PRACTICA N 5 - Degradacion de Aminoacidos

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UNIVERSIDAD CATÓLICA SANTA MARÍA
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACÉUTICAS, BIOQUÍMICAS Y BIOTECNOLÓGICAS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERÍA BIOTECNOLÓGICA
CURSO: BIOQUÍMICA APLICADA
DOCENTE: JULITZA LINDSEY PAREDES FUENTES
GRUPO: 1 - “C”
PRESENTADO POR:
GONZALES LOAIZA GRECIA SHIRLEY
HUALPA RODRIGUEZ PAOLA FABIOLA
MARTINEZ CANDIA VYCTORIA LUZ
MOROCCO BASTIDAS VALENTINA FABIANA
PINTO AMESQUITA DANIELA ALEJANDRA 
 AREQUIPA-2021
PRACTICA No 5
DEGRADACIÓN DE AMINOÁCIDOS: TRANSAMINACIÓN 
RELACIÓN DE EXPERIMENTOS
1. Transaminación utilizando un extracto enzimático de hígado de paloma 
INTRODUCCIÓN 
La transaminación es el proceso que consiste en la transferencia reversible del grupo amino desde un aminoácido hasta un cetoácido , dando como resultado conversión del primero en un cetoácido y el segundo en un nuevo aminoácido Esta reacción es de gran importancia en el metabolismo de los aminoácidos y es catalizada por enzimas llamadas TRANSAMINASAS o Aminotransferasas, presentes en la mayoría de tejidos animales. El cofactor de estas enzimas es el piridoxal fosfato y para casi todas las transaminasas el alfa-cetoglutarato es el aceptor del grupo amino, formándose por tanto ácido glutámico.
 R-C-COO- 
 R-CH-COO- 
 OOC-CH2-CH2-C-COO - - ceto Glutarato
O
O
NH3
NH3
OOC-CH2-CH2-CH-COO-
Glutamato
Enzima
H
 C = O
H
 H - C -NH2 
Enzima
 
 
 
 
 L-aminoácido + alfa-cetoglutarato alfa-cetoácido + L-glutámico
El interés clínico está centrado especialmente en dos transaminasas: L-alanina: alfa-cetoglutarato aminotransferasa (Transaminasa glutámico Pirúvica o TGP) y L-aspartato: alfa-cetoglutarato aminotransferasa (Transaminasa Glutámico Oxalacética o TGO). Estás enzimas tienen una acción eminentemente intracelular, por lo que la actividad sérica en condiciones normales es baja o nula. Un aumento de actividad será evidencia de un deterioro de los tejidos en que se encuentran de los cuales resultan particularmente importantes corazón e hígado. 
Se ha observado que luego de un infarto de miocardio se produce en suero un marcado aumento de la actividad de TGO, debido a la liberación al torrente sanguíneo de esta enzima tan abundante en el miocardio. En este caso no existirá aumento de la actividad sérica de TGP o será mínimo.
En hepatitis vírales u otras formas de enfermedad hepática que involucren necrosis de tejido, habrá también un incremento considerable de la actividad sérica de transaminasas, incluso antes de la aparición de síntomas clínicos como la ictericia. En este caso TGP será la enzima predominante debido a su gran concentración en el tejido hepático. Una elevada actividad de transaminasas puede detectarse también en otras condiciones como: traumas accidentales o quirúrgicos, pancreatitis aguda, distrofias musculares, etc.
TRANSAMINACIÓN EN PRESENCIA DE UN PREPARADO DE HÍGADO DE PALOMA
Objetivo:
Aplicación de la técnica de cromatografía en capa fina para estudiar la transaminación en presencia de un preparado de hígado de paloma como fuente enzimática, utilizando alanina y aspartato como substratos.
Procedimientos:
Preparación de la fuente enzimática (Polvos acetónicos):
Los hígados recientemente extraídos de 4 pichones son homogeneizados en 10 volúmenes de acetona fría durante un minuto, luego de filtrar y lavar varias veces, el residuo obtenido es secado a temperatura ambiente obteniéndose así polvos secos, fáciles de conservar. 
El día de la práctica se muelen en un mortero 700 mg de polvos acetónicos con 7 ml de agua destilada y luego se centrifuga el preparado a 2000 r.p.m. por 10 minutos. Se decanta el sobrenadante y se completa el volumen a 35 ml con agua destilada. 
La acetona por su acción deshidratante facilita la extracción de enzimas de los tejidos. En esta forma la acetona reduce la desnaturalización de las (enzimas) proteínas y concomitantemente produce la desintegración de las estructuras celulares y la disrupción de los enlaces lipoproteicos. 
Preparación del experimento de la transaminación. 
En cuatro tubos de prueba (13 x 100 mm), previamente lavados con HNO3 concentrado, medir lo siguiente : 
	
REACTIVOS
	SISTEMAS
	
	
	I
	II
	III
	IV
	Alanina 0.05 M
	0,2 ml
	-
	-
	-
	Glutamato 0.05 M
	-
	0,2 ml
	-
	-
	Aspartato 0.05 M
	-
	-
	0,2 ml
	0,2 ml
	alfa-cetoglutarato 0.1 M
	0,2 ml
	-
	0,2 ml
	0,2 ml
	Piruvato 0.1 M
	-
	0,2 ml
	-
	-
	Extracto enzimático
	0,2 ml
	0,2 ml
	0,2 ml
	-
	Extracto enzimático hervido
	-
	-
	-
	0,2 ml
Mezclar el contenido de cada sistema y luego incubar en baño maría a 37 oC durante una hora
Identificación de los productos de la reacción por cromatografía en capa fina:
En una placa de Sílica Gel, de 200 x 200 mm, marcar los puntos de origen a 15 mm del borde inferior, con una distancia entre ellos de 25 mm y en el siguiente orden: Uno para cada uno de los cuatro tubos de experimento y tres para los tres estándares de : Alanina, Glutamato y Aspartato. Estos sistemas estándares deberán ser preparados de la siguiente manera:
Medir 0.2 ml del Aminoácido (Alanina, Glutamato o Aspartato) que previamente se encuentra a concentración 0.05 M y agregar 0.8 ml de agua. 
Aplicar utilizando tubos capilares de vidrio y en el punto de origen que les corresponde, 10 μL de cada sistema incubado y 2 μL de las soluciones estándar de aminoácidos en alícuotas de no más de 1 μL cada vez, dejando secar cada área después de cada aplicación. Al final, colocar la placa en la cámara cromatográfica conteniendo como solvente 75 volúmenes de fenol y 25 de agua. 
La cromatografía termina cuando el solvente alcanza la línea marcada a 10 cm de los puntos de origen. Entonces sacar la placa, secarla en la estufa a 110 ºC por 3 minutos, y revelar el cromatograma rociando una solución de ninhidrina al 0.1% en n-butanol saturado con agua y luego dejarla secar. La representación esquemática de los resultados obtenidos luego de revelar el cromatograma se muestra en la siguiente página.
Expresión de Resultados: (Paola)
Calcular los Rf x 100 de cada mancha, completar la siguiente tabla e interpretar el cromatograma con los resultados obtenidos. Haga un comentario de cada uno de los sistemas preparados:
	MANCHAS
	Rf
	Sistema 1
	1
	 26.54
	
	2
	 65.43
	Sistema 2
	3
	 26.54
	
	4
	 65.43
	Sistema 3
	5
	 16.67
	
	6
	 26.54
	Sistema 4
	7
	 16.67
	Estándar de Alanina
	 65.43
	Estándar de Glutamato
	 26.54
	Estándar de Aspartato
	 16.67
Cálculos:
· Sistema 1:
· Mancha 1 → 
· Mancha 2 → 
· Sistema 2:
· Mancha 3 → 
· Mancha 4 → 
· Sistema 3:
· Mancha 5 → 
· Mancha 6 → 
· Sistema 4:
· Mancha 7 → 
· Estándar de Alanina → 
· Estándar de Glutamato → 
· Estándar de Aspartato → 
Haga la identificación de cada una de las manchas señalando a qué aminoácido corresponde en base a sus valores de Rf. Tenga en cuenta que los valores de Rf para los estándares de Alanina, ac. glutámico y ac. Aspártico encontrados en el experimento, para el solvente usado en la presente cromatografía. (Grecia) 
	MANCHAS
	AMINOÁCIDO
	Sistema 1
	1
	Glutamato
	
	2
	Alanina
	Sistema 2
	3
	Glutamato
	
	4
	Alanina
	Sistema 3
	5
	Glutamato
	
	6
	Aspartato
	Sistema 4
	7
	Aspartato
INTERROGANTES BIOQUÍMICAS
1. ¿Qué es Rf ? (Grecia)
El factor de retención es la distancia que recorre la muestra desde el punto de aplicación / distancia que recorre el disolvente hasta el frente del eluyente [1]. 
2. ¿Cuáles son las reacciones catalizadas por TGO y TGP? (Paola)
· Sistema 1: La alanina aminotransferasa (ALT/GPT) cataliza la transferencia del grupo amino de la alanina al α-cetoglutarato con la formación de glutamato; y, al ser una reacción reversible, se vuelve a formar alanina.
·Sistema 2: La alanina aminotransferasa (ALT/GPT) cataliza la transferencia del grupo amino del glutamato al piruvato con la formación de alanina; y, al ser una reacción reversible, se vuelve a formar glutamato.
· Sistema 3: La aspartato aminotransferasa (AST/GOT) cataliza la transferencia del grupo amino del aspartato al α-cetoglutarato con la formación de glutamato; y, al ser una reacción reversible, se vuelve a formar el aspartato.
· Sistema 4: En el último sistema no hubo reacción enzimática, puesto que el extracto enzimático utilizado fue hervido, en consecuencia las enzimas murieron. Por ello, sólo se reconoció al Aspartato.
3. ¿Cuál es el objeto del sistema 2? (Grecia) 
· Observar la reacción reversible con la enzima TGP.
· Formación de la Alanina.
4. Explique el mecanismo que permite la separación de sustancias por cromatografía en capa fina (Daniela)
· La cromatografía en capa fina es un método muy valioso utilizado en bioquímica para la separación y análisis de una amplia variedad de mezclas moleculares, prácticamente su mecanismo consiste en una capa de 0.1 mm de material adsorbente junto a una capa o soporte de plástico; este último se compone de muchas placas microscópicas, donde se va a producir la separación cromatográfica, luego se aplica la solución a la superficie adsorbente y se deja secar; dicha placa es colocada en un recipiente, especialmente en un vaso, que va a contener el disolvente; este último se va a introducir al en la parte seca y se va deslizando hacia arriba arrastrando la muestra, la migración va a depender de la estructura química. [2]
Figura 1. Cubeta con el eluyente y la placa.
5. ¿Se desprende amoniaco libre en el medio durante una reacción de transaminación ? Fundamente su respuesta (Valentina)
Se da a partir de la mayoría de los aminoácidos que se metabolizan en el hígado su forma de transporte en aminoácido de alanina y glutamato donde el exceso de amoniaco se libera y se transforma hasta la urea. El amonio libre es tóxico por lo cual tiene que pasar por un proceso de degradación de aminoácidos en el tejido periférico donde se transforma en urea para su excreción. 
6. Pronostique el efecto de una deficiencia de vitamina B6 sobre la degradación de los aminoácidos. ¿La degradación de los 20 aminoácidos sería afectada? (Daniela)
La vitamina B6 (vitamina hidrosoluble) que se ingiere con la dieta debido a que el cuerpo es incapaz de sintetizar; la piridoxal, junto con la piridoxina y la piridoxamina, es una de las tres formas químicas no fosforiladas en las que se manifiesta la vitamina B6, el consumo de una dieta balanceada y variada cubrirá los requerimientos diarios de vitamina B6, esta dieta es ayuda en la prevención en la aparición de enfermedades asociadas al déficit PLP (forma activa) como la encefalopatía epiléptica sensible al PLP y las enfermedades cardiovasculares asociadas a la hiperhomocisteinemia. [3]
7. ¿Cuál será la distribución celular de la TGO y TGP ? (Valentina)
· TGO / AST: Su distribución celular es el miocardio, hígado,músculo estriado , riñones, páncreas, bazo, pulmones y eritrocitos.
· TGP / ALT: La distribución celular se presenta en el hígado pero en menor concentración, músculo esquelético,páncreas,bazo y pulmones. 
8. Si se administra glucosa con C14 a un animal, los carbonos marcados se incorporan en una proteína. Señale algunas secuencias de reacciones que permitan explicar este fenómeno.
La glucosa es el principal sustrato de energía de la célula y para ingresar requiere una proteína. En la degradación de la proteína se da los aminoácidos cuando pierden el grupo amino se pueden trasladar pero no se encuentran libres hasta el hígado para su eliminación a partir de allí se separa del grupo carbonada dando reacciones :
· Transaminación: transaminasa
· Desaminación: Glutamato DHasa
· Desaminación: Glutaminasa 
· Transaminación: ALAT o GPT 
 
9. Si se utilizara leucina y α-ceto glutarato para estudiar la transaminación; qué productos se podría identificar? ¿Qué nombre propondría para la enzima involucrada? (Daniela)
Los productos que se podrían identificar de la transaminación de leucina y α-ceto glutarato, es el alpha-ketoisocaproic acid (KIC) y L - glutamato; el nombre de la enzima involucrada es la leucina aminotransferasa. [4]
10. ¿Es factible la identificación de cetoácidos mediante cromatografía? ¿De qué manera? (Vyctoria)
Aunque no es el método más común, si es posible realizarlo, y se hace mediante una cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) las cuales se caracterizan por generar datos muy exactos y se aplican mayormente para análisis de orina humana. El método consiste en hacer reaccionar los cetoácidos con 2,4 dinitrofenilhidrazina u orto-fenilendiamina y separar los productos en HPLC, para identificarlos según sus picos cromatográficos. [5][6] A pesar de que sea un método muy exacto, es muy costoso y de un procedimiento difícil, por lo que no se recomendaría para prácticas de laboratorio, en vez de eso, existen otras pruebas bioquímicas más sencillas, pero que detectan solo la presencia o ausencia de cetoácidos en la orina, la más conocida es mediante la reacción con dinitrofenilhidrazina, la cual detecta los alfa-cetoácidos. [7]
 
REFERENCIAS
1. Uam.es. [cited 2021 Sep 30]. Available from: http://www.qfa.uam.es/qb/practicas/P6-guion.pdf 
2. PRINCIPIOS DE LA CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA 4 u 8 grupos de estudiantes [Internet]. Available from: https://www.bioted.es/wp-content/uploads/2020/02/PRINCIPIOS-CROMATOGRAFIA-EN-CAPA-FINA-1.pdf 
3. Galán Cruz E. FACULTAD DE FARMACIA UNIVERSIDAD COMPLUTENSE TRABAJO FIN DE GRADO TÍTULO: FOSFATO DE PIRIDOXAL, MECANISMOS DE ACCIÓN Y PATOLOGÍAS ASOCIADAS A SU DEFICIENCIA [Internet]. Available from: http://147.96.70.122/Web/TFG/TFG/Memoria/ELADIO%20GALAN%20CRUZ.pdf
4. Taylor RT, Jenkins WT. Leucine Aminotransferase. Journal of Biological Chemistry [Internet]. 1966 Oct [cited 2021 Oct 6];241(19):4391–5. Available from: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021925818997334
5. Antonucci A, Pecci L, Montefoschi G, Cavallini D. High performance liquid chromatography of keto acids. [Internet]. 1990 [cited 4 October 2021];1(4). Available from: https://ezproxy.ucsm.edu.pe:2197/article/10.1007/BF03001784
6. Bóveda M, Fraga J, Peña J, Fernández J. Determinación de alfa-cetoácidos en orina por cromatografía líquida de alta resolución. Aplicación a un paciente con enfermedad de la orilla con olor a jarabe de arce. Química Clínica [Internet]. 1985 [cited 4 October 2021];4(3). Available from: https://www.seqc.es/download/revista/694/1698/26418499/1024/cms/Qumica%20Clnica%201985;4%20(3)%20193-197.pdf/
7. Mesa Herrera N, Carmona Carmona C, Burgos Herrera L. Pruebas bioquímicas para la detección de metabolitos producidos en los errores innatos del metabolismo. IATREIA [Internet]. 2014 [cited 4 October 2021];27(4). Available from: https://www.redalyc.org/pdf/1805/180532151005.pdf
EXPERIMENTO 2
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD DE ALANINA AMINO TRANSFERASA (TGP) EN SUERO SANGUÍNEO
Objetivos
· Estudio de la transaminación en sueros normales y patológicos
· Aplicación del método colorimétrico de Reitman y Frankel para la determinación de la actividad de la TGP sérica.
Métodos.
Determinar la cantidad de piruvato formado luego de reaccionar Alanina y α-ceto Glutarato en presencia de la TGP del suero utilizando la reacción con la 2,4 dinitrofenilhidrazina en medio alcalino.
Procedimiento:
En dos tubos de ensayo rotulados como B (Blanco) y D (Desconocido), colocar:
	REACTIVOS
	B
	D
	Sustrato TGP (Alanina y α−ceto glutarato en Tampón Fosfato pH 7.4)
	0.25 ml
	0.25 ml
	Colocar en Baño maría a 37 ºC por 2 minutos y luego agregar:
	Suero sanguineo
	------
	50 μl
	Agua destilada
	50 μl
	------
	Mezclar por agitación suave. Incubar exactamente por 30 minutos y luego agregar:
	Reactivo 2.4 DNFH ( 2,4 Dinitrofenilhidrazina)
	0.25 ml
	0.25 ml
	Mezclar. Dejar durante 10 minutos a 37 ºC. Luego agregar:
	NaOH 0.4 M
	2.5 ml
	2.5 ml
Mezclar por inversión y retirar del baño.Después de 2 minutos leer en el fotocolorímetro con filtro verde (500-550 nm), llevando previamente el aparato a cero D.O. con agua destilada.
Expresión de Resultados:
1. Complete la siguiente Tabla: (Grecia)
	Absorbancias
	1 Muestra
	0.368
	0.345
	0.330
	2 Muestra
	0.083
	0.071
	0.058
· SISTEMA 1
· SISTEMA 2
	
	1 Muestra U/L
	2 Muestra U/L
	Actividad de TGP (U/L)
	33.25
	21.875
2. Haga un breve comentario del experimento realizado y del valor de actividad transaminásica obtenida.
· Muestra 1: Según el primer valor de la actividad de TGP que fue de 33.25 U/L se puede determinar que es un hombre.
· Muestra 2: Según el primer valor de la actividad de TGP que fue de 21.875 U/L se puede determinar que es una mujer.
Interrogantes Bioquímicas.
1. ¿Qué papel desempeña el piridoxal fosfato en las reacciones de transaminación?¿Cuál es el grupo funcional del cofactor? Explique su mecanismo (Vyctoria)
El piridoxal fosfato es el cofactor de las enzimas transaminasas, es decir, que es necesario para que la reacción enzimática pueda llevarse a cabo. Su grupo funcional es el carbonilo (aldehído), y es por el cual el grupo amino se une al co-factor y es transportado al alfa-cetoácido. Su mecanismo se explica de la siguiente forma:
 
Figura 2. Transporte del grupo amino mediante PLP. 
El grupo amino del aminoácido se transfiere al piridoxal fosfato por el carbono del aldehído y se transforma en piridoxamina fosfato, luego, la piridoxamina entrega el aminoácido al cetoácido correspondiente para formar el aminoácido. En este proceso se regenera el PLP y continua transfiriendo en posteriores reacciones. [1]
2. ¿Participan las reacciones de transaminación en la biosíntesis de aminoácidos? Cite algunos ejemplos. (Grecia)
Si participan, y como ejemplo tenemos a la reacciones catalizadas por TGO y TGP:
 TTGP
· 
 TTGO
· 
3. Qué otro método, además del que se usó en esta práctica, podría emplear para detectar los productos de la reacción de transaminación. (Vyctoria)
El método utilizado en esta práctica fue la determinación de la actividad de la TGO mediante la oxidación de NADH+H. Como método alternativo está la colorimetría de Reitman Frankel que consiste en cuantificar el piruvato como producto de la reacción de transaminación de los sustratos (Alanina y α−ceto glutarato), los cuales, deben ser preparados previamente, y, la enzima TGP proveniente del suero sanguíneo de un paciente. El piruvato se hace reaccionar con 2,4 dinitrofenilhidrazina en medio alcalino y se evalúa su absorbancia en filtro verde (500-550 nm). [2] Las desventajas son que el proceso requiere de un tiempo prolongado y es costoso debido a los sustratos y cantidad utilizada. [2] 
4. ¿Qué pensaría de un ensayo en el cual una muestra biológica como el suero se mezclara con aspartato, alfa-cetoglutarato, NADH y un exceso de malato deshidrogenasa ? ¿Qué idearía para determinar la actividad de TGP por un método similar ?. (Grecia)
 TTGO
· 
 DESHIDROGENASA
· 
REFERENCIAS
1. Galán Cruz E. FOSFATO DE PIRIDOXAL, MECANISMOS DE ACCIÓN Y PATOLOGÍAS ASOCIADAS A SU DEFICIENCIA. Universidad Complutense Facultad de Farmacia; 2017.
2. Costa J. Reitman-Frankel Método colorimétrico [Internet]. Linear.es. [cited 6 October 2021]. Available from: http://www.linear.es/ficheros/archivos/1130010C.pdf