Utilización de la huella genómica

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UTILIZACION DE Lj\ HUELLA GENOMICA, PCR Y 
RIBOTIPIFICACION-PCR PARA ESTUDIOS-DE 
CARACTERIZACIÓN GENÉTICA DE CEPAS DE-
Salmonella enteritidis AISLADAS EN PLANTELES , 
AVICOLAS 
-f' 
Jesús E. Ruano B., Bact. *; MS; Fernando Ariza B., MV, MS; 
Francisco Bustos M., MVZ1 MS, MVSc. 
RESUMEN 
En el presente estudio, se evaluó fa utilidad de la huella 
genó~ica, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y fa 
ribotipificación, para fa caracterización de cepas de Si1/monellil 
especie,, aisladas en planteles avícolas. Treinta cepas de Sillmo-
nellil especie fueron obtenidas a partir de muestras fe cales; 
saco vitelino, hígado y ciegos. Mediante pruebas bioquímicas y 
exámenes serológicos, veinticuatro cepas fueron clasificadas 
como S. enteritidi.s,; una como S. pl/inilrum, una como S. 
pullorum y cuatro como S.. typhimurium. El análisis del DNA 
cromosoma) después de fa digestión con enzimas de restricción 
PVu 11., SAL I o Hind III y electroforests, demóstró diferentes 
patrones entre las especies de Si1/monelli1. Un producto de 496 
bp fue obtenido de todas fas cepas, utilizando la técnica de 
PCR para el gen operon transportador de la histidina. Cuando 
se utilizó el DNA de S. enteritidis para la prueba de 
ribotipificadón - PCR empleando cebadores para la región 1 6s 
y 23s del RNA ribosomal, fue posible evidenciar distinto~ perfiles 
electroforéticos, no observados por la huella genómicá del· DNA 
cromosoma(. Los resultados muestran el uso práctica de las ----Posgrado en Microbiología. Pontificia Universidad Javeriana, Bogotá, D.C.; Programas 
de Biología Molecular y Medicina Aviar. CORPOICA - CEISA, Av. Eldorado No. 42-42 
Bogotá, D.C. 
6 Revista del CEISA, Vol. 4 No. 1. Enero-Diciembre de 1997 
técnicas moleculares, para evaluar la difusión de S. enteritidis 
entre los planteles avícolas y para establecer la relación genética 
entre los aislamientos. 
Palabras claves adicionales: huella genómica, PCR, ribotipi ... 
ficación, Salmonel/a • 
.. ABSTRACT 
GENOMIC FINGERPRINT, PCR,. AND PCR-
RIBOTYPING FOR THE GENETIC CHARACTERIZA- ' 
TION OF Salmonella enterlddls STRAINS ISOLATED 
FROM COMMERCIAL POULTRY FLOCKS 
In this study was assesed the usefulness of the genomic finger-
print ,analysis, polimerase chain reaction (PCR) and polimerase 
chain reaction rlbotyping to the molecular characterlzation of 
Salmonella strains isolated from commercial -poultry opera-
tions. Thirty Salmonella stralns were lsolated elther from fecal 
samples, yolk sac, livers and cecum. By biocheniical and sero-
logical tests, 24 strains .were classified as S. enterltldls, oneHas 
s. ga/1/narum, one as S. pul/orum, and four as S. typ/J/murliim. 
Chromosomal DNA analysis after d.ig-estion with the restric-
tion enzymes Pw 11, Sal I or Hind 111 ~nd electrophQresis, 
showed different patterns among the St1/monntl/la species. By 
PCR amplification of the histidlne transport operon-gen a 496 
bp product was obtained from all the stralns. When DÑA from 
S. enteritidíswas used for polymerase chain reaction ribotyping 
using primers dlrected to the 165 and 23S ribosomal RNA 
coding region, it was posslble to diff erentiate distlnct electro-
phoretic pattems not sñown by flnger prlnt of the chromo-
somal DNA. These results show the practical use of these 
molec.,.lar technlques to monitor the spread of Salmonellt1 
enterlddis strains between flocks and to establlsh the genetic 
relationship among isolates. 
Addltlonal lndex words: Salmonella, flngerprint, PCR, 
ribotyping. 
RUANO B., J.E. et al. Huella genómica de Sallllone/la 7 
[I] a industria avícola es la más tecnificada dentro del sector agropecuario del país, y cuenta con una población superior a 
400.000.000 de aves. Sin embargo, existen problemáticas de 
tipo infeccioso las cuales ocasionan pérdidas económicas a esta industria, 
como es el caso se la salmonellosis aviar. (Arroyo y Bustos, 1993). · 
.. ' 
En la ·;~t'uali1ad se habla de la salm.onellosis como un problemi de 
importancia mundial, debido a que es un tipo de infección .queilo reconoce 
barreras internacionales,·~a(e~ta a la mayqría de especies animales y es 
considerada como un importante agente zoonótico {Ariza et al., 1993). 
El desarrollo explosivo de la sociedad industrial durante los últimos 
treinta años ha dado -lugar a que productos de origen animal representen 
la principal fuente de proteína para la alimentación hu~,.JQ_ cual ha~ 
conducido a la industrialización del sector agropecuario y a una adecuada 
racionalización de la nutrición animal (Garlan, 1995}. ··---. 
Un seguimiento epidemiológico de la _Jalmonella spp. está basado 
principalmente en la sero y fago tipificación, para lo cual se requiere un 
grupo de .antisueros costosos y suspensiones de fagos que no están 
comercialmente disponibles y no son de fácil estandarización. { Olsen, 
1992 ). Es así, como el uso de las técnicas de manipulación del AON y su 
aplicación a la taxonomía bacteria! y a la epidemiología de las mismas se 
han desarrollado en los últimos años , en particular el análisis de patrones 
de restricción del ADN cromosoma!, el uso de la reacción en cadena de la 
polimerasa {PCR) y sus aplicaciones adicionales a la ribotipificación. 
Resulta difícil implementar un plan para el control y erradicación de 
Salmonella enteritidis ya que, a diferenci_a de lo que ocurre ton Salmonella 
gallinarum o Salmonella p(!llorum, el microorganismo no es específico de 
~uésped y puede ser transportado biológicamente por numerosas especies 
incluyendo al hombre; además, puede estar presente en algunas materias 
primas o en el alimento terminado (Christians et al., 1992 ). 
Uno de los principales objetivos del examen microbiológico ha siso~, 
d: ?emostrar la presencia de microorganismos patógenos en r:nuest~as 
chnicas y patológicas asociadas con enfermedades infecciosas. (E1sentE:in1 
1986; Kapperud et al., 1989). En cambio, con el de~(lrfOflo de la ger:1étrca 
8 Revista del CEISA, Vol. 4 No. 1. Enero-Diciembre de 1997 
molecular las nuevas tecnologias disponibles permiten realizar 
determinaciones de patógenos utilizando pruebas diagnósticas de una alta 
sensibilidad y especificidad y en periodos más cortos (Owen, 1989; Rivera 
et a/.,1991). ' 
u 
Por esta razón se propuso el presente estudio de evaluación de cepas 
nacionales, utilizando tecnologías más sensibles y específicas que puedan 
servir como base para futuros estudios epidemiológicos. ' 
MATERIALES Y MÉTODOS 
Muestras 
Se estudiaron en total 30 muestras: 24 de Salmonel/a enteritidis, cuatro 
de Salmonella typhimurium, una de Salmonella gallinarum y una de Sa/mo-
nella pullorum, provenientes de planteles avícolas de los departamentos 
del Atlántico, Caldas, Cundinamarca Y Valle del Cauca. Después de su 
identificación, las cepas se conservaron a -20ºC en caldo infusión cerebro 
corazón (BHI) con 20% de glicerol. 
Sitio de estudio 
Las muestras fueron procesadas en el Laboratorio de Biofogía Molecu-
lar de Bacterias en el Centro de Investigación en Salud y Producción-Ani-
mal (CEISA} de la Corporación Colombiana de Investigación Agropecuaria, 
CORPOICA. 
Análisis bacteriológico 
Las muestras recolectadas se sembraron en Agar Mac Conkey y se 
incubaron a 3 7ºC. por 24 "' '"as. Las cepas de Salmonel/a spp. fueron 
sometidas a pruebas bioquímicas r serológicas, Y posteriormente fueron 
subcultivadas en el medio líquido 1B -Luria Bertani. 
Obtención del ADN cromosomal 
Las cepas de Salmonella spp. se cultivaron en 30 mi de medio líquido 
Luria Bertani y se incubaron a 37ºC durante 18 horas en agitación constante. 
RUANO B., ]. E. ee al. Huella genómica de Salmonella 9 
El cultivó se centrifugó por 1 O minutos a 5000 gen tubos falcon de SO 
mi; lueg~ se descartó -~I sobrenadante dejando el pellet lo más seco posible, 
el cual se -r~s_uspend10 con 5 mi de buffer PBS y se centrifugó a SflOO g 
durante 5 minutos; este procedimiento se realizó por 3 veces para obtener 
un pellet limpio de medio de cultivo. '-
--............_______ \ 
·El pellet se ~ometió a va(ips tratamientos con lisozima, proteinasa K, 
SOS y fenol cloroformo isoamil, según la técnica empleada por Sambrook 
et al., (1989). -
Cuantificación del ADN 
Dos métodos fueron usados para medir la cantidad del ADN en una --
preparación: 
A. Por espectrofotometrí~: 
Este método se usa cuando la muestra es pura. Se preparó la muestra 
diluyendo 5 µI del ADN en 995 µI de agua ultrapura. Se mezcló muy bien 
y se hicieron lecturas con dos longitudes de onda, 260 y 280 nm. La lectura 
a 260 nm permite calcular la concentración del ADN en la muestra. La 
división entre la lectura de 260 nm sobre la de 280 nm permite estimar la 
pureza del ácido nucléico. La pureza del ADN comprende valores entre 
1.8 y 2.0. 
B. Por fluorescencia con bromuro de etidio: 
Algunas veces no es suficiente la cantidad del ADN o éste puede estar 
contaminado con otras sustancias que absorben la radiación ultravioleta. 
Una vía rápida para estimar la cantidad del ADN en tales muestras consiste 
en usar la fluorescencia emitida por moléculas de bromuro de etidio 
intercaladas entre el ADN. 
Una serie de diluciones comprendidas entré 1 y 20 µg/ml fueron 
preparadas a partir de un patrón de concentración conocido. Se colocó 
una gota de cada dilución sobre un plástico transparente y un~ gota de 
cada una de las muestras por analizar. A cada gota se le adicionó otra de 
buffer TE pH 7.6 que contenía 2 µg/ml de bromuro de etidío y se vis-waHzó 
con luz UV para analizar las concentraciones del ADN, cortAp,ar:ar1<tlo la 
intensidad de la fluorescencia er-1 la muestra con fas dilud0roes del 'p>atrón 
(Figura 1 ). 
1 O Revista del CEISA, Vol. 4 No. 1. Enero-Diciembre de t 997 
FIGURA 1. Huella genómica del ADN 
de S. enteritidis de cepas de pollitos de 8 
días de nacidos. ' 
Carril A: marcador de peso molecufar 
de 100 pb. 
Carriles 8-J: cepas de S. enteritidis dige-
ridas con la enzima de restricción sal I, 
gel de agarosa al O.SS % teñido con 
bromuro de etidio fotografiado con rollo 
de Polaroid 667. 
Digestión del ADN con enzimas de restricción 
En este estudio se utilizaron cuatro clases de endonucleasas; cada 
enzima presenta un sitio de corte y un origen diferente. La digestión del 
ADN depende del tipo de gel utilizado (agarosa o poliacrilamida). 
Para el gel de agarosa, la digestión se realizó de la siguiente manera: 
En un tubo de eppendorf se colocaron 1 O µI del ADN disuelto 
(aproximadamente 1 O µ g), 3 µI de la enzim~ (Pvu 11, Sal I ó Hind 111), 3 µI 
de buffer de la enzima y 9 µI de agua destilada desmineralizada estéril; 
luego se llevaron a incubar a 37ºC por 3 horas. La reacción se detuvo con 
5 µI del buffer de parada para un volumen final de 30 µl. Similar 
procedimiento se efectuó con el fago lambda (marcador de peso molecu-
lar Promega), de la siguient, manera: 1 µI de enzima Pvu 11, 1 µI de buffer 
de la enzima, 1 µI del fago la,nbdu '/ 2 µI de agua destilada desmineralizada 
estéril ; la reacción de detuvo adicionándole 5 µ I del buffer de parada para 
un volumen final de 1 O µl. 
Para el gel de poliacrilamida la digestión se llevó a cabo así: 
En un tubo de eppendorf se colocaron 25 µI del ADN disuelto 
(aproximadamente 25 µ gr), 5 µI de la enzima Hind 11 1 (Gibco), 5 µI de 
buffer de la enzima (Gibco) y 1 O ~ti de agua desti lada desmineralizada 
RUANO B., J.E. et al Huella genómica de Salmonella 11 
estéril; luego se llevaron a incubar a 37ºC por 4 horas y se paró la reaccion 
con 5 µI de buffer de parada, para un volumen final de 50 µl. Se utilizó un 
marcador de peso molecular de 1 Kb (Gibco). 
Electroforesis de0DN en gel de agarosa 
\ 
El ADN purificado fue digerido con las enzimas de restricción Pvu 11, Sal 
1 y Hind 111 y luego sometido a electroforesis en una unidad horizontal de 
una sola dimensión en gel que contenía agarosa al O.SS% en buffer TBE 1 X. 
Las muestras del ADN digeridas se coloc~n- en una cámara de 
electroforesis que contenía 1 1 del buffer TBE 1 X, y se aplicó una corriente 
contínua de 30 voltios durante 17 horas. 
Tinción del gel de agarosa 
La tinción se llevó a cabo agregando una solución de bromuro de etidio 
(1 O mglml} en una proporción 5/100 (vol/vol) en buffer TBE por 45 minutos. 
Las bandas de ADN se visualizaron con una fuente de luz ultrav1oletc1 
de 300 nm. (transiluminador Sigma Co USA) y luego se fotografió con una 
película 665 ó 667 empleando una cámara Polaroid. 
Electroforesis del ADN en gel de poliacrilamida 
Se utilizó un gel denaturante de poliacrifamida de 6 y 8% (concentrador 
y separador, respectivamente) con un contenido de úrea. 
Primero se prepararon 30 mi del gel separador de acrilamida y úrea al 
8%, (colocado inmediatamente con pipeta o con j eringa) y se dejó 
polimerizar durante 45 minutos a 4ºC. 
Posteriormente, se prepararon 1 O mi del gel concentrador de acrilamida 
y úrea al 6% (servir inmediatamente el gel y el peine correspondiente) 
luego se dejó polimerizar durante 40 minutos a 4ºC. 
Por último se colocaron 30 µI de las muestras del ADN digeridas 
previamente con la enz ima de restricción HIND 111; se llevó al tanque de 
corrido conteniendo 4 lt del buffer TBE 1 X y se aplicó una corriente contínua 
de 280 voltios durante 20 horas. 
12 Revista del CEISA, Vol. 4 No. t. Enero-Diciembre de t 997 
Tinción del gel de poliacrilamida 
Posterior a la electroforesis, el gel fue íijado en á~id6 acético al 7.5% 
durante 30 minutos, después se lavó con agua destilada 3 ·veces durante 2 
minutos cada lavado, luego se sumergió el gel en una solución de nitrato 
de plata (1.5 g/ll y formaldehido al 0.056% durante 1 hora. Después se 
colocó el gel en agua destilada (5 segundos) y luego en una solución 
reveladora entre 8 y 1 OºC (carbonato de sodio 30 g/I, formaldehido al 
0.056% y 400 µg/I de tiosulfato de sodio), reemplazando esa solución por 
otra nueva tan pronto empezaron a observarse las bandas del marcador, 
luego la reacción se detuvo con ácido acético frío al 7.5% (8ºC), se lavó 
con agua destilada y se guardó en nevera a 4º C. 
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 
Todas las muestras del ADN de Sa /mone//a fueron diluidas a una 
concentración comprendida entre 1 O y 100 ng, en un volumen final de 
16 µl. 
Los iniciadores de 25 bases están diseñados para amplificar un segmento 
de 496-pb, altamente conservado en el gen operón transportador de 
histidina de Sa/mone//a typhimurium. 
Las secuencias de los oligonucleótidos iniciadores 1 y 2 utilizados fueron: 
1. 5'-ACT GGC GTT ATC CCT TTC TCT GGT G-3' 
2. 3'-ATG TTG TCC TGC CCC TGG TAA GAG A-5' 
Una mezcla maestra para el PCR fue preparada tomando 1.0 µI de 
cada iniciador (100 ng/µI), 0.5µ1 de dNTP mix 2.5 mM (Perkin Elmer), 2.5 
µI de buffer de amplif icacion 1 OX PCR (Gibco), 3.0 µI de cloruro de 
magnesio, 2.5 mM (Gibco) y 1 .O µI de la enzima Taq polimerasa a una 
concentración de 1 U/µI, para obtener así, un volumen final de la mezcla 
maestra de 9.0 µl. Al volumen final de la mezcla se le adicionaron 16 µI 
del ADN (10-100 ng por ·eacr ión) previamente diluido y hervido a 95º( 
durante 5 minutos y enfr1c.Jo e hielo a -20º( por 5 minutos; se adicionaron, 
además, 50 ~ti de aceite mineral para evitar la evaporación de la muestra y 
se llevó al termociclador. Las condiciones util izadas para la amplificación 
fueron las descri tas por Cohen et al. (1995). 
RUANO B., J.E. et al Huella genómica de Sa/monella 13 
,, Los productos de PCR fueron sometidos a electroforesis en un gel de 
agarosa al 2%, teñido con bromuro de etidio 0.5 µg/ml y visualizado 
mediante un transiluminador de luz ultravioleta (300 nm) después fueron 
fotografiados con una cámara Polaroid con un rollo 665 ó 667. Un resultado 
positivo fue interpretado por la presencia de una banda de 496-pb, la cual 
fue comparada con el marcador de peso molecular lambda digerido con 
Eco RV. 
---
Ribotipificación usando la reacción en cadena de la polimerasa 
Se trabajaron diluciones similares a las del ADN utilizado para PCR, es 
decir, a una concentración finalcomprendida entre 1O y 100 ng para 16 µI 
de volumen final de reacción; las amplificaciones fueron hechas en un 
volumen final de 25 µl. 
Los oligonucleótidos iniciadores fueron diseñados para servir de 
complemento a las regiones altamente conservadas de 16S y 23S del ARNr 
del genoma de la Salmonella. Las secuencias de los iniciadores 1 y 2 
corresponden a las bases 1390-1408 de la región 16S del ARNr y a las 
bases 191-206 de la región 23S del ARN, respectivamente. Las secuencias 
fueron: 
1. 5'-TTG TAC ACA CCG CCC GTC A-3' 
2. 3'- GGT ACCTTA GAT GTT TCA GTT C-5' 
Se preparó una mezcla maestra que contenía 1.0 ~ti de cada iniciador 
(100 ngl~tl), 0.5 µI de dNTP mix 2.5 mM (Perkin Elmer), 2.5 µI de buffer de 
amplificacion 1 0X PCR (Gibco), 3.0 µI de cloruro de magnesio, 30 mM (Gibco) 
y 1.0 µI de la enzima Taq polimerasa a una concentración de 1 U/µI, para 
un volumen final de la mezcla de 9.0 µl. 
Al volumen final de la mezcla maestra se le adicionaron 16 µI del ADN 
diluido (10-100 ng por reacción) y previamente hervido a 95ºC durante 5 
minutos y enfriado en hielo a -20ºC por 5 minutos; se adicionó, además, 
50 ~ti de aceite mineral para evitar la evaporación de la muestra y se llevó 
al termociclador bajo las condiciones seguidas por Kostman el al. (1995). 
14 Revista del CEISA, Vol. 4 No. 1. Enero-Diciembre de 1997 
Veinte mkrolitros de la mezcla de PCR fueron anal izados por 
electroforesis en geles de agarosa al 2% y los productos obtenidos fueron 
visualizados después de la tinción con bromuro de etidio y fotografiados 
con una cámara Polaroid y con un rollo 665 ó ~67,'y comparados con el 
marcador de peso molecular lambda digerido con Eco RV. 
RESULTADOS 
Resultados de la huella genómica 
De las 30 cepas de Salmonella spp. aisladas de aves comerciales, 26 
fueron clasificadas como Sa/monella enteritidis y 4 como Salmonella 
typhimurium por medio de pruebas bioquímicas. De las cepas de 5. 
enteritidis una fue clasificada como Salmonella enteritidis serovar gallinarum 
y otra como serovar pullorum. 
En la Figura 2, los carriles B al J muestran los perfiles electroforéticos 
de 9 ADN aislados de cepas de Salmonella y digeridos con la enzima de 
restricción Sal l. El carril A muestra el marcador de peso molecular digerido 
con la enzima de restricción Pvu 11. Todos los aislamientos fueron iguales 
al patrón de restricción del ADN. 
FIGURA 2. Huella genómica del ADN de 
S. enteritidis de cepas depollitos de 8 días 
de nacidos. 
Carril A: marcador de peso molecular 
A digerido con PVU 11 
Carril es B-J: cepas de 5. enteritidis 
digeridas con la enzima de restricción 
PVU II gel de agarosa al O.SS% teñido 
con bromuro de etidio fotografiado con 
rollo de Polaroid 667. 
RUANO B., J.E. et .il Huella genómica de S,1/mone/1,1 · 15 
La d igestión del ADN genómico de los aislamientos de Salmonella 
enteritidis mostró 9 bandas con un buen patrón de separación en geles de 
agarosa al O.SS% a lo largo del carril electroforético, cuando se sometió a 
20 voltios durante 17 horas. 
En la Figura 3, los carriles B al J- comparan los perfiles electroforéticos 
de 9 ADN extraídos de cepas de Salm-Q!!_ella enteritidis, digeridos con la 
enzima de restricción Pvu 11 y corridos en·geles de agarosa al O.SS%, a 20 
voltios durante 17 horas. 
FIGURA 3. Huella genómica del ADN de 
S. enteritidis de cepas de pollitos de 8 días 
de nacidos. 
CarrilE : marcador de peso molecular A 
digerido con Hind lll. 
Carri les A - D: cepas de 5. enteritidis 
digeridas con la enzima de restricción 
Hind III. gel de agarosa al O. SS% teñido 
con bromuro de etidio fotografiado con 
rollo de Polaroid 667. 
Todas las cepas mostraron un idéntico patrón de migración del ADN 
sin presentar cambios en ninguna de las bandas. Se util izó el marcador de 
peso molecular lambda d igerido con la endonucleasa de restricción Pvu 11. 
En la Figura 4 se observa el perfil electroforético de ADN de Salmo-
nella enteritidis (carri les A al D) aislados de pollitos de 8 días de nacidos, 
d igeridos con la enzima de restricción H ind 111 . En el carril E se observa el 
control de peso molecular lambda digerido con la enzima Hind 111. También 
se puede observar en esta figura que la huella genómica de los 4 
aislamientos, corridos en geles de agarosa al O.SS% a 20 voltios durante 
1 7 horas, son idénticos. 
16 Revista del CEISA, Vol. 4 No. 1. Enero-Diciembre de 1997 
FIGURA 4. Carriles A -D y F-G ': cepas 
de S. entiritidis digeridas con la enzima 
Hind III. 
Carril H: cepa de S. Typhimurium digerida 
con la enzima Hind III. 
Carril E: marcador de peso molecular de 
1 kb. gel de poliacrilamida al 8% teñido 
con nitrato de plata (I) con bromuro de 
etidio (Il). 
llrl A"lºCº O'F,· O-N" 
En la Figura 4 (1) se observa el patrón electroforético de cepas de Sa/-
monella enteritidis (carriles A,B,C,D,F y G) y una cepa de Salmonella 
tiphymurium (carril H) digeridas con la enzima de restricción Hind 111 y 
sometidas a un corrido electroforético en geles de poliacrilamida al 8% y 
teñidos con nitrato de plata. 
Las 6 cepas de Salmonella enteritidis m0straron idéntico patrón 
electroforético. El perfil electroforético de la cepa de Salmonella typhimurium 
(carril H) se diferencia de las cepas de 5. enteritidis, pues tiene 6 bandas 
extras cuyo peso se sitúa por debajo de 1.636 pb (~ ) y por la ausencia de, 
al menos, tres bandas (.) 
La Figura 4 (11) es un duplicado de la figura 4 (1), con la diferencia de 
que su t inción se realizó con bromuro de etidio (obsérvese la diferencia en 
cuanto a sensibilidad de una tinción con la otra). 
La Figura 5 muestra el patrón electroforético de los ADN de 6 
aislamientos de Salmonella enteritidis, digeridos con la enzima de restricción 
Pvu 11.Los carriles By G corresponden a cepas de Salmonella tiphymurium. 
El carril C corresponde a una cepa de Salmonella gallinarum, el carri l F a 
Salmonella pullorum y los carriles D y E a cepas de Salmonella enteritidis. 
En el carril A se encuentra el control de la restricción y el peso molecular 
lambda digerido con la enz a P 1 11 . 
RUANO B., J.E. et al Huella genómica de Salmonel/a 17 
FIGURA 5. Carril A: marcador de peso mo-
lecular A digerido con PvuII. 
Carriles B y G: cepas de S. typhimurium 
digeridas con Pvu II. 
Carril C: cepa de S. gaflinarum digerida 
con Pvu II. 
Carril F: cepa de S. pullorum digerida con 
Pvu II. 
Carriles D y E: cepas de S. entiritidis 
digerida's--Eou.Jvu II. gel de agarosa al 
O.SS% teñido con bromuro de etidio y 
fotografiado con un ro llo Polaroid 667. 
Las muestras correspondientes a 5. enteritidis no presentaron diferencias 
en sus patrones electroforéticos, Por el contrario, cuando se comparó la 
cepa de Salmonella gallinarum con aquellas de Salmonella enteritidis, 
mostraron por lo menos 5 diferencias. De la misma manera, cuando se 
comparó el patrón de restricción de la Salmonella pullorum con las cepas 
de Salmonella enteritidis, se halló un patrón de restricción diferente entre 
el peso molecular 1708 y el peso molecular 63, con relación a la ausencia 
{.) o presencia(~) de bandas.(Figura 5). 
Por otro lado, se analizaron los patrones electroforéticos de los geles 
correspondientes a la Figura 4 y a la Figura 5 mediante el índice de Nei-Li . 
Es destacable que al analizar las bandas presentes de los aislamientos de 
Salmonella pullorum y gallinarum, se aprecia un patrón de bandas diferente 
entre las dos cepas, de acuerdo con las observaciones hechas anteriormente 
cuando se compararon con ceP-as de Salmonella enteritidis e incluso con 
las cepas de S. typhimurium. 
18 Revista del CEISA1 Vol. 4 No. 1. Enero-Diciembre de 1997 
Resultados de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 
Todas las cepas uti lizadas en este estudio fueron sometidas a la técn ica 
de la reacción en cadena de la polimerasa, visua lizándose un producto de 
amplificación de 496 pb. Una cepa de ADN de Pasteurella multocida fue 
usada como control negativo. -
Se analizó un par de oligonucleótidos complementarios a un segmentoaltamente conservado del gen operón encargado del transporte de la 
histidina del genoma de la Salmonella spp, para ser util izados como 
iniciadores en la reacción en cadena de la polimerasa, usando las 
condiciones descritas en materiales y métodos. El set de iniciadores 
amplificó efectivamente un segmento de 496 pb del gen operón encargado 
del transporte de la histidina. 
Se util izó, además, un control positivo de la reaccIon, el cua l 
corresponde a un producto de amplificación de 218 pb perteneciente al 
cromosoma femenino, frente a un par de iniciadores específicos para 
cromosoma humano (Figura 6). 
FIGURA 6. Productos de amplificación del 
ADN de 5. typhimurium, carriles J, Q, R y S. 
Carr i les B-L: control positivo de la 
reacción(cromosoma X humano) 
Carril M: control negativo de la reacción. 
Carriles A y K: marcador de peso molecu-
lar A digerido con Eco Rv. 
RUANO B.1 J.E. et al Huella genómica ·de Salmonella 19 
De la misma forma (Figura 7), este set de iniciadores amplificó un 
----producto de 496 pb de una co lecció n de productos prev iamente 
amplificados, de donde se tomaron 100 ng y se sometiero n a una nueva 
amplificación (reamplificación). _ -
FIGURA 7. Carr iles B, E - J, M - S: 
productos de ampli ficación del segmento 
p r e v i--a.[!l e n t e a m p I i f i c a d o 
(reamplificacioñ) de cepas de S. enteritidis . 
Carriles A y K: marcador de peso molecu-
lar de 1 kb. gel de agarosa agarosa al 2% 
teñid o con bromuro de etidi o y 
fotografiado con rollo Polaroid 667. 
De un total de 18 muestras sometidas a reamplificación, tres resultaron 
negativas. No se obtuvo amplificación a partir de los ADN genórnicos usados 
como controles de especificidad (Pasteurella multocida). 
Resultados de la ribotipificación-PCR 
O ligonucleótidos iniciadores complementarios de regiones ampliamente 
conservadas de los genes del ARN ribosomal fueron usados para amplificar 
el espacio 16S y 23S de 30 cepas de Salmonel/a aisladas de aves comerciales. 
Se identificaron seis aislamiéntos de Salmonella spp. por el polimorfismo 
obtenido después de amplificar las regiones del 16S y 23S (Figura 8). Varias 
bandas fueron ident ificadas en los aislamientos de los carriles C,E,F.G y H, 
que representan regiones del espacio ribosomal de d iferentes longitudes 
entre los operones cistrón del ARN ribosomal de Salmonella typhimurium 
(F,G y H) y de Salmonella enteritidis (C y E). Una banda simple en el carril 
D (S. enteritidis) corresponde a una región uniforme del espacio en los genes 
20 Revista del CEISA, Vol. 4 No. 1. Enero-Diciembre de 1997 
del ARN ribosomal de ese aislamiento. Los pesos moleculares de las bandas 
oscilan entre 3 .054 y 618 pb. 
FIGURA B. Ribotipificación PCR del ADN 
¡,enómirn dr crpas ele 5. entcnd1!1s 
(carriles C - E) y 5 typhimunum (carriles F, 
G, Hl aisladas de polli tos de 8 días de 
nacidos. 
Carril A: marcador de peso mclecular 
A digerido con Eco Rv. 
Carril 1: marcador ele peso molecular de 
1 kb. gel de agarosa al 2% teñido con 
hromuro de ctidio y fotografiado con un 
rollci Polaroid 667. 
Para investigar la estabilidad y 
reproducibilidad de los patrones 
• • O H 
de bandas observados después de la ampl ificación con PCR, se amplificaron 
11 aislamientos de ADN cromosoma! de Sa/mone//a en te ritidis y se 
obtuvieron patrones idénticos de amplificación en todas las muestras (Figura 
9). La d iferencia de la intensidad de bandas de las muestras G, H , 1 y J, se 
debió posiblemente a la variación en la concentración del ADN de la 
muestra y a las concentraciones de 
magnesio (Mg). 
FIGURA 9. Ribotipificación-PCR del ADN 
genómico de < epas de S. entend,tis 
aislados de pollitos de 8 días de nacidos. 
ramles e - M. 
C,11ril A. m.irc .,dor ele• ¡wso mulccul,1r 
A d1gemlo ron [ e o Rv g<'I ch ,1g.irr,•,.1 al 
2'¼, teñido con bromuro df' et1din y 
lotogrdhddCJ con un rollo Polaro1d 667. 
. . 
RUANO B., ']. E. et al Huella genómica de Salmonella 2 f 
En la Figura 1 O se observan 4 productos de ampl ificación de AON de 
Salmonelfa enteritidis (carriles B,C, D y E) y uno de ADN de Pasteurella 
multocida (carril F) extraido de cerdos (la línea F presen1a un patrón de 
bandas, similar a las Sa/mone/las). Todas estas amplificaciones fueron 
rralizadas por triplicado con el fin de demostrar su repraducibi\icldcl 
estabilidad. 
FIGURA 1 O. Productos de amplificación 
del ADN de cepas de 7 aisladas de pollitos 
de 8 días de nacidos, carriles B - E. 
C 1rri / F: ontro/ de la re.1c ión. 5<-• usó el 
AON genómico de una cepa de 
Pasteurella m ultocida. 
Carril A: marcador de peso mo lecular A 
digerido con Eco Rv. 
Los mismos oligonucleótidos 
inic iado res usados en la 
ribotipificación PCR original fueron 
uti l izados para amplificar 100 
nanogramos (ng) de los produ tos 
inic i a l es d e la rib o tip i fi cdción 
( r e ampli f ica c i ó n ), p e ro 
posib lemente deb ido a la 
concent ración del AON y del 
magnesio, no se observaron \o 
produ tos con la intensidad 
esperada (Figura 11). 
FIGURA 11. Carriles C y E: productos de 
ampli ficación del segm ento del ADN 
genó mic-o p reviam ente amplificado 
(rcampl i ficación). 
C;m i/ 13 : c o 111ro/ pos,livo de la r(•acncín 
(cromo,0111,1 X humano). 
arril A. 111d1 c.1dor de p eso 1110/f'cular Á 
digerido con Eco Rv. gel de agarosa al 2% 
teñido co n bro muro de e ti dio y 
fotogr¡fiado con rollo Polaroid 66 7 . 
Los p10d11ctos pm debajo de 212. pb 
conesponden a los iniriadmes. 
22 Revista del CEISA, Vol. 4 No. 1. Enero-Diciembre de 1997 
DISCUSIÓN 
Huella genómica 
En este estudio se analizaron 30 ADN cromosomales extraidos de cepas 
de Sa/monella spp. aisladas de aves comerciales de d iferentes granjas avícolas 
del país, sometidas a digestión con las endonucleasas de restricción Hind 
111 , Pvu 11 y Sal I corridas en geles de agarosa y poliacrilamida ·{Hind 11 1). 
Los resu ltados de este trabajo demostraron que la huella genómica 
puede ser aplicada como un método eficaz para distinguir aislamientos 
individuales de Salmonella enteritidis. Esta técnica t iene la particularidad 
d_e revelar información sobre la epidemiología de las infecciones causadas 
por dicha bacteria, ya que permite reconocer diferencias entre cepas de 
un mismo serotipo, lo que faci lita el análisis de la transmisión y origen de la 
infección dentro de una población. 
En la presente investigación la huella genómica de todos los serotipos 
de Salmonella enteri tidis mostraron patrones similares de restricción, 
sugiriendo esto una estrecha relación filogenética, mientras que los perfiles 
de Salmonella gallinarum y pullorum demostraron tener algunas diferencias 
en los patrones de bandeo, cuando fueron corridas en geles de agarosa, 
considerándose que poseen una relación más.distante. 
Otros autores (Boyd, 1996; Crosa, 1973; -Rivera, 1991) reportan la 
ex istencia de algunas diferencias entre los patrones de restricción de 
aislamientos de una misma granja, lo cual indicaría una d iferencia evolutiva 
originada a partir de una misma cepa y además podría sugerir la posibilidad 
de un parentesco epidemiológico entre cepas. Se requiere un estudio 
epidemiológico más detallado para veri ficar esta hipótesis. Los datos 
presentados respaldan esta hipótesis, ya que los patrones de restricción de 
Salmonella enteritidis se asemejan uno a otro. 
El análisis de los perfiles del ADN genómico proporciona un medio 
altamente seguro para evaluar la diseminación de las infecciones bacterianas, 
ya que es posible investigar cómo una cepa se mueve a través del tiempo 
entre diferentes regiones o dentro de un mismo brote. 
Adicionalmente, se dPrriostró que el perfil electroforético de cepas de 
Salmonella typhimurium _suli muy simi lar cuando fueron sometidas a 
digestión con la enzima de restricción Pvu 11 y corridas en geles de agarosa. 
RUANO B., J.E. et al. Huella genómica de Salmonel/a 2 1 
Para este estudio, las cepas se utilizaron únicamente como patrones de 
comparación cuando fueron corridas en las mismas condicionesfrente a 
cepas ele Salmonella enteritidis en un gel de poliacrilamida, el cual demostró 
una alta resolución y sensibilidad cuando se empleó una- tinción de plata 
para su visualización. 
Por otro lado, se observó que las cepas de Salmonella enteritidis aisladas 
ele tocios los lotes mostraron el mismo patrón de restricción cuando fueron 
sometidas a digestión con las enzimas de restricción Hind 111, Pvu II y Sal 1, 
y corridas en geles de agarosa al 0.55%, lo que significa que estas cepas 
tienen un patrón común de restricción. --........._ 
Igualmente, quedaron demostradas las bondades de la tinción con 
nitrato ele plata, al compararse con la ele bromuro de etidio,- ya que la 
tinción con plata detecta hasta 0.1 picogramos (pg) por m ilímetro cuadrado 
del gel, mientras que en los geles de agarosa teñidos con bromuro de etid io 
so lamente se detectan canlidades mayores a 1 O ng. Hoy, estos estudios 
están limitados por las d ificultades para comparar los geles, debido al error 
del ojo humano y a las variaciones de la movilidad de los fragmentos en 
el gel. 
Mejorando los métodos de lectura de patrones de restricción pueden 
eliminarse los problemas anteriormente mencionados y establecerse un 
banco de datos, para lo cual las cepas desconocidas podrían ser fácilmente 
comparadas frente a patrones, con el fin de encontrar sus relaciones 
epidemiológicas y etiológicas. 
Por medio del análisis de la matriz de similaridad (coeficiente de Nei-
Li) se pueden hallar diferencias ínfimas entre cepas de S. enteritidis y 
diferencias mucho más marcadas entre éstas y cepas de S. pullorum, 
gallinarum y typhimurium. 
Estos hallazgos confi rman que las 24 cepas colombianas estudiadas de 
Salmonella enteritidis poseen un solo patrón común de restriccción. Este 
factor es bastante importante, debido a que en el caso de entrar a formular 
un plan de vacunación con miras a controlar y erradicar la enfermedad de 
las granjas avícolas, se debe conocer el tipo de huella genómica de los 
serotipos presentes en la región, para que sea invo lucrado dentro de la 
vacuna el serotipo prevalente en el brote, y no corno en otras ocas iones en 
que se utilizan serotipos foráneos que pueden producir una protección 
24 Revista del CEISA, Vol. 4 No. 1. Enero-Diciembre de 1997 
deficiente, con el riesgo también de estar introduciendo un serotipo no 
existente en la región. 
La utilidad de cualquier esquema de tipificación es una afi rmación 
sobre el poder discriminatorio del mismo, el cual, a su vez, depende de las 
características que pueden ser medidas. Por tal razón la comparación de la 
huella genómica promete ser una alternativa superior a otros métodos 
taxonómicos. Se espera que cepas con un origen común tengan idénticos 
o por lo menos muy similares fenotipos e iguales marcadorés genotípicos. 
La huella genómica revela un número de marcadores o diferentes sitios de 
restricción que reflejan la organización completa del genoma de un 
microorganismo; por lo tanto, esta aproximación es un medio ideal de 
establecer la relación clona! de las bacterias aisladas de diferentes regiones 
en distintas épocas del año. 
El sitio de digestión producido por una enzima de restricción en el 
ADN ha demostrado ser un indicador específico de las relaciones entre 
cepas (Threlfall y Chart, 1993). 
En este estudio se asumió que el cromosoma es una estructura 
relativamente estable; ello sugiere que patrones de restricción generados 
por el PACE y agarosa pueden ser muy estables, por lo menos dentro de un 
período corto en términos de evolución. Esto es respaldado por la 
reproducibilidad de nuestros estudios con bacterias conservadas hasta por 
dos años, los cuales han mostrado un patrón consistente de estabilidad 
para el mismo microorganismo, aun después de varios pasajes in vitro. 
Esta técnica ha demostrado ser una herramienta confiable en estudios sobre: 
El origen tanto endógeno como exógeno de las cepas. 
Los vectores causantes de la diseminación de las epidemias. 
Los nuevos episodios por persistencia del microorganismo o por 
una reinfección con el mismo. 
Reacción en cadena de la polimerasa 
Métodos altamente sensibles para la amplificación de ácidos nucleícos 
han sido diseñados para la detección específica de pequeños fragmentos 
o secuencias de ADN. Una aplicación de estos incluye el PCR y otras 
RUANO 8,1 J.E. et al. Huella genómica de Sa/monef/,1 25 
técn icas de amplificación en la detección del ADN genómico o plasmídico 
de Sa lmon e lla spp. y otras bacter ias involucradas en procesos 
infectocontagiosos (Cohen et al., 1995). 
Las técn icas de amplificación de ácidos nucleícos, il.demás de ser 
aplicadas al diagnóstico de las enfermedades infecciosas, son utilizadas 
para los estudios epidemiológicos, especialmente sobre la transmisión y 
persistencia de la enfermedad. 
A mediados de los años 70, los brotes de intoxicación alimenticia debido 
a Salmonella enteritidis en humanos se incrementaron de acuerdo con lo 
reportado por Bich ler (1996). Estud ios ep1CJeru_io lógicos sobre este 
incremento han indicado que las cáscaras de los huevos de tipo A son una 
importante fuente para la bacteria. (Louis et al., 1988). De acu_erdo con 
Bichler (1996), desde 1994 han ocurrido 97 brotes de 5. enterilidis en 
humanos, en los cuales los huevos contaminados con el microorganismo 
han resultado implicados. 
De otra parte, se ha sugerido que la colonización por Salmonella es el 
resultado de la infección transovárica que resulta de la contaminación de 
los huevos prepostura y el microorganismo se ha aislado tanto de la albúmina 
como de la yema y de los ovarios de las aves. Por el contrario, autores 
como Gast et al. , (1990) reportan que posiblemente la transmisión no es 
transovárica, sino que se debe a la presencia de la bacteria en otros órganos 
como el oviducto, el hígado, el bazo, la unión cecal y la cavidad perito-
neal; por esta razón los organismos contaminan el exterior de la cáscara y 
penetran a través de ella. Lo anterior se ha demostrado por el mayor número 
de aislamientos realizados de albúmina que del óvulo o yema (Shivaprasad 
et al. , 1990). 
En esta investigación se implementó una metodología mucho más sen-
sible y específica que la anteriormente uti lizada en el diagnóstico: se trata 
de la prueba de ELISA, considerada hasta el momento, como una prueba 
sensible, pero que al compararla con el PCR su uso es limitado, debido al 
costo y a su sensibilidad relativamente baja. 
Debido al comportamiento de la bacteria dentro del hospedero, la 
técnica del PCR ha demostrado ser una valiosa herramienta de identificación 
de este patógeno cuando se encuentra en baja concentración o cuando al 
ser extraida, se encuentra en forma no viable o requiere condiciones 
26 Revista del CEISA, Vol. 4 No. 1. Enero-Diciembre de 1997 
exigentes de aislamiento (preenriquecimiento y enriquecimiento). Otras 
técnicas moleculares 11ecesitan un manejo cuidadoso de las muestras para 
proporcionar un ADN de alta calidad. El PCR sólo reguiere una muestra de 
ácidos nucleícos de mediana calidad o aun degradada; ad~más, es una 
técnica simple y rápida que incrementa la especificidad, la cantidad del 
producto y la sensibilidad de la prueba. 
Haciendo uso de los oligonucleótidos iniciadores, el PCR utilizado en 
este estudio demostró ser altamente específico y sensible para la detección 
de miembros del género Salmonella en muestras de cultivos bacteriológicos 
aislados de aves, ya que estos oligonucleótidos amplifican un fragmento 
altamente conservado entre las Salmonel/as, d_e una longitud de 496 pb, 
correspondiente al gen operón del transporte de la histidina en Sa/mone//a 
typhimurium; otros serotipos, como Salmonella enteritidis, Salmone/Ja 
pullorum y Salmonella gallinarum, fueron también identificados, 
demostrándose así, su alta especificidad de género. 
No se observó ninguna amplificación cuando se utilizó una cepa de 
Pasteurel/a multocida como control negativo. En esta investigación se 
evidencióla rapidez para detectar miembros del género Salmonella entre 
1 O y 12 horas después de cultivar la bacteria. Esto, comparado 
favorablemente con el tiempo requerido (días) para la identificación por 
cultivos bacterianos y caracterización bioquímica. 
La tecnología del PCR tiene un enorme potencial en el diagnóstico 
clínico microbiológico, ya que ofrece la posibilidad de identificar Salmonel/as 
spp. en una forma rápida y económica, incluyendo la detección de cepas 
que portan factores de virulencia conocidos que confieren la resistencia a 
los antibióticos o producen enterotoxinas. Además, ofrece la ventaja de 
realizar una detección directa del microorganismo aislado de órganos, 
materia fecal, tejidos y alimentos contaminados, sin necesidad de someter 
las muestras a procesos de extracción y purificación del ADN total. 
Ribotipificación usando reacción en cadena de la polimerasa 
(Ribotipificación-PCR). 
Diferentes fragmentos d0 ADN cromosoma! son originados por la 
digestión con enzimas de rest1 -ció,., tal como se demostró en este trabajo 
(ver resultados de huella genómica) donde se observa que muchas veces la 
comparación entre un gran número de bandas, es difícil de analizar. Dichos 
RUANO B., J.E. et al. Huella genómica de Salmoae.1111 27 
fragmentos de alto peso molecular han sido claramente separados por 
electroforesis decampo invertido, más no por electroforesis convencionales 
en geles de agarosa. Además, se requiere un equipo mucho más sofisticado, 
extensos tiempos de electroforesis y una considerable estandarización para 
comparar los patrones del ADN bacterial. 
Las sondas genómicas diseñadas a partir del ARNr~ministrail-un sistema 
altamente aplicable para investigar la epidemiología molecular de diferentes 
agentes infecciosos, mientras que·otras sondas genómicas son más liJT1itadas 
con su uso para identificar agentes especie-específicos o solamente 
específicos de cepas dentro de una especie en particular. El fundamento 
del uso de genes de ARNr hibridizados a ADN genómicos se basa en el 
desarrollo evolutivo de la bacteria, debido a que tales secuencias son 
altamente conservadas entre ellas. 
Muchas de las secuencias cistrón del ARNr en los microorganismos 
parece que han cambiado muy poco durante la evolución, y así, fas sondas 
de ADN específicas para estas secuencias pueden detectar un amplio rango 
de agentes que poseen secuencias similares. 
Las sondas utilizadas para la ribotipificación de bacterias pueden ser 
generadas por diferentes métodos. La sonda más comúnmente usada es 
un ARNr heterólogo u homólogo que ha sido marcado con un isótopo 
radiactivo, P32 • Una ventaja de estas sondas radica en que pocos pasos se 
requieren para la hibridización y los lavados. Además, la polaridad de la 
cadena de la sonda es tal que la hibridización con ARNr contaminante es 
minimizada. Sin embargo, las limitaciones del marcaje radiactivo de tales 
sondas para su uso en laboratorios clínicos y epidemiológicos requieren 
personal especialmente entrenado, y como existe el riesgo a la exposición, 
es necesario contar con un sitio especial para el almacenamiento de basuras 
radiactivas, lo cual implica costos y tiempos prolongados para el análisis de 
dichas muestras. 
Recientemente algunos investigadores como (Kostman et al., 1995) han 
utilizado el ARNr extraído de Escherichia coli como una sonda para detectar 
polimorfismos en el cromosoma bacterial de cepas de Pseudomona cepacia. 
Este método de ribotipificación demostró, además, la relación clonal entre 
los aislamientos del microorganismo en lotes de cría y levante de pavos y 
28 Revista del CEISA, Vol. 4 No. 1. Enero-Diciembre de 1997 
animales silvestres, cuando no pudo ser determinado por la serotipificación. 
Con el fin de evitar los anteriores inconvenientes o desventajas, se desarrolló 
para esta investigación la técnica del PCR en unión con_ la ribotipificación. 
Se analizó la aplicabilidad de la técnica para demostrar. polimorfismos 
de las "regiones espacio" comprendidos entre 16S Y 23S del ARNr de 
cistrones del ADN de cepas de Sa/mone//a enteritidis. Los polimorfismos 
representan variaciones en el tamaño de estas «regiones espacio» en los 
operones múltiples de ARNr, los cuales son reproducibles y estables a través 
del tiempo. Los patrones de bandeo producidos por la amplificación de 
estas regiones pueden ser comparados y utilizados en investigaciones de 
epidemiología molecular. 
Como se ilustró en la Figura 8, las muestras de los carriles C, D y E 
pertenecen a cepas de Sa/mone//a enteritidis, pero cada una posee un patrón 
electroforético diferente, que si .se comparara con los hallazgos de la huella 
genómica (Figura 1 ), en donde las cepas aparentemente son similares, se 
podría presumir que en realidad sí existe una diferencia genética más 
significativa, y que la diferencia o la relación clonal entre cepas debe ir 
acompañada por un análisis de este tipo (ribotipificación-PCR), teniendo 
en cuenta la región geográfica en la cual se llevó a cabo el aislamiento, 
además de otros factores de comportamiento de estas cepas en la naturaleza. 
Por el contrario, cepas de Sa/mone//a typhimurium mostraron un· patrón 
muy similar, resultados que concuerdan con los encontrados en la huella 
genómica. (Figura 5). · 
Por otro lado, un grupo de 11 aislamientos fue sometido a la 
ribotipificación con PCR y se demostró que no existen diferencias entre los 
patrones resultantes en la ribotipificación, lo cual concuerda con los 
resultados obtenidos en la huella genómica donde aparentemente no se 
observaron diferencias entre cepas. (Figura 2). 
Dos cepas que habían sido identificadas como Sa/mone//a enteritidis y 
que no pudieron ser serotipificadas completamente, de acuerdo con los 
hallazgos de la huella genómica, se presume que deben pertenecer a un 
serotipo diferente., Así, entonr- 'S, rr necesario llevar a cabo una 
investigación más detallada utiliza, ,do lt.1 secuenciación de los segmentos 
adicionales o diferentes, para comparar la similitud de estos fragmentos 
con aquellos de las cepas actuantes en el brote. 
......_____ 
RUANO B., J.E. et al. Huella genómica de Salmonella 29 
Una ventaja final de la ribotipificación-PCR es su capacidad_potencial 
para ser incluido en el diagnóstico molecular, ya que los oligonucleótidos 
iniciadores usados ,~on complementarios a las regioñes de los genes 
altamente conservados. Un simple par,de oligonucleótidos puede ser usado 
para tipificar un amplio espectro de especies. Los productos amplificados 
pueden, entonces, ser analizados con sondas genómicas especie específicas 
para identificar los productos específicos. 
Otra modificación podría incluir el uso de oligon~eéti.dos iniciadores 
complementarios a diferentes regiones de los genes del ARNr para producir 
diferentes productos de amplificación que pueden contener ..Jos 
polimorfismos. Por último, en ciertas especies puede haber bandas de igual 
tamaño presentes en diferentes radios y en distintos aislamientos. En esta 
situación, la densitomet~ía podría ser usada para determinar los radios de 
bandas producidos por PCR, representando fos radios de diferentes regiones 
espaciales en genes de ARNr. 
La futura aplicación de estas estrategias promete el uso intensivo de la 
ribotipificacion, usando la PCR para un gran número de especies 
bacterianas. Las ventajas de la ribotipificación utilizando la PCR incluyen 
la rapidez, la seguridad de detección, un set de iniciadores universales y el 
uso de pequeñas cantidades de extracto de ADN como materia iniciat;-
demostrando su potencial como una herramienta muy útil en la 
epidemiología molecular. 
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