Informe sobre espectrofotometrìa

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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ
La mayoría de complejos son coloreados; es decir, poseen la propiedad de absorber determinadas longitudes de onda de la región visible del espectro. Estas absorciones suelen extenderse, casi siempre, en las regiones vecinas del infrarrojo cercano y el ultravioleta próximo ; por ello, la expresión “espectro de absorción visible“ se interpreta, frecuentemente, incluyendo las absorciones en todas estas regiones adyacentes del espectro.
La atención dispensada, en los últimos años, a la química de los complejos de metales de transición, ha coincidido con el desarrollo de las teorías que interpretan estas propiedade4s y que se asocian con los compuestos de metales que tienen capas d incompletas. Tales teorías han surgido, en primer lugar, para explicar la coloración y propiedades magnéticas de los complejos; tales propiedades son, además, el mejor punto de partida para demostrar las características más delicadas de estas mismas teorías, en relación con un amplio conjunto de compuestos de metales de transición de propiedades marcadamente diferentes. En consecuencia se conocen los espectros de absorción visible de gran cantidad de sustancias y la medida del mencionado espectro se considera como parte esencial de la caracterización de cualquier nuevo compuesto.
La absorción en esta región puede originarse a partir de una gran variedad de mecanismos, teniendo todos ellos en común, la excitación de un electrón de un nivel energético a un segundo nivel, el cual tiene una energía superior al primero. Estos procesos de excitación difieren unos de otros solo en la manera de describir y clasificar sus niveles energéticos, iníciales y finales; como consecuencia, las fronteras entre las distintas categorías de excitación electrónicas son muy imprecisas. En cuanto concierne a complejos de metales de transición, la absorción en el espectro visible se origina cuando un electrón es excitado entre dos niveles energéticos que son, ambos, orbitales d del átomo metálico. 
Cada sustancia tiene un determinado punto de luz monocromática sonde se produce la mayor cantidad de excitación y por lo tanto se produce la mayor absorción de la luz que incide sobre ella. La curva que nos muestra la variación de absorbancia en función de diferentes longitudes de inda, es conocida como espectro de absorción y el pico mas alto representa la longitud de onda de máxima absorción u optima. 
SEGÚN WIKIPEDIA, LA ENCICLOPEDIA LIBRE NOS SEÑALA 
Un espectrofotómetro es un instrumento usado en la física óptica que sirve para medir, en función de la longitud de onda, la relación entre valores de una misma magnitud fotométrica relativos a dos haces de radiaciones. También es utilizado en los laboratorios de química para la cuantificación de sustancias y microorganismos.
Hay varios tipos de espectrofotómetros, puede ser de absorción atómica o espectrofotómetro de masa.
Este instrumento tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al operador realizar dos funciones:
1. Dar información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra
2. Indicar indirectamente que cantidad de la sustancia que nos interesa está presente en la muestra
SEGUN LA UNIVERSIDAD TECNOLOGICA NOS SEÑALA QUE :
La espectrofotometría es el método de análisis óptico mas usado en las investigaciones biológicas. El espectrofotómetro es un instrumento que permite comparar la radiación absorbida o trasmitida por una solución que contiene una cantidad desconocida se soluto, y una que contiene una cantidad conocida de la misma sustancia todas las sustancias pueden absorber energía radiante, aun en el vidrio que puede ser trasparente absorbe longitud de ondas que pertenece al espectro visible; el agua absorbe fuertemente en la región del infrarrojo.
¿Qué es un espectro fotómetro?
Un espectrofotómetro es un instrumento que tiene la capacidad de manejar un haz de Radiación Electromagnética (REM), comúnmente denominado Luz, separándolo en facilitar la identificación, calificación y cuantificación de su energía. Su eficiencia, resolución, sensibilidad y rango espectral, dependerán de las variables de diseño y de la selección de los componentes ópticos que lo conforman. Cuando la luz atraviesa una sustancia, parte de la energía es absorbida.
El color de las sustancias se debe a que estas absorben ciertas longitudes de onda de la luz blanca que incide sobre ellas, y sólo vemos aquellas longitudes de onda que no fueron absorbidas.
Componentes de un espectrofotómetro
1.-Fuente de luz
La misma ilumina la muestra. Debe cumplir con las condiciones de estabilidad, direccionabilidad, distribución de energía espectral continua y larga vida. Las fuentes empleadas son lámpara de tungsteno y lámpara de arco de xenón.
2 Monocromador 
Para obtener luz monocromática, constituido por las rendijas de entrada y salida, colimadores y el elemento de dispersión. El monocromador aísla las radiaciones de longitud de onda deseada que inciden o se reflejan desde el conjunto.
3 Foto detectores 
En los instrumentos modernos se encuentra una serie de 16 foto detectores para percibir la señal en forma simultánea en 16 longitudes de onda, cubriendo el espectro visible. Esto reduce el tiempo de medida, y minimiza las partes móvil del equipo.
Cubetas de espectofotometría. En un primer plano, dos de cuarzo aptas para el trabajo con luz ultravioleta; en segundo plano, de plástico, para colorimetría (es decir, empleando luz visible).
Stephen Westland, 2001.
Los espectrofotómetros de reflectancia miden la cantidad proporcional de luz reflejada por una superficie como una función de las longitudes de onda para producir un espectro de reflectancia. El espectro de reflectancia de una muestra se puede usar, junto con la función del observador estándar CIE y la distribución relativa de energía espectral de un iluminante para calcular los valores triestímulos CIE XYZ para esa muestra bajo ese iluminante.
El funcionamiento de un espectrofotómetro consiste básicamente en iluminar la muestra con luz blanca y calcular la cantidad de luz que refleja dicha muestra en una serie de intervalos de longitudes de onda. Lo más usual es que los datos se recojan en 31 intérvalos de longitudes de onda (los cortes van de 400 nm, 410 nm, 420 nm… 700 nm). Esto se consigue haciendo pasar la luz a través de un dispositivo monocromático que fracciona la luz en distintos intérvalos de longitudes de onda. El instrumento se calibra con una muestra o loseta blanca cuya reflectancia en cada segmento de longitudes de onda se conoce en comparación con una superficie de reflexión difusa perfecta.
La reflectancia de una muestra se expresa como una fracción entre 0 y 1, o como un porcentaje entre 0 y 100. Es importante darse cuenta de que los valores de reflectancia obtenidos son valores relativos y, para muestras no fluorescentes, son independientes de la calidad y cantidad de la luz usada para iluminar la muestra. Así, aunque los factores de reflectancia se midan usando una fuente de luz concreta, es perfectamente correcto calcular los valores colorimétricos para cualquier iluminante conocido.
Esquema de espectrofotómetro
Consta de los elementos que se ven en la figura y que describimos a continuación:
UTILIDAD
· Los espectrofotómetros son útiles debido a la relación de la intensidad del color en una muestra y su relación a la cantidad de solute dentro de la muestra. Por ejemplo, si usted utiliza una solución del colorante rojo del alimento en agua, y mida la cantidad de luz azul absorbida cuando pasa a través de la solución, una fluctuación mensurable del voltaje puede ser inducido en una fotocélula en el lado opuesto. Si ahora la solución del tinte rojo es diluida por la adición del agua el color será menos intenso. Así, hay una relación entre el voltaje y la cantidad de tinte en la muestra. 
· El espectrofotómetro tiene la capacidad de proyectar un haz de luz monocromática (deuna longitud de onda particular) a través de una muestra y medir la cantidad de luz que es absorbida por dicha muestra. Esto le permite al experimentador realizar dos funciones: 
1. Nos da información sobre la naturaleza de la sustancia en la muestra. Esto podemos lograrlo midiendo la absorbancia (Abs) a distintos largos de onda (l) y graficar estos valores en función del largo de onda, formando un espectrograma. Como cada sustancia tiene unas propiedades espectrales únicas, distintas sustancias producen distintos espectrogramas. Esto se debe a que cada sustancia tiene un arreglo de átomos tridimensional particular que hace que cada sustancia tenga características únicas
· Al ser expuestos a la luz del espectrofotómetro, algunos electrones de los átomos que forman las moléculas absorben energía entrando a un estado alterado. Al recuperar su estado original, la energía absorbida es emitida en forma de fotones. Esa emisión de fotones es distinta para cada sustancia, generando un patrón particular, que varía con el largo de onda usado. Dependiendo del largo de onda, será la cantidad de energía absorbida por una sustancia, lo que logra generar un espectro particular al graficar Abs vs l.
· 2. Nos dice cuanta cantidad de la sustancia que nos interesa está presente en la muestra. La concentración es proporcional a la absorbencia, según la Ley Beer-Lambert: a mayor cantidad de moléculas presentes en la muestra, mayor será la cantidad de energía absorbida por sus electrones.
· Abs = K C L Abs: absorbancia 
· K: coeficiente de extinción molar
· C: concentración
· L: distancia que viaja la luz a través de la muestra. (normalmente es de 1 cm)
· La cubeta promedio, que guarda la muestra, tiene dimensiones internas de un centímetro (L). La ecuación describe una línea recta, donde el origen es cero. Si L es constante (1.0 cm) y se conoce el valor de K, podemos calcular C en base a Abs:
· Abs / K L = C 
· El espectrofotómetro mide la absorbancia de una muestra en los espectros de luz ultravioleta y visible (200 a 850 nm). El largo de onda es determinado por un prisma que descompone el rayo de luz de acuerdo al largo de onda escogido. Luego la luz pasa por una hendidura que determina la intensidad del haz. Este haz atraviesa la muestra y llega a un tubo fotográfico, donde es medido. La cantidad de luz que atraviesa la muestra es el porcentaje (%) de tramitancia. Podemos usar esta unidad o cambiarla a absorbancia usando la siguiente ecuación.
· %T = - Log Abs.
· El espectrofotómetro nos puede dar ambos valores a la misma vez, ahorrando la necesidad de hacer los cálculos. (Tramitancia= cantidad de luz que atravieza la mezcla). 
Una característica del instrumento es la necesidad de “blanquear” el aparato antes de cada lectura. Esto se hace colocando una cuveta con una solución control que tenga todos los componentes de la reacción menos la sustancia que va a ser medida en el instrumento y ajustando la lectura a cero absorbancia. El propósito de esto es eliminar el registro de absorbancia (background) que puedan presentar los demás componentes de la reacción a ese largo de onda particular. Todas las moléculas presentan absorbancia porque todas interfieren con el paso de la luz. Sólo que la absorbancia será óptima a un largo de onda de luz específico para cada tipo de sustancia. 
SEGÚN EL AUTOR SKOOG AND WEST NOS SEÑALA QUE:
Transmitancia
 	 
La figura muestra un haz de radiación paralela antes y después de que ha pasado a través de una capa de solución que tiene un espesor de b cm y una concentración c de una especie absorbente.
Como consecuencia de interacciones entre los fotones y las partículas absorbentes, la potencia del haz es atenuada. La transmitancia T de la solución es entonces la fracción de la radiación incidente trasmitida por la solución. 
T=I/I0
La transmitancia se expresa a menudo como porcentaje:
% T= I/I0 100
Absorbancia
La absorbancia A de una solución se define mediante la ecuación:
A=-log T=I0/I
La mayor parte de los trabajos analíticos se realizan con soluciones de manera que vamos a desarrollarla relación que existe entre la concentración de la solución y su capacidad de absorber radiación 
 
Medición de Transmitancia y Absorbancia
La transmitancia y la absorbancia se miden en un instrumento llamado espectrofotómetro, la solución del analito se debe contener en algún recipiente transparente, tubo o celda.
 
 (
HAS EMERGENTE
)
 (
HAS INCIDENTE
) 
 
Perdida por dispersión de solucion
Pérdidas por reflexión en interfaces
Como se ve en la representación, ocurre reflexión en las interfases: aire-pared, tanto como en la pared-solución. La atenuación del haz resultante es sustancial. Además, la atenuación de un haz puede ocurrir por dispersión de las moléculas grandes y a veces por absorción de las paredes del recipiente
Para compensar estos efectos, la potencia del haz transmitido por la solución del analito es comparada comúnmente con la potencia del haz transmitido por una celda idéntica que contiene solamente solvente. Una absorbancia experimental que se aproxima mucho a la absorbancia verdadera obtención de la ecuacion
A =log I solvente /I solución
Los espectrofotómetros, están a menudo, equipados con un dispositivo que tiene una escala lineal que se extiende de 0 a 100%. De manera de hacer tal instrumento de lectura directa en porcentaje de transmitancia, se efectúan dos ajustes preliminares, llamados 0%T y 100%T. El ajuste del 0%T se lleva a cabo mediante un cierre mecánico del detector.
El ajuste de 100%T se hace con el cierre abierto y el solvente en el camino de la luz.
Normalmente el solvente está contenido en una celda que es casi idéntica a las que contienen las muestras 
Cuando la celda del solvente es reemplazada por la celda que contiene la muestra, la escala da la transmitancia porcentual.
Los instrumentos actuales poseen un sistema electrónico que realiza la operación matemática y da la respuesta directamente absorbancia. También hay que hacer una calibración previa con el solvente o blanco.
Aspectos Cuantitativos de las Mediciones de Absorción
Ley de Beer
Consideremos un bloque de materia absorbente (sólido, líquido o gas). Un haz de radiación monocromática paralelo con intensidad I0 llega al bloque perpendicular a la superficie; luego pasa a través de la longitud b del material, que contiene n partículas absorbentes (átomos, iones o moléculas), la intensidad del haz disminuye a I como resultado de la absorción. Consideremos ahora una sección transversal del bloque que tiene un área S (X x Y) y un espesor infinitesimal dx.
Dentro de esta sección hay dn partículas absorbentes; asociada a cada partícula podemos imaginar una superficie en que ocurrirá la captura del fotón. Esto es, si un fotón alcanza una de esas áreas por casualidad, ocurrirá inmediatamente la absorción. El área total de esas superficies de captura dentro de la sección se designa ds; la relación del área de captura al área total es ds/S.
En un promedio estadístico, esta relación representa la probabilidad para la captura de fotones dentro de la sección.
La intensidad del haz que entra en la sección, Ix es proporcional al número de fotones por cm2 y por segundo, y dIx representa la cantidad removida por segundo dentro de la sección, la fracción absorbida es entonces -dIx/Ix y esta relación también es la probabilidad promedio por captura. El término tiene signo negativo para indicar que la intensidad del haz disminuye.
- =
Recordemos que ds es la suma de las áreas de captura para cada partícula dentro de la sección; puede ser por eso proporcional al número de partículas ds = α dn; siendo dn el número de partículas dentro de la sección y α unaconstante de proporcionalidad, que se puede llamar sección transversal de captura. Considerando las ecuaciones e integrando de 0 a n
 = 
Queda: 
 -ln =
Absortividad y Absortividad Molar
La absorbancia es directamente proporcional a la longitud del camino b a través de la solución y la concentración c de la especie absorbente. Estas relaciones se dan como:
 
 A = a·b·c
Siendo a una constante de proporcionalidad llamada absortividad. La magnitud de a dependerá de las unidades empleadas para b y c. A menudo b es dada en términos de cm y c en gramos por litro, entonces la absortividad tiene unidades de l·g–1·cm
Cuando la concentración se expresa en moles por litro y la longitud de la celda en centímetros, la absortividad se llama absortividad molar, se designa como ε y tiene unidades de l·mol–1·cm–1, entonces la absorbancia es:
 A = ε·b·c
Curva de Calibración
Denominamos espectro de una sustancia a la representación de absorbancia (A) en función de longitud de onda (λ),este gráfico presenta ondulaciones con máximos y mínimos.
Para hacer las determinaciones cuantitativas se elige, en general, la longitud de onda
correspondiente a un máximo, pues el error de medición es mínimo y la sensibilidad
máxima. Para verificar el cumplimiento de la ley de Beer, se debe realizar la curva de calibración; absorbancia (A) en función de concentración (c), para lo cual se preparan soluciones de la sustancia de concentraciones conocidas y se mide la absorbancia a la longitud de onda elegida.
Si es válida la ley de Beer, para esa sustancia a esas concentraciones, la relación debe ser una recta, que pase por el origen de los ejes cartesianos; a menudo se observan desviaciones debidas a diversos factores
 
Aplicaciones de la Ley de Beer a Mezclas
La ley de Beer también se aplica a una solución que contiene más de una clase de sustancia absorbente. Siempre que no haya interacción entre las varias especies, la absorbancia total para un sistema multicomponente está dada por
:
A = A1 + A2 + A3 + ........... + An = ε1 b c1 + ε2 b c2 + ε3 b c3 + ......... + εn b cn
Indicando los subíndices 1,2, .. n, las especies absorbentes.
Limitaciones a la Aplicabilidad de la Ley de Beer
Se encuentran pocas excepciones a la generalización que la absorbancia está relacionada
linealmente a la longitud del camino óptico.
En cambio, las desviaciones de la proporcionalidad directa entre la absorbancia medida y la concentración, para b constante, son más frecuentes.
Estas desviaciones son fundamentales y representan limitaciones reales de la ley.
Algunas ocurren como una consecuencia de la manera en que las mediciones de absorbancia se hacen, o como un resultado de cambios químicos asociados con cambios en la concentración.
Otras ocurren a veces como desviaciones instrumentales.
Limitaciones Propias de la Ley de Beer
La ley de Beer es exitosa en describir el comportamiento de absorción de soluciones diluidas solamente; a concentraciones altas (generalmente mayores que 0,01 M), la distancia promedio entre las especies responsables de la absorción está disminuida hasta el punto que cada una afecta la distribución de cargas de sus vecinas. Esta interacción, a su vez, puede alterar la habilidad de las especies para absorber en una longitud de onda de radiación. Debido a que la extensión de la interacción depende de la concentración, la ocurrencia de este fenómeno provoca desviaciones de la relación lineal entre absorbancia y concentración
.
Un efecto similar se encuentra a veces en soluciones que contienen altas concentraciones de otras especies, particularmente electrolitos. La proximidad de iones a la especie absorbente altera la absortividad molar de la última por atracciones electrostáticas, este efecto se disminuye por dilución
Se encuentran algunas excepciones entre ciertos iones o moléculas orgánicas grandes, que presentan interacciones significativas a concentraciones debajo de 0,01 M.
Desviaciones de la ley de Beer también surgen porque ε es dependiente del índice de refracción de la solución; entonces, si cambios de concentración provocan alteraciones en el índice de refracción de la solución, se observan desviaciones de la ley.
Desviaciones Químicas Aparentes
Surgen cuando un analito se disocia, se asocia, o reacciona con el solvente para producir un producto teniendo un espectro de absorción diferente del analito. Por ejemplo CrO4
2- en función del pH va a absorber diferente
.
Desviaciones Instrumentales Aparentes con Radiación Policromática
Se observa una adhesión estricta a la ley de Beer solamente cuando la radiación es monocromática verdadera; esta observación es otra información del carácter limitante de la ley. El uso de radiación que está restringida a una longitud de onda simple es raro porque los elementos que aislan
porciones de la salida de una fuente continua producen una banda mas o menos simétrica de longitudes de onda alrededor de la deseada
.
La derivación siguiente muestra el efecto de la radiación policromática de la ley de Beer. Consideremos un haz que consiste de dos longitudes de onda λ’ y λ’’. Suponiendo que la ley de Beer se aplica estrictamente para cada una de estas individuales, se puede escribir para λ’
Tipos Generales de Instrumentos Para Mediciones de Absorción Molecular
Ver en libros de texto de Análisis Instrumental esquemas de equipos de simple haz y de doble haz.
Titulaciones Fotométricas
Las mediciones fotométricas o espectrofotométricas se pueden emplear para localizar el punto de equivalencia de una titulación, siempre que el analito, el reactivo o el producto de la titulación absorban radiación. Alternativamente un indicador absorbente puede proveer el cambio necesario de absorbancia para la ubicación del punto final
.
Curvas de Titulación
Una curva de titulación fotométrica es un gráfico de absorbancia, corregida por cambios de volumen, como una función del volumen del titulante. Si se eligen las condiciones adecuadamente, la curva consistirá de dos regiones de líneas rectas con pendientes diferentes, una que ocurre al comienzo de la titulación y la otra ubicada más allá de la región del punto de equivalencia; se toma el punto final como la intersección de las porciones lineales extrapoladas.
A	
 
 1 2 3
B
 
 4 5 6
MATERIALES
Espectrofotómetro
Tubos de prueba
Gradilla
Fiolas y pipetas
REASCTIVOS 
Azul de bromo fenol u cualquier otro colorante
METODOLOGIA
1. A partir de una solución stock del colorante del azul de bromo fenol u otro colorante de 10 mg % de concentración, preparar una solución de trabajo que tenga una concentración de 0,4 mg. Por ciento.
2. Encender el espectro fotómetro, dejar calentar 5 minutos y proceder a calibrar el equipo con agua destilada a un lambda igual a 400nm.
3. Coloque una alícuota de la solución de trabajo en un tubo del espectrofotómetro y haga su lectura en unidades de absorbancia. NOTA: Pruebe sus lecturas con las dos soluciones preparadas y de acuerdo a los resultados decida la concentración de la solución a trabajar. 
4. Repita la lectura en las lambdas, de tal forma que se incrementen de 10 en 10 hasta 700 nm; anote sus lecturas en forma tabular. No olvide que debe calibrar el equipo con agua destilada cada vez que cambie de lambda.
5. Grafique en papel milimetrado ploteando absorbancia (eje y) vs lambda (eje x). Una todos lo puntos con trazos suaves y en el punto de máxima absorvancia trace unalínea recta que corte el eje x y determine así el lambda optimo para el colorante.
RESULTADOS:
Con los espectros de complejos de metales de transición no es posible dar una descripción general de los espectros que dan estos compuestos, aplicable a todos y cada uno de ellos. Lo mejor es describirlos como espectros con débiles bandas de absorción en la región visible, de valores de comprendidos en le intervalo de 1 - , y bandas mas intensas en la región ultravioleta, con valores para entre y . Un ejemplo típico es de las soluciones acuosas de cloruro de cloropentammin cobalto (III) 
Resultado obtenido por el libro
Resultado obtenido en le laboratorio
 
 (
 1.- LA ABSORCION LUMINOSA
)
 
 
 
 (
Ley de Beer - Lambert
)
 (
Relaciona la cantidad de luz absorbida por una muestra con
)
 (
Y la concentración de la sustancia
) (
El espesor de la muestra
)
 (
 Io/I = A = 
cl
)
	
 (
Con la ayuda de la computadora lo ponemos en rango de 800 – 400 y aun intervalo de 2 – 2
) (
Tomamos tres muestras
) (
 2.- ABSORCION LUMINOSA
) (
Luego sacamos una blanca y lo ponemos el azul de metileno
) (
Con estas dos calibramos el espectrofotómetro
) (
Azul de metileno
) (
blanca
) (
blanca
)
DISCUSIONES:
SKOOG LEARY,1997 
ABSORBANCIA: La absorbancia de una solucion viene definida por la ecuacion: 
						 
 b
Donde:
A: absorbancia
T: transmitancia
: Potencia del haz atenuada inicial
P: potencia de haz atenuada final
Solucion absorbente de concentracion C.
“La absorbancia de una solucion aumenta cuanto mayor es la atenuacion del haz.”
EXPERIMENTO:
Nosotros observamos en nuestro experimento que la A en la primera medición fue de 0.785, y la segundad oportunidad que medimos la A fue la misma, por este resultado podemos afirmar el enunciado anterior ya que la A se mantuvo igual pués utilizamos la misma Po 
RECIPIENTES PARA LA MUESTRA:
En nuestro experimento utilizamos celdas de plástico de 400 a 800 nm lo cual va con el rango de utilización de 350-2000 nm lo que no tuvimos en cuenta es que las celdas se encontraban en las condiciones adecuadas para la medición y no poseer errores en el resultado. La calibración dela celda con la solución lo hicimos al inicio de la medición con otra celda con agua destilada .
ALIAGA P. Y COL. 1997. Manual De Prácticas. Bioquímica I. Facultad De Ciencias. Departamento De Química. UNA – LM-Lima- Perú
Plummer, D. 1981. Introducción a la Bioquímica Práctica. Editorial Acribia S.A. Zaragoza- España
Skoog, D. Y West, D. 1989. Análisis Instrumental. Editorial Mcgrawhill/ Interamericana De México S.A. México DF
SUTTON, D.1975. Espectro Electrónico De Los Complejos De Los Metales De Transición. Barcelona.
SEIBL, J. 1973. Espectrometría De masas, Impreso en Madrid, Alhambra
Http:\\ull.chemistry.uakron.edu/analytical/Spectrophotometry 
en.wikipedia.org/wiki/Spectrophotometry 
faculty.uca.edu/~march/bio1/scimethod/spectro.htm 
 (
2
)BIOQUIMICA