AMINOACIDOS (1)

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CAPITULO II - AMINOACIDOS Y PROTEINAS - Página 
 Padilla, A.F.
 AMINOACIDOS Y PROTEINAS
En 1839, el químico holandés Gerardus Johannes Mulder investigaba las propiedades de las albúminas, un grupo de sustancias tales como la leche y los huevos, que coagulaban cuando se las sometía al calor. Mulder determinó, lo que el pensó sería la fórmula química de todas las sustancias albuminosas: C4OH62O12N10. El científico sueco Jons Jacob Berzelius, uno de los fundadores de la química moderna, sugirió a Mulder de que las albúminas deben ser llamadas proteínas (de la palabra griega proteios, que significa "primero") debido a que el sospechaba (basado en la fórmula determinada por Mulder, que conocemos ahora está fuera de lo correcto) que estos compuestos podían ser los más importantes de todas las sustancias biológicas. Así, se impregnó el nombre de proteína. El nombre fue profético; investigaciones desde 1839 hasta la fecha han revelado que las proteínas están involucradas en cada proceso celular. Estos compuestos nitrogenados, son los sólidos más abundantes en el protoplasma celular. El núcleo celular, uno de los componentes del protoplasma, contiene proteínas (nucleoproteínas) que están íntimamente relacionadas con la división celular y con la herencia. Otra parte, el citoplasma celular, contiene más de un millar de proteínas distintas, denominadas enzimas, que catalizan los múltiples cambios químicos requeridos para el mantenimiento de la vida celular. Además, los animales, plantas y microbios producen enzimas extracelulares necesarios en la descomposición de la dieta compleja de proteínas, lípidos y carbohidratos, para simplificar los nutrientes que son fácilmente absorbidos y utilizados por la célula. Para comprender el amplio rango de sus funciones biológicas, se cita a continuación algunos ejemplos:
1.	La gran mayoría de los catalizadores bioquímicos, conocidos como Enzimas son proteínas. Los enzimas catalizan casi todas las reacciones biológicas que ocurren en las células vivientes y aceleran, por muchos órdenes de magnitud, la tasa de esas reacciones. Sin éste notable poder catalítico, por el cual las tasas de reacción se aceleran hasta un millón de veces o más, la vida como conocemos no sería posible. Algunas de éstas reacciones como la hidratación del dióxido de carbono son muy sencillas. Otras, como la replicación de un cromosoma entero, son extraordinariamente complicadas.
2.	Las proteínas, conocidas colectivamente como inmunoglobulinas, sirven como primera línea de defensa contra infecciones bacterianas y virales. Estas proteínas altamente específicas, reconocen lo propio y lo ajeno y se combinan con las sustancias extrañas para combatirlas.
3.	Las proteínas transportadoras, acarrean materiales (iones y moléculas pequeñas) a través de las membranas celulares. La hemoglobina, por ejemplo, transporta el oxígeno en los eritrocitos, mientras la mioglobina, una proteína relacionada, transporta el oxígeno en el músculo. Así mismo, el hierro es transportado en el plasma sanguíneo por la transferrina y se almacena en el hígado en forma de un complejo con ferritina, otra proteína. Sin éste transporte, las células morirían.
4.	Muchas hormonas, tales como la insulina, son proteínas. Estas proteínas reguladoras controlan muchos aspectos funcionales de la célula, desde el metabolismo hasta la reproducción.
5.	Las proteínas estructurales proporcionan soporte mecánico a animales y algunas veces conforman sus esqueletos dérmicos. La dureza y flexibilidad del tejido conectivo, la fuerza de tensión de la piel y el hueso se debe a la presencia del colágeno, una proteína fibrosa extracelular.
6.	Ensamblajes de proteínas hacen posible la contracción muscular por medio del movimiento deslizante de dos clases de filamentos proteicos (actina y miosina). Movimientos coordinados a nivel microscópico, tales como los movimientos de los cromosomas en la mitosis, el movimiento de bacterias y la propulsión de esperma por medio de flagelos también se producen por ensamblajes contráctiles de naturaleza proteica.
7.	La respuesta de las neuronas a estímulos específicos causados en la sinapsis por el bombardeo de hormonas neurotrasmisoras colinérgicas como la acetilcolina y andrenérgicas como la adrenalina, depende de la asequibilidad de receptores proteicos, que generalmente se encuentran ligados a las membranas. La rodopsina, una cromoproteína sensible a la luz, es el receptor proteico en los bastoncitos de la retina.
8.	El control de la expresión genética, por enzimas, en el desarrollo y la diferenciación celular es imprescindible para un metabolismo celular coordinado. En el caso de organismos procariotes, tales como las bacterias, las proteínas represoras son moléculas de suma importancia, que sirven de control en la transcripción, silenciando segmentos específicos (operones) del DNA de la célula.
9.	El citoesqueleto está compuesto de varios tipos de proteínas que desempeñan diversas funciones.
La lista se pudiera extender casi indefinidamente, sin embargo las funciones mencionadas anteriormente, demuestran la importancia central de las proteínas en el estudio de la bioquímica.
Aminoácidos: elementos constructivos de las proteínas
Las proteínas son polímeros de elevado peso molecular constituídas por monómeros de bajo peso molecular (~110 Daltons) denominados aminoácidos. Los aminoácidos se derivan de las proteínas animales, vegetales y microbianas y son ácidos orgánicos que contienen ya sea un grupo amino o un imino, un grupo carboxílico, un átomo de hidrógeno y un grupo distintivo (o cadena lateral) R enlazados a un átomo de carbono central alfa. Al carbono central se lo denomina alfa por encontrarse ligado adyacente al grupo (ácido) carboxílico.
Los aminoácidos en solución, a pH neutro, son predominantemente iones dipolares (zwitteriones) en lugar de moléculas no iónicas. La forma dipolar de un aminoácido se caracteriza por tener protonado el grupo amino (__NH3+) y disociado el grupo carboxílico (__COO-). El estado de ionización de los aminoácidos varía conforme al pH. En condiciones ácidas, el grupo carboxilo no se encuentra ionizado (__COOH) mientras que el grupo amino si está ionizado (__NH3+). En ambiente alcalino, por ejemplo a un pH aproximado a 11, el grupo carboxilo se encuentra en su forma ionizada (__COO-) y el grupo amino no está ionizado (__NH2). En solución neutra, ambos grupos se encuentran ionizados a la vez (__NH3+, __COO-). 
Todos los aminoácidos, a excepción de glicina, contienen por lo menos un átomo de carbón asimétrico. Estos átomos llevan ligados cuatro grupos diferentes. Las moléculas que contienen un átomo de carbono asimétrico existen en dos formas ópticamente activas, las que contienen dos átomos de carbono asimétricos tienen cuatro formas ópticamente activas, calculándose el número total de éstas formas por la regla de Le Bel-Van't Hoff, la cual establece que el número total de formas ópticamente activas será igual a 2n, en la que n representa el número de átomos de carbono asimétrico en el aminoácido. El agrupamiento tetrahédrico de cuatro grupos diferentes alrededor del carbono confiere actividad óptica a los aminoácidos. Las dos formas especulares objeto-imagen se denominan isómero L y D. Un isómero son dos o más compuestos que poseen la misma fórmula, pero diferente estructura o, la misma colección de átomos arreglados en diferente manera. Unicamente los aminoácidos L (relacionado con el L-gliceraldehído) son constituyentes de las proteínas. La mayoría de los L aminoácidos existentes en la naturaleza hacen girar el plano de luz polarizada hacia la izquierda, sin embargo, existen algunos aminoácidos L que hacen girar el plano de la luz polarizada hacia la derecha. (D y L se refiere a conformación; + y - se refiere a rotación). Los isómeros ópticos o enantiómeros hacen girar el plano de luz polarizada en igual extensión, pero en direcciones opuestas (dextrógiro + y levógiro -). Puesto que los enzimas actúan específicamente sobreuno de los enantiómeros de un par, únicamente la mitad de una mezcla racémica (una mezcla con iguales cantidades de ambos enatiómeros) es, por lo general, fisiológicamente activa (ópticamente inactivas por lo que se cancelan + y -). 
Aproximadamente existen 300 aminoácidos en la naturaleza, sinembargo, únicamente 20 de ellos están presentes en las proteínas. Verdaderamente, todas las especies, desde las bacterias hasta el hombre, se constituyen a partir del mismo conjunto de aminoácidos. Este alfabeto fundamental de las proteínas tiene, por lo menos, dos millones de años de antigüedad. El extraordinario conjunto de funciones en las que intervienen las proteínas es el resultado de la diversidad y del gran número de ellas que pueden constituirse con distintos ordenamientos de los 20 aminoácidos. Como ejemplo se puede notar que se pueden formar 6 X 1011 decapéptidos con el repertorio de 20 aminoácidos. 
A= m(m-1)(m-2)...[m-(n-1)] en donde m=20 y n=10
Los aminoácidos son compuestos incoloros cristalinos, que a primera vista, la apariencia de un polvo blanco. Las formas cristalinas son muy características, variando desde haces de delgadas agujas (tirosina) a gruesas placas hexagonales (cistina). El sabor varía desde el dulce azucarado (glicina, alanina), pasando por el insípido (tirosina) hasta el amargo (arginina).
lista de aminoácidos ????????????
Existen aminoácidos cuyas cadenas laterales se encuentran cargadas a un pH fisiológico. Según su carga, estos aminoácidos se dividen en dos categorías: aminoácidos ácidos cuya carga a pH fisiológico es negativa (aspartato, glutamato y en algunos casos tirosina y cisteína), y aminoácidos básicos cuya carga a pH fisiológico es positiva (arginina, lisina y en algunos casos histidina). Los derivados no cargados del aspartato y del glutamato son la asparagina y la glutamina, respectivamente.
RXN ?????????????????????????????
Los aminoácidos se unen por enlaces peptídicos para formar cadenas polipeptídicas
Para conformar las proteínas, el grupo a-carboxilo de un aminoácido, se une al grupo a-amino de otro aminoácido por medio de un enlace peptídico (también denominado enlace amídico). Los péptidos y polipéptidos se forman a partir de dos aminoácidos por pérdida de una molécula de agua. Se debe recordar que un péptido o un polipéptido no necesariamente es una proteína. Un péptido que contiene diez o menos aminoácidos se denomina un oligopéptido, mientras que más de diez aminoácidos unidos constituyen un polipéptido. Muchas proteínas están compuestas por varias subunidades polipeptídicas (hemoglobina, deshidrogenasa láctica, etc.). 
Cada unidad de aminoácido en una cadena polipeptídica se denomina residuo.
Las cadenas polipetídicas tienen dirección porque sus elementos constructores tienen extremos diferentes (polaridad), es decir, los grupos a-amino y a-carboxilo. Por convención, se toma al extremo amínico como el comienzo de una cadena polipeptídica. La secuencia de aminoácidos en una cadena polipeptídica se ecribe comenzando con el residuo amino terminal. Así, en el tripéptido glicina-tirosina-fenilalanina la alanina es es residuo amino terminal y el triptófano es el residuo carboxilo terminal. Se debe tener en cuenta que fenilalanina-tirosina-glicina es un tripéptido diferente.
Una cadena polipeptídica consiste de una columna vertebral, regularmente repetida, llamada la cadena principal del polipéptido y de una parte variable constituída por las cadenas laterales distintivas. La mayoría de las cadenas polipeptídicas naturales, contienen entre 50 y 2000 residuos de aminoácidos. Por lo tanto si la media del peso molecular de los aminoácidos es de 110, los pesos moleculares de la mayoría de polipéptidos está entre 5500 y 220000. La masa molecular de las proteínas se puede expresar en unidades de daltons; un dalton es igual a una unidad de masa atómica. Una proteína con un peso molecular de 50000, tiene una masa de 50000 daltons, o 50 kilodaltons (kd). 
En determinadas proteínas, algunas cadenas peptídicas o polipeptídicas pueden estar unidas lateralmente por puentes o enlaces disulfuro, como es el caso de la insulina o de las queratinas. Estos enlaces cruzados se forman por la oxidación de los residuos de cisteína. El compuesto disulfurado resultante se llama cistina. Normalmente no existen otros enlaces cruzados covalentes entre las proteínas. Proteínas intracelulares por lo general no contienen enlaces disulfuro, mientras que las proteínas extracelulares muy a menudo contienen varios enlaces de éste tipo. En algunas proteínas existen enlaces cruzados, pero no del tipo disulfuro, derivados de las cadenas laterales de los residuos de lisina. Por ejemplo, las fibras de colágeno del tejido conectivo se encuentran reforzadas de esta forma, de igual manera se encuentra la fibrina en los coágulos sanguíneos.
Se ha mencionado que los aminoácidos se encuentran como iones dipolares en solución acuosa a un pH fisiológico. El pH al cual un ión dipolar no migra en un campo eléctrico se conoce como el punto isoeléctrico (pI). En ese punto isoeléctrico, el número de cargas posotivas y negativas es el mismo.
Los a-aminoácidos tienen al menos dos grupos ácidos en potencia, el grupo carboxilo sin disociar y el grupo amino protonado.
El clorhidrato de un aminoácido es un electrolito fuerte y se disocia en agua completamente de la siguiente manera:
 H H
 I I
 Cl◊NH3-C-COOH ⁄ Cl- + +H3N-C-COOH 
 I I
 R R 
La forma cargada positivamente, totalmente protonada, aparece en el segundo término. Este catión posee dos grupos ácidos débiles, cada uno con su valor pK característico; por convención se los designan como pK1, pK2, y pK3, correspondiendo el menor número al grupo ácido más fuerte. 
Así, la constante de disociación pK1 para todo aminoácido corresponde a la disociación del grupo a-carboxilo.
 
 
 H H
 I I
 +H3N-C-COOH ⁄ +H3N-C-COO- + H+
 I I
 R R
por lo tanto,
K1= +] [AA±],[AA+]) 
La especie sobrante se disociará en el grupo amino de la siguiente manera (pK2):
 H H
 I I
 +H3N-C-COO- ⁄ H2N-C-COO- + H+
 I I
 R R
por lo tanto,
K2= +] [AA-],[AA±]) 
Una vez obtenidos el K1 y el K2, se puede calcular el punto isoeléctrico de un aminoácido neutro de la siguiente manera:
pI= 1 + pK2,2) 
En el caso de poseer aminoácidos cargados positiva o negativamente, existirá un K3. El K3 se utilizará solamente para los cálculos del pI en aminoácidos cargados positivamente (básicos), ya que el K3 corresponde al grupo amino de la cadena lateral de los aminoácidos básicos (+H3N- , =NH2+). Para éstos aminoácidos, se debe utilizar la siguiente ecuación:
pI= 2 + pK3,2) 
como mencionado anteriormente, el pK2 se refiere al grupo a-amino. Para un aminoácido ácido (carga negativa), se utilizarán también los pK1 y pK2 que en éste caso específico se refieren al grupo a-carboxilo y al carboxilo de la cadena lateral, respectivamente.Así, la ecuación que se debe utilizar para calcular el pI de los aminoácidos ácidos es igual que la de los aminoácidos neutros pero teniendo en mente que los pK's se refieren a grupos diferentes.
PROBLEMA:
Calcular el pI de apartato si el pk1 es de 1.88, el pK2 es de 3.65 y el pK3 es de 9.60.
SOLUCION:
1.	Se determina el tipo de aminoácido que es, con respecto a su carga. 	Esto implica que es una especie ácida.
 H
 I
+H3N-C-COO-
 I
 CH2
 I
 COO-
Aspartato
2.	La ecuación que se debe utilizar es la que corresponde a un aminoácido 	ácido. Por convención pK1 se refiere al grupo a-carboxilo de todos los 	aminoácidos. Al no ser éste un aminoácido neutro ni básico, el pK2, se 	refiere al otro grupo ácido y más no al grupo a-amino como en el 	resto de los casos. El pK3 se ignora por no ser aminoácido básico.
pI= 1 + pK2,2) 
4.	por lo tanto,
	pI= = 2.77
PROBLEMA:
Calcular el pI de lisina. Pk1 = 2.18, pK2 = 8.95 y pK3 = 10.53
SOLUCION:
1.	Se determina el tipo de aminoácido que es, con respecto a su carga. 	Esto implica que es una especie básica.
 H
 I
+H3N-C-COO-
 I
 (CH2)4
 I
 NH3+
2.	La ecuación que se debe utilizar es la que corresponde a un aminoácido 	básico. Al tratarse de un aminoácido de éste tipo, los grupos que 	interesan son el a-amino (pK2) y el e-amino (pK3).
pI= 2 + pK3,2) 
3.	por lo tanto,
pI= = 9.74
El punto isoeléctrico para aminoácidos neutros es – 7, para aminoácidos ácidos «7 y para aminoácidos básicos es »7.
Nomenclatura
Para la nomenclatura de los péptidos, se enumeran los residuos de aminoácidos por el orden en que se encuentran en la cadena empezando a partir del grupo amino terminal. Se utiliza la terminación -il - para cada uno de los residuos, excepto para el terminal carboxilo no sustituído.
Ejemplo:
H2N-Ala-Tyr-Gly-Glu-COOH
El nombre de éste tetrapéptido es: ácido alanil, tirosil, glicil, glutámico. 
Deben destacarse las diferencias entre glutamilo (glutamato), y aspartilo (aspartato) de glutaminilo (glutamina) y asparraginilo (asparragina).
Cargas netas de péptidos
A partir de la ecuación de Henderson-Hasselbalch, Dexter Moore, en el año de 1985, derivó una simple expresión matemática para facilitar el cálculo de las cargas netas tanto en péptidos como en aminoácidos a cualquier pH. Es importante recordar, en la derivación, que la carga de la especie HA es positiva para un ácido Brønsted, como el grupo amino protonado, mientras que el grupo no protonado, la especie A- , es neutro. Por lo tanto, para dicho grupo, la meta es calcular la fracción de especies protonadas y por lo tanto la fracción de carga positiva. Para un ácido como el grupo carboxilo, la meta es calcular la fracción de especies no protonadas y por lo tanto la fracción de carga negativa. La carga molecular neta se obtiene sumando la contribuición de carga de los varios grupos. Así, siguiendo el procedimiento estándar para determinar la fracción de carga negativa (Q-), para los grupos funcionales -COOH, -SH, -PhOH, la ecuación es:
Q-= -(pH-pKa)) 
La expresión general para la fracción de carga positiva (Q+), para los grupos funcionales -NH3+, =NH2+, NH+, es:
Q+= +(pH-pKa)) 
La expresión general para la carga molecular neta a cualquier pH es dada por:
Qmolécula= ∑Q- + ∑Q+
EJEMPLO:
Calcular la carga neta del péptido: Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asp , a pH 7.0.
SOLUCION:
	Los pKa de cada uno de los grupos en cuestión se pueden obtener de 	tablas. Así, para el grupo terminal amino (+H3N-) el pKa es de 8.5; 	para el grupo terminal carboxilo (-COO-) el pKa es de 3.2; para cada 	uno de los cuatro aspartatos-COO-, el pKa es de 3.9 y para cada una de 	las dos lisinas-NH3+, el pKa es de 10.5. Se debe recordar que a 	excepción de los grupos a-terminales, el resto de los valores pKa se 	refieren a las cadenas laterales de cada residuo aminoácido. Por lo 	tanto, sustituyendo los valores en las fórmulas anteriormente 	mencionadas se obtiene:
Qpéptido = -1.5) + -3.5) + -3.8) + -3.1) = -2.0
Modificación protéica y rupturas confieren nuevas capacidades
El set de 20 aminoácidos puede ser modificado después de la síntesis de una cadena polipeptídica (modificación postraduccional) para así acrecentar sus capacidades. Por ejemplo, el grupo a-amino terminal de muchas proteínas es acetilado, lo que hace que estas proteínas sean más resistentes a una degradación. En el colágeno recién sintetizado, muchos residuos de prolina son hidroxilados para formar hidroxiprolina. Los grupos hidroxilos añadidos estabilizan la fibra de colágeno.
El significado biológico de ésta modificación es evidente en el escorbuto, que resulta por la insuficiente hidroxilación del colágeno por una deficiencia de vitamina C. Otro aminoácido especializado, producido por éste tipo de toques finales es el ©- carboxiglutamato. En la deficiencia de vitamina K, la carboxilación insuficiente del glutamato de la protrombina, una proteína de coagulación, puede provocar hemorragias.
Conformación de las cadenas polipeptídicas
Una característica espectacular de las proteínas es que poseen estructuras tridimensionales bien definidas. Una cadena polipeptídica estirada o más o menos organizada al azar no tiene actividad biológica. La función nace de la conformación, que es la organización de los átomos de manera tridimensional, en una estructura. La secuencia de aminoácidos es muy importante porque determina la conformación de las proteínas. En los últimos años de la década de los treinta, Linus Pauling y Robert Corey iniciaron los estudios cristalográficos por rayos X, de la estructura precisa de los aminoácidos y péptidos. Su intención era obtener un conjunto de longitudes estándar de enlace para éstos silliares estructurales y después utilizar ésta información para predecir la conformación de las proteínas. Uno de sus importantes descubrimientos fue el que la unidad peptídica es rígida y plana. El hidrógeno del grupo amino sustituído está generalmente en posición trans con respecto al oxígeno del grupo carboxilo. No existe libertad de rotación alrededor del enlace entre el átomo de carbono carbonilo y el átomo de nitrógeno de la unidad peptídica, porque éste enlace posee un carácter parcial de doble enlace.
Ver estructuras dadas en clase
Por ser los enlaces entre el átomo de carbono a y el átomo de nitrógeno; y el átomo de carbono a y el átomo de carbono carbonilo enlaces sencillos, no existe resonancia y como consecuencia existe un enorme grado de libertad rotacional de los enlaces ubicados a cada lado de la unidad peptídica rígida. Las rotaciones alrededor de estos enlaces se designan por los ángulos y y f. La conformación de la cadena principal del polipéptido está definida completamente cuando se conocen y y f para cada uno de los residuos de aminoácidos.
Estructura proteica
Al discutir la arquitectura de las proteínas, es conveniente referirnos a seis niveles estructurales.
1. ESTRUCTURA PRIMARIA- es simplemente la secuencia de aminoácidos y la localización de los enlaces disulfuro, si existe alguno. Así, la estructura primaria es una descripción completa de las conecciones o enlaces covalentes de una proteína.
2. ESTRUCTURA SECUNDARIA- se refiere a las relaciones estéricas de los residuos de aminoácidos que están próximos uno a otro en la secuencia lineal. Algunas de éstas relaciones estéricas son de un tipo regular, lo que da lugar a una estructuraperiódica. La hélice a, la hoja plegada b y la hélice del colágeno son ejemplos de estructura secundaria.
	a) Hélice a - es una estructura semejante a la de un cilindro. La cadena polipeptídica estrechamente arrollada, forma la parte interior del cilindro, y las cadenas laterales, de los aminoácidos, se extienden hacia afuera en una disposición helicoidal. 
Ver diagrama dado en clase.
La hélice a queda estabilizada por enlaces de hidrógeno entre los grupos NH y CO de la cadena principal. El grupo CO de cada aminoácido esta enlazado por puentes de hidrógeno al grupo NH del aminoácido situado cuatro residuos más adelante en la secuencia lineal.
Ver estrucura dada en clase
De ésta manera, todos los grupos NH y CO de la cadena principal quedan enlazados por puentes de hidrógeno. Cada residuo queda relacionado con el siguiente por una translación de 1.5 Å a lo largo del eje de la hélice a y una rotación de 100° con un diámetro de rosca de 5.4 Å , lo que da 3.6 residuos de aminoácidos por vuelta de la hélice (5.4 Å/1.5Å = 3.6). Así, aminoácidos espaciados tres o cuatro lugares en la secuencia lineal, quedan espacialmente situados muy próximos en la hélice a. Como contraste, aquellos aminoácidos separados dos lugares en la secuencia lineal, quedan ubicados a lados opuestos en la hélice y de ésta manera es poco probable que hagan contacto. Aunque el sentido de la hélice pueda ser dextro o levorrotatorio, las hélice a que se encuentran en las proteínas son dextrorrotatorias.
	(b) Hoja plegada b - es denominada así por haber sido descubierta inmediatamente después de la hélice a. La hoja plegada b difiere profundamente de la hélice a en que es una hoja en vez de un cilindro. La cadena polipeptídica en la hoja plegada b está casi totalmente extendida en vez de estar estrechamente arrollada como en la hélice a. La distancia axial entre los aminoácidos adyacentes es de 3.5 Å, en contraste con la de 1.5 Å para la hélice a. Otra diferencia es que la hoja plegada b queda estabilizada por enlaces de hidrógeno entre los grupos NH y CO de cadenas polipeptídicas diferentes, mientras que en la hélice a el enlace de hidrógeno se establece entre los grupos NH y CO de la misma cadena polipeptídica.
ver diagrama dado en clase
Las cadenas adyacentes en una hoja plegada b pueden orientarse en la misma dirección denominándose así, hoja plegada b paralela. Si las cadenas se encuentran orientadas en direcciones opuestas, se denomina hoja plegada b antiparalela. 
 diagrama ???????????????????
3. ESTRUCTURA TERCIARIA- se refiere a las relaciones estéricas de los residuos de aminoácidos que se encuentran muy distanciados en la estructura lineal. La línea divisoria entre la estructura secundaria y terciaria es arbitraria
4. ESTRUCTURA CUATERNARIA- las proteínas que se componen de más de una cadena o dominio polipeptídico (hemoglobina, deshidrogenasa láctica, etc.) muestran un nivel de organización estructural adicional, es decir, la estructura cuaternaria. Esta se refiere a la forma en la cual están empaquetadas las cadenas entre sí. Cada cadena polipeptídica en éste tipo de proteínas se denomina una subunidad.
5. ESTRUCTURA SUPERSECUNDARIA- es aquella que se encuentra alternada entre las dos formas de estructura secundaria en una cadena polipeptídica. Por ejemplo, una hoja plegada b separada de otra hoja plegada b por una hélice a. Es provechoso considerar las estructuras supersecundarias como intermediarios entre estructuras secundarias y terciarias.
6. DOMINIOS- son unidades globulares compactas con un rango entre 100 y 400 aminoácidos. Por ejemplo, la cadena liviana de un anticuerpo (25 kd) se dobla en dos dominios. Estos dominios resemblan el uno al otro, lo que sugiere que provienen del mismo gen.
Los dominios proteicos son, por lo general, codificados por distintas partes de un gen denominados exones.
 Técnicas Para la Purificación de Proteínas 
Las proteínas pueden ser separadas entre sí y de otros tipos de moléculas, sobre la base de características tales como el tamaño, la solubilidad, la carga y la afinidad específica de enlace.
Diálisis- Las proteínas pueden ser separadas de las moléculas pequeñas, por medio de diálisis a través de una membrana semipermeable. La membrana actúa como un tamiz molecular y móleculas cuyas masas son mayores a los 15 kilodaltons, son retenidas dentro de la membrana de diálisis típica, por el contrario, iones y moléculas inferiores en tamaño, atraviesan los poros de la membrana hacia el exterior de esta.
Cromatografía de filtración por gel- Es otro ejemplo de tamiz molecular que separa moléculas de acuerdo a su forma y tamaño. La resina es un polímero de glucosa (dextran) insoluble, altamente hidratado, su morfología es esférica con radios variables de acuerdo al tipo, utilizada como soporte dentro de una columna cromatográfica, generalmente de vidrio.
El resultado es que las moléculas pequeñas se difunden en la solución tampón dentro de las pequeñas esferas en las cuales penetran y también entre ellas, mientras que las moléculas grandes quedan localizadas en la solución, entre las esferas. Al no tener que penetrar los poros de las esferas, las moléculas grandes fluyen más reapidamente a través de la columna.
Cromatografía de intercambio iónico- Las proteínas nativas, poseen cargas netas que hacen posible su separación, de acuerdo a esta técnica. Si una proteína, tiene una carga positiva neta a pH 7, normalmente esta se unirá a una resina de intercambio iónico que contenga grupos negativos (COO-), mientras que una proteína cargada negativamente no lo hará. Así, una proteína con carga neta positiva, puede ser desligada de la resina en la columna añadiendo NaCl, en forma de gradiente, u otra sal, al tampón de elución. El principio se basa en que los iones sodio compiten con los grupos cargados positivos, en la proteína, para ligarse al la resina. Obviamente, las proteínas que tengan una baja densidad de carga neta positiva, tenderán a eluir primero seguidas de aquellas que tienen una densidad de carga mayor.
Electroforesis- Es una técnica utilizada para separar proteínas tanto en base a su carga neta como también por peso molecular. La electroforesis se define como la migración de partículas cargadas en un campo eléctrico. Cualquier ión o grupo cargado migrará cuando sometido a un campo eléctrico. Las proteínas llevan una carga neta a cualquier pH que sea diferente al de su punto isoeléctrico, por lo tanto estas migrarán y su tasa de migración dependerá de la densidad de carga (la razón de carga a masa). Mientras más alta sea la razón de carga a masa, más rápida será la migración de la molécula. La aplicación de un campo eléctrico a una mezcla de proteínas en solución, resultará en diferentes migraciones para diferentes proteínas hacia uno de los electrodos. La velocidad de migración (u) de una proteína (o cualquier otra molécula como DNA o RNA) en un campo eléctrico depende de la fuerza del campo eleectrico (E ), la carga neta de la proteína (z ), y el coeficiente de fricción (f ).
u = Ez, f ) 
La fuerza eléctrica Ez que conduce la molécula cargada hacia el electrodo de carga opuesta es contenida por el arrastre viscoso f u suscitado por la fricción entre la molécula en movimiento y el medio de soporte. El coeficiente de fricción f depende de la masa y la forma de la molécula en movimiento, como también de la visocidad del medio.
Las separaciones electroforéticas son generalmente ejecutadas en soportes gélicos y no en soluciones libres por dos razones. Primeramente, los geles minimizan la convección producida por pequeñas gradientes de temperatura, un requisito para la separación efectiva. Segundo, los geles se comportan como tamíces moleculares que ayudan a la separación de las macromoléculas. Aquellas moléculas con tamaños más pequeños que los poros del gel, migrarán fácilmente a lo largo del soporte, mientras que aquellas moléculas con tamaños más grandes que los poros del gel, estarán casi inmóviles. Móleculas con tamaños intermediosmigrarán a través del soporte con diferentes grados de facilidad.
Las proteínas pueden separarse mayormente en base a su masa molecular, por electroforesis en gel de poliacrilamida, bajo condiciones desnaturalizantes. La mezcla de las proteínas se disuelven primeramente en una solución de dodecil sulfato sódico (SDS), un detergente aniónico que interrumpe casi todas las interacciones no covalentes de las proteínas nativas. Mercaptoetanol o ditiotreitol también se añade para reducir los enlaces disulfuro. Los aniones del SDS se unen a las cadenas principales a razón de aproximadamente un SDS por cada dos residuos aminoácidos (1.4g de SDS por gramo de proteína). El complejo SDS-proteína formado posee una carga neta negativa casi proporcional a la masa de la proteína. Así, todas las proteínas migrarán desde el polo negativo hacia el polo positivo. Las proteínas pequeñas migrarán más rápido a través del gel, mientras que las grandes quedarán más cerca al punto de aplicación de la muestra. La migración de la mayoría de las cadenas peptídicas, bajo estas condiciones, es linealmente proporcional al logaritmo del peso molecular de su masa. Esta relación empírica no es obedecida por algunas proteínas, por ejemplo, algunas proteínas ricas en carbohidratos y proteínas de membrana, las cuales migran anormalmente.
La electroforesis en poliacrilamida-SDS, es rápida, sensible y capaz de un alto grado de resolución. Cantidades pequeñas hasta de 0.1µg (~ 2 pmol) de proteína dan una banda detectable cuando teñida con azul de Coomasie. Cantidades mucho menores (~ 0.02 µg) pueden ser fácilmente detectadas con tinción de plata. Proteínas que difieren en masa por aproximadamente 2% (por ejemplo, 40 y 41 kd, aproximadamente 10 residuos de aminoácidos) generalmente pueden ser distinguidas una de la otra.
Las proteínas también pueden ser separadas electroforéticamente en base a su contenido de residuos ácidos y básicos. Anteriormente se ha mencionado que el punto isoeléctrico (pI) de una proteína es el pH al cual su carga neta es cero. A este pH, su movilidad electroforética es cero porque z en la ecuación de velocidad de migración es igual a cero. Por ejemplo, el pI del citocromo c , una proteína transportadora de electrones altamente básica, es de 10.6, mientras que el pI de la albúmina de suero, una proteína ácida en la sangre, es de 4.8. Suponga que la mezcla de estas proteínas se someten a electroforesis en una gradiente de pH en un gel carente de SDS. Cada proteína migrará hasta que alcance una posición en el gel en la que el pH sea igual al pI de la proteína. Este método de separar proteínas de acuerdo al punto isoeléctrico se denomina enfoque isoeléctrico. La gradiente en el gel se crea sometiendo a electroforesis una mezcla de polianfolitos (pequeños polímeros con cargas múltiples) que contienen varios valores de pI. La técnica de enfoque isoeléctrico puede separar de forma muy efectiva, proteínas que difieren tan solo 0.01 en sus valores de pI. Esto significa que proteínas que difieren entre sí por una sola carga neta, pueden ser separadas.
Las técnicas de enfoque isoeléctrico y electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS, pueden combinarse para obtener separaciones de muy alta resolución. Primeramente, la muestra se somete a enfoque isoeléctrico; este gel es luego colocado en forma horizontal sobre la parte superior de la matriz de poliacrilamida con SDS y corrido verticalmente para generar un patrón de puntos bidimensional. Con una técnica de este tipo, las proteínas se separan en la dirección horizontal en base a punto isoeléctrico y en la dirección vertical en base a la masa. Con esta técnica se han podido separar más de mil proteínas diferentes provenientes de E. coli, en un solo experimento.
Cromatografía de afinidad- Esta es otra técnica eficaz y generalmente utilizada en la purificación de proteínas. Esta técnica se aprovecha de la alta afinidad de proteínas por grupos químicos específicos. Así por ejemplo, la muy conocida proteína vegetal, concavalina A, puede ser purificada al pasar el extracto crudo a través de una columna que contenga residuos de glucosa ligados a las esferas del soporte. La concavalina A se adhiere a una columna de este tipo por tener una alta afinidad por glucosa, mientras que la mayoría de otras proteínas no la tienen. La concavalina adherida a la columna es subsecuentemente eluída del medio de soporte añadiendo una solución concentrada de glucosa. La glucosa en solución, compite más fuertemente por los sitios de unión de la concavalina A y desplaza la proteína de los residuos ligados al soporte. 
Centrifugación- Esta técnica es muy utilizada para separar y analizar células, organelos y macromoléculas biológicas. Una partícula en movimiento circular con radio r a una velocidad angular w está sujeta a un campo centrífugo equivalente a w 2r. La fuerza centrífuga Fc para esta partícula es igual al producto de su masa efectiva m' y de su campo centrífugo.
 -
Fc = m' w 2r = m( 1-nr) w 2r
La masa efectiva m' es menor que la masa m debido a que el líquido desplazado ejerce una fuerza opuesta. Este factor boyante es igual a (1-nr), en donde n es el volumen parcial específico de la partícula y r es la densidad de la solución. Una partícula se mueve en este campo a una velocidad constante v cuando Fc es igual al arrastre viscoso uf, en donde f es el coeficiente de fricción de la partícula. Por lo tanto, la velocidad de migración (velocidad de sedimentación) de la partícula es
u = c ,f ) = nr) w2r,f ) 
Nótese que esta expresión para movimiento en un campo centrífugo es análogo a la ecuación para movimiento en un campo eléctrico.
La ecuación anterior demuestra que la velocidad de sedimentación es directamente proporcional a la fuerza del campo centrífugo. Por lo tanto, es posible definir una medida de sedimentación que depende de las propiedades de la partícula y de la solución, pero es independiente de cuan rápido gire la muestra. El coeficiente de sedimentación s, definido como la velocidad dividido para el campo centrífugo , es igual a
s = u,w2r) = f(m (1-nr),f) 
Los coeficientes de sedimentación son generalmente expresados en unidades Svedberg. Un Svedberg (S) es igual a 10-13 segundos. Por ejemplo, si se somete un anticuerpo de 150 kd a un campo centrífugo de un radio de 8 cm a 75.000 revoluciones por minuto (rpm), el campo centrífugo bajo estas condiciones es de 4.9 x 108 cm s-2, el cual es aproximadamente 500.000 veces el campo gravitacional de la tierra (g). Si la velocidad de una proteína en este campo es de 3.4 x 10-4 cm/s, entonces su coeficiente de sedimentación es 7S.
Varias conclusiones importantes se pueden derivar a partir de la última ecuación:
1.	La velocidad de sedimentación de una partícula es proporcional a su masa. Una proteína de 100 kd se mueve al doble de la velocidad que una proteína de 50 kd, que tenga la misma morfología y densidad.
2.	Una partícula densa se mueve más rápido que una partícula menos densa debido a que la fuerza boyante opuesta es menor para una partícula de mayor densidad.
3.	La forma de la partícula también es importante, porque afecta el arrastre viscoso. El coeficiente de fricción de una partícula compacta es menor que el de una partícula extendida de la misma masa. 
4.	La velocidad de sedimentación también depende de la densidad de la solución (r). Las partículas tienden a undirse cuando nr <1, a flotar cuando nr >1 y a no moverse cuando nr =1.
La centrifugación puede separar proteínas con diferentes coeficientes de sedimentación. El primer paso en la centifugación zonal (también llamada centrifugación de bandeo), es el formar una gradiente en un tubo de centrífuga, mezclando diferentes proporciones de una solución de baja densidad (tal como 5% sucrosa) y otra de alta densidad ( tal como 20% sucrosa). La función de la gradiente de densidad es la de prevenir el flujo convectivo. Un pequeñovolumen de la solución que contiene la muestra de proteína, entonces se coloca en la parte superior de la gradiente creada. Cuando el rotor gira, las proteínas migran a través de la gradiente y se separan de acuerdo a los coeficientes de sedimentación. La centrifugación se para antes de que la proteína más rápida alcance el fondo del tubo. Las bandas de proteínas pueden ser colectadas por goteo, al provocar un orificio en la base del tubo. Las gotas pueden ser analizadas por contenido proteíco actividad catalítica o algún otro parámetro de interés. Esta técnica de velocidad de sedimentación, fácilmente separa proteínas que difieren en coeficientes de sedimentación por un factor de dos o más.
La masa (peso molecular) de una proteína, puede ser directamente determinada por el equilibrio de sedimentación, en el cula una muestra es centrifugada a relativamente una baja velocidad de tal manera que la sedimentación es contrabalanceada por difusión. Bajo éstas circunstancias, una gradiente uniforme, de concentración proteíca, se forma. La dependencia de la concentración en la distancia a partir del eje de rotación, elucida la masa de la partícula. La masa m es dada por
m = f(2k T,(1-nr)w2) loge c2 /(c1 (r22-r12)) 
en donde c1 y c2 son las concentraciones a las distancias (desde el eje de rotación) r1 y r2, k es la constante de Boltzmann, y T es la temperatura absoluta. Esta técnica de equilibrio de sedimentación para determinar masa, es rigurosa y puede ser aplicada bajo condicones no desnaturalizantes, en la cual la estrucutura nativa de las proteínas multiméricas es preservada. Al contrario, electroforesis en geles de poliacrilamida con SDS proveen un estimado de la masa de las cadenas polipeptídidcas, bajo condiciones desnaturalizantes. 
Reacciones de los aminoácidos: secuenciación
Ver estructuras dadas en clase
Pasando, de la purificación de las porteínas y el análisis de sus propiedades hidrodinámicas, a la elucidación de la secuencia de sus aminoácidos, consideremos como la secuencia de un péptido corto tal como 
Ala-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly
puede ser establecida. Primeramente, la composición de residuos de aminoácidos del péptido, es determinada. El péptido se hidroliza en sus aminoácidos constituyentes al someterlo a calentamiento (110°C) con 6 N HCl, por 24 horas. Stanford Moore y William Stein demostraron que los aminoácidos hidrolizados de un péptido, pueden ser separados por cromatografía de intercambio iónico en columnas de poliestireno sulfonado y cuantificados al reaccionar con ninhidrina. Los a-aminoácidos tratados en ésta forma, dan un color azul intenso denominado azul de Ruheman, mientras que iminoácidos, como la prolina dan un color amarillo. La concentración de los aminoácidos en solución es proporcional a la absorbancia de la solución, después de calentrala con la ninhidrina. Esta técnica puede detectar hasta un microgramo (10 nmoles) de un aminoácido, que es aproximadamente la cantidad presente en una huella dactilar. Cantidades considerablemente más pequeñas como es la de un nanogramo (10 pmoles) de un aminoácido pueden ser detectadas utilizando fluorescamina, una sustancia que reacciona con el grupo a-amino para formar un producto altamente fluorescente. La identidad del aminoácido se revela por el volumen de elución, que es el volumen de tampón necesario para remover el aminoácido de la columna. La comparación de los patrones cromatográficos de la muestra hidrolizada y de la muestra estándar de aminoácidos determinarán que la composición de aminoácidos en el péptido es
(Ala, Arg, Asp, Gly2, Phe)
El paréntesis denota que ésta es la composición de aminoácidos del péptido en cuestión, mas no de su secuencia.
El residuo amino terminal de una proteína o péptido, puede ser identificado al marcarlo con un compuesto que forme un enlace covalente estable, con éste grupo. El fluorodinitrobenceno (FDNB), fue el primer compuesto utilizado para éste propósito, por Frederick Sanger. El FDBN reacciona con el grupo a-amino, no cargado (NH2), para formar un derivado dinitrofenílico (DNP) del péptido, de color amarillo. El enlace entre el dinitrofenilo y el grupo amino terminal se establece en condiciones en las que se hidrolizan los enlaces peptídicos. La hidrólisis del DNP-péptido en 6N HCl da lugar a un DNP-aminoácido, que en el caso del péptido puesto como ejemplo se identifica como DNP-alanina, por sus propiedades cromatográficas.
El cloruro de dabsilo es comunmente utilizado porque forma derivados intensamente coloreados que pueden ser detectdos con gran sensibilidad. El compuesto reacciona con el grupo a-amino, neutro (-NH2), para formar un derivado sulfonamida, el cual es estable bajo condiciones que hidrolizan enlaces peptídicos. La hidrólisis del péptido hipotético (dabsilo-péptido) en 6 N HCl producirá un dabsilo-aminoácido, que sería identificado como dabsilo-alanina, por sus propiedades cromatográficas. El cloruro de dansilo, otro reactivo frecuentemente utilizado para marcar grupos a-NH2, forma derivados sulfonamida fluorescentes.
Aunque el método del dabsilo, para determinar el grupo amino terminal, es sensible, éste no puede ser utilizado repetitivamente sobre el mismo péptido porque éste se degrada por completo en la etapa de hidrólisis ácida. Pehr Edman desarrolló un método para marcar el residuo amino terminal y romper el primer enlace petídico sin destruir el resto de enlaces, entre los residuos de aminoácidos del péptido. La degradación de Edman remueve, en forma secuencial, un residuo aminoácido a la vez, empezando desde el grupo amino terminal del péptido. En éste procedimiento, el fenilisotiocianato reacciona con el grupo amino terminal no cargado del péptido para formar un derivado fenilisotiocarbamato; luego, bajo condiciones ácidas leves, se libera un derivado cíclico del aminoácido terminal, dejando así el péptido intacto, pero acortado en un residuo. El compuesto cíclico es una feniltiohidantoína (PTH) del aminoácido. El derivado PTH-aminoácido puede ser fácilmente identificado por medio de procedimientos cromatográficos tal como la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). Además, la composición de aminoácidos del péptido acortado:
(Arg, Asp, Gly2, Phe)
puede ser comparada con el péptido original:
(Ala, Arg, Asp, Gly2, Phe)
La diferencia existente entre estos análisis es el de un residuo de alanina, lo que demuestra que la alanina es el residuo amino terminal del péptido original. El procedimiento de Edman puede así ser repetido sobre el péptido acortado. El análisis de aminoácidos después de la segunda vuelta de degradación es:
(Arg, Asp, Gly, Phe)
lo cual indica que el segundo residuo desde el extremo amínico es la glicina. Un PTH-aminoácido individual puede ser identificado cromatográficamente, por HPLC, comparándolo con los perfiles de volumenes de elución de estándares conocidos.
Los análisis de secuenciación de aminoácidos han sido acelerados por el desarrollo de secuenciadores automáticos. En un secuenciador de fase líquida, se coloca una capa fina de proteína en un recipiente cilíndrico que se somete a la degradación de Edman mientras este gira. Los reactivos y solventes de extracción se pasan sobre la capa inmóvil de proteína y el PTH-aminoácido es identificado por cromatografía líquida de alta resolución. Un ciclo de degradación es llevado a cabo en menos de dos horas. Esta técnica puede secuenciar péptidos de hasta más o menos cincuenta residuos de aminoácidos. Un secuenciador de fase gaseosa, recientemente ideado, puede analizar cantidades de péptidos y proteínas en el orden de picomoles. Esta alta sensibilidad hace posible que se analice la secuencia de una banda proteica eluída de un gel de poliacrilamida.
Las proteínas pueden ser escindidas en un sitio específico para formar péptidos de menor tamaño y facilitar su análisis.
Las proteínas grandes, con mucho más de aproximadamente cincuenta residuos de aminoácidos, no pueden ser confiablemente secuenciadas por el método de Edman.Esto se debe a que no todos los péptidos involucrados en la reacción generan el aminoácido derivado en cada ciclo. Si la eficiencia de generación de cada ciclo fuese del 98%, la proporción del aminoácido "correcto" generado después de 60 ciclos sería de únicamente 0.3 (0.98 60). Este obstáculo se puede obviar por medio de esciciones específicas de las proteínas, que generen segmentos peptídicos de no más de cincuenta residuos de aminoácidos. En esencia, la estrategia es de dividir y conquistar. 
Cortes específicos se pueden obtener con métodos químicos o enzimáticos. Por ejemplo, Bernhard Witkop y Erhard Gross descubrieron que el bromuro de cianógeno (CNBr) rompe cadenas polipeptídicas únicamente sobre el lado carboxílico de los residuos de metionina. Por lo tanto, con éste método, una proteína que contenga diez residuos de metionina proporcionará once péptidos. Cortes altamente específicos se pueden obtener también con la tripsina, un enzima proteolítico del jugo intestinal. La tripsina corta a las cadenas polipeptídicas por el lado carboxílico de los residuos de arginina y lisina, por lo tanto, una proteína que contenga diez residuos de lisina y siete de arginina, suministrará dieciocho péptidos mediante la digestión con tripsina. Cada uno de los péptidos trípticos formados, terminarán ya sea con arginina o con lisina. 
Los péptidos obtenidos por escición específica, química o enzimática, se separan mediante métodos cromatográficos. La secuencia de aminoácidos de cada péptido purificado es subsecuentemente determinada mediante el método de Edman. En este punto, la secuencia de los segmentos peptídicos generados por la degradación queda aún desconocida. La información adicional para determinar la secuencia de los segmentos generados se obtiene por superposición de péptidos. Para esto se utiliza un enzima distinto a la tripsina para cortar la cadena polipeptídica por enlaces diferentes. Por ejemplo, la quimotripsina corta preferencialmente sobre el lado carboxílico de los residuos aromáticos y otros residuos voluminosos apolares. Puesto que estos péptidos quimotrípticos se superponen sobre dos o más péptidos trípticos, pueden ser utilizados para obtener su ordenación. Así, queda determinada la secuencia completa de la proteína.
 péptidos trípticos péptido quimotríptico
Ala-Ala-Trp-Gly-Lys Val-Lys-Ala-Ala-Trp
Thr-Asn-Val-Lys
 
 péptido tríptico péptido tríptico
 _______________ __________________
 I I I I
 Thr-Asn-Val-Lys-Ala-Ala-Trp-Gly-Lys
 I________________I
 
 péptido quimotríptico
 superpuesto
Esta metodología se aplica a las proteínas que constan de una sola cadena polipeptídica sin ningúb enlace disulfuro. Procedimientos adicionales son necesarios para proteínas con más de una cadena polipeptídica o que contenga enlaces disulfuro. Para proteínas que contengan dos o más cadenas polipeptídicas unidas por enlaces no covalentes, se utilizan agentes desnaturalizantes tales como urea y el clorhidrato de guanidina para disociar las cadenas. Las cadenas disociadas deben ser separadas antes de determinar su secuencia. Para las cadenas polipeptídicas unidas covalentemente por puentes disulfuro, primeramente se procede a la reducción, con b-mercaptoetanol o ditiotreitol, de los enlaces disulfuro. Para prevenir la re asociación de los residuos de cisteína, estos son alquilados con iodoacetato para formar S- carboximetil derivados estables. 
La posición de los enlaces disulfuro puede ser determinada por la técnica de electroforesis diagonal. Primeramente, la proteína es escindida específicamente hasta péptidos bajo condiciones que preserve los enlaces disulfuro. La mezcla de los péptidos es sometida a electroforesis y subsecuentemente expuesta a vapores de ácido perfórmico, para de esa manera romper los enlaces disulfuro y convertir los residuos de cistína en residuos de cisteína. Así, los péptidos originalmente ligados por puentes disulfuro se encontrarán separados y también con carácter más ácido por la formación de un grupo SO3-.
R-Cisteína-S-S-Cisteína-R' + H2CO3 · R-Cisteína-SO3- + -O3S-Cisteína-R'
 CISTINA AC. PERFORMICO AC. CISTEICO
Esta mezcla se somete a electroforesis en dirección perpendicular bajo las mismas condiciones que en la primera electroforesis. Los péptidos que nunca tuvieron enlaces disulfuro tendrán una mobilidad igual a la primera vez, y como consecuencia todos estos se encontrarán ubicados en línea diagonal. Por el otro lado, los nuevos péptidos formados, conteniendo ácido cisteíco, migrarán en forma diferente al péptido original que contenía el enlace disulfuro y por lo tanto se encontrará fuera del patrón diagonal de migración.
La secuenciación proteíca ha sido revolucionada por la tecnología del DNA recombinante.
Cientos de proteínas han sido secuenciadas por el método de la degradación peptídica de Edman, derivado de escisiones específicas. La secuenciación proteíca es un evento laborioso que demanda mucho tiempo. La elucidación de secuencias de proteínas largas, aquellas con más de 1000 residuos, requieren de un esfuerzo sumamente especial. Afortunadamente, un proceso experimental complementario, basado en la tecnología del DNA recombinate, se encuentra al alcance hoy en día. Largos segmentos de DNA pueden ser clonados y secuenciados. La secuencia de los cuatro tipos de bases que integran el DNA -adenina(A), timina (T), guanina (G) y citosina(C)- revelan en manera directa la secuencia de los aminoácidos de la proteína codificada por el gen o la molécula correspondiente de RNA mensajero (mRNA).
GGG.TTC.TTG.GGA.GCA.GCA.AGG.AAG.CAC.TAT.GGG.GCA. DNA
Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala AMINOACIDOS
FIGURA ? Parte de la secuencia de nucleótidos del virus del SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida) especificada por el genoma de RNA del virus y la secuencia de los aminoácidos correspondientes deducida por el conocimiento del código genético.
La secuencia de aminoácidos deducida por lectura de la secuencia del DNA es aquella de la proteína original (naciente), o sea, el producto directo de la maquinaria traductora en los ribosomas, que liga los aminoácidos en la secuencia especificada por la cadena de mRNA. Pero, como se conoce, muchas proteínas son modificadas después de su síntesis. Así, algunas pierden residuos terminales, nuevas aparecen por cortes de algún péptido original más grande, otras oxidan sus residuos de cisteína para formar enlaces disulfuro con la misma proteína u otra diferente. También, residuos específicos de algunas proteínas son alterados, como aquellas dirigidas hacia membranas, que unen grupos carbohidratos a residuos específicos de asparragina. Por lo tanto, secuencias de aminoácidos derivadas de un DNA tienen gran información, pero no revelan modificaciones posttraduccionales, como las mencionadas. Es por este motivo, que los análisis químicos son necesarios para delinear la naturaleza de estos cambios, los cuales son críticos para la actividad biológica de la mayoría de proteínas. Así, la secuenciación del DNA y los análisis químicos de las proteínas son procesos complementarios para elucidar las bases fundamentales de la función proteíca. La tecnología del DNA recombinante a contribuido enormemente a proporcionar información más rápida y exacta de las secuencias de los aminoácidos, especialmente para proteínas con un gran número de residuos. Hoy en díase conoce la secuencia de aproximadamente 3000 proteínas con un número de residuos de más de106. 
La secuencia de aminoácidos provee gran información en una variedad de formas.
1. La secuencia de la proteína de interés puede ser comparada con secuencias conocidas para determinar si existen similitudes, pudiéndose cuestionar si la proteína pertenece a alguna familia ya establecida. Por ejemplo, mioglobina y hemoglobina, pertenecen a la familia de las globinas, quimotripsina y tripsina pertenecen a la familia de las serina proteasas. En este tipo de comparaciones se han logrado obtener resultados sorprendentes tal como el de una proteína que produce cáncer en un huesped susceptible que es casi idéntica a un factor de crecimiento celular totalmente normal.
2. La comparación de las secuencias de la misma proteína en diferentes especies da un conocimiento inmenso sobre las vias evolutivas. Relaciones genealógicas entre especies se pueden asumir a partir de las diferencias en secuencia entre dos proteínas. El tiempo de divergencia de los dos caminos evolutivos pueden ser estimados por el reloj evolutivo de mutaciones al azar. Por ejemplo, la comparación de albúminas de suero de primates indican que los seres humanos y los apes africanos han divergido únicamente hace cinco millones de años y no treinta millones como se pensaba.
3. Las secuencias de aminoácidos contienen señales que determinan el destino de las proteínas y controlan su procesamiento. Muchas proteínas destinadas para ser exportadas fuera de la célula o dirigidas hacia una membrana contienen una secuencia indicativa de aproximadamente veinte residuos hidrofóbicos de aminoácidos localizados en el lado amino terminal de la proteína, que los dirige a su destino. Además, sitios con potencial para la adición de unidades de carbohidratos a residuos de asparragina, pueden ser identificados encontrando en la secuencia Asn-X-Ser y Asn-X-Thr (X denota cualquier residuo). Pares de residuos básicos tales como Arg-Arg, marcan un sitio potencial para una escisión proteolítica como en el caso de proinsulina, el precursor de la insulina.
4. Datos de secuenciación proveen las bases para preparar anticuerpos contra una proteína específica. Anticuerpos específicos pueden ser muy útiles en la determinación de la cantidad de proteína y su distribuición en la célula.
5. Las secuencias de aminoácidos hacen posible elaborar sondas de DNA que son específicas para genes que codifican las proteínas correspondientes. 
Las proteínas pueden ser cuantificadas y localizadas por anticuerpos altamente específicos.
Un anticuerpo es una proteína sintetizada por un animal en respuesta a la presencia de una sustancia foránea, llamada antígeno. Los anticuerpos, también llamados inmunoglobulinas, tienen afinidad específica por los antígenos que provocaron su síntesis. Las proteínas, polisacáridos y ácidos nucléicos extraños a un sistema celular, pueden ser antígenos efectivos. Anticuerpos también pueden ser formados contra moléculas pequeñas como aquellos péptidos sintéticos, siempre y cuando la proteína pequeña esté ligada a un componente acarreador macromolecular. El grupo que reconoce el anticuerpo, en una molécula foránea, se denomina una determinante antigénica o epítopo. Los animales tienen un repertorio muy grande de células productoras de anticuerpos, cada una de ellas produciendo anticuerpos de especificidad única. El tipo de anticuerpo presente en el plasma sanguíneo, en mayor cantidad, es la inmunoglobulina G, una proteína de 150 kd, que contiene dos sitios idénticos para la unión con el antígeno. 
 
FIGURA ? Diagrama de la inmunoglobulina G (IgG), la clase mayoritaria de anticuerpos en el plasma sanguíneo. La IgG contiene dos unidades de unión al antígeno (Fab) y una unidad mediadora de funciones efectoras (Fc), tales como la lisis de las membranas celulares.
Los anticuerpos que reconocen una proteína en particular, pueden ser obtenidos inyectando la proteína a un conejo. Las inyecciones deben ser dos, a tres semanas de separación la una de la otra. Varias semanas después se obtiene la sangre del conejo inmunizado y se la somete a centrifugación. El suero resultante se denomina antisuero, que usualmente contiene el anticuerpo deseado. El antisuero o su fracción de inmunoglobulina G, puede ser utilizada directamente. Alternativamente, moléculas de anticuerpos específicas para el antígeno, pueden ser purificadas por cromatografía de afinidad. Los anticuerpos producidos en esta manera son policlonales. Esto significa que son productos de muchas poblaciones diferentes, de células productoras de anticuerpos, y por lo tanto, difieren de alguna manera en la precisión de la especificidad y afinidad por el antígeno. Un avance significativo de los últimos años es el descubriemiento de un método para la producción de anticuerpos monoclonales, con cualquier especificidad deseada. Los anticuerpos monoclonales, en contraste con los policlonales, son homogéneos, porque son producidos por una población de células idénticas (clones). Cada población de células de este tipo, descienden de una sóla célula híbrida, llamada hibridoma, formada por la fusión de una célula productora de anticuerpos con una célula tumoral, la cual tiene una capacidad ilimitada de proliferación.
Proteínas con alarmantes similitudes entre ellas, pueden ser distinguidas por la gran especificidad de los anticuerpos. Tanto así, que hasta la más mínima diferencia en la superficie (un sólo residuo) puede ser detectada. Los anticuerpos pueden ser utilizados como reactivos analíticos específicos, para cuantificar la cantidad de una proteína u otro antígeno. En un inmunoensayo de fase sólida, un anticuerpo específico para una proteína de interés, es ligado a un soporte polimérico, como puede ser una hoja de polivinilcloruro (PVC). A ésta, se le añade una gota de extracto celular, o se esparce una muestra de sangre u orina, para lograr la formación del complejo anígeno-anticuerpo, y luego se la somete a un primer lavado. A continuación se añade un anticuerpo específico, el cual reconoce un segundo sitio en el antígeno, y se vuelve a lavar la hoja de PVC para eliminar el exceso de anticuerpo. El segundo anticuerpo añadido, lleva una marca radioactiva o fluorescente que puede ser detectada con facilidad debido a su sensibilidad. La cantidad del segundo anticuerpo ligado a la hoja de PVC es proporcional a la cantidad de antígeno presente en la muestra. La sensibilidad por este método, puede ser incrementada aún más si el segundo anticuerpo está ligado a un enzima como la fosfatasa alcalina, ya que ésta convierte, de manera rápida, una sustancia incolora en un producto coloreado, o un substrato no fluorescente en un producto intensamente fluorescente. Menos de un nanogramo (10-9 g) de proteína puede ser medido por este ensayo inmunosorbente ligado a un enzima (ELISA), el cual es rápido y conveniente. Por ejemplo, con éste método, el embarazo puede ser detectado a los pocos días después de la concepción , utilizando la orina de la paciente como muestra biológica, para la detección de la hormona gonadotropina coriónica humana (HCG), una proteína de 37 kd, producida por la placenta.
Muy pequeñas cantidades de una proteína de interés, en una célula o líquido biológico, pueden ser detectadas por una técnica de inmunoensayo, denominada Western blotting. Una muestra es sometida a electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. Las proteínas resueltas en el gel, se transfieren a una hoja de nitrocelulosa (blotting) proporcionando mayor facilidad a la proteína de interés, para reaccionar con el anticuerpo específico añadido. El complejo antígeno-anticuerpo formado en la nitrocelulosa, puede ser detectado, enjuagando la hoja de nitrocelulosa con un segundo anticuerpo específico para el reconocimiento del primero. Marcando radioactivamente el segundo anticuerpo, se produce una banda obscura en una película de rayos X. Alternativamente,para detectar la proteína de interés, se puede utilizar un enzima que utilice como sustrato, el segundo anticuerpo, y que genere un producto coloreado.