilm. Si ponemos un cristal 
limpio y estéril en una corriente de agua que contenga nutrientes mínimos, al 
cabo de un tiempo variable se habrá formado un ecosistema microbiano que 
establecerá complejas relaciones individuales y se trasformará en una masa de 
polisacáridos producida extracelularmente por los mismos pobladores (Biofilm 
Online Manual, 1998). 
La capacidad de formación de biofilm no parece estar restringida a ningún 
grupo específico de microorganismos y hoy se considera que bajo condiciones 
ambientales adecuadas todos los microorganismos son capaces de formar 
biofilms (Lasa et al., 2005). 
En la producción láctea argentina uno de los contaminantes más frecuentes de 
la leche cruda es Staphylococcus spp., debido a que es el microorganismo 
8 
 
causante de mastitis de mayor prevalencia en la mayoría de los tambos de las 
cuencas lecheras nacionales y/o es parte de la microbiota normal de la la piel 
de la ubre de la vaca (Bonetto, 2014). 
El género Staphylococcus tiene morfología de cocos gram positivos agrupados 
en racimos, catalasa positivos, aerobios anaerobios facultativos, inmóviles, 
oxidan y fermentan la glucosa, toleran hasta un 10% de cloruro de sodio 
(halófilos), son mesófilos, velogénicos y las colonias son lisas, redondas, 
cremosas, ligeramente convexas de 1 a 4 mm de diámetro (Figura 2). 
Este género Staphylococcus comprende 42 especies, las cuales pueden 
subdividirse en dos grandes grupos de acuerdo con la producción de 
coagulasa. La mayoría de estas especies son coagulasa negativa, con 
excepción de Staphylococcus aureus, Staphylococcus intermedius, 
Staphylococcus pseudointermedius que son estafilococos coagulasa positiva 
(ECP) y Staphylococcus hyicus que es coagulasa variable; éstas han sido 
aisladas de mastitis, aunque hace falta más información acerca de la 
prevalencia e incidencia de cada especie. Los estafilococos coagulasa 
negativos (ECN) que se aíslan con mayor frecuencia comprenden 
Staphylococcus simulans, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus warneri y 
Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus sciuri, Staphylococcus 
chromogenes, Staphylococcus cohnii y Staphylococcus haemolyticus que son 
parte de la microbiota de la piel de los pezones y usualmente pueden ocasionar 
formas subclínicas de mastitis (Bonetto, 2014). 
9 
 
 
A B C 
Figura 2. 
A. Tinción de Gram. Cocos gram positivo, agrupados en racimos 
irregulares (1000X). 
B. Microfotografía, tomada con un microscopio electrónico de barrido. Se 
observa morfología de coco, carencia de flagelo y asociación en racimo. 
C. Colonia de Staphylococcus aureus (hemolítica) en Agar Sangre. 
(Obtenidas en: http://microbitosblog.com/2011/08/03/staphylococcus-aureus-
epidermidis-saprophyticus/). 
 
S. aureus presenta diferentes factores de virulencia como: proteína A, cápsula, 
enzimas extracelulares como la coagulasa, leucocidina, hemolisina, la 
capacidad de formar biopelículas y además pueden presentar genes de 
resistencia a los antibióticos (Roberson et al., 1996). Alimentos contaminados 
con la enterotoxina estafilocócica secretada por S. aureus puede afectar al 
hombre produciendo diversos síntomas como náuseas, vómitos, diarrea, 
malestar y debilidad. Raramente la enfermedad es mortal, pero puede 
complicarse, presentándose a veces deshidratación y shock (Anmat, 2013). 
La habilidad de Staphylococcus spp. de formar biofilm in vivo se considera uno 
de los principales factores de virulencia en su patogénesis de la mastitis, 
favoreciendo la colonización del tejido mamario y su resistencia a los agentes 
antimicrobianos (Arslan y Özkardes, 2007). Las vías regulatorias para la 
formación de biofilm varían entre las cepas (Melchior et al., 2006), por lo que 
resulta interesante saber si las diferencias de expresión resultante entre 
aislamientos se pueden atribuir a diferentes genotipos (Peña y Uffo, 2013). 
Además, los estafilococos también pueden adherirse directamente a superficies 
abióticas generalmente por atracciones hidrofóbicas (Figura 3). Sin embargo, 
10 
 
varias moléculas estafilocócicas específicas también se han implicado en la 
unión a la superficie. Estas incluyen la autolisina principal de S. epidermidis 
(AtlE) y su homólogo de S. aureus (Atl) y los ácidos teicoicos de la pared 
(WTA) en S. aureus (Bose et al., 2012). 
 
 
Figura 3. Desarrollo de biopelículas estafilocócicas. La unión de las células a 
una superficie (en el caso de las biopelículas unidas a la superficie) se produce 
a través de interacciones hidrofóbicas en una superficie abiótica o a través de 
proteínas de superficie que se unen de manera específica a las proteínas de la 
matriz del huésped. El crecimiento de la biopelícula en la etapa de proliferación/ 
maduración se acompaña de la producción de componentes de la matriz 
adhesión intercelular (como PIA, eDNA y proteínas), así como factores 
perturbadores (como PSM y enzimas secretadas degradativas). (Extraída de 
Otto, 2018). 
 
Durante la segunda etapa del desarrollo de la biopelícula, etapa de 
proliferación y maduración de la matriz, las microcolonias que se han formado 
después del acoplamiento crecen por proliferación y las células secretan 
moléculas poliméricas para formar la matriz de biofilm (Figura 3). Los polímeros 
de matriz de biopelículas tienen una naturaleza química divergente e incluyen 
polisacáridos, proteínas y ácidos teicoicos. Además de esas moléculas 
secretadas activamente, también se cree que sustancias poliméricas de las 
11 
 
células muertas contribuyen a la matriz del biofilm, principalmente el ADN que 
se libera de las células muertas (ADN extracelular (eDNA)) (Otto, 2018). 
Los estafilococos producen un exopolisacárido llamado polisacárido de 
adhesión intercelular (PIA), un homopolímero de N-acetilglucosamina unido por 
enlaces β-1-6 (Figura 4). Este polisacárido presenta un carácter catiónico 
debido a la eliminación, catalizada por enzimas, de ∼15 a 20% de los grupos 
N-acetilo después de la secreción. Esta característica puede ser importante 
para la interacción electrostática con otros polímeros de superficie y, por lo 
tanto, para la formación de la matriz de biopelícula extracelular pegajosa (Mack 
et al,. 1996; Vuong et al., 2004). No parece haber un "anclaje" específico para 
PIA en la superficie de la célula, y se ha demostrado directamente que esta 
función no se cumple con los ácidos teicoicos de la pared (Vergara et al., 2008). 
La biosíntesis de PIA se realiza mediante las proteínas codificadaspor el locus 
del gen ica (adhesión intercelular), que comprende los genes icaA, icaD, icaB e 
icaC (Figura 4). Los genes icaA e icaD codifican enzimas N-acetilglucosamina 
transferasa, que sintetizan PIA. La sola expresión de icaA induce una baja 
actividad enzimática, pero la coexpresión de icaA e icaD lleva a un incremento 
significativo en la actividad enzimática y se relaciona con la expresión 
fenotípica del polisacárido capsular (Arciola et al., 2002). El crecimiento de la 
cadena depende de la presencia de IcaC, una proteína de membrana que se 
supone que es el exportador de PIA. Además, la enzima IcaB, que se 
encuentra en la superficie bacteriana, es la desacetilasa de PIA. La 
desacetilación es crucial para la retención de PIA en la superficie y las diversas 
funciones que cumple PIA en la fisiología estafilocócica, que además de la 
formación de biofilm comprende una mayor resistencia a los péptidos 
antimicrobianos (AMP) y la fagocitosis de neutrófilos (Vuong et al., 2004). 
Por delante del operón ica se encuentra el gen icaR, que se transcribe en la 
dirección opuesta al operón icaADBC. icaR es un represor del operón ica. 
Varios estudios han demostrado que la formación de biopelículas in vitro o in 
vivo se puede lograr mediante aislamientos de S. epidermidis o S. aureus que 
no albergan el locus ica, aunque la extensión, estructuración y robustez de las 
biopelículas PIA-negativas parece ser más bajo que las formadas por PIA, al 
menos en S. epidermidis (Schommer et al., 2011; Wang et al., 2011). En los 
12 
 
aislamientos de S. aureus, la formación de biopelículas parece ser 
predominantemente dependiente de proteínas. Estudios anteriores informaron 
diferencias entre aislamientos resistentes y sensibles a la meticilina al respecto, 
mientras que un estudio más reciente se indica que tanto los aislamientos de S. 
aureus resistentes a la meticilina como los sensibles, forman biofilms casi 
exclusivamente dependientes de proteínas (Pozzi et al., 2012; Loughran et al., 
2014). En contraste, S. epidermidis requiere de PIA para formar biopelículas, 
con una contribución adicional mediada por proteínas (Rohde et al., 2007). 
Distintas proteínas de la superficie también se han implicado en la adhesión 
intercelular, pero en muchos de esos casos es difícil distinguir entre una unión 
superficie / tejido y una función de adhesión intercelular genuina. Estas 
proteínas contienen muchas proteínas de unión a la superficie de la familia 
MSCRAMM (microbial surface components recognising adhesive matrix 
molecules) además de la proteína asociada al biofilm (Bap), que se encuentra 
en los aislamientos de mastitis de S. aureus, de los cuales un homólogo (Bhp) 
está presente en S. epidermidis (Cuccarella et al., 2001). En apoyo de una 
participación específica en la formación de matrices, se ha informado 
recientemente que Bap se ensambla en matrices amiloideas para promover el 
ensamblaje de biopelículas (Taglialegna et al., 2016). 
 
 
 
 
13 
 
 
 
 
Figura 4. Componentes predominantes de la matriz de biofilm estafilocócica. El 
exopolisacárido PIA (izquierda), producido por muchos aislamientos de S. 
aureus y S. epidermidis, es un homopolímero de N-acetilglucosamina unidos 
por enlaces β-1-6. Este exopolisacárido se sintetiza en la célula por la actividad 
combinada de las enzimas de membrana IcaA e IcaD y es probable que se 
exporte por IcaC. La enzima IcaB unida a la superficie extracelular elimina un 
cierto porcentaje (∼15 a 20%) de restos N-acetilo, lo que le da a la molécula 
PIA neutral una carga neta positiva, anclando el PIA a la superficie celular 
cargada negativamente. Además del locus icaADBC, también está presente un 
gen regulador, icaR (extraída de Otto, 2018). 
 
La característica más notable del gen bap es la presencia de una extensa 
región de repetición, en la que las repeticiones son idénticas incluso a nivel de 
nucleótidos. Aunque no se ha establecido la función biológica de las 
repeticiones, es posible especular que esta región podría servir para proyectar 
la parte amino terminal de la proteína desde la superficie celular y promover la 
interacción con las superficies abióticas, los componentes de la célula 
hospedadora u otras bacterias (Cuccarella et al., 2001) 
 
El gen bap se ha encontrado en cepas de S. aureus, S. epidermidis, S. 
chromogenes, S. xylosus, S. simulans y S. hyicus aisladas de glándulas 
mamarias en rumiantes que padecen mastitis (Potter et al. 2009). 
14 
 
 
Importancia de las biopelículas en la Industria Alimentaria 
El interés actual de la industria alimentaria por los biofilms, que se forman en 
las superficies de los equipos de elaboración de los alimentos, está relacionado 
con la posibilidad de que se produzca la transferencia de los microorganismos 
desde la superficie de los equipos al alimento que entra en contacto con ella, 
con el consiguiente riesgo, ya sea por el deterioro del producto o para la salud 
pública (San José y Orgáz, 2010). 
El principal problema sanitario de los biofilms en la Industria Alimentaria es que, 
al resistir muchos de los tratamientos de limpieza y desinfección 
convencionales, los microorganismos alojados pueden hacerse persistentes en 
la planta y comportarse como reservorios de patógenos, que en algún 
momento pueden transferirse al alimento, antes, durante o después del 
procesado (Moretro y Langsrud, 2004). 
Puesto que estas formaciones pueden contener microorganismos patógenos y 
presentar una mayor resistencia a la desinfección, se incrementan las 
probabilidades de contaminación del producto y de provocar infecciones 
alimentarias, razón por la que se considera que la presencia de biofilms en las 
superficies de contacto de la industria alimentaria constituye un evidente riesgo 
para la salud. La presencia de biofilms en estas superficies es la causa 
principal de contaminación del producto final. Las consecuencias de esta 
contaminación pueden conducir a pérdidas económicas debidas tanto al 
necesario rechazo del producto como, incluso, al desarrollo de enfermedades, 
si intervienen microorganismos patógenos (Piera, 2002). 
Además del riesgo de contaminación, el desarrollo de biofilms puede interferir 
en diferentes procesos y causar daños en los equipos. En sistemas de agua 
potable el crecimiento de biopelículas pueden obstruir las cañerías 
disminuyendo su velocidad y su capacidad de transporte originando un 
incremento en el consumo energético. La formación de biofilm en 
intercambiadores de calor y torres de refrigeración puede reducir la 
transferencia de calor y como consecuencia su eficiencia en el proceso. 
Biofilms persistentes en las superficies metálicas pueden causar corrosión 
15 
 
debido a la producción de ácido por parte de las bacterias (Chmielewski y 
Frank, 2003). 
En la industria láctea se emplean los sistemas de ultrafiltración y de ósmosis 
inversa durante el fraccionamiento de la leche. Estos filtros y membranas 
tienen poros de diámetro muy pequeño y están continuamente en contacto con 
el alimento; la más mínima adsorción microbiana bloquearía los poros y 
provocaría la saturación del filtro. Esto produciría una reducción del flujo con 
las consiguientes pérdidas de rendimiento y de producto (Piera, 2002). 
Otro aspecto importante en la industria láctea es la formación de depósitos en 
intercambiadores de calor, problema que causa la reducción de la eficiencia y 
el aumento de la caída de presión, afectando la economía de las plantas de 
procesamiento. Como resultado de la formación de estos depósitos existe la 
posibilidad del deterioro en la calidad del producto por que el fluido no se pude 
calentar a la temperatura requerida y a que los depósitos desalojados por el 
flujo del fluido pueden causar contaminación (Navia et al., 2010). Al ser la leche 
un fluido biológico complejo, las respuestas térmicas de sus constituyentes 
difieren uno del otro,pudiéndose clasificar los depósitos en dos tipos. El tipo A, 
corresponde a proteína y se llevan a cabo a temperaturas entre 75 -110°C. 
Estos depósitos son blancos, suaves y esponjosos y su composición es de 50- 
70% de proteínas, 30-40% de minerales y 4-8% de grasa. Los depósitos tipo B, 
corresponden a minerales y se presentan a temperaturas superiores a 110°C. 
Estos depósitos son duros de color gris, y su composición es de 70-80% de 
minerales, 15-20% de proteínas y 4-8% de grasa (Bansal y Chen, 2006). La 
formación de estos depósitos promueve la adhesión de microorganismos a la 
superficie de la transferencia de calor, formándose una bioincrustación. La 
presencia de microorganismos en el flujo del proceso y/o en la capa de 
depósitos no solo afecta la calidad del producto, sino que también tiene 
influencia en el proceso (Yoo et al., 2006). 
La presencia de los biofilms están llevando a una revisión general de las 
normas higiénicas en la industria alimentaria y, dentro de los sistemas de 
Análisis de Peligros y Puntos de Control Crítico (HACCP), al diseño de 
programas de limpieza y desinfección “customizados”, esto es, pormenorizados 
16 
 
y ajustados a los detalles de operación, diseño y status de mantenimiento de 
cada planta concreta (San José y Orgáz, 2010). 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
17 
 
OBJETIVOS 
Objetivo General 
Caracterizar Staphylococcus aislados de leche bovina provenientes de vacas 
con mastitis e identificar y analizar la producción de biofilm. 
 
Objetivos Específicos 
• Identificar mediante pruebas fenotípicas los aislamientos de Staphylococcus 
spp. obtenidos a partir de leche bovina provenientes de vacas con mastitis. 
• Identificar genotípicamente aislamientos de Staphylococcus spp. obtenidos 
a partir de leche bovina provenientes de vacas con mastitis, mediante el uso 
del ARNr 16s (específico para género Staphylococcus spp.). 
• Determinar fenotípicamente la capacidad para producir biofilm en las cepas 
de Staphylococcus previamente aisladas, mediante la prueba del Rojo 
Congo y de la microplaca. 
• Detectar los genes involucrados en la producción de biofilm: bap, icaA e 
icaD. 
• Comparar la presencia de los genes icaA, icaD y bap con los resultados 
obtenidos de las pruebas de Rojo Congo y microplaca realizadas para 
determinar la producción de biofilm. 
 
 
 
 
 
 
 
18 
 
MATERIALES Y MÉTODOS 
Población de estudio 
Se trabajó, durante los meses de septiembre y octubre de 2018 con 20 cepas 
previamente aisladas provenientes de leche bovina de diez tambos 
procedentes de la Cuenca Mar y Sierra. Todas estas cepas fueron aisladas en 
el Laboratorio de Microbiología, FCV-UNCPBA. Las mismas eran causantes de 
mastitis en los animales de los cuales se extrajeron las muestras. 
También se empleó una cepa conocida productora de biofilm como control 
positivo y una cepa no productora de biofilm como control negativo. 
Identificación bioquímica bacteriana 
Se realizaron pruebas bioquímicas siguiendo la tabla de identificación de 
Cowan and Steel’s (Barrow y Felthan, 1993). 
A partir de aislamientos criopreservados a -20°C se reactivaron en placas de 
Agar Sangre, incubadas 24 h a 37°C. A partir de las colonias obtenidas se 
realizó extendido y coloración de Gram. A continuación se realizaron los 
cultivos puros en Agar triptosoya (ATS). A partir de este cultivo puro se realizó 
la prueba de catalasa, y las siembras en diferentes medios para las siguientes 
pruebas metabólicas: 
 
• Oxidación y fermentación de la glucosa 
• Hemólisis 
• Coagulasa 
• Voges Proskauer 
• ADNasa 
• Fructuosa 
• Manitol 
• Lactosa 
• Ureasa 
• Reducción de Nitratos 
 
 
 
19 
 
Determinación fenotípica de biofilm 
Inoculo: Se sembró una anzada de cada aislamiento en caldo Tripteína Soya 
suplementado con 1% de glucosa (CTSg) y se incubaron a 35ºC durante toda 
la noche. A partir de los caldos se procedió a realizar la determinación 
fenotípica de la formación de biofilm. 
• Rojo Congo modificado 
Se utilizó un medio de cultivo sólido que contiene por cada litro: 36 g de Agar 
infusión cerebro corazón, 0,8 g de Rojo Congo, 50 g de sacarosa, 1,5% de 
cloruro de sodio y 2% de glucosa. Luego de sembrar las placas mediante 
estriado, las mismas se incubaron durante 24 h a 37ºC en aerobiosis, en donde 
se realizó una primera lectura de los resultados. Luego de esto, se dejaron las 
placas por 24 h más a temperatura ambiente y se realizó una segunda lectura. 
Las colonias productoras de biofilm, son aquellas que muestran rugosidad y 
coloración negra, mientras que las colonias no productoras de biofilm son de 
aspecto liso y coloración roja (Rachid et al., 2000). 
 
• Método de microplaca 
A partir de los caldos sembrados de cada aislamiento, se realizaron diluciones 
en proporción 1:100 de cada cepa con CTS glucosado al 1%. Las diluciones 
fueron sembradas por triplicado en microplacas de 96 pocillos de poliestireno 
de fondo plano. Se utilizaron 6 pocillos en cada microplaca como control 
negativo, los mismos contenían CTS con glucosa al 1% sin inocular. Se 
incubaron las microplacas a 35ºC durante 24 h. Luego, se midió el crecimiento 
de las cepas en la microplaca, sin agitación previa para garantizar la integridad 
de las biopelículas en un lector de ELISA a una longitud de onda de 570 nm. El 
contenido de los pocillos se descartó en un contenedor con lavandina diluida al 
10%. 
Se realizaron tres lavados con solución buffer PBS pH 7,2 a temperatura 
ambiente, agregando por lavado, 200 μl en cada pocillo, con el fin de remover 
las bacterias planctónicas. Se tuvo en cuenta el pipetear con cuidado para no 
comprometer la integridad del biofilm y el vaciado se realizó con un movimiento 
rápido. 
20 
 
La fijación del biofilm, se realizó agregando 150 μl metanol en cada pocillo. Se 
lo dejó actuar durante 20 minutos. Las placas se vaciaron con un movimiento 
rápido y se dejaron secar a temperatura ambiente, en posición invertida 
durante toda la noche. 
La capa adherida de biofilm, se tiñó con Cristal Violeta utilizado para la tinción 
de Gram (cristal violeta al 2%), agregando en cada pocillo 150 μl dejándolo 
actuar por 15 minutos. Luego de pasado este tiempo, se lavó con agua de la 
canilla hasta observar que no queden restos de colorante y se dejó secar a 
temperatura ambiente. 
Antes de la lectura, se realizó una elución con 150 μl de alcohol-acetona en 
proporción 80:20, para que la medición sea homogénea. Se dejó actuar por al 
menos 30 minutos con la tapa para evitar evaporación. Por último se midió a 
densidad óptica (DO) con un lector de ELISA a 570 nm. 
Con los datos obtenidos se realizaron los cálculos necesarios para clasificar las 
cepas de acuerdo a su capacidad de formar biofilm. El valor de corte por DO 
(DOc) se definió como el valor de la media del blanco más tres desviaciones 
estándar (DE), esto se realiza con el fin de corregir las densidades ópticas de 
las cepas eliminando lo correspondiente al colorante absorbido por el medio y 
la superficie y de este modo conocer lo que realmente corresponde a la 
formación del biofilm de cada cepa (Stepanovic et al., 2007). 
Una vez obtenida la DO se corrigieron las DO promedio de cada cepa 
obteniendo una DO ajustada (DOa) que sirvió para la clasificación de las cepas 
según la formación de biofilm que hayan presentado de acuerdo a lo reflejado 
en la tabla 1. 
 
Tabla 1. Regla de clasificación de cepas formadoras de biofilm. 
No productoras de biofilm DOa ≤ DOc 
Débiles productoras de biofilm DOc < DOa ≤ 2xDOc 
Productoras moderadas de biofilm 2xDOc< DOa ≤ 4xDOc 
Fuerte productora de biofilm DOa ≥ 4xDOc. 
Según Stepanovic et al., 2007. 
 
 
21 
 
 
 
Identificación genotípica bacteriana 
• Extracción de ADN 
La extracción del ADN cromosómico de los aislamientos seleccionados e 
realizó según el protocolo descripto en Thiran et al. (2018) con pequeñasmodificaciones. Colonias de cultivos bacterianos de 24-48 h en Agar Sangre se 
resuspendieron en 100 μl de Solución buffer Tris-EDTA pH 8 y se incubaron a 
95ºC durante 10 minutos. Luego se centrifugaron a 14000 rpm por 5 minutos y 
el sobrenadante se conservó a -20ºC. 
• Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 
La identificación molecular del género Staphylococcus se realizó por detección 
del gen 16S rRNA mediante la técnica de PCR descripta en Ciftci et al. (2009). 
Para la detección genotípica de dos genes responsables de la adhesión 
intercelular icaA e icaD se realizó una PCR específica también descripta en 
Ciftci et al. (2009). Todas las reacciones de PCR fueron realizadas en un 
volumen final de 15 μl. Los primers utilizados y la longitud del segmento 
amplificado se detallan en la tabla 2. Los productos de PCR se observaron 
mediante electroforesis en geles de agarosa al 1,5% teñidos con sybr safe. 
La detección del gen bap se realizó por PCR específica descripta por Cucarella 
et al. (2004) con las modificaciones realizadas por Vautor et al. (2008). Los 
primers utilizados se describen en la tabla 2. Los productos de PCR se 
observaron mediante electroforesis en geles de agarosa al 1% teñidos con sybr 
safe. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
22 
 
 
 
 
 
 
Tabla 2. Características de los primers utilizados en este estudio. 
Primers Secuencia 5´ 3´ Amplicón Referencia 
ARNr 
16S F 
ARNr 
16S R 
AACTCTGTTATTAGGGAAGAACA 
 
CCACCTTCTCCGGTTTGTCACC 
756 bp Ciftci et al., 
2009 
icaA F 
icaA R 
CCTAACTAACGAAAGGTAG 
AAGATATAGCGATAAGTGC 
1315 bp Ciftci et al., 
2009 
icaD F 
icaD R 
AAACGTAAGAGAGGTGG 
GGCAATATGATCAAGATA 
381 bp Ciftci et al., 
2009 
bap F 
bap R 
CCCTATATCGAAGGTGTAGAATTGCAC 
GCTGTTGAAGTTAATACTGTACCTGC 
variable Cucarella et 
al., 2004 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
23 
 
 
 
 
RESULTADOS 
Identificación bioquímica y genotípica bacteriana 
A partir de los resultados obtenidos de las pruebas Oxidación y fermentación 
de la glucosa realizados a los 20 aislamientos en estudio, se identificaron 16 
cepas que pertenecían al género Staphylococcus spp. Estos resultados fueron 
confirmados por análisis genético del gen 16S rRNA (Figura 5). En cuanto a la 
tinción de Gram, todas las cepas observadas fueron gram positivas, agrupadas 
en racimos (características propias del género). En la tabla 3 se muestran los 
resultados de las pruebas bioquímicas realizadas y la identificación de las 
especies de Staphylococcus. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 5. Foto del producto de amplificación del gen 16S rRNA corrido en gel 
de agarosa al 1,5% y teñido con syber safe. El segmento amplificado tiene una 
longitud de 756 pb. Calle 1: marcador de PM de 1 Kb (15 bandas: 100 pb, 200 
bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 700 bp, 1000 bp, 1500 bp, 2000 bp, 3000 bp, 4000 
bp, 5000 bp, 6000 bp, 8000 bp, 10000 bp). Calle 2: control negativo (agua). 
Calle 3: control positivo. Calle 4: control negativo. Calle 5-8, 10-13, 15-16: 
muestras positivas. Calle 9 y 14: muestras negativas 
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 
24 
 
 
 
 
Tabla 3. Resultados de las pruebas bioquímicas de los aislamientos. 
Cepa 
 
Hem Coag. Man Fruct
. 
V
P 
DNAs
a 
Lact. Sac Red. 
Nit. 
Urea Identif. 
A1 NH + - + + + + + - - S. pseudointermedius 
A2 β + + + + + + + + + S. aureus 
A3 NH - - + - - + + + + S. chromogenes 
A4 NH - - + - + + - - - S. caseolyticus 
A5 β + + + + + + + + + S. aureus 
A6 NH + + + + + + + + + S. aureus 
A7 NH + - + + - + + + + S. pseudointermedius 
A8 β - + - - - - + + + S. haemolyticus 
A9 NH - - + - + + + + + S. hyicus 
A10 NH - - + + - + - + - S. haemolyticus 
A11 β + + + + + + + + + S. aureus 
A12 NH - + + - - + + + - S. sciuri 
A13 NH + + + + + + + + + S. aureus 
A14 NH - - + - + + + - + S. caseolyticus 
25 
 
Referencias: Hem, hemólisis; Coag.: coagulasa; Man., manitol; Fruct., 
fructuosa; VP, acetoina; Lact. , lactosa; Sac., sacarosa; Red. Nit. , reducción de 
nitratos a nitritos; NH, no hemolítico; β, beta hemolítico 
 
Determinación fenotípica de biofilm 
A través del ensayo de Rojo Congo se determinó que 10 cepas resultaron 
positivas para la formación de biofilm (62,5%), presentando rugosidad y 
coloración negra, mientras que 6 cepas resultaron negativas (37,5%) ya que 
presentaron color rojo y aspecto liso (Figura 6). En la tabla 4 se muestran los 
resultados de las dos técnicas utilizadas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
A15 β + + + + + + + + + S. aureus 
A16 NH + + + + + + + + + S. aureus 
26 
 
Figura 6. Placa de Rojo Congo 
modificado. A modo ilustrativo 
se muestra una placa realizada 
en el laboratorio. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Tabla 4. Resultados de la producción de biofilm y presencia de los genes 
relacionados en los aislamientos de Staphylococcus spp. 
Referencias: RC, Rojo Congo; M, Moderado; D, Débil; F, Fuerte 
 
 
 
 
 
Cepa 
Produccion de biofilm Presencia de gen 
Identificación Rojo 
Congo 
Microplaca icaA icaD bap 
A1 + M + + - S. pseudointermedius 
A2 + M + + - S. aureus 
A3 - F - - - S. chromogenes 
A4 - F - - - S. caseolyticus 
A5 + M + + - S. aureus 
A6 + M - - - S. aureus 
A7 + M - + - S. pseudointermedius 
A8 - F - + - S. haemolyticus 
A9 - F - - - S. hyicus 
A10 - F - + - S. haemolyticus 
A11 + M - - - S. aureus 
A12 - F - - - S. sciuri 
A13 + M - - - S. aureus 
A14 + F - - - S. caseolyticus 
A15 + M - - - S. aureus 
A16 + D - - - S. aureus 
Cepa positiva 
Cepa negativa 
27 
 
A partir del análisis de las densidades ópticas en la prueba de microplaca 
(Figura 7) y de la aplicación de la fórmula de Stepanovick et al. (2007) los 
resultados obtenidos fueron: 
• No productoras de biofilm: ninguna cepa. 
• Débiles productoras de biofilm: 1 cepa (6,25%). 
• Moderadas productoras de biofilm: 8 cepas (50,0%). 
• Fuertes productoras de biofilm: 7 cepas (43,75%). 
 
 
Figura 7. Desarrollo de 
biofilm de los aislamientos 
estudiados en Microplaca 
de poliestireno de fondo 
plano. 
 
 
 
 
 
Detección genotípica de genes de responsables de la adhesión 
intercelular 
De las 16 cepas estafilocócicas analizadas se encontró la presencia del gen 
icaA en 3 cepas y del gen icaD en 6 cepas (Tabla 4, Figura 8). Dos cepas 
identificadas como S. aureus y una de las cepas de S. pseudointermedius 
presentaban ambos genes icaA e icaD. Las cepas que sólo presentaban el gen 
icaD fueron identificadas como S. haemolyticus (2) y S. pseudointermedius (1). 
En ninguna cepa se detectó la presencia del gen bap. 
 
28 
 
 
Figura 8. Foto de los productos de amplificación de los genes icaA e icaD 
corridos en gel de agarosa al 1,5% y teñido con syber safe. Los segmentos 
amplificados tienen una longitud de 1315 pb (icaA) y 381 pb (icaD). Se observa 
bandeado inespecífico Calle 1: marcador de PM de 1 Kb (15 bandas: 100 pb, 
200 bp, 300 bp, 400 bp, 500 bp, 700 bp, 1000 bp, 1500 bp, 2000 bp, 3000 bp, 
4000 bp, 5000 bp, 6000 bp, 8000 bp, 10000 bp). Calle 2: control negativo 
(agua). Calle 3-4: muestras positivas icaA. Calle 5-6: muestras negativas Calle 
7: muestra positiva icaA e icaD. Calle 8: control positivo. Calle 9: control 
negativo. Nota: Se observa bandeado inespecífico en algunas muestras a 158 
bp. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 1 2 3 4 5 6 7 8 
9 
29 
 
DISCUSIÓN 
El biofilm es definido como una comunidad de células microbianas asociadas 
en una matriz extracelular principalmente de polisacáridos. La importancia del 
biofilm es reconocido tanto en contextos médicos, ambientales e industriales. 
En las últimas décadas se han descripto que la mayoría de los 
microorganismos (bacterianos y fúngicos) presentan la capacidad de producir 
biofilm, ya sea para iniciar un proceso patológico ó aumentar su viabilidad en el 
medio ambiente. A nivel industrial son un problema económico-sanitario debido 
a que pueden colonizar superficiesinertes y afectar los procesos de 
elaboración de productos alimentarios. Varios mecanismos de producción de 
biofilm están siendo estudiados. La producción de biofilm no sólo depende de 
la presencia de genes involucrados en la codificación de las sustancias 
extracelulares sino que también depende de factores ambientales como 
superficies disponibles, presencia de material orgánico, corriente de efluídos o 
de gases, etc. (Piera, 2002; Navia et al., 2010; Tellez, 2010;). 
En la producción primaria láctea, una de las principales patologías que causa 
grandes pérdidas económicas es la mastitis clínica y subclínica. Esta infección 
intramamaria usualmente contamina la leche ordeñada, especialmente de 
vacas con mastitis subclínica. De acuerdo a varios estudios realizados en la 
República Argentina, los microorganismos más prevalentes pertenecen al 
género Staphylococcus (Calvinho, 2005; Larriestra, 2013). Desde hace varios 
años, en el laboratorio de Microbiología, FCV-UNCPBA, se está trabajando en 
la identificación y caracterización de Staphylococcus presentes en muestras de 
leche provenientes de vacas con mastitis de la región de la Cuenca Mar y 
Sierra. 
En este estudio la mayoría de las cepas fueron identificadas como 
Staphylococcus aureus (43,75%), microorganismo descripto como más 
prevalente en los tambos argentinos (Calvinho y Tirante, 2005). Además se 
encontró otro estafilococo coagulasa positiva, S. pseudointermedius (12,5%); y 
S. hyicus que es coagulasa variable (6,25%). 
También se aislaron los siguientes estafilococos coagulasa negativos S. sciuri 
(6,25%), S. chromogenes (6,25%), S. caseolyticus (12.5%) y S. haemolyticus 
30 
 
(12,5%); que como describió Bonetto (2014) usualmente pueden ocasionar 
formas subclínicas de mastitis, a excepción de S. caseolyticus. 
Uno de los mecanismos de acción patógena de Staphylococcus es la 
adherencia mediante la producción de biofilm. Se han descripto distintos 
métodos para analizar la producción de biofilm. Los dos más utilizados son el 
método en placa de Rojo Congo (cualitativo), en el cual se detecta la 
producción de polisacáridos extracelulares, y el método de microplaca 
(semicuantitativo), en el cual se analiza en forma estática la producción de 
biofilm por adherencia a la placa de poliestireno. Coincidentemente con lo 
descripto en la bibliografía (Kord et al., 2018), en este estudio se detectaron 
menos cepas positivas a la producción de biofilm por el método de Rojo Congo 
que por el método de la microplaca. 
Varios genes han sido asociados a los mecanismos de producción de biofilm. 
En el género Staphylococcus se han identificado como más importantes los 
genes del operon ica y por otro lado se ha detectado el gen bap, especialmente 
en muestras aisladas de glándulas mamarias bovinas (Götz, 2002; Potter et al. 
2009). 
De las 16 cepas de Staphylococcus aisladas detectamos la presencia de los 
genes icaA e icaD simultáneamente en 3 cepas: S. aureus (2/7) y en una de las 
dos cepas de S. pseudointermedius. Por otro lado detectamos sólo la presencia 
del gen icaD en 3 cepas: S. pseudointermedius y en las dos cepas de S. 
haemolyticus aisladas. En ninguna de las cepas aisladas detectamos el gen 
bap. Pinheiro et al. (2016) hallaron también cepas de S. haemolyticus con sólo 
la presencia del gen icaD. 
Los resultados obtenidos aportan importante información sobre las 
características de las cepas presentes en nuestra región. Cabe mencionar que 
los diferentes métodos utilizados son herramientas adecuadas y disponibles en 
nuestra institución. 
Si analizamos los tres métodos estudiados y teniendo en cuenta las 
características del proceso de formación del biofilm, podemos relacionar que el 
método de Rojo Congo detecta la presencia del polisacárido mientras que, el 
31 
 
análisis genético detecta la presencia de genes pero no su expresión. 
Finalmente el método de la microplaca está diseñado utilizando placas para 
cultivos celulares, de modo que provee la superficie adecuada para la 
adherencia de células, primer paso necesario en la formación de las 
biopelículas. 
Este trabajo forma parte de un proyecto de investigación enfocado en detectar 
con celeridad y certeza los factores de virulencia presentes en las cepas de 
Staphylococcus. Estas cepas representan un grave problema debido a que 
afectan tanto a nivel de la salud pública como de la salud animal. Por otro lado, 
la presencia de biopelículas en la industria láctea es un problema que impacta 
en términos de tecnología, que ocasiona pérdidas económicas y por lo tanto se 
deben establecer estrategias eficientes de control con respecto a la prevención 
de su formación. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
32 
 
CONCLUSIÓN 
• La metodología utilizada para la identificación nos permitió determinar 
las especies de Staphylococcus presentes en las muestras de leche 
procesadas. 
• De las técnicas aplicadas para analizar la producción de biofilm, el 
método de la microplaca es el más sensible aunque es el más lento para 
la obtención de resultados y permite semicuantificar. 
• Este método es factible de realizar en un laboratorio de mediana y baja 
complejidad. 
• Los otros dos métodos se pueden utilizar como screning. 
• Según los resultados obtenidos, tanto fenótipicos como génotípicos para 
la formación de biofilm, se puede concluir que aunque algunas cepas 
carezcan de todos los genes estudiados (icaA, icaD y bap), tienen el 
potencial para adherirse a la superficie de la microplaca. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
33 
 
BIBLIOGRAFIA 
ANMAT (2013). Análisis microbiológico de los alimentos, Microorganismos 
patógenos. Volumen 2. Disponible en el URL: 
http://www.anmat.gov.ar/renaloa/docs/Analisis_microbiologico_de_los_alimento
s_vol_II.pdf. Consultado: 24/10/2018. 
Arciola, C.; Campoccia, D.; Gamberini, S.; Cervellati, M.; Donati, E.; Montanaro, 
L. (2002). Detection of slime production by means of an optimised Congo red 
agar plate test based on a colourimetric scale in Staphylococcus epidermidis 
clinical isolates genotyped for ica locus. Biomaterials. 23, 4233-4239. 
Arslan, S.; Özkardes, F. (2007). Slime production and antibiotic susceptibility in 
staphylococci isolated from clinical samples. Memórias do Instituto Oswaldo 
Cruz 102(1), 29-33. 
Bansal, B.; Chen, X. (2006). A critical review of milk fouling in heat exchangers. 
Compr Rev Food Sci. Food Saf. 5, 27-47. 
Barrow, G. I.; Feltham, R. K. A. (1993) Cowan and Steel's manual for the 
identification of medical bacteria, p55. Cambridge University Press (ed). 3° 
edición. 
Biofilm Online Manual. (1998). AMS Board of Education and Training for the 
biofilm. Universidad de Pennsilvania (USA). Disponible en el URL: 
http://www.personal.psu.edu/faculty/j/e/jel5/biofilms/primero.htlm. (Consultado 
el 21/10/2018). 
Bose, J. L; Lehman, M. K; Fey, P. D; Bayles, K. W. (2012). Contribution of the 
Staphylococcus aureus Atl AM and GL murein hydrolase activities in cell 
division, autolysis, and biofilm formation. PLoS One 7, 42244. 
Bonetto, C. (2014) Mastitis bovina causada por Staphylococcus coagulasa 
negativos. Tesis doctoral. FCV-UNLP. 
Calvinho L. F.; Tirante L. (2005). Prevalencia de microorganismos patógenos 
de mastitis bovina y evolución del estado de salud de la glándula mamaria en la 
Argentina en los últimos 25 años. Rev. FAVE, sección Ciencias Veterinarias. 
http://www.anmat.gov.ar/renaloa/docs/Analisis_microbiologico_de_los_alimentos_vol_II.pdf
http://www.anmat.gov.ar/renaloa/docs/Analisis_microbiologico_de_los_alimentos_vol_II.pdf
34 
 
Calvinho L. F. (2005). Mastitis en Argentina: evolución en los últimos diez años 
y perspectivas futuras. APROCAL. E.E.A. Rafaela, INTA. Disponible en el URL: 
http://www.aprocal.com.ar/wp-content/uploads/mastitis_en_argentina.htm.pdf 
Consultado 15/12/2018. 
Carpentier, B.; Cerf, O. (1993). Biofilms and their consequenceswith particular 
references to hygiene in the food industry. Journal of Applied Bacteriology 75, 
499- 511. 
Chmielewski, R. A. N.; Frank, J. F. (2003). Biofilm formation and control in food 
processing facilities. Comp. Rev. Food Sci. and Food Saf. 2, 22-32. 
Ciftci, A.; Findik, A.; Onuk, E.; Savasan, S. (2009). Detection of methicillin 
resistance and slime factor production of Staphylococcus aureus in bovine 
mastitis Braz. J. Microbiol. 40, 254-261. 
Costerton, J.; Stewart, P.; Greenberg, E. (1999). Bacterial biofilm: a common 
cause of persistent infections. Science 284, 1318-1322. 
Cucarella, C., Tormo, M. A.; Ubeda, C.; Trotonda, M. P.; Monzon, M.; Peris, C.; 
Amorena, B.; Lasa, I. & Penades, J. R. (2004). Role of biofilm-associated 
protein Bap in the pathogenesis of bovine Staphylococcus aureus. Infect Immun 
72, 2177–2185. 
Cucarella, C.; Solano, C.; Valle, J.; Amorena, B.; Lasa, I.; Penades, J. R. (2001) 
Bap, a Staphylococcus aureus surface protein involved in biofilm formation. J 
Bacteriol 183, 2888–2896. 
Götz, F. (2002). Staphylococcus and biofilms. Molecular Microbiology, 43(6), 
1367–1378. doi:10.1046/j.1365-2958.2002.02827 
Jefferson, K. K. (2004). What drives bacteria to produce a biofilm? FEMS 
Microbiol. Lett. 236, 163-173. 
Kord, M.; Ardebili, A.; Jamalan, M.; Jahanbakhsh, R.; Behnampour, N.; Ghaemi, 
E. A. (2018). Evaluation of Biofilm Formation and Presence of Ica Genes in 
Staphylococcus epidermidis Clinical Isolates. Osong Public Health Res 
Perspect. 9(4), 160−166. 
35 
 
Larriestra, A. (2013). Situación de la mastitis en Argentina. APROCAL. 
Epidemiología Veterinaria Universidad Nacional de Río Cuarto Universidad 
Nacional de Villa María. Disponible en el URL: http://www.aprocal.com.ar/wp-
content/uploads/downloads/2013/09/Apuntes-Charla-Alejandro-Larriestra.pdf. 
Consultado: 15/12/18. 
Lasa, I.; del Pozo, J.; Penadés, J.; Leiva, J. (2005). Biofilms bacterianos e 
infección. An. Sist. Sanit. Navar. 28, 163-176. 
Loughran, A. J.; Atwood, D. N.; Anthony, A. C.; Harik, N. S.; Spencer, H.J.; 
Beenken, K.E.; Smeltzer, M. S. (2014). Impact of individual extracellular 
proteases on Staphylococcus aureus biofilm formation in diverse clinical 
isolates and their isogenic sarA mutants. MicrobiologyOpen 3, 897–909. 
Mack, D.; Fischer, W.; Krokotsch, A.; Leopold, K.; Hartmann, R.; Egge, H.; 
Laufs, R. (1996). The intercellular adhesin involved in biofilm accumulation of 
Staphylococcus epidermidis is a linear beta-1,6-linked glucosaminoglycan: 
purification and structural analysis. J Bacteriol 178, 175–183. 
Mayette, D. C. (1992). The existence and significance of biofilms in water. 
Water Rev. 1, 3. 
Melchior, M. B.; Vaarkamp, H.; Fink Gremmels, J. (2006). Biofilms: a role in 
recurrent mastitis infections? Vet J. 171(3), 398-407. 
Microbitos blog. (2011). Staphylococcus aureus, S. epidermidis y S. 
saprophyticus. Disponible en el URL: 
http://microbitosblog.com/2011/08/03/staphylococcus-aureus-epidermidis-
saprophyticus/ (Consultado 20/10/2018). 
Moretro, T.; Langsrud, S. (2004). Listeria monocytogenes: biofilm formation and 
persistence in food-processing environments. Biofilms. 1, 107-121. 
Navia, D.; Villada, H.; Mosquera, S. (2010). Las biopelículas en la industria de 
alimentos. Facultad de Ciencias Agropecuarias 8 (2), 118-128. 
Otto, M. (2018). Staphylococcal Biofilms, Microbiol Spectrum 6(4), GPP3-0023-
2018. doi:10.1128/microbiolspec.GPP3-0023-2018. 
36 
 
Peña, J.; Uffo, O. (2013). Producción de biofilme en genotipos de 
Staphylococcus aureus aislados de mastitis bovina en Cuba. Rev. Salud 
Animal. 35 (3), 189-196. 
Piera, G. (2002). Estudio del biofilm: formación y consecuencias. Disponible en 
el URL: http://www.adiveter.com/ftp_public/A1070308.pdf. Consultado: 
20/09/2018. 
Pinheiro, L.; Brito, C. I.; De Oliveira, A.; Pereira, V. C.; Cunha, M. (2016). 
Staphylococcus epidermidis and Staphylococcus haemolyticus: detection of 
biofilm genes and biofilm formation in blood culture isolates from patients in a 
Brazilian teaching hospital. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease 
86(1), 4 - 11. doi: 10.1016/j.diagmicrobio.2016.06.006. Epub 2016 Jun 7. 
Potter, A.; Ceotto, H.; Giambiagi-Demarval, M.; dos Santos, K. R.; Nes, I. F.; 
Bastos, M. C. (2009). The gene bap, involved in biofilm production, is .present 
in Staphylococcus spp. strains from nosocomial infections. J Microbiol. 47(3), 
319-26. 
Pozzi, C.; Waters, E. M.; Rudkin, J. K.; Schaeffer, C. R.; Lohan, A. J.; Tong, P.; 
Loftus, B.J.; Pier, G. B.; Fey, P.D.; Massey, R.C.; O’Gara, J. P. (2012). 
Methicillin resistance alters the biofilm phenotype and attenuates virulence in 
Staphylococcus aureus device-associated infections. PLoS Pathog 8, 
e1002626. 
Rachid, S.; Ohlsen, K.; Witte, W.; Hacker, J.; Ziebuhr, W. (2000). Effect of 
subinhibitory antibiotic concentrations on polysaccharide intercellular adhesin 
expression in biofilm forming Staphylococcus epidermidis. Antimicrob Agents 
Chemother 44, 3357–63. 
Roberson, J. R.; Lawrence, K.; Hancock, D. D.; Gay, J. M.; Besser, T. (1996). 
Prevalence of coagulase positive Staphylococci, other than Staphylococcus 
aureus, in bovine mastitis. AJVR 57 (Suppl), 54-58. 
Rohde, H.; Burandt, E. C.; Siemssen, N.; Frommelt, L.; Burdelski, C.; Wurster, 
S.; Scherpe, S.; Davies, A. P; Harris, L.G.; Horstkotte, M.A.; Knobloch, J.K.; 
Ragunath, C.; Kaplan, J. B.; Mack, D. (2007). Polysaccharide intercellular 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Potter%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19557349
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Ceotto%20H%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19557349
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Giambiagi-Demarval%20M%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19557349
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=dos%20Santos%20KR%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19557349
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Nes%20IF%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19557349
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Bastos%20Mdo%20C%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=19557349
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19557349
37 
 
adhesin or protein factors in biofilm accumulation of Staphylococcus 
epidermidis and Staphylococcus aureus isolated from prosthetic hip and knee 
joint infections. Biomaterials 28, 1711–1720. 
San José, C.; Orgaz, B. (2010). Las biopelículas microbianas, un búnker de uso 
habitual. Departamento de Nutrición, Bromatología y Tecnología de los 
Alimentos, Facultad de Veterinaria. Universidad Complutense de Madrid. 
Schommer, N. N.; Christner, M.; Hentschke, M.; Ruckdeschel, K.; Aepfelbacher, 
M.; Rohde, H. (2011). Staphylococcus epidermidis uses distinct mechanisms of 
biofilm formation to interfere with phagocytosis and activation of mouse 
macrophage-like cells 774A.1. Infect Immun 79, 2267–2276 
http://dx.doi.org/10.1128/IAI.01142-10. 47. 
SEDICI. Descripción de biofilms, desarrollo e importancia de su estudio. 
Impacto de las técnicas de micronanofabricación en sistemas biológicos. 
Disponible en el URL: http://sedici.unlp.edu.ar/. Consultado: 26/10/2018. 
Singh, P. K.; Parsek, M. R.; Greenberg, E. P.; Welsh, M. J. (2002). A 
component of innate immunity prevents bacterial biofilm developement. Nature 
417, 552-555. 
Stepanovic, S.; Vukovic, D.; Hola, V.; Di Bonaventura, G.; Djukic, S.; Cirkovic, 
I.; Ruzicka, F. (2007). Quantification of biofilm in microtiter plates: overview of 
testing conditions and practical recommendations for assessment of biofilm 
production by staphylococci. Journal Compilation 115, 891–899. 
Taglialegna, A.; Navarro, S.; Ventura, S.; Garnett, J. A.; Matthews, S.; Penades, 
J. R.; Lasa, I.; Valle, J. (2016). Staphylococcal Bap proteins build amyloid 
scaffold biofilm matrices in response to environmental signals. PLoS Pathog 12 
e1005711. 
Tellez, S. (2010). Los Biofilms y su repercusión en la Industria Alimentaria 
Disponible en el URL: https://www.visavet.es/es/articulos/biofilms-repercusion-industria-alimentaria.php. Consultado: 02/10/2018. 
38 
 
Thiran E.; Di Ciccio, P. A.; Graber, H. U.; Zanardi, E.; Ianieri, A.; 
Hummerjohann, J. (2018). Biofilm formation of Staphylococcus aureus dairy 
isolates representing different genotypes. J. Dairy Sci. 101, 1–13. 
Uzcudun, I. L. (2004). Biofilms bacterianos. Temas de actualidad 37, 14-18. 
Vautor, E.; Abadie, G.; Pont, A.; Thiery, R. (2008). Evaluation of the presence of 
the bap gene in Staphylococcus aureus isolates recovered from human and 
animals species. Vet Microbiol.127(3-4), 407-11. 
Vergara Irigaray, M.; Maira Litrán, T.: Merino, N.; Pier, G. B.; Penadés, J. R.; 
Lasa, I. (2008). Wall teichoic acids are dispensable for anchoring the PNAG 
exopolysaccharide to the Staphylococcus aureus cell surface. Microbiology 154, 
865–877. 
Vuong, C.; Kocianova, S.; Voyich, J. M.; Yao, Y.; Fischer, E. R.; DeLeo, F.R.; 
Otto, M. (2004). A crucial role for exopolysaccharide modification in bacterial 
biofilm formation, immune evasion, and virulence. J Biol Chem 279, 54881–
54886. 
Wang, R.; Khan, B.A.; Cheung, G.Y.; Bach, T. H.; Jameson-Lee, M.; Kong, K. 
F.; Queck, S. Y.; Otto, M. (2011). Staphylococcus epidermidis surfactant 
peptides promote biofilm maturation and dissemination of biofilm-associated 
infection in mice. J Clin Invest 121, 238–248. 
Yoo, J. A., Hardin, M.; Chen, X. (2006). The influence of milk composition on 
the growth of Bacillus sterothermophilus. J Food Eng. 77, 96-102. 
 
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Vautor%20E%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17881161
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Abadie%20G%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17881161
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Pont%20A%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17881161
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Thiery%20R%5BAuthor%5D&cauthor=true&cauthor_uid=17881161
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=vautor+staphylococcus+biofilm