Practica 3. Aislamiento de Leucitos y Neutrofilos Humanos

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E.P de Ingeniería Biotecnológica	 UCSM		Inmunología Básica
PRACTICA N° 3
AISLAMIENTO Y CULTIVO DE LINFOCITOS Y NEUTRÓFILOS HUMANOS
I. OBJETIVOS
· Aislar linfocitos y neutrófilos humanos utilizando dextrano y una gradiente de densidad con ficoll–hypaque
· Cultivar linfocitos y neutrófilos humanos en medio de cultivo RPMI – 1640 o DMEM
II. INTRODUCCIÓN
La densidad de una célula es la principal característica física que es usada para la purificación y separación de poblaciones celulares por medio de centrifugación isopicnica. La densidad refleja la composición química promedio de una célula más que su tamaño o alguna característica de su superficie. Los principales componentes celulares difieren sustancialmente en sus densidades. Sin embargo, ya que muchas células tienen similares proporciones de estos componentes, el rango de densidad de las células es relativamente estrecho. La separación es conseguida simplemente por centrifugación de una célula con la suficiente fuerza centrífuga y por un periodo de tiempo suficiente para que alcance su densidad isopicnica en la gradiente, que se define como la localización en la gradiente donde la densidad de la célula es la misma que la densidad de la gradiente.
Este método es simple y rápido y toma ventajas de las diferencias de densidad entre las células mononucleares, polimorfonucleares y otras células encontradas en la sangre. Primero las células son sedimentadas en dextrano y luego hay una separación diferencial en una gradiente de densidad discontinua de HISTOPAQUE - 1077. En el dextrano los eritrocitos forman roulex y de este modo sedimentan más rápidamente que los granulocitos En el ficoll–hypaque las células mononucleares y plaquetas son colectadas en la parte superior de la capa de, debido a que estas células tienen una baja densidad. En contraste los granulocitos (neutrófilos) tienen una densidad mayor que el HISTOPAQUE - 1077 y son colectados en la parte inferior de la capa HISTOPAQUE - 1077 las plaquetas son separadas de las células mononucleares por subsecuentes pasos de lavados y centrifugación.
Figura 1.- Centrifugación En Gradiente De Densidad De Ficoll – Hypaque
III. REACTIVOS Y MATERIALES
Materiales 
· Tubos de centrifuga de 15ml (Falcón)
· Centrífuga
· Micropipetas
· Tubos eppendoffs
· Hemocitometro
Reactivos 
· HISTOPAQUE - 1077
· dextrano 
· medio de cultivo RPMI – 1640 o DMEM
· PBS
· Sangre con anticoagulante (EDTA )
· Azul de trypan
· NaCl 1,8 %
IV. PROCEDIMIENTO
A. Obtención de la Sangre
 1. Colectar 20 ml de sangre en tubos de vidrio con anticoagulante (EDTA)
 2. Mezclar bien la sangre con el anticoagulante.
B. Sedimentación en dextrano
1. Añadir 2.5 ml de dextrano al 10% por cada 20 ml de sangre
2. Mezclar suavemente por inversión 10 veces
3. Dejar sedimentar durante ~40 minutos en posición vertical 
4. Recuperar la capa superior (sobrenadante) y colocarla sobre el HISTOPAQUE-1077, La relación HISTOPAQUE -1077/ sobrenadante debe ser 1:2.
C. Preparación de la gradiente de densidad con HISTOPAQUE - 1077
1. Colocar 5 ml de HISTOPAQUE - 1077 en un tubo de falcon
2. Colocar lentamente 10 ml del sobrenadante obtenido en la etapa anterior, sobre el ficoll–hypaque evitando la mezcla de ambas soluciones
D. Separación de las células
1. Centrifugar a 2000 rpm durante 20 min (200 C )
2. Retirar los tubos de la centrífuga lentamente evitando mezclar las fases 
3. Colectar la interfase de leucocitos mononucleares ubicada entre la capa de HISTOPAQUE-1077 y la capa de plasma y transferirla a un nuevo tubo falcon
4. Luego colectar el precipitado, conteniendo los neutrófilos, ubicado por debajo de la capa de HISTOPAQUE - 1077 y transferirlo a un nuevo tubo falcon.
5. Agregar 10 ml de PBS.
6. Centrifugar a 2000 rpm durante 4 min (Si el pellet está contaminado realizar un shock osmótico).
7. Eliminar el sobrenadante y Resuspender el precipitado celular en 1-2 ml de medio de cultivo completo (RPMI – 1640) con suero humano AB+ AL 10 %, penicilina 100 u / ml, estreptomicina 100 g / ml
8. Contar las células y determinar la viabilidad celular por el método de azul de trypan.
· Shock osmótico: Agregar um volumem de água destilada a las células mezclar por pipeteo, no más de 28segundos y luego agregar un volumen igual de NaCl 1,8 %.
E. Cultivo primario de linfocitos y neutrófilos
1. Colocar 3 x 106 células (1 x 106 células 1 cm2) en placas de cultivo de 60 mm. de diámetro con 4 ml de medio de cultivo completo 
2. Incubar las células a 370 C con 5 % de CO2 95 % de humedad.
V. RESULTADOS
1. Esquematice el procedimiento de aislamiento y cultivo de linfocitos y neutrófilos humanos.
2. Determinar la viabilidad y el número de linfocitos y neutrófilos humanos obtenidos por mililitros.
	Cuadrantes
	Teñidas de azul/no viables
	No teñidas/viables
	Total
	1
	1
	60
	61
	3
	4
	46
	50
	7
	7
	57
	64
	9
	9
	36
	45
	Total
	21
	199
	220
VI. CUESTIONARIO
1. Indique el fundamento del aislamiento de linfocitos y neutrófilos humanos con ficoll–hypaque.
Ficoll-Paque es un medio en gradiente de densidad comúnmente usado para aislar células mononucleares provenientes de sangre periférica humana, utilizando un procedimiento de centrifugación basado en el método desarrollado por Bøyum. La separación de las células de sangre periférica humana normal generalmente se obtienen: 
• 60 ± 20% de recuperación de las células mononucleares presentes en la muestra de sangre original 
• 95 ± 5% de células mononucleares 
•> 90% de viabilidad de las mononucleares 
•> 90% de viabilidad de las celdas se celdas separadas 
• Máximo 5% paradas 
• Máximo 5% de granulocitos, parte inmediata superior a los eritrocitos 
• Máximo 10% trocitos 
• Máximo 10% de eritrocitos, parte baja del tubo. 
Los linfocitos, monocitos y plaquetas no son lo suficientemente densos para penetrar en las capas del medio de FicollPaque. Estas células, por lo tanto, se reúnen como una banda concentrada en la interfase de la muestra. Esta banda permite aislar las células mononucleares para ser recuperadas con un alto rendimiento en un pequeño volumen.
2. ¿Qué características físicas de las células de la sangre permiten la distribución de las células de la sangre en distintas capas?
De todas las propiedades físicas de las células que podrían usarse para distinguir y separar las células de interés, la densidad celular (la relación masa-volumen de una célula) es quizás la más poderosa, puesto que, la variabilidad intrínseca de la densidad de célula a célula es generalmente mucho menor que la de la masa o el volumen.
3. ¿Qué es una gradiente de densidad?
Columna de líquido de densidad concreta que se utiliza en la separación de diferentes tipos de células por centrifugación. Las células van progresando por el gradiente hasta que alcanzan el nivel en que su gravedad específica, es la misma que la del medio.
4. Indique los tipos de linfocitos que se encuentran en la sangre
Los dos tipos de linfocitos son los linfocitos B y los linfocitos T. Los linfocitos B elaboran anticuerpos y los linfocitos T ayudan a destruir las células tumorales y a controlar las respuestas inmunitarias.
5. ¿Qué es una centrifugación isopícnica?
La centrifugación isopícnica separa las partículas en un gradiente de densidades en función de la densidad de las mismas. Las partículas se mueven en el gradiente hasta que llegan a un punto donde la densidad de éstas y la del gradiente son idénticas.
6. Indique ¿qué otros medios de densidad se pueden utilizar para la separación de linfocitos?
· Remoción de leucocitos de la sangre.
· Sedimentación isopícnica.
· Ensayo de RAPD para confirmar la remoción de leucocitos.
· Filtración a través de diferentes matrices.
7. Indique cual es la composición del medio de Cultivo RPMI-1640 y DMEM e indique la importancia de sus componentes
· Medio de Cultivo RPMI - 1640
El medio RPMI 1640 contiene biotina, vitamina B12 y PABA, que no se encuentran en el medio esencial mínimo de Eagle o en el medio de Eagle modificadopor Dulbecco. Además, las vitaminas inositol y colina están presentes en concentraciones muy altas. El medio RPMI 1640 no contiene proteínas, lípidos o factores de crecimiento; Por lo tanto, requieren suplementación, comúnmente con 10% de suero bovino fetal (FBS). El medio RPMI 1640 utiliza un sistema tampón de bicarbonato sódico (2,0 g / L) y, por lo tanto, requiere un entorno de 5 - 10% de CO2 para mantener el pH fisiológico. Las formas en polvo de los medios de cultivo celular Gibco requieren la administración de suplementos de bicarbonato de sodio, ajuste del pH y filtración en el momento de la preparación.
· Medio de Cultivo DMEM
DMEM es único en su tipo y DMEM es único en su tipo y difiere de otros medios difiere de otros medios en que contiene 4 veces más en que contiene 4 veces más de aminoácidos y vitaminas que el Medio mínimo esencial de Eagles. DMEM fue originalmente formulado con bajo contenido en glucosa (LG) (1 g/L) y piruvato de sodio, pero también es usado con altas concentraciones de glucosa (HG) (4.5 g/L) con o sin piruvato de sodio. La adición de glucosa ha mostrado ser útil para el cultivo de otras líneas celulares que incluyen cultivos primarios de células de ratón, y pollo. DMEM no contiene proteínas, lípidos o factores de crecimiento. Por esta razón, DMEM requiere de suplementos, habitualmente con 10 % de suero fetal bovino. Además, como contiene bicarbonato de sodio (3.6 g/L) requiere atmósferas con 5 – 10% CO2 para mantener el pH fisiológico.
8. ¿Por qué se utiliza CO2 en el cultivo de células animales o humanas? ¿Cuál es su función? ¿Qué buffer se puede emplear en vez del CO2?
La mayoría de las líneas celulares crecen adecuadamente a pH 7,4. El pH del medio está íntimamente relacionado con la concentración de CO2. Esto se debe a que el CO2 juega un papel fundamental en el sistema tampón natural CO2 /HCO3-. Este sistema permite mantener el pH del medio dentro del intervalo fisiológico mediante la siguiente serie de reacciones en equilibrio:
Dado que el metabolismo celular tiende a acidificar el medio, el aumento de la concentración de hidrogeniones desplaza el equilibrio de la ecuación hacia la izquierda, causando el consumo de bicarbonato disponible. Si la concentración de bicarbonato no es suficiente para contrarrestar el efecto del aumento de la concentración de hidrogeniones, el pH del medio disminuirá por debajo del requerido para el crecimiento o mantenimiento celular causando su muerte. Por el contrario, si se trata de un sistema abierto y hay suficiente bicarbonato, el medio se tornará alcalino, dado que el CO2 formado se perderá a la atmósfera y el metabolismo celular no será suficiente para contrarrestar la concentración de bicarbonato. Es por esto que, para mantener el pH en el rango adecuado para el crecimiento celular, los cultivos celulares deben disponer de concentraciones de CO2 disuelto y bicarbonato determinadas que permitan al sistema tampón poder amortiguar los cambios.