Conocimientos Previos - PCR

Vista previa del material en texto

Fundamento de la PCR y tipos de PCR 
Mullis se basó en la replicación del ADN en los organismos eucariotas realizada por la DNA 
polimerasa. Estas enzimas realizan la síntesis de una cadena complementaria de DNA en el 
sentido 5´-> 3´ usando un molde de cadena sencilla, pero a partir de una región de doble cadena. 
Para crear esta región doble cadena se usan los denominados cebadores (primers). Son una 
pareja de oligonucleótidos sintetizados de manera que sean complementarios a cada uno de los 
extremos 3´ del fragmento de DNA que se desea amplificar. 
Partiendo de este principio, la reacción en Cadena de la Polimerasa se basa en la repetición de 
un ciclo formado por tres etapas: 
1ª Desnaturalización del ADN doble cadena 
2ª Hibridación de los cebadores a la zona 3´específica de cada una de las hebras 
3ª Extensión del cebador por actuación de la DNA polimerasa 
En la primera etapa (desnaturalización) la doble hélice de ADN se separa en dos hebras. 
Para ello se realiza una incubación de la muestra a altas temperaturas (93-97ºC). La 
renaturalización se producirá cuando la temperatura disminuya. 
En el segundo paso (hibridación) los cebadores se unen a las zonas 3´ complementarias 
que flanquean el fragmento que queremos amplificar. Se realiza gracias a la bajada de la 
temperatura (50-65ºC). 
En la tercera etapa (elongación) se produce la síntesis de una cadena sencilla 
(produciéndose un fragmento de doble cadena por la complementariedad) en la dirección 
5´-> 3´ mediante la enzima DNA polimerasa, la cual incorpora los deoxinucleótidos fosfato 
presentes en el medio siguiendo la cadena molde. 
Un termociclador es un aparato que regula la temperatura en cada ciclo de la PCR. 
La PCR se compone de varios ciclos, que se repiten unas 30 veces, dependiendo de la 
cantidad de muestra que necesitamos. Cada ciclo comprende la desnaturalización de la doble 
hebra de ADN y la síntesis de la una nueva cadena de ADN por cada cadena haya presente. 
En la primera parte del ciclo de una PCR, se desnaturalizan la moléculas de ADN de la 
muestra. Esto significa que las dos cadenas que forman cada molécula se separan, dando 
lugar a dos moléculas de ADN monocatenario. Normalmente, este primer paso se logra 
realizar mediante un aumento muy grande de la temperatura de la solución (aproximadamente 
a 95º). 
El siguiente paso de un ciclo de la PCR implica unas moléculas muy importantes, de las que 
hablaba antes, los cebadores. En este paso, se disminuye la temperatura de la solución para 
favorecer la unión de los cebadores al ADN monocatenario que habíamos obtenido en el 
proceso anterior. Recordad que los cebadores se unen al ADN de forma específica, así que 
solo amplificaremos la región de las moléculas que nos interese. 
Acto seguido, se ajusta la temperatura de la solución de nuevo, para que la ADN polimerasa 
pueda actuar a partir de los cebadores. La temperatura en este paso es dependiente de la ADN 
polimerasa que se esté utilizando. Por ejemplo, para la polimerasa Taq, la temperatura ideal 
está entre los 70 ºC y los 80 ºC. En este paso, la polimerasa utiliza como molde las cadenas de 
ADN monocatenario y va añadiendo al cebador los desoxirribonucleótidos-trifosfato 
complementarios a la cadena molde, formando una nueva cadena. 
 
¿Qué características debe tener el ADN utilizado en la reacción? 
Extracción de ADN debe de generar a un ADN puro 
Existen una serie de reglas sencillas para que el DNA molde no sea un problema en la reacción: 
 Integridad del ADN: no puede estar fragmentado en trozos más pequeños de lo que 
queremos amplificar. 
 Origen de la muestra y proceso de extracción: la muestra no debe llevar agentes 
quelantes (EDTA) que reducen la concentración de iones de Mg. en la disolución. 
Tampoco debe haber determinados factores sanguíneos, fenol, detergentes... que 
inhibirían la actividad de la polimerasa. 
 Cantidad de la muestra: si se dispone de suficiente cantidad para la amplificación de ADN 
genómico de copia única se usan cantidades de 100-500 ng. En el caso de zonas 
repetidas se puede reducir esta cantidad a 10-50 ng. El mínimo oscila entre 10-100 ng. y 
el máximo entre 400-500 ng. 
¿Qué tipos de ADN polimerasas se pueden emplear para PCR y que utilidad tienen? 
En la PCR se pueden utilizar diferentes ADN polimerasas, obtenidas de varios organismos. Sin 
embargo, la más utilizada dada su efectividad, es la ADN polimerasa de la bacteria Thermus 
aquaticus, también llamada Polimerasa Taq. Esta polimerasa es idónea para la PCR por su 
resistencia a las altas temperaturas que se utilizan en el proceso. 
 
 
Otros tipos de PCR 
 
PCR anidada: se trata de una variante de la PCR básica que utiliza dos pares de cebadores. En 
un primer paso, se realiza la amplificación de una región del genoma, para después concretar 
más la región mediante una segunda amplificación más específica. Esta PCR se utiliza 
para amplificar fragmentos muy específicos del genoma. 
RT-PCR: Esta técnica convierte el ARN de una muestra en ADN. Para ello utiliza la transcriptasa 
inversa, una enzima utilizada por los retrovirus Se utiliza para múltiples objetivos. Por ejemplo se 
puede utilizar para saber si un gen se está expresando en una muestra biológica. También se 
utiliza para genotipar diferentes virus de ARN, como el SARS-Co-V o el VIH. 
PCR cuantitativa: es una PCR que permite medir en tiempo real la cantidad de fragmentos que 
se van produciendo. Se utiliza a menudo para analizar la expresión de los genes. 
PCR múltiple: en este tipo de PCR se realizan amplificaciones simultáneas de más de un 
fragmento de ADN. Para ello, se utilizan varios cebadores diferentes en una misma reacción. 
PCR in situ: esta PCR se realiza en células o tejidos. Se utiliza para poder detectar secuencias 
de ADN en el interior de las células que no son detectables mediante otras técnicas. 
PCR digital: es una de las últimas generaciones en técnicas de amplificación de ADN. Está 
basada en la separación de cada muestra en múltiples particiones (microgotas), de forma que la 
reacción de amplificación se produce de forma independiente cada una de ellas. 
 
¿Qué características debe tener el buffer para la mezcla de reacción? 
La PCR se lleva a cabo en un tampón que proporciona un entorno químico adecuado para la 
actividad de la ADN polimerasa. El pH del tampón suele estar entre 8,0 y 9,5 y, a menudo, se 
estabiliza con Tris-HCl. 
Para la ADN polimerasa Taq, un componente común en el tampón es el ión potasio (K +) de 
KCl, que promueve la hibridación del cebador. 
A veces, el sulfato de amonio (NH4) 2SO4 puede reemplazar al KCl en el tampón. El ión 
amonio (NH4 +) tiene un efecto desestabilizador, especialmente en los enlaces de hidrógeno 
débiles entre el emparejamiento de bases cebador-molde mal emparejado, mejorando así la 
especificidad (Figura 8). Tenga en cuenta que las ADN polimerasas a menudo vienen con 
tampones de PCR que se han optimizado para una actividad enzimática sólida; por lo tanto, se 
recomienda utilizar el tampón proporcionado para lograr resultados de PCR óptimos. 
También se pueden añadir: 
 
En ciertos escenarios, se pueden incluir aditivos químicos o codisolventes en el tampón para 
mejorar la especificidad de la amplificación al reducir el cebado incorrecto y mejorar la 
eficiencia de la amplificación al eliminar las estructuras secundarias (Tabla 2). Además, algunas 
ADN polimerasas se suministran con potenciadores especialmente formulados optimizados 
para la ADN polimerasa y el tampón de PCR. Estos reactivos se utilizan comúnmente con 
muestras difíciles como las plantillas ricas en GC. Tenga en cuenta que el uso de aditivos 
químicos o codisolventes puede afectar el recocido del cebador, la desnaturalización del molde, 
la unión de Mg2 + y la actividad enzimática. Además, pueden interferir con ciertas aplicaciones 
posteriores, por ejemplo, detergentes no iónicos en experimentos de microarrays. Por lo tanto, 
esimportante conocer las composiciones de tampón para una PCR exitosa y un uso posterior. 
Tampón de la reacción 
Por lo general está formado por: 10 mM tris-HCl (pH=8.4 a Tª ambiente), 50 mM ClK, 0.1% w/v 
gelatina y 1.5 mM MgCl2. 
Algunos autores recomiendan el uso de adyuvantes, los cuales ayudarían en la práctica a 
aumentar la especificidad y fidelidad de la reacción en cadena de la polimerasa. El 
dimetilsulfóxido (DMSO) añadido al buffer de la reacción en un 10% contribuye a la disminución 
de la estructura secundaria del ADN (Anderson, 1990). También se pueden usar detergentes 
como el tween 20, laureth 12 (0.1%) o Tritón x10, que ayudan a estabilizar la enzima. Existen 
también protocolos que incorporan polietilenglicol (PEG), glicerol, formamida, seroalbúmina 
bovina (BSA), etc, aunque no son en ningún caso imprescindibles. 
 
Sales 
Es de gran importancia la concentración de dos cationes que son añadidos en forma de sales. 
 Cloruro potásico (KCl). Influye en la desnaturalización del ADN. 
o Elevadas concentraciones del ión K+ favorece la desnaturalización de secuencias 
cortas de ADN. 
o Bajas concentraciones de K+ ayudan a la desnaturalización de secuencias largas 
de ADN. 
 
 Cloruro de magnesio (MgCl2). Aumenta la temperatura de hibridación del DNA. La 
concentración de este ion resulta fundamental para la optimización de la reacción. 
o Altas concentraciones de Mg++ disminuyen la especificidad de la PCR. 
o Bajas concentraciones de Mg++ aumentan la especificidad de la reacción. 
¿Cuál es la función del Mg en la reacción de PCR? 
Dado que el Mg2 + tiene un efecto estabilizador similar al K +, las concentraciones 
recomendadas de MgCl2 son generalmente más bajas cuando se usa un tampón de KCl (1,5 ± 
0,25 mM) pero más altas con un tampón (NH4) 2SO4 (2,0 ± 0,5 mM). 
Debido a los efectos antagonistas de NH4 + y Mg2 +, los tampones con (NH4) 2SO4 ofrecen 
una mayor especificidad de cebador en un amplio rango de concentraciones de Mg2 + (Figura 
9). Es importante seguir las recomendaciones de tampón del proveedor de la enzima, ya que el 
tampón de PCR óptimo depende de la ADN polimerasa utilizada. 
 
¿Qué características deben cumplir los primers para una reacción de PCR? 
Los cebadores son oligonucleótidos, secuencias cortas de ADN, que se unen a la molécula de 
ADN molde y sirven como punto de inicio para comenzar la síntesis de ADN. En la PCR 
necesitamos dos cebadores, cada uno complementario a una cadena del ADN que buscamos 
amplificar. Estos oligonucleótidos determinan la región del ADN a amplificar. 
Para la elección de los primers, existen una serie de normas que nos pueden ayudar, aunque 
hay que indicar también que existen programas de ordenador que nos facilitan esta tarea 
(DNAsis, Primer3, etc.). 
 El contenido en G + C debe ser aproximadamente del 50%. La relación máxima de 
purinas/pirimidinas será 60%/40%. 
 Deben evitarse zonas con largas secuencias de una sola base. 
 No seleccionar cebadores que en su extremo 3´ tenga una importante estructura 
secundaria. 
 Se recomienda que los extremos las últimas bases sean G o C. 
 Se debe evitar la complementariedad entre la pareja de primers. Si ésta existe entre los 
extremos 3´, se aumenta la posibilidad de que se creen dímeros de cebadores. 
 Normalmente deben tener un tamaño de 18-30 pb. 
 La Tª de hibridación de los cebadores ha de ser similar en ambos y será variable en 
función de la secuencia de los mismos. Generalmente oscila entre 45 y 65ºC. 
 Si el primer es menor a 20 pb, la temperatura de fusión (Tm), se calcula en base a la 
siguiente fórmula: 
Tm= 4 (G+C) + 2(A+T) 
Siendo G, C, T y A el número de cada una de las bases que forman cada uno de los 
oligos. La temperatura de hibridación debe ser aproximadamente 5ºC menor que la 
temperatura calculada. 
Factores que afectan la PCR 
 contaminaciones, ya que es posible que el ADN no deseado (aunque se encuentre en 
una cantidad muy pequeña) se amplifique y obtengamos un resultado que no es real. 
 Temperatura 
 Concentraciones diferentes a las recomendadas 
Explique qué son las secuencias de inserción Alu, ¿qué otros tipos de secuencias existen para 
conocer la variabilidad génica de una población existen y cuál es su utilidad? 
 (Forma parte de los SINES Short Interspersed Nuclear Elements Elementos nucleares 
dispersos cortos) Una secuencia Alu es un fragmento de ADN de aproximadamente 
300 pares de bases que con ligeras variaciones puede encontrarse en un gran número 
de lugares en el genoma de los primates. Las primeras secuencias de este tipo se 
identificaron mediante la endonucleasa Alu, de la cual han recibido su nombre, aunque 
actualmente se analizan mediante técnicas basadas en la reacción en cadena de la 
polimerasa y electroforesis. Son las secuencias móviles más abundantes del genoma 
humano. Derivan probablemente del gen 7SL ARN, que forma parte del complejo 
ribosomal. La aparición de las secuencias Alu se sitúa hace aproximadamente 65 
millones de años, coincidiendo con el origen y expansión de los primates.1 
Las secuencias Alu es el resultado aparente de un retrotransposición donde en el 
momento de su inserción la mayoría de los nucleótidos se conservan idénticos. Estas 
posiciones CONSBI (conserved before insertion) son útiles porque los cambios que 
hayan ocurrido después de la inserción son reconocibles y la divergencia que resulta de 
las sustituciones, inserciones y delecciones es informativa. La divergencia de las 
secuencias Alu en las posiciones CONSBI es una medida del tiempo desde que fueron 
insertadas. 
 SINE constituyen el 13% del genoma humano y su longitud varía entre 100 y 400 pares 
de bases (bp), siendo la mayor parte de unas 300bp. Son derivados de genes 
estructurales del ARN. La mayoría contienen una secuencia rica en A/T en su extremo 
3’ y son transcritos por la ARN polimerasa III, la misma enzima nuclear que transcribe 
los genes que codifican para los ARN de transferencia, ARN ribosómico 5S y otros ARN 
estables pequeños. 
 SVAs es otro tipo de elemento SINE, también activo en el genoma humano, es un 
retrotransposón formado por porciones de otros retrotransposones. La estructura típica 
de Elementos Móviles en el Genoma Humano 33 un elemento SVA (del inglés SINE-
VNTR-Alus) es la siguiente, presenta en su extremo 5’ una repetición del hexámero 
CCCTCT seguido de dos elementos ALU antisentido, seguido de un número variable de 
secuencias repetidas en tándem ricas en GC, y por último, una secuencia que tiene 
homología con el gen ENV y una secuencia LTR procedentes ambas de un retrovirus 
endógeno ancestral, seguido todo ello de una señal de poliadenilación canónica 
https://es.wikipedia.org/wiki/ADN
https://es.wikipedia.org/wiki/Endonucleasa
https://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_en_cadena_de_la_polimerasa
https://es.wikipedia.org/wiki/Reacci%C3%B3n_en_cadena_de_la_polimerasa
https://es.wikipedia.org/wiki/Electroforesis
https://es.wikipedia.org/wiki/Secuencia_Alu#cite_note-1
AATAAA .Las inserciones de SVA tienen más o menos una longitud de 2.000 pares de 
bases aunque pueden oscilar entre 700 y 4.000 pares de bases. 
 LINE Long Interspersed Nuclear Elements (Elementos nucleares dispersos largos). 
Constituyen el 20 % del genoma humano, contiene unos 100 000-500 000 copias de 
retrotransposones L1 que es la familia de mayor importancia cuantitativa, es una 
secuencia de 6 kb repetida unas 800 000 veces de modo disperso por todo el genoma, 
aunque la gran mayoría de las copias es incompleta al presentar el extremo 5' truncado 
por una retrotranscripción incompleta. Así, se estima que hay unas 5000 copias 
completas de L1, sólo 90 de las cuales son activas, estando el resto inhibidas 
por metilación de su promotor. 
https://es.wikipedia.org/wiki/Metilaci%C3%B3n