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Citometría de flujo M en C. Carlos Arturo Gallardo Hernández CITOMETRÍA DE FLUJO Análisis multiparamétrico de las características físicas y químicas de las células en suspensión Tamaño. Complejidad. Fluorescencia INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 3 Obtención de células provenientes del bazo de un ratón 1500 r.p.m durante 5 minutos Aforar a 11 mL con PBS 1X Lisis de eritrocitos Cloruro de amonio 3 mL durante 3 minutos + 1500 r.p.m durante 5 minutos Aforar a 11 mL con PBS 1X Conteo de células y viabilidad Decantar el sobrenadante + 1 mL Dato importante: Mantener las células siempre en hielo. 10 uL 90 uL Conteo de células y viabilidad # de esplenocitos totales= # de células vivas X 100,000 Tinción de citometría de flujo IL-10 1 mL 65,000,000 millones de esplenocitos Tinción de citometría de flujo ¿? mL 1,000,000 millones de esplenocitos ¿Cuántos uL debo tomar del total de células para quedarme solo con 1 millón? Tinción de citometría de flujo Mix de Anticuerpos 0.3 uL 0.3 uL 0.3 uL 0.3 uL 0.3 uL 0.9 uL 0.9 uL 0.9 uL 0.9 uL 0.9 uL Multiplicar X 3 CD19 CD21 CD23 CD24 IL-10 MIX 4.5 uL de Ac´s + 45.5 uL de PBS1X= 50 uL 10 uL 10 uL MIX 15.38 uL Células 74.62 uL PBS 1X Volumen final= 100 uL Incubar a temperatura ambiente en oscuridad durante 15 min 1 mL 1500 r.p.m durante 5 minutos 300 uL Lectura de resultados en el citómetro de flujo CD19 CD3 LB LT Estrategia de análisis CD21 CD24 T1: CD21Low CD24High T2: CD21High CD24High M: CD21LowCD24low CD21 CD23 NF: CD21NegCD23Neg FO: CD21LowCD23Pos ZM: CD21PosCD23Neg Expresión de proteínas por citometría de flujo Análisis de citometría de flujo para separar Linfocitos B (T1, T2, foliculares y zona marginal) de ratones sanos y deficientes de CD19 Entrega: Lunes 6 de junio Trabajo de laboratorio
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