PRACTICA N 3 - PROTEINAS II

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PRÁCTICA Nº 3: PROTEINAS II
RELACIÓN DE EXPERIMENTOS
1. Determinación de las proteínas totales del suero sanguíneo
2. Desnaturalización de proteínas y actividad biológica
3. Identificación de la presencia de proteínas en la orina
4. Electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo
5. Experimento casero
INTRODUCCIÓN
La determinación de las proteínas totales del suero sanguíneo es un procedimiento de rutina
del laboratorio clínico. Hay diversos métodos para hacerlo, sin embargo, aquellos que utilizan
ciertas reacciones de color, son los más difundidos. Uno de ellos es el que utiliza la reacción
de Biuret.
Desde hace mucho tiempo se conoce que al calentar la urea hasta 180°C, se descompone para
rendir amoniaco y un compuesto denominado biuret. Este último, en presencia de iones
cúpricos y en medio alcalino, rinde una coloración violeta.
No solamente el biuret es capaz de dar esta reacción, otras sustancias que tienen dos radicales
CONH2 o CH2NH2, también pueden hacerlo; incluso estos radicales están unidos mediante
átomos de carbono o de nitrógeno. De la misma manera, los péptidos con más de dos enlaces
peptídicos dan positividad a esta reacción, que es comúnmente conocida como la reacción de
Biuret.
Con la aplicación de la reacción de Biuret se ha estandarizado un método para la
determinación de las proteínas totales del suero sanguíneo y que se utilizará en la presente
práctica. Los valores normales para este método son de 6 a 8 g%. Por debajo de 6 g% se
habla de hipoproteinemia y por encima de 8g% hablamos de hiperproteinemia.
A pesar de existir una concentración tan alta de proteínas en el suero, normalmente no se
detecta proteína en la orina, explicable por la incapacidad de las proteínas (macromoléculas)
de atravesar los poros de la membrana basal del glomérulo renal. Por esta razón el encontrar
proteínas en cantidades demostrables en la orina de un paciente, es una situación de mucho
cuidado desde el punto de vista médico.
Las proteínas pueden ser identificadas en la orina, de manera muy sencilla, al calentar una
muestra de orina y apreciar la turbidez, lo cual es indicativo de la desnaturalización de las
proteínas por el calor. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que los fosfatos también pueden
enturbiar la orina; la distinción puede hacerse considerando que los fosfatos se vuelven
solubles en medio ácido.
En muchos casos no resulta suficiente hacer la determinación de las proteínas del suero
sanguíneo, sino que es también necesario establecer las concentraciones de las diferentes
fracciones proteicas. En este sentido, se usa un procedimiento denominado electroforesis de
las proteínas del suero, que nos permite aislar las diferentes fracciones y cuantificarlas.
El procedimiento separa a las proteínas por la carga que adquieren a un pH determinado. La
velocidad de migración de estas macromoléculas dependerá de la intensidad de su carga
eléctrica, su tamaño y forma, la naturaleza del soporte sobre el cual migran, la fuerza iónica
del medio, la temperatura, etc. Se entiende que este procedimiento también será de utilidad
para la separación de las proteínas de otros muestras biológicas.
La electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo, como comúnmente se realiza,
determina la separación de 5 fracciones proteicas, que ordenadas en función de su velocidad
de migración, son las siguientes: albúmina, alfa 1 globulina, alfa 2 globulina, beta globulina y
gamma globulina. La albúmina es la más homogénea, su peso molecular es de 69,000; su PI
es aproximadamente 4,9 y es la de mayor velocidad de migración. Tiene como función
importante su participación en el equilibrio hídrico y además el transporte de una serie de
sustancias como la bilirrubina, los ácidos grasos, etc. La albúmina también se une a drogas
que son poco solubles en el agua, como barbitúricos, digitálicos, aspirina, etc. Normalmente,
el 50% del calcio plasmático está unido a la albúmina y esto debe tomarse muy en cuenta
para explicar las manifestaciones de hipocalcemia asociadas a las situaciones en las cuales
disminuye la concentración de albúmina plasmática.
Las alfa globulinas incluyen dos fracciones electroforéticas, las alfa 1 PI (5.1) y las alfa 2 (5.5
- 5.8). las principales alfa 1 globulinas, son la proteína C reactiva y las lipoproteínas de alta
densidad (HDL): en tanto que las alfa 2 globulinas son la haptoglobina, ceruloplasmina y
protrombina. La beta globulina (PI 5.4 - 6.3) incluye la proteína transportadora de hierro
(transferrina) y a las lipoproteínas de baja densidad (LDL). Las gamma globulinas (PI 6.3 -
7.3), contiene las diferentes inmunoglobulinas, como la inmunoglobulina G (Ig G) que
corresponde al 80%, la inmunoglobulina A (Ig A) que representa un 13% y a otras
inmunoglobulinas, que se encuentran en menor concentración (Inmunoglobulinas M, D, E,
etc.).
La técnica más comúnmente usada para la separación de las proteínas del suero sanguíneo
por electroforesis consiste en depositar unos microlitros de suero en una tira de papel filtro
humedecida con buffer barbital pH 8.6. Los extremos de la tira luego son introducidos en dos
recipientes que contienen el mismo tampón y que están en contacto con los electrodos.
En vista que el PI de todas las fracciones, es menor que el pH del tampón, se cargarán
negativamente y por lo tanto migrarán al polo positivo. Como quiera que la intensidad de
carga de las diferentes fracciones, es distinta, al igual que su tamaño, migrarán a diferente
velocidad. Esto quiere decir que una vez desconectado el aparato de la fuente eléctrica,
quedarán separadas las fracciones y será posible su identificación si las teñimos con un
colorante específico para proteínas (como el amido black). La cuantificación de cada fracción
se hará en función de la intensidad de color que tiene cada banda y que puede hacerse por
diversos métodos, como con el uso de un aparato llamado densitómetro que nos grafica un
pico para cada fracción y cuya área es proporcional a su intensidad de color.
La tabla siguiente muestra los valores que podemos considerar como normales tanto en
valores absolutos (g%) como en valores relativos (porcentaje). En la tabla 2 se muestran las
variaciones en la concentración de las diferentes fracciones electroforéticas de las proteínas
del suero sanguíneo en algunas enfermedades, en donde este método es de gran ayuda en su
diagnóstico.
TABLA 1: VALORES NORMALES PARA LAS DIFERENTES FRACCIONES
PROTEICAS DEL SUERO SANGUÍNEO SEPARADAS POR ELECTROFORESIS AL
PAPEL
Albúmina Alfa 1
globulina
Alfa 2
globulina
Beta
globulina
Gama
globulina
Porcentaje 50 - 58 4 - 7 7 - 11 11 - 15 14 – 22
Gramos por
100 ml de
suero
3.24 - 4.42 0.36 - 0.48 0.5 - 1.0 0.78 - 1.04 0.80 - 1.60
TABLA 2. VARIACIÓN DE LAS FRACCIONES DEL ELECTROFEROGRAMA DE LAS
PROTEÍNAS SÉRICAS EN ALGUNAS ENFERMEDADES.
ENFERMEDAD P.T. Albúmina Alfa -1 Alfa - 2 Beta Gama
Infecciones agudas N N A (+)
Endocarditis bacteriana N N A (++)
Plasmocitoma beta N N A (++)
Artritis reumatoide N D (+) A (+) A (++)
Hipogamaglobulinemia N ó D N D (++)
Mieloma múltiple A N A (+++)
Síndrome nefrótico D (+) D (++) A (+)
Desnutrición D (+) D (+)
Cirrosis hepática D (+) D (+) A (+)
N: Normal A: Aumento D: Disminución
Rietmann y Daniels señalan que la electroforesis de las proteínas séricas (“serum protein
electrophoresis” SPE), junto con la determinación de las proteínas séricas totales debe ser
considerado como un procedimiento rutinario para cualquier paciente, como ayuda en el
diagnóstico y en el control de la enfermedad que tiene.
EXPERIMENTO 1.
DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES DEL SUERO SANGUÍNEO
Objetivos.
Mediante el uso de la reacción de Biuret y la aplicación del método fotocolorimétrico, hacer
la determinación cuantitativa de las proteínas de una muestra biológica (suero sanguíneo).
Método
Determinación de las proteínas totales del suero por el método de biuret
Procedimiento.
a) A 0,1 ml de suero sanguíneo añadir 1,9 ml de agua destilada y mezclar
b) Medir 1 ml de la solución anterior en un tubode ensayo y añadir 4 ml del reactivo de
biuret. Mezclar
c) Dejar en reposo 30 minutos y medir la absorbancia en el fotocolorímetro utilizando
filtro verde
d) Preparar al mismo tiempo un blanco, que llevará 1 ml de agua destilada en lugar del
suero diluido
e) Durante el desarrollo de este experimento se proporcionará la lectura del estándar, que
se preparará en la misma forma que la muestra, solo que en lugar de suero sanguíneo
se usará una solución de proteínas, de concentración 7 g %.
Resultados
Llenar los espacios en blanco:
Lectura Bruta Lectura Neta
Tubo Muestra (M) 0.328 0.25
Tubo Blanco (B) 0.078 0.078
Tubo Estándar (St) 0.295 0.217
FACTOR DE CALIBRACIÓN:
- Fc(muestra) = 0.4
- Fc(estandar) = 6.45
- Fc(final)= 3.425
Concentración de proteína de la muestra:8.56 g por 100 ml de suero. Es un caso de
hipoproteinemia
INTERROGANTES
1. ¿Se puede hacer la determinación fotométrica de la concentración proteica, sin
utilizar una reacción de color? Fundamente su respuesta
No se podría, porque la reacción necesariamente va a necesitar llevar un indicador
para que en el espectrofotómetro pueda medir las distintas absorbancias de las
soluciones y poder encontrar las concentraciones proteicas.
2. ¿Cuál es el objeto de preparar el blanco?
El objetivo de preparar el tubo en blanco, es poder encontrar las absorbancias netas y
con esos datos poder encontrar el factor de calibración y la concentración de la
muestra.
3. ¿Por qué se utilizó el filtro verde del fotocolorímetro para medir la absorbancia
de la solución en el experimento 1?
Esto se debe a que las moléculas se pueden llegar a exaltar con distintos colores ya
que hay algunas que absorben un color más que el otro, y en el caso del experimento 1
el suero reacciona mejor con los rayos de luz verde por eso se usa un filtro de color
verde.
ACTIVIDAD 2.
EXPERIMENTO 2.
IDENTIFICACIÓN DE LA PRESENCIA DE PROTEÍNA EN LA ORINA.
Objetivo:
- Aplicar un método sencillo que permita la identificación de la presencia de proteínas
en la orina
Método
- Coagulación de las proteínas por el calor
Procedimiento.
a) Medir 5 ml de orina en un tubo de ensayo y calentar hasta la ebullición. Observar lo
que sucede
b) En caso de que observe enturbiamiento, añada algunas gotas de solución de ácido
acético al 2%. Apreciar si la turbidez persiste o desaparece
c) Haga el mismo procedimiento con todas las muestras de orina que le serán
proporcionadas.
Resultados.
1. Llene el espacio en blanco escribiendo + cuando hay turbidez y - cuando no la hay o
cuando desaparece la turbidez
ORINA X ORINA Y ORINA Z
Calentando la muestra - + +
Añadiendo Ac. Acético - - +
DIAGNÓSTICO SANO FOSFATURIA PROTEINURIA
INTERROGANTES.
1. ¿Puede una proteína coagulada dar la reacción de biuret? Fundamente su
respuesta.
Una proteína coagulada, sí podría dar la reacción de Biuret, porque el reactivo
reacciona con cualquier proteína, líquida o sólida. Ya que al desnaturalizarse una
proteína, ésta cambia su estructura pero no se rompen los enlaces que la conforman, lo
que hace esta prueba es romper los enlaces peptídicos para comprobar la presencia de
estas.
2. ¿Qué puede decir de un líquido biológico que al ser calentado se pone turbio y
con el añadido de unas gotas de limón desaparece su turbidez?
Si la turbidez desaparece al echarle gotas de limón significa que no había proteínas y
lo que causaba la turbidez eran los fosfatos.
EXPERIMENTO 3
DESNATURALIZACION DE PROTEINAS Y ACTIVIDAD BIOLÓGICA
Objetivos
- Verificar como la desnaturalización de la proteína determina la pérdida de su actividad
biológica.
- Verificar la acción de varios agentes desnaturalizantes.
Método
- Estudio de la actividad de la catalasa de los hematíes en presencia de diversos agentes
desnaturalizantes a través de la producción de oxígeno.
Procedimiento
a) Rotular 4 tubos de ensayo del 1 al 4 y medir respectivamente, 0,1 ml de sangre diluida
(dos gotas de sangre en 100 ml de agua destilada), 0,1 ml de sangre diluida hervida,
sangre diluida en presencia de Urea 8 M y sangre diluida en SDS al 3 % (0,1 ml)
b) Medir en cada tubo 5 ml de peróxido de hidrógeno 0,05 M y mezclar
c) Con ayuda de una varilla de vidrio depositar en el fondo de cada tubo un círculo de
papel filtro y tomar el tiempo que tarda en cada tubo para subir hasta la superficie
Resultados
Complete la siguiente tabla:
1. Sangre
diluida normal
2. Sangre
diluida con
SDS
3. Sangre
diluida con
Urea 8 M
4. Sangre diluida
hervida
Tiempo que tarda en
subir el papel hasta
la superficie
3 minutos _ _ _
INTERROGANTES
1. Junto al nombre de cada agente desnaturalizante describa su mecanismo de
acción
a) Urea 8 M: Es una sustancia que rompe los enlaces disulfuro que permiten la
estructura terciaria de la proteína.
b) SDS : Es un detergente usado como desnaturalizante a nivel de enlace no
covalente de las proteínas, provocando que estas moléculas proteicas pierdan
su conformación nativa.
c) DTT: La Técnica del Ditiotreitol es usada como un potente agente reductor
cuyo principal uso es la reducción de enlaces disulfuro entre proteínas,
destruyendo la plegación, característico de la estructura terciaria.
2. Escriba la reacción química catalizada por la catalasa
La catalasa es una enzima antioxidante, por lo tanto, cataliza la reacción de
descomposición del peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno.
2𝐻
2
𝑂 − 𝑐𝑎𝑡𝑎𝑙𝑎𝑠𝑎 → 2𝐻
2
𝑂 + 𝑂
2
3. ¿Es la catalasa una proteína simple o conjugada?. Fundamente su respuesta
La catalasa es una proteína conjugada debido a su estructura, puesto que su estructura
se asocia a un grupo hemo (posee hierro en su núcleo).
4. ¿Con qué experimento (s) podría demostrar que la desnaturalización no afecta la
estructura primaria de la proteína?
Se podría demostrar que la desnaturalización no afectó la estructura primaria de la
proteína a través del reactivo de Biuret, dado que este indica la presencia de 3 a más
enlaces peptídicos cuando el se une con los enlaces peptídicos formando un𝐶𝑢+
complejo de color violeta.
5. ¿Qué importancia podría tener en clínica la búsqueda de actividad catalásica en
la orina?
En la clínica se pide examen de orina para poder detectar la proteínas para la
determinación de la actividad catalítica de una enzima .
EXPERIMENTO 4
ELECTROFORESIS DE LAS PROTEÍNAS DEL SUERO SANGUÍNEO
Objetivos
1. Reconocer las diferentes fracciones proteicas que aparecen luego de realizada la
electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo
2. Identificar las alteraciones cualitativas y cuantitativas en el electroferograma y
proponer un diagnóstico en los casos de alteración.
Método.
- Electroforesis de las proteínas del suero sanguíneo en un medio de Buffer barbital pH
8,6 y usando como soporte papel para electroforesis (papel Whatman N°1).
Procedimiento.
a) Cada mesa dispondrá de varios electroferogramas y su trazo densitométrico.
b) Identificar cada fracción y marcar sus límites utilizando lápiz
c) Contando los cuadraditos estimar el área de cada fracción y estimar el porcentaje del
área total que le corresponde.
d) Con el valor de las proteínas totales del suero, que será proporcionado, estime la
concentración absoluta de cada fracción en g%.
Resultados.
1. Llene la Tabla con las cifras obtenidas. Junto a cada valor de las cifras absolutas (g%)
anote A(+), A(++),A(+++), D(+), D(++) ó D(+++), según encuentre aumento o
disminución, con respecto a lo normal. Considere (+) cuando el aumento o
disminución es hasta un 10%, (++) cuando el aumento o disminución está entre 10 -
25%; considere (+++), cuando el aumento o disminución sea mayor del 25%.
MUESTRA P.T. Albúmina Alfa 1 Alfa 2 Beta Gama
A
Valor en % 100 50.3 N 11.9A(+++) 8.6 N 11.6 N 17.6 N
Valor en g% 7.56 N 3.80 N 0.90A(+++) 0.65 N 0.88 N 1.33 N
B
Valor en % 100 38,4D(++) 5.5 N
14.2
A(+++) 12.0 N
30.0
A(+++)
Valor en g% 7.61N 2.92 D(+) 0.42 N 1.08A(+++) 0.91 N
2.28
A(+++)
2. De acuerdo a la tabla 2, el diagnóstico probable es:
Muestra A: Endocarditis bacteriana.
Muestra B: Artritis reumatoide.INTERROGANTES
1. ¿Cómo será el electroferograma de las proteínas del plasma sanguíneo?
Un pico alto representando la álbumina, seguido de picos con variaciones menores
representando
2. Si en lugar de buffer de pH 8,6, se emplea otro de pH 3,8, ¿qué diferencias
importantes esperaría encontrar en el electroferograma?
Se esperaría que, las proteínas al tener un pI mayor al pH 3,8 se cargarán
positivamente; por lo tanto, migrarán hacia el cátodo. Asimismo, las proteínas (como:
gammaglobulina) con un pI alejado del pH del buffer tendrán una mayor velocidad de
migración que la albúmina, la cual tendrá dificultad para moverse. Por lo tanto, se
obtendría un electroferograma totalmente distinto al que trabaja con pH alcalino; y se
observaría picos altos para las gammaglobulinas y picos mucho menores para la
albúmina. Por otro lado, es importante considerar que al trabajar en medios con pH
ácidos bajos, podría causar la desnaturalización (precipitación) de las proteínas,
dificultando la identificación de alguna alteración y el diagnóstico.
3. Si las proteínas totales de una muestra de suero fueron 4.74 g % y el porcentaje
para las diferentes fracciones fue de 23.2%, 8.0 %, 31.1 %, 17.7% y 20.0 % para
albúmina, alfa1, alfa2, beta y gamma, respectivamente, estimar la concentración
absoluta de cada una
Proteína % g%
Albúmina 23.2 1.10
Globulina α1 8.0 0.38
Globulina α1 31.1 1.47
Globulina β 17.7 0.84
Globulina γ 20 0.95
Total 100 4.74
EXPERIMENTO CASERO 2
Materiales:
● 2 tubos de ensayo y gradilla o recipientes equivalentes
● 2 jeringas una de 10 y una de 5 mL
● Taza grande con cubos de hielo
● Clara de huevo de gallina diluida 1:4
● Etanol al 70%
● Agua
Procedimiento:
a) Colocar a cada uno de los 2 tubos de ensayo o recipientes equivalentes, cerca de 5 mL
de la solución de ovoalbúmina diluida 1:4
b) Uno de ellos ponerlo en baño de hielo y el otro a temperatura ambiente
c) Después de 10 minutos de incubación, agregue a cada uno de ellos, cerca de 1 mL de
etanol, mezcle y observe la aparición en ambos de enturbiamiento.
d) Vuelva a poner las muestras enturbiadas en sus respectivos baños por 5 minutos más
e) Agregue luego, cerca de 1 ml de agua a cada una de ellas y observe qué ocurre, si no
hay diferencia agregue un poco más
Muestra 1 Muestra 2
Como resultado obtuvimos dos muestras en las cuales se notó acumulación de proteínas. En
la muestra fría se notó una mayor acumulación, mientras que en la muestra a temperatura
ambiente se notó ligeramente. Probablemente está acumulación se deba a que la temperatura
influyó en la agrupación de las proteínas