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Facultad de Ciencias Veterinarias -UNCPBA- Estudio de la calidad microbiológica y fisicoquímica de salmueras en una quesería Pontín, Maximiliano; Barraza, Ayelén; Bruschi, Julieta Agosto, 2017 Tandil Estudio de la calidad microbiológica y fisicoquímica de salmueras en una quesería Tesis de la Carrera de Licenciatura en Tecnología de los Alimentos, presentada como parte de los requisitos para optar al título de grado de Licenciado del estudiante: Director: Dra.,Bruschi Julieta Codirector: Lic., Barraza Ayelén Evaluador: Dra., Vega María Fernanda Agradecimientos En primer lugar quiero agradecer al Departamento de Tecnología y Calidad de los Alimentos de la Facultad de Ciencias Veterinarias – Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires. A mi Directora de tesis, Julieta Bruschi y a su ayudante Soledad Vera por el apoyo incondicional que me brindaron para que el trabajo se lleve a cabo de la mejor manera. A la fábrica de quesos artesanales y dulce de leche donde la práctica se realizó, así como también a mi tutora Ayelén Barraza, por el espacio otorgado y la predisposición para conmigo y con el trabajo. A mi familia, principalmente, a mi papá, mamá, hermanos y abuelos, ya que con su gran apoyo y esfuerzo fueron los responsables de que se pudiera llevar a cabo este trabajo. A mis amigos, por el interés que me prestaron durante todo el transcurso realizado. ¡Gracias a todos! Resumen La elaboración de queso es una actividad muy antiguaque fue incrementando su escala de producción, abarcando una gran diversidad de productos. Durante una de las etapas de su elaboración, la maduración, pueden evidenciarsedefectos en la superficie del queso que pueden ser provocados por la contaminación de la salmuera; a raíz de un mal mantenimiento de la misma.Es por eso que el objetivo del presente trabajo consistió enanalizarla evolución de la calidad de las salmueras de una quesería de Tandil, así como también el mantenimiento de las mismas.Se trataron4 piletas del saladero de quesos durante dos semanas, a las cuales se les realizaron análisis físico- químicos y microbiológicos. La primera semana se tomaron 3 muestras de cada pileta y durante la segunda se tomaron 5 muestras de dos piletas seleccionadas. Se realizó la desinfección con ácido peracético e hipoclorito de sodio en distintas concentraciones siguiendo el mismo procedimiento para cada caso. Se evaluaronlosrecuentos de microorganismos aerobios mesófilos totales, coliformes, hongos y levaduras.A partir de los datos obtenidos, se observóque el hipoclorito de sodio en 2 dosis de 300 ml y 750 ml en 1500 litros de salmuera tuvo mayor efectividad sobre el desarrollo de microorganismos que el ácido peracético con una dosis de 300ml y 400 ml en igual volumen.La respuesta al tratamiento de desinfección fue diferente para los 3 grupos microbianos en estudio, resultando más sensibles los microorganismos coliformes. Resulta indispensable que cada fábrica cuente con estandarización de sus procesos de desinfección, generados a partir de protocolos de uso particulares para cada fábrica. Palabras claves: salmuera; calidad; quesería. Índice 1. Introducción……………………………………………………………………...1 2. Objetivos……………………………………………………………………….... 3 3. Marco teórico………………………………………………………………........ 4 3.1 Queso: Características generales………………………………………....4 3.2 Etapas esenciales de la elaboración de quesos…………………….......4 3.3 Salado de quesos en salmuera……………………………………………8 3.4 Defectos de los quesos…………………………………………………….10 3.5 Desinfectantes utilizados en queserías para mantenimiento de salmueras………………………………………………………………14 4. Materiales y métodos…………………………………………………………...17 4.1- Control de salmueras en planta………………………………………….17 4.2- Características comerciales de los productos utilizados…………...…18 4.3- Toma de muestras…...….………………...............................................18 4.4- Desinfección y protocolo de toma de muestras....................................18 4.5- Calidad microbiológica de salmueras: Tratamiento de las muestras...19 5. Resultados…………….……………………………………………………….. 21 5.1- Control de salmueras……………………………………………………...21 5.2- Calidad microbiológica de salmueras……………………………………26 5.2-1 Desinfección con ácido peracético………………………………………26 5.2-2Desinfección con ácido peracético e hipoclorito de sodio en distintas concentraciones……………………………………………………….29 5.2-3Desarrollo microbiano con 300 ml de cloro y 300 ml de ácido………..34 5.2-4Desarrollo microbiano con 750 ml de cloro y 400 ml de ácido………..36 6. Discusión………………………………………………………………………..38 7. Conclusión.…………………………………………………………………...... 41 8. Bibliografía…………………..…………………………………………………..42 1 1- Introducción La fabricación de queso es una actividad muy antigua. Se cree que este producto tiene su origen en la costumbre mediterránea de llevar la leche en odres hechos con las pieles de animales o con estómagos y vejigas. La elaboración de queso se mantuvo como una actividad artesanal hasta la aplicación de bases científicas a principios del siglo XX, permitiendo su fabricación a gran escala. Hoy en día las variedades de queso más populares se elaboran industrialmente y el queso es un producto de exportación importante en las economías de los principales países productores como Francia, Australia y Nueva Zelanda. A lo largo de los años, se ha desarrollado un número casi increíble de variedades distintas de queso, pero en algunos casos las diferencias son muy pequeñas y residen solamente en la forma o tipo de envasado. No obstante, todas las variedades de queso comparten una tecnología básica común, en la que generalmente los cultivos fermentadores compuestos por bacterias lácticas desempeñan un papel fundamental (Varnam y Sutherland, 1994). Durante la maduración los quesos se colocan en estanterías de madera para que adquieran características organolépticas deseadas, y es en este período en el que pueden aparecer ciertos defectos en la corteza o en el interior de los quesos, con las consecuentes pérdidas económicas. Algunos de los defectos encontrados son corteza gruesa, dura, porosa, gomosa y pegajosa, alteración de color, manchas blanquecinas y negras, grietas en superficie, hinchazón precoz, etc., (Reinherner y Salazar, 2006) y muchas veces, el origen de estos defectos puede ser la contaminación con bacterias, hongos y/o levaduras, debido al envejecimiento bacteriológico de la salmuera utilizada originando una sobrecarga de la microflora halófila y tolerante a la sal que va poblando y reproduciéndose en la salmuera. Las salmueras son soluciones concentradas de sal común, cloruro de sodio, en agua y deben controlarse y corregirse frecuentemente con la aplicación de desinfectantes como hipoclorito de sodio o ácido peracético (Zamboni, 1994). La importancia del salado es realzar el sabor del queso, controlar 2 microorganismos contaminantes, terminar de extraer el suero remanente y contribuir a la formación de su corteza (Battro, 2010). La presente tesis permitirá conocer y analizar la evolución de la calidad microbiológica de las salmueras de una quesería en estudio y la forma más eficiente de mantenerlas y/o controlarlas dentro de los parámetros de calidad adecuados. 3 2- Objetivos Objetivo general Analizar la evolución de la calidad y el control de las salmueras de una quesería de Tandil. Objetivos específicos Analizar la calidad microbiológica y físico-química de salmueras en una quesería de Tandil. Comparar la eficiencia como desinfectantes de salmueras entre ácido peracético e hipocloritode sodio. 4 3- Marco teórico 3.1- Queso: Características generales El queso es el producto fresco o madurado que se obtiene por separación parcial del suero de la leche o leche reconstituida (entera, parcial o totalmente descremada) o de sueros lácteos, coagulados por la acción física, del cuajo, de enzimas específicas, de bacterias específicas, de ácidos orgánicos, solos o combinados, todos de calidad apta para uso alimentario; con o sin el agregado de sustancias alimenticias y/o especias y/o condimentos, aditivos específicamente indicados, sustancias aromatizantes y materiales colorantes (CAA, Cap. 8, Art 605). Los quesos son una forma de conservación de los componentes insolubles de la leche: la caseína y la materia grasa; se obtienen por coagulación de la leche seguida del desuerado, en donde el lactosuero se separa de la cuajada. El lactosuero contiene la mayor parte del agua y de los componentes solubles de la leche, quedando una pequeña fracción en la cuajada (Alais, 1970). 3.2- Etapas esenciales de la elaboración de quesos La tecnología básica de fabricación es similar para todas las variedades de queso, pero cambios relativamente pequeños en las condiciones de elaboración dan lugar a importantes diferencias en el queso final. La tecnología está bien establecida pero en los últimos años ha experimentado una gran sofisticación y automatización (Varnam y Sutherland, 1994). A continuación se describen las principales etapas de fabricación: • Recepción de la leche: Una vez recibida la leche se almacena en tanque con agitación y frío (5 º c). • Filtrado: El objetivo es eliminar impurezas visibles (pastos, pelos, etc.) que acompañan a la leche pero por más purificada que sea no elimina los microorganismos. Antes de llenar el tanque, se coloca un filtro, los cuales deben lavarse y 5 desinfectarse periódicamente ya que si no pueden actuar como contaminantes. Existen varios tipos de filtros: colador metálico, tela de algodón o lino de trama fina, filtro específico para leche. • Homogeneización: Se consigue con una buena agitación mecánica durante un par de minutos. El objetivo es lograr uniformar el tamaño de los glóbulos de grasa para obtener una textura uniforme, evitar pérdida de grasa en el desuerado (lo que aumenta el rendimiento quesero) y mejorar la lipólisis. • Pasteurización: La pasteurización elimina patógenos, mejora el crecimiento del fermento, aumenta el rendimiento quesero.Los tiempos y temperaturas para la pasteurización baja son: en tinas queseras: 63 º C - 30 minutos y en pasteurizador a placas: 72 ºC - 15 segundos. Luego del calentamiento se debe enfriar lo más rápidamente posible para evitar que se produzcan efectos indeseables que se manifiestan luego durante el proceso de coagulación de la leche.Según el tipo de queso enfriar hasta: 38 º C: quesos blandos, 36 º C: quesos semiduros, 32 º C: quesos duros. • Adición de fermentos Lácticos: Los fermentos lácticos son el cultivo de una o más cepas de una o más especies de microorganismos útiles, empleados para inocular un producto natural pasteurizado con el objeto de iniciar una fermentación. Los fermentos lácticos actúan sobre la lactosa de la leche produciendo ácido láctico. El ácido láctico favorece la coagulación durante la elaboración, produciendo compuestos responsables de aromas y sabores característicos durante la maduración (Luluaga y Núñez, 2010). El cultivo iniciador que se agrega depende del tipo de queso que se va a elaborar. Si el queso es de pasta blanda se usan cultivos de acidificación rápida, como el compuesto por Lactococcuslactis, subespecie lactis y subespecie cremoris. Para obtener quesos de pasta dura y firme, se utilizan 6 cultivos con capacidad proteolítica y lenta producción de ácido, como el formado por Lactobacilluscasei y Leuconostoccitrovorum (Hernández, 2003). Los fermentos se pueden añadir a la leche de forma líquida, congelada, liofilizados o deshidratados. Pueden ser naturales (de suero, de leche) y seleccionados (semidirectos, de tina). • Adición de Aditivos: Cloruro de calcio: Su uso permite obtener una cuajada firme y rápida. Nitrato de sodio/ lisozima: Su uso permite controlar la hinchazón producida por bacterias (Luluaga y Núñez, 2010). Coagulación: Consiste en la desnaturalización de las proteínas de la leche y se puede realizar de dos formas: agregando ácidos o enzimas. Algunos factores que afectan la coagulación son la temperatura, el pH, y los contenidos de calcio y fosfato de la leche. La coagulación ácida ocurre por la acumulación de ácido láctico producido por la fermentación; la cuajada que se obtiene es débil. La coagulación enzimática se lleva a cabo por la adición de un conjunto de enzimas, denominado renina o cuajo común, extraído generalmente del estómago de los terneros (Hernández, 2003). • Lirado de la Cuajada: Corte de la cuajada, el tamaño del grano depende del tipo de queso: Quesos de pasta blanda 3-5 cm 2-4cm, quesos de pasta semidura 2 cm 0,8 cm, quesos de pasta dura 1 cm 0,3 cm (Luluaga y Núñez, 2010). Este procedimiento ayuda a eliminar el suero, por el aumento que se logra en la superficie. Otros factores que ayudan a eliminar el suero de la cuajada, son el aumento de la temperatura y la agitación. El calentamiento debe ser lento, 1 ºC cada dos o tres minutos y la agitación debe ser a una temperatura suficientemente alta para impedir que los granos estén en contacto, pero no tanto como para que se rompan. • Moldeo y Prensado: 7 El moldeo tiene como finalidad dar forma al queso y ayudar a que los gránulos de cuajada se aglomeren, los moldes pueden ser redondos, cuadrados, cilíndricos o alargados (Hernández, 2003). El prensado se realiza para eliminar el exceso de suero, compactar el queso para lograr una masa cerrada y lograr su forma.Las características del prensado dependen del tipo de queso, el prensado suave (por gravedad) se aplica a quesos blandos de alto contenido en humedad y tiempo de vida corto y el prensado fuerte (prensa hidráulica o neumática) se aplica a quesos duros de bajo contenido en humedad y tiempo de vida largo (Luluaga y Núñez, 2010). • Salado: El salado de los quesos tiene diferentes funciones: proporcionar sabor al producto, evitar la proliferación de microorganismos, ayudar al desuerado y contribuir a la formación de la corteza (Hernández, 2003). Existen diferentes formas de salado: en seco, recubriendo el queso con cloruro de calcio y por inmersión en baño de salmuera. El proceso de salado se trata de un intercambio de fluidos entre el queso y la salmuera circundante. La sal ingresa al queso y este se deshidrata, principalmente la parte exterior del queso y conjuntamente con el agua que fluye hacia la salmuera también salen desde el queso proteínas solubles, lactosa, ácido láctico, minerales y microorganismos del queso. Desde que se introduce un queso dentro de la salmuera comienza a generarse capas desde el exterior y hacia el interior, donde se puede encontrar mayor proporción de sal y menor cantidad de agua en las capas externas (Martínez, 2015). • Maduración Los quesos se colocan en cámara de maduración, el lugar donde suceden los fenómenos físico-químicos y bioquímicos que definirán las características de textura, gusto y presentación del queso. Los parámetros que se deben tener en cuenta son: la temperatura, la humedad y la aireación. Estos parámetros son variables de acuerdo al tipo de queso que se madure. La humedad ambiente 8 varía entre 75 y 95 %, hay que facilitar la ventilación con ventanas, ventiladores. • Pintado de la corteza del queso: Esta técnica consiste en recubrir al queso con ceras o pinturas con el propósito de evitar el desarrollode mohos, bacterias y ácaros indeseables en la corteza del producto (Luluaga y Núñez, 2010). 3.3- Características del salado de quesos en salmuera: Aunque las salmueras aportan una serie de ventajas, presentan algunos problemas menores que hay que controlarlos, como el envejecimiento químico y microbiológico, y el continuo control al que hay que someterlas, por ejemplo: concentración y temperatura, tiempo de permanencia, acidez y pH, control microbiológico y organoléptico(Zamboni, 1994). 1. Concentración y temperatura de las salmueras: El salado en salmuera se realiza en frío a una temperatura igual o inferior a 15º C, en algunas clases de quesos se realiza en caliente durante el desuerado. El tiempo de permanencia de los quesos en salmuera depende fundamentalmente, del tipo, del formato y del tamaño de los quesos, y puede variar de unas pocas horas hasta 48 horas o más (Alais, 1985). La concentración salina se debe controlar mediante el uso dedensímetros especiales, llamados pesasal, que no son más que una escala expresada en grados baumé (ºBé) y que dan directamente la cantidad de sal expresada en 100 litros de salmuera, las concentraciones más utilizadas para el salado son entre el 18 y 22 ºBé (Zamboni, 1994). A continuación se detallan estos valores: Tabla 1: Tabla de valores para preparar una salmuera (Centro de Investigaciones Tecnológicas de la Industria Láctea,s/d). % de sal deseada Kg. de sal por 100 litros de agua Densidad ºBé g/ml 13,6 15,6 13,2 1,10 9 16,2 19,8 15,6 1,12 18,8 23,1 17,8 1,14 21,2 26,9 20,0 1,16 22,4 29,0 21,1 1,17 23,7 31,1 22,1 1,18 2. Acidez y pH: La acidezde la salmuera debe ser igual a la acidez del queso, por lo tanto su pH debe ser de aproximadamente 5-5,4 y se puede controlar mediante una valoración acido-base con hidróxido de sodio. Si la salmuera presenta poca acidez, se extrae demasiado ácido láctico de los quesos, por el contrario si presenta una alta acidez o mucho más elevada que la del queso, se altera la composición y textura del queso por lo cual se dificulta el normal salado de los mismos (Zamboni, 1994).La acidez de una salmuera nueva es de 6 a 8 º D; a medida que se utiliza va a ir aumentando hasta llegar a un máximo recomendado de 30 º D para quesos duros, 40 º D para quesos de pasta semidura o 50 º D para quesos de pasta blanda (Castañeda et al., 2005). 3. Envejecimiento químico: El envejecimiento químico se produce por descenso de la concentración de cloruro de sodio (NaCl) y aumento de la concentración de los componentes del suero, esto se puede controlar con frecuentes adiciones de sal para elevar la densidad, además de una neutralización y un filtrado. 4. Envejecimiento y control microbiológico: A pesar de la alta concentración de sal algunas bacterias, hongos y levaduras, que provienen del ambiente, de los quesos, del agua, de la sal, etcétera (etc.), pueden persistir y desarrollarse en la salmuera, lo que implica la necesidad de mantenerlas bajo control. Esto se puede llevar a cabo con la filtración para separar depósitos que se acumulan en la superficie, así como también 10 realizando análisis de rutina para determinar el contenido de aerobios totales (mesófilos), coliformes, hongos y levaduras (Zamboni, 1994). Los límites microbiológicos deben ser establecidos por cada empresa en particular, sin embargo una buena recomendación es mantener las salmueras por debajo de 50.000 ufc/ml de aerobios totales, menos de 500 ufc/ml de coliformes y menos de 1000 levaduras/ml de salmuera (Martínez, 2015). Además se puede controlar mediante la utilización de desinfectantes químicos como agua oxigenada (2-3 ml / 10 litros de salmuera), hipoclorito de sodio (5 ml /10 litros de salmuera) y ácido peracético (Luluaga y Núñez, 2010). El grado de salado de los quesos en salmuera depende del tipo de masa, de la temperatura de la salmuera, de su concentración, del tiempo de salado, del tamaño y de la forma del queso. Como norma general, los quesos blandos se salan más rápidamente que los quesos duros, también cuando más alta sea la temperatura de la salmuera o su concentración, más rápido es el salado, además cuando más tiempo permanezca el queso en inmersión, mayor será el grado de salado que posee. Con respecto a la forma del queso, hay que tener en cuenta la superficie específica, es decir, cuanta superficie tiene para determinado volumen o peso del queso, y su forma. La forma que presenta una menor superficie por unidad de volumen es la esfera y las formas de mayor superficie específica son las de los quesos planos (Battro, 2010). 3.4 - Defectos de los quesos: Los defectos que se pueden generar en los quesos son de índole variada, los principales son: Fenómenos de hinchazón Hinchazón precoz:Aparece durante las primeras etapas de la elaboración, como el prensado o salado y consiste en la formación de pequeños ojos en gran cantidad, denominado “mil ojos”. El problema que generalmente afecta a quesos blandos, tiene su origen por bacterias coliformes o levaduras provenientes de la leche de elaboración, ya sea leche no pasteurizada, mal 11 pasteurizada o contaminaciones con leche cruda. Además también puede producirse contaminación por la utilización de fermentos de desarrollo muy lento, donde no produce a tiempo la acidez necesaria para bloquear el desarrollo de estos microorganismos antes mencionados. Hinchazón tardía:Este defecto es propio de quesos de largo periodo de maduración, principalmente quesos duros y consiste en la aparición de grietas grandes, a veces huecos, con olores desagradables, en algunos casos puede reventarse la horma. La causa de este problema es la germinación de esporos de clostridios con producción de ácido butírico y anhídrido carbónico. Cabe mencionar que esto ocurre cuando el recuento de bacterias esporuladas en leche cruda es superior a 200 por litro, generalmente se da cuando el ganado lechero fue alimentado con forrajes ensilados. Defectos en la masa Arricotado: Este defecto es típico de los quesos blandos, y consiste en la obtención de una pasta similar a ricota, que no sufre ningún cambio por efecto de la temperatura. Se presenta cuando hay un excesivo desarrollo de acidez antes de que el queso ingrese a la salmuera, es decir un pH inferior a 4,9-5,0, lo que produce un desorden en la estructura de la caseína de la leche, las submicelas se encuentran aisladas, se pierde calcio y se genera un queso con pérdida de humedad en los primeros días y se torna duro posteriormente. También se puede producir por la utilización de un fermento demasiado rápido, que no detiene su acción por inmersión del queso en salmuera fría, o por el empleo de bacterias mesófilas en épocas de verano. Ausencia de ojos:Durante la maduración de ciertos quesos pueden aparecer la presencia de dos tipos de ojos: ojos dulces en quesos suaves como el Gouda o pategrás y ojos picantes en quesos tipo suizo como el gruyere o Emmental. Los ojos dulces son ocasionados por bacterias heterofermentativas con producción de anhídrido carbónico, etanol, ácido acético y láctico; la ausencia 12 de estos ojos, puede deberse al uso de leche con baja carga o inexistente de bacterias heterofermentativas,pasteurización a temperaturas elevadas, empleo excesivo de nitratos en leche o demasiada acidez que inhibe el desarrollo de esas bacterias. En el caso de ojos picantes, son producidos por bacterias propiónicas con formación de anhídrido carbónico, acetato y propionato; la ausencia de los ojos puede ser consecuencia de la poca disponibilidad de lactato, que es su sustrato específico. En estos quesos se puede producir grietas o rasgaduras, originadas por la presión ejercida por el anhídrido carbónico en casos de pasta muy dura. Defectos en salado Cuando el queso permanece más tiempo que el correspondiente al tipo de queso en la salmuera, se forma una capa de color blanquecino muy salada, que impide que actúen las enzimas presentes en el queso con lo cual quedan partes sin madurar. De esta forma se obtiene una zona seca, quebradiza, dura y muy salada. Otro defecto originado en el salado es, cuando la salmuera no se encuentra saturada, y la concentración de sal baja, aparece sobre la superficie del queso, una capa de consistencia gomosa, que es debida a la proteólisis ocasionada por las levaduras que pudieron desarrollarse en ausencia de una concentración de sal elevada. A su vez, la baja concentración salina puede permitir el desarrollo de bacterias termófilas propias de fermentos, que causan coloración rosada en la superficie de quesos duros, principalmente. Defectos de sabor Durante la maduración, se forman compuestos responsables del sabor amargo de los quesos, como péptidos de bajo peso molecular, aminas, amidas, cetonas y aminoácidos. Existe un balance entre las velocidades de formación y desaparición por degradación a péptidos de menor peso molecular u otros compuestos no amargos. El problema se refleja cuando la velocidad de 13 formación de estos compuestos es superior a la de su desaparición, esto puede ser causado por utilizar leches mantenidas en frío por un largo tiempo, ya que la elevada carga de bacterias psicrótrofas proteolíticas, produce el desbalance mencionado. Además del sabor amargo que puede aparecer en los quesos; por acción de lipasas provenientes de bacterias psicrótrofas, se forman ácidos grasos libres, que en elevado número, causan el enranciamiento de los quesos durante la maduración. Defectos de superficie Presencia de manchas blanquecinas y gomosas en la superficie:Este defecto que se genera principalmente en quesos duros, ocasiona zonas blanquecinas que exudan un líquido pegajoso en la superficie de los mismos, frecuentemente se manifiestan después del primer mes de maduración. La causa del problema es la utilización de leche que proviene de animales con mastitis, debido a esto, el aumento en el número de células somáticas, la presencia de gérmenes que no proviene de la leche y el desequilibrio entre las proteínas de suero y las caseínas dan origen a este defecto. Desarrollo de hongos en la superficie: Este defecto se produce por diversos tipos de microorganismos que se desarrollan en la superficie del queso en la sala de maduración. Principalmente, los hongos son quienes causan este defecto, pudiendo controlarlo, mediante limpieza de los quesos o recurrir al pintado con sustancias antifúngicas. Acaro del queso: Este defecto aparece en la sala de maduración, se trata de un arácnido pequeño, que roe la cáscara de los quesos duros y maduros, penetrando al interior dejando un agujero y generando un polvillo muy sutil, que cae sobre los estantes. El polvillo, hace que el queso pierda valor comercial (Reinherner y Salazar, 2006). 14 3.5- Desinfectantes más utilizados en queserías para mantenimiento de salmueras: Ácido peracético: El ácido peracético, también llamado peróxido de ácido acético o ácido peroxiacético es otro agente sanitizante que se ha utilizado con bastante éxito, sobre todo en los Estados Unidos. Se obtiene por la reacción del ácido acético o anhídrido acético con el peróxido de hidrógeno. Su eficiencia es similar o superior a la del hipoclorito de sodio, pero más potente que el peróxido de hidrógeno. Se trata de un excelente sanitizante por la gran capacidad de oxidación de los componentes celulares de los microorganismos, teniendo una rápida acción a bajas concentraciones sobre un amplio espectro de microorganismos (Srebernich, 2007). El ácido peracético (PAA) (CH3COOOH) se considera un biocida más potente que el peróxido de hidrógeno, siendo esporicida, bactericida, virucida y fungicida a bajas concentraciones (<0,3%). El PAA desnaturaliza probablemente las proteínas y las enzimas y aumenta la permeabilidad de la pared celular al interrumpir los enlaces sulfhidrilo (SH) y azufre (SS), (McDonnell y Russell, 1999).Su acción biocida es influenciada por la concentración, temperatura y tipo de microorganismos (Srebernich, 2007). El PAA se descompone en subproductos seguros (ácido acético y oxígeno), pero tiene las ventajas añadidas de estar libre de descomposición por las peroxidasas, a diferencia del H2O2, y permanecer activo en presencia de cargas orgánicas. Su aplicación principal es como un esterilizador líquido a baja temperatura para dispositivos médicos, telescopios flexibles y hemodializadores, pero también se utiliza como esterilizante superficial medioambiental (McDonnell y Russell, 1999). 15 Compuestos clorados (Hipoclorito de sodio): El cloro, es uno de los desinfectantes más eficaces y más utilizados. Se presenta en varias formas, como por ejemplo: las soluciones de hipoclorito sódico, las cloraminas y otros compuestos orgánicos que contienen cloro. También se utilizan el cloro gaseoso y el dióxido de cloro. El efecto del desinfectante disminuye considerablemente en presencia de residuos orgánicos. Los compuestos disueltos en agua producirán ácido hipocloroso, HOCI, que es el agente esterilizante activo y actúa por oxidación. En solución es muy inestable, en particular en solución ácida porque libera gas de cloro tóxico. La actividad germicida es considerablemente mejor en solución ácida que en alcalina (Huss, 1997). La eficacia antimicrobiana del hipoclorito de sodio, basado en su alto pH (acción de iones hidroxilo), es similar al mecanismo de acción del hidróxido de calcio. El alto pH del hipoclorito de sodio interfiere en la integridad de la membrana citoplasmática con una inhibición enzimática irreversible, alteraciones biosintéticas en el metabolismo celular y degradación de fosfolípidos observadas en la peroxidación lipídica (Estrela C. et al, 2002). Peróxido de hidrógeno: El peróxido de hidrógeno (H2O2) es un biocida ampliamente utilizado para la desinfección, la esterilización y la antisepsia. Es un líquido transparente, incoloro, que está comercialmente disponible en una variedad de concentraciones que van desde 3 % a 90%. El H2O2 se considera respetuoso con el medio ambiente, ya que puede degradarse rápidamente en los productos inocuos de agua y oxígeno (McDonnell y Russell, 1999). Es un compuesto endotérmico, de modo que es inestable y un oxidante bastante energético. El peróxido de hidrogeno se comporta en solución acuosa como un ácido débil.Por el hecho de ser un oxidante se usa para decolorar 16 compuestos orgánicos, para blanquear plumas, cabellos, marfil, seda y paja. Además, se emplea como antiséptico, debido a que una enzima que existe en la sangre llamada catalasa descompone al peróxido de hidrogeno produciendo oxigeno atómico (Beguet, 1979). H2O2 demuestra una eficacia de amplio espectro contra virus, bacterias, levaduras y esporas bacterianas. En general, se observa una mayor actividad frente a bacterias gram-positivas que gram-negativas; Sin embargo, la presencia de catalasa u otras peroxidasas en estos organismos puede aumentar la tolerancia en presencia de concentraciones más bajas. Se requierenmayores concentraciones de H2O2 (10 % a 30%) y mayores tiempos de contacto para la actividad esporicida, aunque esta actividad se incrementa significativamente en la fase gaseosa. H2O2 actúa como un oxidante mediante la producción de radicales libres hidroxilo (OH) que atacan los componentes celulares esenciales, incluidos los lípidos, proteínas y ADN (McDonnell y Russell, 1999). 17 4- Materiales y métodos El trabajo se realizó en una fábrica de quesos y dulce de leche artesanales, en la cual se procesan cerca de 50 mil litros semanales, de los cuales el 90% es para elaboración de quesos y el 10% para el dulce de leche. Los tipos de quesos que se elaboran en la fábrica son: pasta blanda (Port salut), pasta semidura (Gouda, Original, Holanda, Pionero), pasta dura (Romano, Pepato, Brindamour), pasta hilada (Mozzarella y Parrillero), quesos de oveja (Manchego, Pecorino). La mayor producción de quesos es de semiduros ocupando casi el 80 % de toda la elaboración, seguido de los quesos duros y en menor medida los quesos blandos. El saladero cuenta con 11 piletas, 9 de ellas con una capacidad de 1.500 litros y 2 de 600 litros. Se seleccionaron 4 piletas, 3 de 1500 l (P1, P3 y P4) y 1 de 600 l (P2). Sobre las mismas se realizaron controles físico-químicos y microbiológicos. 4.1- Control de salmueras en planta Se realizaron controles físico-químicos diariamente, por un período de 10 días. Los mismos se detallan a continuación: A) pH-temperatura: Con la utilización de un pHmetro (método potenciométrico), se tomaron ambos parámetros, observando el visor del mismo hasta que el número en pantalla permanezca sin variación. B)Densidad de la salmuera: Con la utilización de un pesasal, se tomó la densidad de las salmueras de cada una de las piletas analizadas, observando el nivel que marcaba la salmuera en el instrumento C) Acidez: Mediante una titulación con hidróxido de sodio, se determinó la acidez de las salmueras. Para ello se tomaron 10 ml de la solución, se agregaron 3 gotas de indicador de fenolftaleína y luego se realizó la titulación agregando el hidróxido de sodio, gota a gota hasta viraje a color rosado. Luego se registró la cantidad de hidróxido consumido y el valor en grados Dornic 18 obtenido. Cabe mencionar que el cambio de color debe permanecer por unos segundos. 4.2- Características comerciales de los productos utilizados Los productos químicos que se utilizaron para la evaluación de la calidad microbiológica y físico-química de las salmueras son de uso alimenticio para industrias. El ácido peracético se utilizó en una concentración del 5% de ácido activo, mientras que el hipoclorito de sodio utilizado es a granel. Como se mencionó anteriormente, la dosis de hipoclorito de sodio máxima utilizada fue consultada en bibliografía, 5 ml /10 litros de salmuera (Luluaga y Núñez, 2010) o lo que es lo mismo, 500 ml cada 1000 litros de salmuera (Battro, 2010). En cambio la dosis del ácido peracético fue consultada por asesoramiento técnico del instituto nacional de tecnología industrial (INTI). 4.3- Toma de muestras Se procesaron 22 muestras de salmueras que se transportaron refrigeradas hasta su procesamiento en el Laboratorio de Calidad de Leche del Departamento de Tecnología y Calidad de los Alimentos (FCV-UNCPBA). Se tomaron aprox. 125 ml de salmuera de cada pileta, en condiciones de esterilidad. Las muestras fueron procesadas dentro de las 24h. 4.4- Desinfección y protocolo de toma de muestras Aplicación de ácido peracético: A las piletas P1, P2, P3 y P4 se les adicionó ácido peracético. El desinfectante se agregó en las siguientes proporciones: 200 ml a las piletas de 1500 l (P1- P3- P4) y 100 ml a la de 600 l (P2). De cada una de las piletas se tomaron 3 muestras, la primera antes del agregado del desinfectante y las otras a las 24 h y 72 h de realizada la desinfección. 19 Estudio comparativo de la aplicación de ácido peracético e hipoclorito de sodio Aplicación de hipoclorito de sodio: • A la pileta P1, se le adicionaron 300 ml de hipoclorito de sodio y se reforzó a las 72 h con el agregado de 750 ml de hipoclorito de sodio. Se tomaron 5 muestras, la primera antes del agregado del desinfectante, a las 24 h, a las 72 h, a las 96 h y 144 h de realizada la desinfección. Aplicación de ácido peracético: • A la pileta P3, se le adicionaron 300 ml de ácido peracético y se reforzó a las 72 h con el agregado de 400 ml del ácido. Se tomaron 5 muestras: antes del agregado del desinfectante, a las 24 h, a las 72 h, a las 96 h y 144 h de realizada la desinfección. 4.5- Calidad microbiológica de salmueras: Tratamientos de las muestras Los controles microbiológicos se realizaron siguiendo normas de International Dairy Federation(FIL) para Mesófilos: ISO 4833-1:2013, para Coliformes: ISO 4832:2006 y para el recuento de mohos y levaduras: Norma IDF 94B:1990. A las muestras recolectadas previamente se les realizaron las siguientes determinaciones: • Recuento de aerobios mesófilos totales (Plate Count Ágar, periodo de incubación de 48-72h) • Recuento de coliformes (Ágar Violeta Rojo Bilis, periodo de incubación de 48-72h). • Recuento de hongos y levaduras (Yeats Glucose Cloranfenicol, periodo de incubación de 3-5 días). Las diluciones correspondientes se realizaron con agua peptonada 0.01% según norma ISO 707: 2008 /FIL 50:2008. 20 Para la siembra de las muestras recolectadas se utilizaron los medios de cultivopreviamente indicados. Recuento de aerobios mesófilos totales: Se realizó la siembra en profundidad con el medio Plate Count Ágar, para ello se tomó 1 ml de la dilución correspondiente y se colocó en placa de Petri.Luego se agregó 15 ml del Ágar y se homogeneizó completamente, se dejó solidificar el medio, se invirtieron las placas y se llevaron a incubar a estufa durante 48 h a 37 º C. Recuento de coliformes totales: Se realizó el mismo procedimiento que en el caso anterior, es decir siembra en profundidad, con 1 ml de cada dilución, y luego se agregó Ágar VRB. Por último se llevó a incubar a estufa durante 48 h a 30º C. Recuento de hongos y levaduras: La siembra se efectuó de la misma manera que en los casos anteriores, se agregó 15 ml de Ágar Yeats Glucose Cloranfenicol, se mezcló y dejó solidificar, luego se invirtieron todas las placas y se llevaron a incubar durante 3-5 díasa 30 º C. Una vez cumplido el tiempo de incubación de cada siembra, se realizó el conteo de colonias. 21 5- Resultados 5.1- Control de salmueras: Los parámetros físicos-químicos y los valores de conformidad que utiliza la fábrica para el control de las salmueras son: Densidad: 18º-21º Baumé, pH: 4,9-5,4, temperatura ≤ a 15 º C y acidez: 25º-35º Dornic. Generalmente cuando el pH es más alto la corrección se realiza con ácido láctico (150 ml para bajar 1,5 puntos aprox.), y si es más bajo con soda cáustica. En el caso de la densidad, cuando los valores de conformidad son inferiores a lo considerado aceptable por la empresa, secorrige con el agregado de sal. En el caso de los parámetros microbiológicos, la empresa no cuenta con límites determinados, sin embargo, para realizar este trabajo se tomaron como referencia los siguientes valores: mesófilos menos de 50000ufc/ml, coliformes menos de 500 ufc/ml y hongos y levaduras menos de 1000 ufc/ml (Martínez, 2015). Grafico 1. Cantidad de quesos (kg) que hubo en las piletas 1, 2,3 y 4 los 10 días de análisis. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 k il o s d e q u e s o s Dias de analisis pileta 1 pileta 2 pileta 3 pileta 4 22 pH La variación de los valores de pH de las salmueras analizadas se muestra en el gráfico 2 Gráfico 2-Variación del pH de 4 piletasde salmueras de una quesería Los promedios de pH obtenidos de los muestreos realizados a las piletas 1, 2, 3 y 4 fueron de 5,00; 4,89; 4,91; 5,02 respectivamente. El valor máximo se observó en la pileta 4 y fue de 5,09. El valor mínimo se observó en la pileta 2 y fue de 4,81.Este valor se encuentra fuera del rango considerado aceptable por la fábrica, los días 7 y 8 del análisis, yfue de 4,81. Esta pileta es la que presentamayorconcentración de desinfectante y tuvo adición de quesos continua por 5 días y mayores variaciones de densidad. Temperatura La variación de los valores de temperatura de las salmueras analizadas se muestra en el gráfico 3 4.5 4.6 4.7 4.8 4.9 5 5.1 5.2 5.3 5.4 5.5 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 Dia 8 Dia 9 Dia 10 p H Tiempo (dias) Evolucion del pH de las salmueras P1 P2 P3 P4 23 Gráfico 3-Variación de temperatura de 4 piletas de salmueras de una quesería Los promedios de temperaturaobtenidos de los muestreos realizados a las piletas 1, 2, 3 y 4, fueron de 12,56; 12,79; 12,27; 12,26, respectivamente. El valor máximo se observó en la pileta 4 y fue de 13,8º C, y el valor mínimo se observó en la pileta 3 y fue de 11,6º C. No se observaron valores fuera del rango considerado aceptable por la fábrica. Cuando se colocan los quesos en la salmuera, la temperatura de ésta, aumenta, es lo que se refleja en el grafico anterior cuando los valores de temperatura se alejan de su valor promedio, como en el caso de las piletas 1,3 y 4, los días 3, 5 y 7 del análisis. LaPileta 2 fue la que tuvo menor variación en el rango de temperatura, a diferencia del resto de las piletas donde se observó una mayor variación. Densidad La variación de los valores de densidad de las salmueras analizadas se muestra en el gráfico 4 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 Dia 8 Dia 9 Dia 10 T e m p e ra tu ra ( ºC ) Tíempo (dias) Evolucion de temperatura de las salmueras P1 P2 P3 P4 24 Gráfico 4-Variación de densidad de 4 piletas de salmueras de una quesería Los promedios de densidad obtenidos a partir de los muestreos realizados a las piletas 1, 2, 3 y 4 fueron de 18,2; 18,3; 18,5; 18,7 respectivamente. Durante los días que se realizó la desinfección, no se observó una variación considerable en la densidad de las piletas. El valor más alto observado fue de 19º B, que se presentó en todas las piletas. El valor mínimo se observó en las piletas 1 y 2, este valor se encuentra fuera del rango considerado aceptable por la fábrica, los días 4 y 6 del análisis, y fue de 17º Baumé. Considerando la densidad de las salmueras, se observan las principales variaciones en relación a los kilos de queso adicionados principalmente cuando se agregan quesos diariamente sin períodos de descanso de las salmueras, como es en el caso de la pileta 1 y 2. Acidez La variación de los valores de acidez de las salmueras analizadas se muestra en el gráfico 5 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 4 Dia 5 Dia 6 Dia 7 Dia 8 Dia 9 Dia 10 D e n s id a d ( º B ) Tiempo (dias) Evolucion de densidad de las salmueras P1 P2 P3 P4 25 Gráfico 5-Variación de acidez de 4 piletas de salmueras de una quesería Los promedios de acidez obtenidos de los muestreos realizados a laspiletas 1, 2, 3 y 4, fueron de 25,25º D; 32,87º D; 27,37º D; 24,87º Drespectivamente. El valor máximo se observó en la pileta 2 y fue de 35º D y el valor mínimo se observó en las piletas 1 y 4, y fue de 24º D, este valor se encuentra fuera del rango considerado aceptable por la fábrica, que se repitió todos los días del análisis. Al igual que en el caso anterior con la temperatura, en la pileta número 2 de mayor concentración, hubo un mayor promedio de acidez que en el resto de las piletas. Además esta pileta fue la que obtuvo el menor valor de pH, en cambio, la pileta número 1 y 4 tuvieron el mayor valor de pH, esto demuestra que la relación que existe entre el pH y la acidez, es inversamente proporcional. 15 17.5 20 22.5 25 27.5 30 32.5 35 37.5 40 42.5 45 47.5 50 Dia 1 Dia 2 Dia 4 Dia 6 Dia 7 Dia 8 Dia 9 Dia 10 A c id e z ( º D ) Tiempo (dias) Evolucion de acidez de las salmueras P1 P2 P3 P4 26 5.2- Calidad microbiológica de salmueras 5.2-1 Desinfección con ácido peracético Los resultados de la utilización de ácido peracético para el control del desarrollo de microorganismos mesófilos se muestran en el grafico 5. Gráfico 6. Evolución del recuento de mesófilos en salmuera tratada con ácido peracético antes y después de su aplicación El gráfico anterior muestra el recuento de mesófilos de las piletas 1, 2, 3, 4, antes de la desinfección (0 h), 24 h después de la desinfección con 200 ml de ácido peracético y 100 ml (pileta 2), y a las 72 h de la desinfección. Pileta 1: el valor de origen antes de la desinfección con 200 ml dio un recuento de 460000 ufc/ml, el descenso a las 24 h fue de un logaritmo (13400 ufc/ml), a las 72 h el recuento volvió a aumentar y fue de 154000 ufc/ml. Pileta 2:el valor de origen antes de la desinfección con 100 ml dio un recuento de 470000 ufc/ml, el descenso a las 24 h fue también de un logaritmo (21960 ufc/ml), a las 72 h fue a 1490000 ufc/ml. 1.00E+00 1.00E+01 1.00E+02 1.00E+03 1.00E+04 1.00E+05 1.00E+06 1.00E+07 0 24 72 R E C U E N T O D E M E S Ó F IL O S ( U F C /M L ) TIEMPO (H) Desinfección con ácido peracético P1 200 ml P2 100 ml P3 200 ml P4 200 ml 27 Pileta 3:el valor de origen antes de la desinfección con 200 ml dio un recuento de 145000 ufc/ml, el descenso a las 24 h fue de dos logaritmo (9800 ufc/ml), a las 72 h fue a 49000 ufc/ml. Pileta 4:el valor de origen antes de la desinfección con 200 ml dio un recuento de 139000 ufc/ml, el descenso a las 24 h fue de un logaritmo (37200 ufc/ml), a las 72 h fue a 127000 ufc/ml. A las 24 h de la aplicación del ácido peracético, se puede observar una notable disminución en el desarrollo de mesófilos, mientras que a las 72 h, se ve un aumento en el número, en todas las piletas, sin embargo hubo diferencias en algunas de ellas:En el caso de la pileta nº 2, se observa un aumento mayor. Los resultados de la utilización de ácido peracético para el control del desarrollo de microorganismos coliformes se muestran en elgráfico 6. Gráfico 7. Evolución del Recuento de coliformes en salmuera tratada con ácido peracético El gráfico anterior muestra el recuento de coliformes de las piletas 1, 2, 3 y 4 antes de la desinfección (0 h), 24 h después de la desinfección con 200 ml de ácido peracético y 100 ml (pileta 2), y a las 72 h de la desinfección. 0 50 100 150 200 250 300 350 400 0 24 72 R E C U E N T O D E C O L IF O R M E S (U F C /M L ) TIEMPO (H) Desinfección con ácido peracético P1 200 ml P2 100 ml P3 200 ml P4 200 ml 28 El valor de origen en el recuento de coliformes antes de la desinfección es muy similar para todas las piletas: 260, 30, 20 y 390 ufc/ml para la 1, 2, 3 y 4 respectivamente. A las 24 h de la aplicación del ácido peracético, se puede observar, que no hay desarrollo de coliformes en ninguna de las piletas; sin embargo, a las 72 h, en las piletas 3 y 4 si hubo crecimiento.En la pileta 3, el valor fue de 7 ufc/ml, y en la pileta 4 fue de 57 ufc/ml. Los resultados de la utilización de ácido peracético para el control del desarrollo de hongos y levaduras se muestran en el grafico 7. Gráfico 8.Evolución del Recuento de hongos y levaduras en salmuera tratada con ácido peracético El gráfico anterior muestra el recuento de hongos y levaduras de las piletas 1, 2, 3 y 4, antes de la desinfección (0 h), 24 h después de la desinfección con 200 ml deácido peracético y 100 ml (pileta 2), y a las 72 h de la desinfección. A las 24 h de la aplicación del ácido peracético, el desarrollo de levaduras disminuyó en todas las piletas.Desde un valor de origen de 43000 ufc/ml, 4500 ufc/ml, 35000 ufc/ml, 2600 ufc/ml en las piletas 1, 2, 3 y 4 respectivamente, 1.00E+00 1.00E+01 1.00E+02 1.00E+03 1.00E+04 1.00E+05 0 24 72 R E C U E N T O D E H O N G O S Y L E V A D U R A S ( U F C /M L ) TIEMPO (H) Desinfección con ácido peracético P1 200 ml P2 100 ml P3 200 ml P4 200 ml 29 pasaron a un recuento de 16000 ufc/ml para la pileta 1, 4300 ufc/ml para la pileta 2, 6200 ufc/ml para la pileta 3 y 700 ufc/ml para la pileta 4. Mientras que a las 72 h de la desinfección,los valores en el recuento de levaduras, permanecen por debajo de los valores iniciales en las piletas 1 y 3 (2900 ufc/ml y 1600 ufc/ml respectivamente), no ocurre lo mismo en las piletas 2 y 4,donde los valores superan incluso el recuento inicial, siendo de 6700 ufc/ml en la pileta 2 y 3600 ufc/ml en la pileta 4. En la pileta 2 se observó menor efectividad en la reducción del desarrollo de hongos y levaduras. Probablemente esto se deba a que esta pileta sufrió una adición constante de quesos, pH bajo, acidez y temperatura elevada; y densidad baja. 5.2-2 Desinfección con ácido peracético e hipoclorito de sodio en distintas concentraciones Los resultados de la utilización de hipoclorito de sodiovs ácido peracéticopara el control del desarrollo de microorganismos mesófilos se muestran en el grafico 9 y 10, respectivamente. Gráfico 9- Evolución del recuento de mesófilos en salmueras desinfectadas con hipoclorito de sodio (P1). 1.00E+00 1.00E+01 1.00E+02 1.00E+03 1.00E+04 1.00E+05 1.00E+06 0 24 72 96 144 R E C U E N T O D E M E S Ó F IL O S (U F C /M L ) TIEMPO (H) Desinfección con cloro 30 El gráfico anterior muestra el recuento de mesófilos de la piletas 1, antes de la desinfección (0 h), 24 h y 72 h después de la desinfección con 300 ml de cloro, así como también muestra la segunda desinfección realizada a las 72 h con 750 ml cloro y el recuento de mesófilos a las 96 h y 144 h de la misma. A las 24 h de la desinfección con 300 ml de cloro, se observa una disminución en el desarrollo de mesófilos en relación al valor inicial (155.000 ufc/ml), a 55.000 ufc/ml. A las 72 h de la desinfección el recuento de mesófilos incrementó a 111.000 ufc/ml. 24 h después de la segunda desinfección con 750 ml de cloro, el recuento disminuyó a 1.940 ufc/ml, mientras que a las 144 h, el desarrollo de mesófilos fue de 9.500 ufc/ml. A las 72 h y 144 h de la desinfección con cloro, hubo aumento en el desarrollo de mesófilos, sin embargo, en la segunda desinfección (mayor dosis), el aumento fue menor. Gráfico 10- Evolución del recuento de mesófilos en salmueras desinfectadas conácidoperacético (P3). El gráfico anterior muestra el recuento de mesófilos de la pileta 3, antes de la desinfección (0 h), 24 h y 72 h después de la desinfección con 300 ml de ácido peracético, así como también muestra la segunda desinfección realizada a las 1.00E+00 1.00E+01 1.00E+02 1.00E+03 1.00E+04 1.00E+05 1.00E+06 0 24 72 96 144 R E C U E N T O D E M E S Ó F IL O S (U F C /M L ) TIEMPO (H) Desinfección con ácido peracético 31 72 h, con 400 ml de ácido y el recuento de mesófilos a las 96 h y 144 h de la misma. Antes de la desinfección con 300 ml de ácido el recuento de mesófilos fue de 242.000 ufc/ml, a las 24 h de la desinfección se redujo a 51.000 ufc/ml. A las 72 h el recuento de mesófilos aumento a 55.000 ufc/ml. A las 96 h, el recuento se redujo a 2.710 ufc/ml, mientras que a las 144 h, el desarrollo de mesófilos fue de 38.000 ufc/ml.La segunda desinfección (mayor dosis) fue más efectiva, ya que el aumento fue menor. Si nos ponemos a analizar en conjunto el efecto de los desinfectantes, podemos decir que durante la desinfección con 300 ml de cloro y ácido peracético, a las 24 h de la misma, el ácido peracético tuvo mayor efectividad sobre el desarrollo de mesófilos, que el cloro, ya que redujo en mayor medida el recuento. Sin embargo el número de mesófilos que se desarrollaron durante este periodo, permaneció por encima del límite considerado como máximo para la fábrica (50.000 ufc/ml) con ambos desinfectantes. La aplicación de los desinfectantes fue más efectiva cuando se realizó el aumento en la dosis de los desinfectantes, a 400 ml para el ácido y 750 ml para el cloro, fue ya que el número de unidades formadoras de colonias desarrolladas luego de dichas desinfecciones, se mantuvo dentro del límite considerado como máximo para la fábrica. Aunque con ambos desinfectantes, el desarrollo de mesófilos fue menor a 50.000 ufc/ml (límite máximo), el recuento de mesófilos después de la desinfección con 750 ml de cloro fue menor que en el caso de la desinfección con 400 ml de ácido. Evolución del recuento de coliformes en salmueras v desinfectadas con ácido peracético e hipoclorito de sodio. La utilización de ácido peracéticovs hipoclorito de sodio para el control del desarrollo de microorganismos coliformes se realizaron de la misma manera que en el caso anterior y siguiendo el mismo procedimiento. Es decir, dos 32 desinfecciones, la primera con 300 ml de ácido y 300 ml de cloro y la segunda con 400 ml de ácido y 750 ml de cloro. Los resultados observados fueron que no hubo desarrollo en ninguna de las dos piletas en ningún momento. Por lo tanto, la dosis de cloro y acido utilizada durante la primer desinfección fue lo suficientemente efectiva como para evitar el desarrollo de coliformes. Los resultados de la utilización de hipoclorito de sodiovs ácido peracéticopara el control del desarrollo de hongos y levaduras se muestran en el grafico 11 y 12. Gráfico 11- Evolución del Recuento de hongos y levaduras en salmueras desinfectadas con hipoclorito de sodio (P1). El gráfico anterior muestra el recuento de hongos y levaduras de la piletas 1 antes de la desinfección (0 h), 24 h y 72 h después de la desinfección con 300 ml de cloro. A su vez muestra la segunda desinfección con 750 ml de cloro realizado a las 72 h y el recuento de hongos y levaduras a las 96 h y 144 h de la misma. En la pileta 1 a las 24 h de su desinfección con 300 ml de cloro, se observa una disminución en el desarrollo de hongos y levaduras en relación al valor inicial 1.00E+00 1.00E+01 1.00E+02 1.00E+03 1.00E+04 1.00E+05 0 24 72 96 144 R E C U E N T O D E H O N G O S Y L E V A D U R A S ( U F C /M L ) TIEMPO (H) Desinfección con cloro 33 (9.100 ufc/ml), a 2.000 ufc/ml. A las 72 h de la desinfección incrementó a 6.800 ufc/ml. A las 96 h, el recuento bajo a 11 ufc/ml, mientras que a las 144 h, 72 h luego de dicha desinfección, el desarrollo de hongos y levaduras fue de 420 ufc/ml. A las 72 h y 144 h de la desinfección con cloro, hubo aumento en el desarrollo de mesófilos, sin embargo, en la segunda desinfección (mayor dosis), el aumento fue menor. Gráfico 12- Evolución del Recuento de hongos y levaduras en salmueras desinfectadas con ácido peracético (P3). El gráfico anterior muestra el recuento de hongos y levaduras de las pileta 3, antes de la desinfección (0 h), 24 h y 72 h después de la desinfección con 300 ml de ácido peracético. A su vez muestra la segunda desinfección con 400 ml de ácidorealizada a las 72 h y el recuento de coliformes a las 96 h y 144 h de la misma. Antes de la desinfección con 300 ml de ácidoel valor de originen fue de 41.000ufc/ml, a las 24 h de la desinfección se redujo a 2.180 ufc/ml. A las 72 h el recuento de hongos y levaduras aumento a 10.700 ufc/ml. A las 96 h, es decir 24 h después de la segunda desinfección con 400ml de ácido, el recuento bajo a 185ufc/ml, mientras que a las 144 h, 72 h luego de dicha desinfección, el desarrollo de hongos y levaduras fue de 1.000 ufc/ml. 1.00E+00 1.00E+01 1.00E+02 1.00E+03 1.00E+04 1.00E+05 0 24 72 96 144 R E C U E N T O D E H O N G O S Y L E V A D U R A S ( U F C /M L ) TIEMPO (H) Desinfección con ácido peracético 34 Analizando el efecto de ambos desinfectantes se puede ver que el ácido peracético durante la primera desinfección a las 24 h de la misma, tuvo mayor efectividad sobre el desarrollo de hongos y levaduras que el cloro en la misma concentración (300 ml). Aun así, el número de hongos y levaduras que se desarrollaron durante este periodo, permaneció por encima del límite considerado como máximo para la fábrica (1.000 ufc/ml) con ambos desinfectantes. Durante la segunda desinfección, con el aumento en la dosis de los desinfectantes, como se dio en el caso de los mesófilos, el número de unidades formadoras de colonias desarrolladas se mantuvo dentro del límite considerado como máximo para la fábrica con los dos tipos de desinfectantes utilizados. Aunque con ambos desinfectantes, el desarrollo de mesófilos fue menor a 1.000 ufc/ml, el recuento de hongos y levaduras después de la desinfección con 750 ml de cloro fue menor que en el caso de la desinfección con 400 ml de ácido. 5.2-3 Desarrollo microbiano con 300 ml de cloro y 300 ml de ácido. Gráfico 13- Efecto de ladesinfección con 300 ml de cloro sobre el desarrollo microbiano. 0 25000 50000 75000 100000 125000 150000 175000 200000 225000 250000 0 h 24 h 72 h U F C /M L TIEMPO (H) Desarrollo microbiano con 300 ml de cloro mesofilos coliformes levaduras 35 Gráfico 14- Efecto de ladesinfección con 300 ml de ácido sobre el desarrollo microbiano. En los gráficos 13 y 14 se muestra el efecto de la utilización de cloro y acido respectivamente sobre el desarrollo de mesófilos, coliformes y hongos y levaduras, durante la primera aplicación. El desarrollo de aerobios mesófilos con la utilización de 300 ml de desinfectante demostró, que si bien a las 24 h ambos redujeron el número inicial de mesófilos hasta valores similares, el ácido peracético fue más efectivo que el cloro, ya que partió de 242000 ufc/ml en relación a las 155000 ufc/ml que partió con el cloro. También, a las 72 h de la desinfección el ácido demostró ser más eficaz, teniendo en cuenta que el desarrollo de mesófilos fue de111000 ufc/ml con el cloro y 55000ufc/ml con el ácido. La dosis de 300ml aplicada a ambas piletas, de cualquiera de los 2 desinfectantes demostró ser efectiva para el control de microorganismos coliformes. En cuanto al desarrollo de levaduras y hongos, fue menor con la aplicación de cloro que con el ácido peracético utilizado. 0 25000 50000 75000 100000 125000 150000 175000 200000 225000 250000 0 h 24 h 72 h U F C /M L TIEMPO (H) Desarrollo microbiano con 300 ml de ácido mesofilos coliformes levaduras 36 5.2-4 Desarrollo microbiano con 750 ml de cloro y 400 ml de ácido. Gráfico 15- Efecto de ladesinfección con 750 ml de cloro sobre el desarrollo microbiano. Gráfico 16- Efecto de ladesinfección con 400 ml de ácido sobre el desarrollo microbiano. 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 0 h 24 h 72 h U F C /M L TIEMPO (H) Desarrollo microbiano con 750 ml de cloro mesofilos coliformes levaduras 0 20000 40000 60000 80000 100000 120000 0 h 24 h 72 h U F C /M L TIEMPO (H) Desarrollo microbiano con 400 ml de ácido mesofilos coliformes levaduras 37 En los gráficos 15 y 16 se muestra el efecto de la utilización de cloro y acido respectivamente sobre el desarrollo de mesófilos, coliformes y hongos y levaduras, durante el aumento de la dosis de ambos desinfectantes. El desarrollo de aerobios mesófilos con el aumento de la dosis de los desinfectantes, fue menor con el cloro, tanto a las 24 h de la aplicación como a las 72 h, aunque, la dosis del cloro agregada fue mayor que la del ácido peracético. En el caso de los coliformes, el aumento de la dosis no influyó, ya que no se observó ningún tipo de desarrollo en ninguna de las piletas, como en el caso anterior. El desarrollo de levaduras y hongos, aunque los valores no tuvieron gran diferencia con un desinfectante y el otro, fue menor con la aplicación de cloro que con el ácido peracético utilizado, igual que antes del aumento de la dosis de los desinfectantes. 38 6- Discusión Sería necesario y útil que se establezcan límites para estos grupos de microorganismos presentes en las salmueras, que aseguren la inocuidad del producto, ya que la información disponible,además de ser escasa, no tiene respaldo científico que demuestre que al superarlos, generen problemas de inocuidad. En la bibliografía consultada sobre la concentración y el tipo de desinfectantes a utilizar,no se tiene en cuenta factores tales como, la frecuencia con lacual realizar la desinfección, la cantidad de kilos de quesos que poseen las salmueras, la carga inicial de microorganismos que posee al desinfectar, etc. Debido a la falta de información, fue necesario determinar la dosis de desinfeccióndel ácido peracético y la frecuencia de aplicación de ambos desinfectantes para mantener el desarrollo de microorganismos dentro de los límites establecidos. A partir de ellos, surge la necesidad de conocer si existe riesgo de que los residuos de los desinfectantes afecten a los quesos. En cuanto a los parámetros físico-químicos evaluados, la información disponible es mayor. El aumento de la temperatura en la salmuera de 5 a 20°C aumenta tanto la tasa de difusión como la cantidad de sal absorbida. Este aumento en parte se debe a un aumento en el ancho de los poros de la matriz proteica (Soto Cartes, 2013). En comparación con la evaluación realizada, si bien hubo aumento de temperatura en algunos casos como por ejemplo en la pileta 4, no fue de tanta magnitud como para que se genere uno de estos problemas. La tasa de absorción de sal en el queso es también influenciada por la relación entre el volumen de salmuera y la cantidad de quesos. Se demostró con un modelo matemático que la absorción de la sal fue más lenta cuando había gran cantidad de queso en la salmuera. En este estudio, se llegó a la conclusión, de que el volumen de salmuera debe ser cinco veces o mayor el volumen del queso para asegurar que la absorción de la sal no se vea afectada por la cantidad de quesos en la salmuera (Soto Cartes, 2013). La cantidad de quesos que poseía la pileta número 1 en los días 1 y 2 de la evaluación, supero más de 39 cinco veces el volumen de salmuera que en nuestro caso era de 1500 lt. Sin embargo, la absorción de sal no se vio influenciada por este hecho. Los distintos defectos de los quesos que se manifiestan durante la maduración de los mismos, en algunos casos se ven influenciados por el desarrollo excesivo de microorganismos contaminantes que se encuentran en las salmueras. Durante el trabajo de investigación realizado, a pesar de que el crecimiento de microorganismos que alteran los quesos es significativo a comienzos de la evaluación, no se encuentra relación directa con el defecto de los quesos que luego aparecieron en el madurado. Los mismos defectos que se hicieron presentes durante la evaluación con los desinfectantes, también se presentaron en igual medida antes de comenzar con el mantenimiento de las salmueras. El problema que puedan tener los quesos radica en muchos factores y por eso es importante que cada empresaláctea cuente con manuales de calidad, procedimientos de limpieza y desinfección, capacitaciones e implementación de BPM. A partir de los datos y resultados obtenidos en la presente tesis, se intentó disminuiresas controversias, estableciendo un procedimiento estándar para el mantenimiento de las piletas de salmueras, con el fin de garantizar una vida útil prolongada evitando una posible alteración y/o contaminación de los quesos. Cabe mencionar que también la falta de información bibliográfica sobre desinfección de salmueras, hace importante poder definir este procedimiento. Los puntos a tener en cuenta son: • Preparar la solución de sal y agua (salmuera) según corresponda: la densidad debe ser de aproximadamente 18-20 º baumé, por lo que es necesario agregar entre 20 y 25 kg de sal cada 100 lt de agua. Para corregir el contenido salino, se irá incorporando bolsas de sal de medio kilo hasta llegar al grado deseado. • Agitar bien la salmuera • Antes de colocar los quesos es necesario la desinfección. Se puede utilizar hipoclorito de sodio o ácido peracético, para ello es aconsejable 40 el uso de guantes, barbijo y gafas, evitando el contacto directo con la piel, mucosas y ojos. • Se preparan las soluciones en una jarra con mediciones y se agrega a la pileta distribuyendo homogéneamente por toda la salmuera. La dosis utilizada depende del volumen de salmuera que presente la pileta, se podría recomendar una dosis de 750 ml de hipoclorito de sodio cada 1500 lt de salmuera, dos veces por semana o cada 72 h, o 400 ml de ácido peracético cada 1500 lt de salmuera, dos veces por semana. Para realizar este procedimiento las piletas no deben tener quesos al momento de la desinfección. • Una vez desinfectada cada pileta se deberá agitar bien. • Medir densidad y pH de las salmueras, utilizando el pesa-sal y el pHmetro, respectivamente. Si el valor de pH no se encuentra dentro del rango deseado (4,9-5,4), se puede corregir utilizando ácido láctico si es alto y soda caustica si es bajo. • Colocar los quesos que se retiran de las prensas en las piletas correspondientes. • Medir densidad y pH de las salmueras nuevamente y llevar registros de cada pileta. • Una o dos veces por día realizar volteo de quesos, esta acción evita que se reseque la cara expuesta hacia la superficie. • Retirar los quesos de las piletas para su oreo. • Antes de recomenzar el procedimiento, se debe agitar las piletas que están vacías, para evitar que la sal e impurezas se depositen en el fondo, así como también para asegurarse que el valor de densidad medido sea correcto y no agregar sal innecesariamente. • Cada 6 meses se deberá retirar el 50 % del volumen de la salmuera de cada pileta y volver a renovar la solución. • Renovar 1 vez por año la totalidad del agua de salmuera de cada pileta, previamente desinfectar la pileta con cloro. • Cada vez que se renueve parte del agua o su totalidad se debe ajustar el contenido salino y tomar densidad y pH de la solución. 41 7- Conclusiones • Tomando en cuenta los resultados observados y los recuentos aceptables según el límite establecido en planta puede concluirse que una dosis inicial de cloro o ácido peracético no logran cumplir el objetivo buscado. Sin embargo, el aumento en la dosis de ambos desinfectantes, logró la reducción del desarrollo de mesófilos y hongos y levaduras por debajo del límite establecido. Es de destacar que con la primera dosis no se observa desarrollo de los microorganismos coliformes. • La respuesta al tratamiento de desinfección fue diferente para los 3 grupos microbianos en estudio, resultando más sensible los microorganismos coliformes. • Al analizar la eficiencia de los desinfectantes se deberían considerar diferentes factores en forma conjunta, no solo los resultados obtenidos al analizar los recuentos microbiológicos de las diversas muestras, sino también los parámetros físico-químicos analizados (pH, densidad, temperatura, acidez), los kilos de quesos de cada pileta y su reposición. • A partir de los datos y resultados obtenidos en la presente tesis, se intentó disminuir esas controversias,estableciendo un procedimiento estándar para el mantenimiento de las piletas de salmueras, con el fin de garantizar una vida útil prolongada evitando una posible alteración y/o contaminación de los quesos. Cabe mencionar que también la falta de información bibliográfica sobre desinfección de salmueras, hace importante poder definir este procedimiento. 42 Bibliografía impresa: Alais C. (1985). Ciencia de la leche: Principios de técnica lechera, pp478 y 711. Reverté S. A., Barcelona, España. Battro P. (2010). Quesos artesanales: Historia- Descripción- Elaboración, pp 88-91. Albatros, Buenos Aires, Argentina. BeguetA. (1979). Merceologia Primera Parte. Cap. 6: Agua Oxigenada, pp 178- 182. Talleres Gráficos Didot S.A, Buenos Aires, Argentina. Castañeda et al. (2005).Manual para la eficiencia productiva de la pyme quesera: Mantenimiento de la salmuera, pp 8. Instituto nacional de tecnología industrial,Buenos aires, Argentina. Hernández A. (2003). Microbiología industrial: Los productos lácteos, pp 76-78. Editorial Universidad Estatal a Distancia, Costa rica. Instituto nacional de tecnología industrial. Centro de investigaciones tecnológicas de la industria láctea. Diapositiva 46 de 79. 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