introduccion de peroxidasa

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INSTITUTO TECNOLÓGICO SUPERIOR
De Ciudad Hidalgo
PRACTICA DE CONTEO DE PROTEÍNAS DE LA PEROXIDASA (HORSERADISH PEROXIDASE, HRP)
MATERIA: BIOCATÁLISIS
	DOCENTE: 	M.C. YOHANA L. LEÓN MÁRQUEZ 
PRESENTAN:
DULCE MARÍA GUZMÁN BUCIO 
SOFÍA NAVA CORONEL 
CRISTIAN SALAS TORRES 
CARRERA:
INGENIERÍA EN NANOTECNOLOGÍA 
GRUPO: 
NANO 9
Ciudad Hidalgo Michoacán a 11 de octubre de 2018
Índice
Introducción	2
1.- Rábano	4
2.- Peroxidasa (Horseradish peroxidase, HRP)	4
2.1.- Mecanismo catalítico	8
2.2.- Factores que influyen sobre la actividad peroxidasa	10
2.2.1.- Efecto del pH sobre la actividad peroxidasa	10
2.2.2.- Efecto de la Temperatura sobre la actividad peroxidasa	10
2.2.3.- Otros factores que influyen la actividad peroxidasa	10
2.3.- Ciclo catalítico	11
2.3.1.- Mecanismo de reacción de la peroxidasa (horseradish peroxidase)	12
Referencias	14
Introducción 
Las enzimas forman una parte fundamental en el funcionamiento de los organismos vivos, cualesquiera que sea su origen, todas las actividades de las células y por ende los órganos se ven regidas por la influencia e importancia de las enzimas presentes en el organismo, es bien sabido que las enzimas tienen actividades específicas que les permiten realizar una actividad específica, esto está determinado por la especificidad de las enzimas hacia un sustrato lo cual conlleva también a organizarlas dentro de diversas categorías según sea su actividad catalítica.
Existe un gran interés en las enzimas como biocatalizadores ya que sus características les proporcionan cualidades que son muy útiles para diversas reacciones que no necesitan de condiciones específicas y mayormente elevadas tal como ocurre con catalizadores inorgánicos, es por ello que actualmente las enzimas son estudiadas para su uso incluso a nivel industrial que permita obtener mayores rendimientos en las reacciones químicas involucradas en la manufactura de diversos productos. 
El presente trabajo tiene como fin la extracción de la enzima peroxidasa de rábano conocida horsderadish peroxidase, HRP o POD, para lo cuál se partirá de la elaboración de un extracto crudo, mismo del que se llevará a cabo la inactivación de la catalasa presente mediante un calentamiento y que posteriormente de realizará una precipitación salina mediante sulfato de amonio, permitiendo así, obtener una enzima peroxidasa HRP de mayor pureza.
Las aplicaciones que tiene esta enzima son fascinantes, que van desde un tratamiento para cáncer, hasta la biorremediación, gracias a sus características estructurales, así como, a su selectividad y actividad hacia los diversos sustratos. Las características más importantes, como lo son su estructura, su clasificación y la explicación de su actividad catalítica se aborda en las siguientes páginas, además de los procesos que se han realizado durante las prácticas de laboratorio con el fin de determinar la presencia de dicha enzima en nuestros extractos. 
1.- Rábano
El rábano (Raphanus sativus) es el nombre común de las plantas de un género de hierbas anuales o bianuales de la familia de las Crucíferas, y en particular del rábano común de huerta.
Presenta un tallo ramoso, con numerosos pelos. La base de éste se une con la raíz, y ambos constituyen un tubérculo globoso. Las flores son blancas o amarillas, dispuestas en racimos terminales. Las hojas son grandes y ásperas, divididas en lóbulos con bordes dentados.
Se cree que la planta procede de China y hoy se cultiva en toda la región templada boreal por la raíz pungente que forma. El sabor del rábano es ligeramente picante.
Las distintas variedades cultivadas se diferencian en tamaño, forma y color, que va desde el blanco al rojo, pasando por el amarillo. Esto depende también en parte de la estación en que se cultive: así, los rábanos de primavera son esféricos, mientras que los de verano son más grandes y alargados.
El rábano japonés, llamado «daikon», es grande y de color blanco. Las variedades alargadas miden de 10 a 15 cm, mientras que las redondas tienen un diámetro de unos 2 o 3 cm. Su peso en el mercado suele ser de unos 70 g, si bien hay ejemplares que pueden llegar a pesar hasta 1 kg o más. La piel puede ser negra, morada, roja, blanca o roja y blanca, mientras que la carne es siempre blanca, excepto en algunas variedades asiáticas en las que adquiere un tono rosado.
2.- Peroxidasa (Horseradish peroxidase, HRP) 
La conocida como peroxidasa de rábano (horsderadish peroxidase, HRP, POD) es una enzima (EC 1.11.1.7.) que contiene un grupo hemo y un peso molecular de 40-45 kDa. Cataliza la oxidación de una amplia gama de sustratos en presencia de un agente oxidante como el peróxido de hidrógeno (H2O2). Su grupo hemo es de tipo b (protoporfirina IX), con un ión de hierro en el centro del anillo porfirínico cuyo estado de reducción oscila entre valencia III y IV. El grupo hemo forma parte del centro activo de la enzima. La reacción catalizada por la enzima tiene la capacidad de oxidar una amplia gama de productos orgánicos e inorgánicos, tales como fenoles (pirogalol, guayacol) o aminas aromáticas (Ofenilendiamina, O-dianisidina), y los electrones son transmitidos al peróxido de hidrógeno (H2O2), que se reduce a H2O.
La actividad catalítica depende principalmente de la estructura molecular del enzima, la estructura de HRP puede observarse en la Figura 1. La proteína presenta una estructura globular compuesta por 308 aminoácidos formando una cadena sencilla, con 12 regiones en estructura secundaria hélice α separadas por giros y bucles, además, presenta una escasa proporción de estructura en lámina β.
Como ya se ha dicho, contiene un grupo hemo situado en el centro de la estructura fijado a la proteína mediante un enlace coordinado entre el hierro y un residuo de histidina, cuatro puentes disulfuro estabilizan la estructura.
La presencia de dos iones calcio (Ca2+), junto al grupo hemo, son esenciales para la actividad catalítica. La ausencia del calcio en la estructura genera una desestabilización de la estructura del enzima con la consiguiente disminución de la actividad específica. Esta disminución puede ser parcial o completa dependiendo de la peroxidasa.
Figura 1.- Estructura de HRP, determinada mediante cristalografía de rayos X. En color rojo el grupo hemo, en azul dos átomos de calcio, en violeta las hélices α y en amarillo las láminas β.
A partir del análisis estructural del centro activo de las diferentes peroxidasas cristalizadas hasta la fecha, se han podido identificar una serie de residuos implicados en la ruptura heterolítica del peróxido de hidrógeno y en la estabilización de los diferentes estados de oxidación del hierro a lo largo del ciclo catalítico. Estos residuos se encuentran localizados por encima y por debajo del plano que ocupa el grupo hemo, en los denominados respectivamente lados distal y proximal en referencia a las dos histidinas axiales, una de las cuales actúa como quinto ligando del hierro.
El lado proximal del hemo presenta dos residuos invariables en todas las peroxidasas: una histidina axial y un aspartato (His 170 y Asp 247 en la HRP C). La histidina es el ligando proximal del hierro y se encuentra unida a la cadena lateral del aspartato por un puente de hidrógeno. Esta interacción proporciona al residuo de histidina el carácter aniónico imprescindible para la estabilización de los elevados estados de oxidación del hierro. En el lado proximal de todas las peroxidasas también se puede observar un residuo aromático que varía en las tres clases de peroxidasas. Este residuo es un triptófano en las de la Clase I y una fenilalanina en las de las clases II y III, con la excepción de la ARP y CIP (peroxidasa de Arthromyces ramosus y Coprinus cinereus) que presenta una leucina en dicha posición.
Los residuos del lado distal cumplen una doble función. Conjuntamente con los del lado proximal participan en la estabilización de los estados de oxidación del hierro en los compuestos I y II de la enzima, e intervienen directamente en la interacción con el peróxido de hidrógeno. Al igualque en el lado proximal, dos residuos aparecen conservados en todas las peroxidasas: una histidina distal y una arginina distal (His 42 y Arg 38 en la HRP C.
Existe una gran variedad de enzimas con actividad peroxidasa. Las PODs se dividen en dos superfamilias; Una identificada en algunas bacterias, hongos y animales o de animales y otra superfamilia encontrada esencialmente en bacterias, hongos y plantas.
Se han identificado tres subclases dentro de esta segunda superfamilia o superfamilia de plantas. La diferencia entre estas tres clases depende de su estructura primaria.
Las superfamilias de peroxidasas se distinguen mediante la presencia en su estructura de residuos concretos. La superfamilia de bacterias, hongos y plantas (clase III o C) se caracteriza por la conservación evolutiva las hélices A hasta la hélice J. A pesar de ello, los bucles parecen no ser idénticos. No se presenta una homología superior al 55% de la estructura, algunos ejemplos pueden observarse en la tabla 1.
Tabla 1.- Clasificación de la superfamilia de POD de plantas.
Todas las peroxidasas conocidas presentan tres aminoácidos caracterizados por formar parte del centro activo del enzima. Se sugiere que estos residuos están involucrados en la estabilización de las cargas entre His y Arg y como ligando del grupo hemo.
HRP se clasifica en la clase III o C de la superfamilia de hemoperoxidasas de plantas, hongos y bacterias. Esta clase engloba a peroxidasas de plantas que son N-glucosiladas y secretadas de las células.
Cumplen varias funciones fisiológicas en la planta a lo largo de todo su ciclo vital; participa en la eliminación del peróxido de hidrógeno, oxidación de compuestos tóxicos, lignificación, elongación y parada del crecimiento de la pared celular, el catabolismo de auxinas, la defensa frente al estrés oxidativo y en la defensa frente a patógenos, simbiosis y germinación.
La principal función de las PODs en la planta parece ser la lignificación de la pared celular, esta puede presentar una rigidez modificable por la enzima. La aparición de especies reactivas de oxígeno (ROS) hace que la pared celular sea más flexible, además, ROS actúa eliminando ciertos agentes patógenos para la planta. La ausencia de ROS en la pared aumenta su rigidez.
La funcionalidad del enzima en los procesos fisiológicos de la planta abre el camino para la determinación no solo de enzimas de distinta clase en relación con su origen evolutivo y su estructura, sino a la existencia de diferentes isoenzimas.
Se han descrito isoenzimas de HRP con capacidad de soportar diferentes ambientes de pH.
Se diferencian 3 grupos:
· Isoenzimas aniónicas o ácidas: Soportan un pH menor que 7, se caracterizan por la presencia de un alto contenido en carbohidratos.
· Isoenzimas neutras: Comprenden un pH entre 7 y 9. También se conocen con el nombre de isoenzimas ligeramente básicas.
· Isoenzimas catiónicas o básicas: Soportan un pH mayor a 11, se caracterizan por un bajo contenido en carbohidratos.
La planta presenta una compartimentación enzimática en la cual las diferentes isoenzimas van a cubrir un papel crucial para la realización de la función catalítica de la POD en diferentes órganos de la planta y estructuras celulares. La razón por la que existen isoformas de una enzima dentro de una misma planta se debe a la necesidad de conservar la actividad catalítica. Las propiedades cinéticas, catalítica, secuencia de aminoácidos y la carga pueden ser diferentes entre isoenzimas.
2.1.- Mecanismo catalítico
La reacción enzimática general se presenta a continuación:
H2O2 + AH2 → 2(∙AH) + H2O
Los radicales libres formados durante el ciclo catalítico se unen formando cadenas de polímeros con baja solubilidad y que tienden a precipitar en la solución. En la remoción de fenol, los radicales formados son radicales fenoxil que pueden acoplarse entre sí para generar diversos oligómeros y polímeros.
La estructura tridimensional de la proteína junto con la estructura del metal ayuda a la función catalítica establecida por el grupo hemo, proporcionando un ambiente catalítico idóneo para reacciones de transferencia de electrones.
La POD puede ejercer dos posibles ciclos catalíticos, peroxidativo e hidrolítico, siendo esta una enzima multifuncional. La regulación de su actividad y expresión se debe a la aparición de estímulos tanto internos como externos (aún no dilucidados con precisión).
La reacción catalítica consiste en el uso del peróxido de hidrógeno (H2O2) como aceptor electrones para realizar la oxidación de numerosos compuestos, dando la capacidad a la POD de ser uno de los oxidantes por excelencia [1].
La inhibición de la peroxidasa por el exceso de peróxido de hidrógeno, es una inhibición por exceso de sustrato, en donde a una concentración dada de enzima, la velocidad inicial de reacción aumenta con el incremento de la concentración inicial de sustrato, hasta un valor límite (velocidad máxima) y, a concentraciones mayores de sustrato, la velocidad inicial es menor que el valor máximo.
La representación gráfica de la inhibición por exceso de sustrato se muestra en la Figura 2.
Figura 2.- Inhibición por exceso de sustrato (a) Dependencia de Vo vs [S] (Michaelis-Menten). (b) Gráfico de los dobles recíprocos 1/Vo vs 1/[S] (Lineweaver-Burk).
2.2.- Factores que influyen sobre la actividad peroxidasa
2.2.1.- Efecto del pH sobre la actividad peroxidasa
El pH afecta la actividad enzimática si tenemos en cuenta su influencia sobre los procesos de unión del sustrato y su transformación catalítica.
Se ha demostrado que no hay coincidencia en el pH óptimo de las peroxidasas de diversas fuentes vegetales cuando se emplea el guayacol como donador de hidrógeno. Sin embargo, la mayoría de las peroxidasas son activas en un rango de pH relativamente amplio (3-12), lo que puede deberse a la presencia de diferentes isoenzimas las cuales tienen cada una un pH óptimo para realizar su función catalítica.
2.2.2.- Efecto de la Temperatura sobre la actividad peroxidasa
La complejidad de la inactivación de las peroxidasas es debida a la presencia de diferentes especies isoenzimáticas, por ejemplo, la peroxidasa del maíz consta de fracciones resistentes y lábiles al calor, donde el 5% de la actividad total pertenece a la fracción resistente al calor la que requiere un tratamiento.
La peroxidasa es una de las enzimas más termoestables de las plantas y bajo ciertas condiciones de tratamiento con calor puede retener la actividad durante el almacenaje. Al estudiar la peroxidasa de coliflor se determinó que la temperatura óptima era de 40°C y que la actividad disminuía drásticamente a temperaturas superiores hasta llegar al 50% a 48°C y aproximadamente 0% a 60°C, por lo que llegaron a la conclusión de que la enzima de la coliflor es termolábil.
Se han postulado muchas hipótesis para explicar la termorresistencia de las peroxidasas. Algunos trabajos han demostrado que las cadenas de carbohidratos unidas a la molécula de proteína incrementan su estabilidad térmica. Por otro lado, en estudios preliminares de dispersión dinámica de la luz se encontró que la peroxidasa es una proteína con alta tendencia a formar agregados, dichos agregados le confieren o incrementan su termoestabilidad.
2.2.3.- Otros factores que influyen la actividad peroxidasa
Además del pH y la temperatura, existen otros factores que alteran la actividad enzimática, tales como las radiaciones electromagnéticas, la humedad, la concentración de sustrato, la presencia de activadores, los metales pesados, entre otros.
Metales pesados como: hierro (Fe2+ y Fe3+), cobalto (Co2+), estroncio (Sr 2+), zinc (Zn2+), mercurio (Hg2+), níquel (Ni2+), aluminio (Al2+) y plomo (Pb2+) a ciertas concentraciones de dichos metales inhiben la actividad peroxidasa hasta en un 50% [2].
2.3.- Ciclo catalítico
Las peroxidasas utilizan hidroperóxidos, incluyendo H202, como aceptores de electrones para catalizar un gran número de reacciones oxidativas. La mayoría siguen el mecanismo de reacción que se describe en la siguiente figura:
Figura 3.- ciclo catalíticode las peroxidasas
La enzima reacciona con un equivalente de H202 para dar lugar al Compuesto 1. Esto implica una reacción de oxido-reducción de dos electrones en la que el H202 es reducido a KO y la enzima es oxidada. Un equivalente de oxidación reside en el hierro en forma de un intermediario oxoferril (Fe4+=O) y el otro, en la mayoría de las peroxidasas, reside en la porfirina (en forma de radical catiónico π de la porfirina, representado en la F¡g. como ·+). En algunos casos, como en la citocromo c peroxidasa (CcP), pueda estar centrado en un aminoácido. A continuación, el Compuesto I puede oxidar un sustrato mediante una reacción de transferencia electrónica en la que se forma el radical del sustrato correspondiente ·A. La enzima queda como Compuesto II con un centro (Fe4+=O) coordinado con la porfirina que ha recuperado su electrón. Finalmente, el Fe4+=O del Compuesto II es reducido a la forma férrica (Fe3+) de la enzima nativa mediante la sustracción de un electrón de otra molécula de sustrato. En ausencia de sustratos reductores adecuados, un exceso de H2O2 reacciona con el Compuesto II para formar el Compuesto III (Fe3+ O2) produciéndose la inactivación de la enzima y la pérdida del grupo hemo.
2.3.1.- Mecanismo de reacción de la peroxidasa (horseradish peroxidase)
Mecanismo de reacción para las reacciones catalizadas por peroxidasa en las que el H2O2 es el sustrato aceptor de electrones. El sustrato donador de electrones se simboliza como AH, y el radical libre formado por este es A*. Un anión capaz de reaccionar con la ferriperoxidasa se indica con Y-. 
	
	
	
	H2O2
	
	Ferriperoxidasa-H+-Y-
	⇄
	Ferriperoxidasa
	→
	Compuesto I
	
	
	↓-A*
	
	↓
	
	
	(Compuesto II)-AH
	
	Compuesto (I)-AH
	
	
	↕AH
	-A*
	
	Oxiperoxidasa
	⇄
	Compuesto II
	
	
	
	H2O2
	
	
	
Figura 4.- Esquema del mecanismo de acción de la peroxidasa HRP, tomado de [1]
El H2O2 reacciona con la ferriperoxidasa (la enzima libre) para dar especies llamadas compuesto I. Este paso tienen una constante de disociación de 5x10-8 M, por lo que la reacción es considerada irreversible. La ferriperoxidasa, el compuesto I y otras especies enzimáticas pueden denominarse “formas enzimáticas”. El compuesto I sufre una reducción equivalente para dar el compuesto II, el cual a través de una segunda reducción uni-equivalente es reducido a ferriperoxidasa. 
Los complejos enzima-sustrato formados mediante la adición del sustrato oxidable al compuesto I y compuesto II son de vida corta y no es posible detectarlos por métodos espectrofotométricos directos. El compuesto II puede reaccionar con el H2O2 para dar una forma enzimática, denominada compuesto III. Este compuesto III está estructuralmente relacionado con la oxihemoglobina y la oximioglobina, por lo que se le puede denominar oxiperoxidasa. La oxiperoxidasa puede sufrir posterior reacción, pero a velocidad muy lenta. El efecto inhibitorio de concentraciones altas de H2O2 se debe obviamente a la acumulación de oxiperoxidasa. 
Referencias
[1] 	Á. C. PEINADO, «PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE UNA PEROXIDASA DE ZANAHORIA,» UNIVERSIDAD DE JAÉN, FACULTAD DE CIENCIAS EXPERIMENTALES, ESPAÑA, 2006.
[2] 	P. M. G. SALAZAR, «ESTUDIO DE LA POLIMERIZACIÓN DE FENOLES UTILIZANDO PEROXIDASAS PRESENTES EN RÁBANO COMÚN (Raphanus sativus var sativus), CON APLICACIÓN EN LA BIORREMEDIACIÓN DE AGUAS RESIDUALES DE UNA EMPRESA TEXTILERA,» ESCUELA POLITÉCNICA DEL EJÉRCITO, DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA , SANGOLQUÍ, 2011.
[3] 	F. Bjorksteb, H. Yliopiston y B. Laitos, «A kinetic Study of the Horse-Radish Peroxidase-Catalyzed Oxidation of Iodide,» 1968.
[4] 	F. J. R. Dueñas, «CARACTERIZACIÓN MOLECULAR DE UN NUEVO TIPO DE PEROXIDASA LIGNINOLÍTICA,» Universidad Complutense de Madrid, Facultad de Ciencias Biológicas, Madrid, España, 1998.
[5] 	S. Rathnamsamy, R. Singh, R. Auxilia y B. N. Vedhahari, «Extraction of peroxidase from various plant sources and its biodegradation studies on phenolic compounds,» BioTechnology: An Indian Journal, 2014. 
[6] 	E. M. B.Sc, «Stability Characteristics and Applications of Native and Chemically-Modified Horseradish Peroxidases,» pp. 8-11, 1996. 
[7] 	P. M. GUTIÉRREZ SALAZAR, «ESTUDIO DE LA POLIMERIZACIÓN DE FENOLES UTILIZANDO PEROXIDASAS PRESENTES EN RÁBANO COMÚN (Raphanus sativus var sativus), CON APLICACIÓN EN LA BIORREMEDIACIÓN DE AGUAS RESIDUALES DE UNA EMPRESA TEXTILERA,» DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA, 2011. 
[8] 	F. W. Krainer y A. Glieder, «An updated view on horseradish peroxidases: recombinant production and biotechnological applications,» springer, vol. 99, p. 1611–1625, 2015.