PRACTICA 7 - ACTIVIDAD Y CINETICA DE FOSFATASA ALCALINA

Vista previa del material en texto

PRÁCTICA 7: ACTIVIDAD Y CINÉTICA DE FOSFATASA ALCALINA
OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA:
1. Entender y practicar los principios de la espectrofotometría
2. Aprender a manejar micropipetas automáticas
3. Familiarizarse con el concepto de actividad enzimática y su utilización en clínica
4. Calcular velocidades de reacción
5. Utilizar métodos gráficos para el cálculo de la constante de Michaelis-Menten (KM) y
Velocidad máxima (Vmax) de las enzimas.
INTRODUCCIÓN
Los enzimas son los catalizadores de las reacciones bioquímicas. La medida de la actividad
de una enzima y la comprensión de las variables que la afectan es importante no sólo para
entender la biología de la célula sino también para el diagnóstico clínico. Cuando se
producen lesiones celulares como inflamación o necrosis de los tejidos, ciertas enzimas
pasan al plasma y sus niveles aumentan.
Estos niveles enzimáticos en plasma se analizan para detectar la enfermedad y llegar al
diagnóstico diferencial. Una concentración anormalmente alta de una enzima en sangre
(manifestada por un anormal aumento de su actividad) puede ser debida a la destrucción de
células de un tejido rico en dicha enzima o al aumento del número de células, como ocurre
en los tumores. Por el contrario, una baja actividad enzimática indicaría un trastorno del
tejido en cuestión. Los niveles enzimáticos también pueden ser útiles para ver el curso del
tratamiento. Por esta razón la enzimología clínica es un aspecto fundamental del laboratorio
clínico.
FOSFATASA ALCALINA
La fosfatasa alcalina es una enzima, implicada en el transporte de metabolitos a través de las
membranas celulares, que hidroliza el enlace éster fosfórico entre un grupo fosfato y un
radical orgánico, liberando fosfato inorgánico.
Las fosfatasas alcalinas, como su nombre lo indica, presentan su máxima actividad a pHs
entre 9 a 10,5 y catalizan la hidrólisis de ésteres monofosfato. La reacción general es la
siguiente:
H2O + R- ‐PO4H2– ______ R- ‐OH + PO4H2–
Hay distintas isoenzimas de la fosfatasa alcalina y se encuentran ampliamente distribuidas en
los tejidos humanos tales como hueso, placenta, intestino, bazo y riñón; se desconoce su
función biológica precisa. Los niveles de la fosfatasa alcalina en plasma son la suma de las
isoenzimas procedentes de los distintos órganos. Los valores normales de su actividad en
plasma oscilan entre 30 a 100 U/L (µmoles/min/L de suero). Se encuentra presente en casi
todos los tejidos del organismo, siendo particularmente alta en huesos, hígado, placenta,
intestinos y riñón. Se han descrito a las distintas isoenzimas de la fosfatasa alcalina, con leves
diferencias en su estructura. La concentración de esta enzima en suero varía en función de la
edad:
Adultos 40 a 140 U/L
Niños menores de 2
años
85-235 U/L
Niños entre 2 y 8 años 65-120 U/L
Niños entre 9 y 15 años 60-300 U/L
Adolescente 16-21 años 30-200 U/L
Importancia clínica
Las causas más probables del aumento de los niveles de concentración de la fosfatasa alcalina
son por consumo excesivo de alcohol, anemia, cáncer de huesos, cáncer de próstata,
colestasis, enfermedades de huesos, enfermedades de hígado, enfermedades renales.
Pueden observarse elevaciones moderadas debido a la presencia de fracturas óseas o debido a
una hepatitis infecciosa. Mientras que las causas más probables de la disminución de los
niveles de esta enzima son el cretinismo y el déficit de vitamina C de Zinc, magnesio o
proteínas.
Su concentración también desciende temporalmente tras someterse a una transfusión
sanguínea o un by-pass cardíaco.
EXPERIMENTO 1:
1. Determinación de la fosfatasa alcalina en suero de un paciente
deSe utiliza como sustrato el p-nitrofenilfosfato (pNFP). La fosfatasa alcalina cataliza la
hidrólisis del pNFP a p-nitrofenol (pNF) y fosfato, en un medio alcalino. La reacción se
detiene con NaOH (muy concentrado); el p-nitrofenol (pNF) en solución alcalina es amarillo
y su concentración puede ser determinada espectrofotométricamente, a 405 nm. La
absorbancia de la solución (intensidad de color amarillo) es una medida de la concentración
del producto.
Material:
- Tubos de ensayo pequeños
- Cubeta del espectrofotómetro
- Espectrofotómetro
Reactivos:
- Tampón carbonato 0,1M, pH 10,2.
- p-nitrofenil fosfato 10 mM.
- D-Manitol 200 mM.
- MgCl2 3 mM.
- p-Nitrofenol 1 mM.
- NaOH 3 N.
Procedimiento experimental:
- Pipetear en cada uno de 7 tubos de ensayo pequeños, enumerados del 1 al 5
(estándares) y otros dos rotulados como B (blanco) y M (muestra), las cantidades
indicadas. Mezclar bien (usar vortex).
DETERMINACIÓN DE LA FOSFATASA ALCALINA
Tubo Tampón
Carbonato
0.1M
pH
10.2
Manitol
200 mM
Cl2Mg 3
mM
pNF
(1 mM)
Producto
pNFP
(10mM)
Sustrato
Muestra Reacción NaOH
3N
Abs
405
nm
CONC
pNF
Blanco 800 µl 100 µl 100 µl ---- ---- ----
Volumen
Final
1000𝑢𝑙
Incubar a
30°C 15
min
Parar la
reacción
con 1000
𝑢𝑙
0
µmol/L
1 790 µl 100 µl 100 µl 10 µl ---- ----
10 µmol/L
2 775 µl 100 µl 100 µl 25 µl ---- ----
25 µmol/L
3 750 µl 100 µl 100 µl 50 µl ---- ----
50 µmol/L
4 700 µl 100 µl 100 µl 100 µl ---- ----
100 µmol/L
5 600 µl 100 µl 100 µl 200 µl ---- ----
200 µmol/L
Muestra 650 µl 100 µl 100 µl ---- 100 µl 50 µl
- Se incuban los tubos durante 15 minutos a 30º C.
- Detener la reacción con 1000 μL /tubo de NaOH 3N, momento en que se torna
amarilla
- Leer Absorbancia a 405 nm.
N° de tubo [PNF] µM Absorbancia netaλ 405 nm FC
1 10 0.031 322.58
2 25 0.078 320.51
3 50 0.156 320.51
4 100 0.318 314.47
5 200 0.630 317.46
Muestra 131.47 0.412 319.11
CUESTIONARIO
1. Representar la concentración de p Nitrofenol (μM) frente a la absorbancia.
2. Determinar los factores de calibración (FC1, FC2, etc.) de los 5 estándares,
observar el parecido entre ellos y obtener un FC promedio
FC1 322.58
FC2 320.51
FC3 320.51
FC4 314.47
FC5 317.46
FCPROMEDIO 319.11
3. Interpolar los valores de absorbancia obtenidos en el ensayo enzimático
(muestra). Recuerde que, de los 2 mililitros (2000 µl) de muestra evaluada, sólo
50µl corresponden a suero
131. 47 µ𝑀 −−−−− 0. 05 𝑚𝑙
𝑥 −−−−− 2 𝑚𝑙
𝑥 = 131.47 µ𝑀×2 𝑚𝑙0.05 𝑚𝑙
𝑥 = 5 258. 8 µ𝑀
4. La actividad de una enzima se ha establecido internacionalmente que se expresa
en Unidades de actividad enzimática “U” ¿Cómo se definen?
La unidad de actividad enzimática (U) está definida como la cantidad de enzima que
cataliza la conversión de 1 µmol de sustrato en producto en un minuto de reacción
bajo condiciones determinadas.
5. Expresar los resultados obtenidos como U/L (μmol/min/L).
5 258. 8 µ𝑀 −−−−− 15 𝑚𝑖𝑛
 𝑥 −−−−− 1 𝑚𝑖𝑛
𝑥 = 5 258.8 µ𝑀× 1𝑚𝑖𝑛15 𝑚𝑖𝑛
𝑥 = 350. 6 µ𝑀/𝑚𝑖𝑛
350. 6 µ𝑀/𝑚𝑖𝑛 −−−−− 2 𝑚𝑙
 𝑈 −−−−− 100 𝑚𝑙
𝑥 = 350.6 µ𝑀/𝑚𝑖𝑛× 1000 𝑚𝑙2 𝑚𝑙
𝑥 = 35 𝑈/𝐿
6. Discutir los resultados obtenidos con la enzima analizada.
Los resultados obtenidos con la medición de fosfatasa alcalina nos comprueba la
eficacia del análisis clínico con métodos enzimáticos a comparación de métodos
químicos. Es una enzima muy específica para el diagnóstico clínico.
7. ¿Cuál es la razón de agregar NaOH 3N?
La razón para agregar NaOH 3N fue dar las condiciones en medio alcalino y en
consecuencia, se pueda producir la coloración de color amarillo, que posteriormente
seria medida con un filtro azul.
8. ¿Son iguales los resultados usando el FC y la gráfica para el cálculo? ¿Cuál cree
que es más exacto?
La diferencia es mínima, pero en sí la gráfica nos ayuda mucho con cálculos más
complejos, por lo que creemos que, al momento de hacer un análisis clínico real sería
más preciso el uso de la ecuación lineal obtenida con el gráfico.
9. ¿Cómo están los resultados? ¿Qué se podría sospechar?
Los resultados muestran la posibilidad de un paciente relativamente sano con una
edad aproimada entre 16 y 21 años. La concentración es baja.
10. ¿Qué isoenzimas de fosfatasa alcalina se conocen? ¿Cuál es su utilidad en el
diagnóstico?
Primero las isoenzimas son enzimas que poseen funciones idénticas específicas
similar al sustrato,tienen la capacidad de catalizar la misma reacción y se le reconoce
como la fracción de una enzima.
En la fosfatasa alcalina las isoenzimas están presentes en:
● La fracción hepática: es termoestable.
● La fracción leucocitaria: es termolábil.
● La fracción ósea: es termolábil.
● Isoenzima placentaria.
● Isoenzima intestinal.
● Renal leucocitaria: fosfatas alcalinas.
● FAL isoenzima.
Para los diagnósticos clínicos:
● Para la evaluación del daño tisular en enfermedades hepatobiliar.
● Diagnóstico en enfermedades óseas con alteraciones de la actividad
osteoblásticas.
● Crecimiento de masa tumoral que produce actividad de FAL.
INTRODUCCIÓN AL ESTUDIO DE LA CINÉTICA ENZIMÁTICA
En esta práctica, emplearemos a la fosfatasa alcalina como modelo. Aprenderemos a calcular
los dos principales parámetros cinéticos de las enzimas, la constante de Michaelis-Menten
(KM) y la Velocidad máxima (Vmax), para lo cual utilizaremos la representación de
Michaelis-Menten y para obtenerlos en forma exacta, la representación de dobles recíprocos
de Lineweaver y Burk
Utilidad de determinar KM y Vmax de una enzima
La KM establece un valor aproximado para el nivel intracelular de sustrato. Es poco probable
que este nivel sea apreciablemente mayor o menor que KM. Si [s]i « KM, la velocidad será
muy sensible a cambios de [s]i, pero no se utilizará todo el potencial catalítico de la enzima,
pues la velocidad siempre será menor que Vmax. Por otro lado, si [s]i » KM, la velocidad será
insensible a pequeñas diferencias de [s]i. En esas condiciones, la diferencia entre la velocidad
correspondiente a [s]i = KM y la correspondiente a [s]i » KM sería sólo el doble.
Midiendo los efectos de diferentes compuestos sobre KM y Vmax, se pueden identificar
inhibidores enzimáticos y el tipo de inhibición que producen.
La KM indica la afinidad relativa de los distintos compuestos que pueden ser sustratos de una
determinada enzima. Conociendo KM se pueden ajustar las condiciones de ensayo, de manera
que [s] » KM ([S]>10KM) y así determinar Vmax, que es proporcional a la cantidad total de
enzima {Vmax = K2 [Et]}. Esto tiene aplicación en la determinación de las actividades séricas
de enzimas que se utilizan en clínica como marcadores de ciertas patologías (fosfatasas,
transaminasas, lactato DH, etc.)
Para el cálculo de KM y Vmax se necesita medir la velocidad inicial de la reacción a distintas
concentraciones de sustrato, utilizando una concentración constante y una adecuada cantidad
de enzima. Para ello, se realizan primero varias curvas de progreso (absorbancia frente a
tiempo) utilizando distintas concentraciones de sustrato.
La pendiente de la tangente a la curva de progreso para t=0 es la velocidad inicial (V0). Si la
primera parte de la curva es lineal, no es necesario trazar la tangente en el origen y basta
calcular la pendiente en esa zona lineal:
Para cada concentración de sustrato será: V0 = A2-A1
t2-t1
Como se conoce la [S], tenemos para cada [S] una velocidad, con esos datos se calcula Vmax
y KM, ya sea con el método de Michaelis-Menten o Lineweaver-Burk. Con 5 a 7 datos es
suficiente calcular estos parámetros, pero si se obtienen muchos datos hay que saber
escogerlos.
EXPERIMENTO 2
2. ¿Cómo escoger los datos adecuados en el cálculo de KM y Vmax?
Se debe hacer las determinaciones a concentraciones de sustrato en las inmediaciones de la
KM; por esta razón, se emplea como criterio de selección la siguiente fórmula: vo2 / [S]; y se
toman en cuenta los valores más altos de esta relación.
PARTE EXPERIMENTAL
En la siguiente tabla se exponen varios resultados experimentales de V0 a diferentes
concentraciones de sustrato de una enzima; para el cálculo de los parámetros KM y Vmax
bastan 5 datos. Para escoger cuáles, imaginar lo siguiente; si tomamos los 5 datos de
concentración más alta, es probable que en la mayoría de ellos ya estemos en Vmax y por lo
tanto solo obtendremos la parte superior de la hipérbola rectangular; por otro lado, si
tomamos los datos de menor [S], no podremos obtener Vmax. Por esta razón, hay un
parámetro que nos permite encontrar la concentración de sustrato y su velocidad
correspondiente (V0), más cercana a la KM y este es, V02/[S]; donde haya el valor más alto
(punto de inflexión), este será el más cercano a la KM. Calcule en la tabla siguiente ese valor;
tome los datos del resultado mayor y además de él, dos datos hacia arriba y dos datos hacia
abajo; de esta manera quedan seleccionados los 5 datos a utilizar:
[S] (mM) vo (μmol/min) vo2 / [S]
1000 10 0,1
100 9,9 0,9801
10 9,1 8,281
5 8,3 13,778
2 6,7 22,445
1 5,0 25
0,5 3,3 21,78
0,2 1,67 13,9445
0,1 0,91 8,281
0,01 0,099 0,9801
0,001 0,010 0,1
Complete la siguiente tabla, para realizar las gráficas de Michaelis-Menten y Lineweaver y
Burk, con los datos seleccionados, para verificar si se obtiene lo esperado, en excel o papel
cuadriculado. Envíe Tablas y gráficos a su tutor por el Chat, para su calificación.
TUBO [S] V0 1/[S] 1/V0
1 0,2 1,67 5 0,5988
2 0,5 3,3 2 0,3030
3 1 5,0 1 0,2
4 2 6,7 0,5 0,1493
5 5 8,3 0,2 0,1205
Vmax Km
9,93049 0,99106
EXPERIMENTO 3
3. Determinación de KM y Vmax de fosfatasa alcalina
PARTE EXPERIMENTAL
Usaremos suero sanguíneo como fuente de fosfatasa alcalina. La actividad enzimática se
medirá utilizando el mismo sustrato del experimento anterior, p-nitrofenil fosfato (pNFP) y se
determinará el producto formado pNF.
La práctica tiene dos partes:
3.1. Construcción de la curva patrón para el pNF, eje “x” [pNF], eje “y” absorbancia
3.2. Efecto de la [S] sobre la actividad de fosfatasa alcalina, para calcular KMy Vmax
Materiales
- ‐ Tubos y pipetas.
- ‐ Agua destilada.
- ‐ Tampón Tris 10 Mm pH 9,6.
- ‐ Soluciones de p‐nitrofenol (pNF): 15, 30, 60 y 90 µM
- ‐ Soluciones de p‐nitrofenil‐fosfato (p‐NFP): 2.5, 5, 7, 10 y 15 mM
- ‐ NaOH 0,2N.
- ‐ Suero humano.
- ‐ Espectrofotómetro.
- ‐ Baño a 37°C.
- ‐ Calculadora.
3.1. Curva patrón de p nitrofenol
Preparar los siguientes tubos patrón de p‐nitrofenol (pNF, producto):
TUBO Blanco 1 2 3 4
Tris pH 9,6 2,2 ml 2,2 ml 2,2 ml 2,2 ml 2,2 ml
Agua destilada 1 ml ------- ---------- ---------- ---------
Soluciones patrón
pNF ------
1ml
(15µM)
1ml
(30µM)
1ml
(60µM)
1ml
(90µM)
Mezclar bien.
- Seleccionar en el espectrofotómetro la longitud de onda de 405 nm
- Añadir 0,3 ml NaOH 0,2N a cada tubo (incluyendo el blanco) para obtener el color
amarillo.
- Ajustar el cero con el tubo blanco.
- Medir las absorbancias de los 4 tubos
Resultados
Anotar los valores obtenidos en la siguiente tabla:
TUBO 1 2 3 4
DO405 0.152 0.302 0.605 0.910
[pNF]µM 15µM 30µM 60µM 90µM
nmoles de pNF 15 30 60 90
● Representar gráficamente la curva patrón: absorbancias en el eje de las ordenadas
frente a cantidades de p-nitrofenol en nanomoles, en el eje de las abscisas, en exel o
papel cuadriculado.
● Calcular el Factor de calibración promedio, como en el experimento anterior.
N° de Tubo Absorbancia a 405
nm
nmoles de PNF FC
1 0.152 15 98.68
2 0.302 30 99.34
3 0.605 60 99.17
4 0.910 90 98.90
Factor de Calibración promedio es: 99.02
3.2. Efecto de la concentración de sustrato y cálculo de la KM y Vmax
- Preparar 6 tubos rotulados convenientemente y añadir lo siguiente:
TUBO 1 2 3 4 5 6
Tris pH
9,6
2.1ml 2.1ml 2.1ml 2.1ml 2.1ml 2.1ml
Agua
destilada
1ml --- --- --- --- ---
pNFP* --- 1(2.5) 1(5) 1(7) 1(10) 1(15)
suero 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml 0.1ml
* = Volúmenes en ml. 1(2,5) significa 1ml de una solución 2,5 mM de p-nitrofenil fosfato
Antes de añadir el suero, pre-incubar los 6 tubos, además del suero a 37°C por 5 min (periodo
de preincubación)
- Una vez adquirida la temperatura, agregar el suero y mezclar bien e incubar por
exactamente 5 min a 37°C (este es el periodo de incubación).
- Completados los 5 minutos de incubación, añadir rápidamente 0,3 ml de NaOH 0,2N
para detener la reacción.
- Mezclar.
- Ajustar el "cero" del espectrofotómetro con el tubo del blanco y medir la Absorbancia
a 405 nm de longitud de onda (DO405)
23 4 5 6
mM𝑃𝑁𝐹𝑃[ ] 0,71 0.83 0.87 0.90 0.94
Absorbancia 405
nm
0,378 0,554 0,609 0,655 0,705
Vo
𝑛𝑚𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑃𝑁𝐹/𝑚𝑖𝑛[ ]
7,51 10.97 12.06 12.97 13.96
1/S 1,41 1.20 1.15 1.11 1.06
1/Vo 0,133 0.091 0.082 0.077 0.072
RESULTADOS
1.- Calcular la velocidad inicial (V0) en cada tubo, expresada en nmoles de pNF/min
2.- Completar los datos de la tabla siguiente y hacer las gráficas de Michaelis-Menten y
Lineweaver-Burk en excel o papel cuadriculado. Enviar a los tutores por el Chat
Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6
[S]
{[PNFP]mM}
0.71 0.83 0.87 0.90 0.94
DO405 0.378 0.554 0.609 0.655 0.705
[pNF] calculada
en la curva de
calibración
0.71 0.83 0.87 0.90 0.94
V0 (nmoles de
pNF/min)
7.51 10.97 12.06 12.97 13.96
1/[S] 1.41 1.20 1.15 1.11 1.06
1/V0 0.133 0.091 0.082 0.077 0.072
3.- Calcular KMy Vmax, ¿Cuáles son sus unidades?
● La velocidad máxima es: 1/0.1224 = 8.17 PNF/min
● Nuestro Km es: 8.17 x 0.1799 = 1.469783 [S]
BIBLIOGRAFÍA
1. Guía de prácticas de Bioquímica Estructural y Biológica, J.C. Rodríguez, J. León, M.
Delgado y J. Navas. Universidad de Cantabria-España
2. Cuaderno de Prácticas Bioquímica Básica, Departamento de Bioquímica y Biología
Molecular III. Facultad de Medicina, Universidad Complutense de Madrid, España
(2018/2019)
3. Prácticas de Bioquímica Médica I, B. Paz Aliaga, P. Noriega, F. Zegarra e I. Paz
Aliaga. Universidad Católica de Santa María Arequipa, Perú. 2011
4. R. Eisenthal and M.J. Danson. Enzime Assays, A practical approach. Oxford
University press. New York, USA. 1995
5. © 1998-2020 Mayo Foundation for Medical Education and Research. All rights
reserved.