Técnicas para visualización

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44Capítulo
Laura Valverde Islas
Javier Ambrosio Hernández
Contenido
■ Introducción 
■ Microscopia sin microscopio
■ Videomicroscopia
■ Microscopia de fl uorescencia
■ Microscopia electrónica
■ Microscopia de fuerza atómica 
■ Visualización 3D
ca están en continua evolución, pues con frecuencia se bus-
ca obtener las mejores imágenes, la mejor defi nición para 
apreciar los detalles con el mayor aumento posible, obser-
vaciones en tiempo real y las imágenes más reales que im-
pliquen una menor manipulación de las muestras por 
observar. Bajo estas circunstancias se considera que habría 
una mejor posibilidad de comprender mejor lo que sucede 
en el ámbito microscópico de los organismos en estudio.
Las formas de observación varían por las estrategias que 
se emplean, y éstas van desde la observación a nivel micromé-
trico hasta el nanométrico; por consiguiente, se requieren 
diferentes tipos de microscopio, como el fotónico y el electró-
nico (tanto el de barrido como el de transmisión y el de 
energía atómica). Con tales tecnologías de observación, los 
microorganismos pueden ser observados inmediatamente 
después de algún tratamiento, y no sólo de manera superfi -
cial, sino que es posible explorar su interior o el de las células 
o tejidos (Tsien, 2003). La decisión de la estrategia depende 
del estado, profundidad, rapidez y resolución de observación 
de lo que se desea; por ejemplo, si es necesario observar la 
muestra a bajo aumento sin recibir tratamiento alguno y de 
forma inmediata, se requerirá de un sistema de microscopia 
fotónica en la que se empleen sistemas en los que varía la in-
tensidad o la composición de la luz que se hace incidir. Sin 
embargo, si se desea observar a mayor aumento (a nivel nano-
métrico), es posible hacerlo sin que se trate a la muestra me-
diante la microscopia de energía atómica o la microscopia 
electrónica de barrido por ultracongelación rápida. De hecho, 
en los últimos años, mediante la microscopia electrónica de 
Preguntas de evaluación inicial
 1. ¿Cuántos tipos de microscopios existen?
 2 . ¿Qué tipo de microscopios podrían tener mejor aplicación 
para el diagnóstico en el campo o el consultorio? ¿Por qué?
 3 . ¿Cuáles serían las ventajas de usar los marcadores fl uores-
centes intravitales en la parasitología? 
 4 . ¿Con qué tipo de microscopio se pueden hacer observaciones 
de proteínas fl uorescentes?
 5 . ¿Qué tipos de microscopios pueden ser utilizados para efec-
tuar observaciones a nivel ultraestructural de los parásitos? 
 6 . ¿Cuál es la ventaja de llevar a cabo visualizaciones científi cas 
tridimensionales?
Introducción
La observación microscópica de los microorganismos es 
una necesidad en el campo de la parasitología. Se le utiliza 
para fi nes de diagnóstico o investigación, y para ello se usan 
microscopios sencillos y complejos que sean funcionales 
para los fi nes de observación que se persiguen. Por consi-
guiente, cualquier avance o aspecto técnico de la microsco-
pia impacta la forma de observación y la información que de 
ella se obtenga. Las tecnologías de observación microscópi-
Técnicas para visualización 
de parásitos mediante 
microscopia
transmisión combinada con la congelación ultrarrápida (to-
mografía crioelectrónica), se obtienen imágenes seriadas con 
las que se generan reconstrucciones de los componentes inte-
riores de los organismos, y con las imágenes reconstruidas se 
puede visualizar su interior desde diferentes ángulos. 
Ya es posible correlacionar lo obtenido en las recons-
trucciones digitales mediante la microscopia electrónica 
con lo visto para las mismas muestras por microscopia de 
fl uorescencia; esto implica que hay posibilidades de integrar 
los niveles de observación microscópica con la nanoscópica 
(Lucic et al., 2008). Sin embargo, esto no signifi ca que el 
poder de la resolución de los microscopios ópticos sea sufi -
ciente para alcanzar visualizaciones en los niveles ultraes-
tructurales. El hecho de contar con tecnología de video y 
fotografía digital, que permiten mejorar las amplifi caciones 
de las imágenes, no mejora la resolución; lo único que se 
conseguirá será superar la defi nición de las imágenes. A pesar 
de ello, cuando se combinan las observaciones por microsco-
pia de fl uorescencia con videomicroscopia bajo condiciones 
especiales, se ha demostrado que es posible alcanzar niveles 
de observación nanométrica (Westphal et al., 2008). No está 
lejano el día en que esto pueda ser aplicado para observar 
cómo los parásitos invaden las células o, tejidos, o la mane-
ra como se multiplican. 
En la actualidad no sólo es posible la observación de 
imágenes fi jas y, con apoyo en ellas, intentar defi nir su diná-
mica o funcionalidad. El desarrollo de la videomicroscopia, 
su acoplamiento a la microscopia de fl uorescencia (entre la 
que ya se incluye la microscopia multifotónica) y el desarro-
llo de marcadores fl uorescentes que pueden ser adicionados 
a los organismos en estudio, o que han sido introducidos 
como promotores dentro de su genoma (marcadores intra-
vitales), ha abierto un campo de observación excitante que 
permite no sólo la grabación de imágenes con la dinámica 
de los organismos en tiempo real, sino que es posible deter-
minar el comportamiento de componentes estructurales 
defi nidos durante el movimiento de los organismos y los 
cuales no sólo pueden ser observados en células aisladas y 
mantenidas en cultivo in vitro, sino incluso dentro de los 
tejidos u órganos, como en el caso de las células del sistema 
inmune y los nódulos linfáticos, tal como podría presentar-
se en la vida real (Nitschke et al., 2008).
Independientemente del método de observación, en la 
actualidad las imágenes pueden ser manejadas como se de-
see; se adquieren de forma simple, se les almacena en el for-
mato más conveniente, y cuando se requiera y con apego a 
la ética, se les puede editar para fi nes de investigación, edu-
cativos o de difusión. Asimismo, con la tecnología actual, 
las observaciones se pueden mejorar, analizar, ampliar o de-
tallar mediante estrategias digitales, y que a simple vista 
podrían resultar invisibles o difíciles de destacar en un mar 
de estructuras distintas. El ejemplo más representativo de la 
evolución que ha tenido la observación microscópica está 
asociado con el desarrollo de la tecnología computacional; 
hace aproximadamente 10 años, las imágenes obtenidas con 
microscopios convencionales tenían que ser capturadas y 
editadas mediante trabajo manual fotográfi co, lo que hacía 
de las imágenes obtenidas un verdadero trabajo artesanal, 
dado que las computadoras aún no habían evolucionado ni 
eran de dominio público. Los cuartos oscuros eran una 
infraestructura necesaria para ello, y se requería invertir 
mucho tiempo en la búsqueda de las mejores imágenes. De 
hecho, como en ese entonces no había posibilidad de hacer 
fi lmaciones y llevar el registro de las secuencias observadas, 
se recurría al dibujo para ilustrar lo que se observaba. 
Con la tecnología moderna, ahora no sólo se adquieren 
las imágenes en tiempo real, sino que incluso es posible re-
construir y obtener animaciones dinámicas que ilustran lo 
observado, pues los libretos de las historias de la dinámica 
de lo que sucede a nivel microscópico ya están escritos, y 
sólo falta hallar la forma de presentarlo (McGill, 2008). En 
el campo de la parasitología se han generado diversas ani-
maciones mediante las cuales se ilustran fenómenos como 
la infección por los parásitos que producen el paludismo.1,2 
Los sistemas de observación indicados facilitan la ob-
tención de imágenes de gran calidad, y su captura, almacena-
je y edición resultan de lo más sencillo, con lo que es posible 
disponer de ellas cuando se les requiera. Adicionalmente a la 
forma de obtención de las imágenes, con la tecnología actual 
también se pueden mejorar las observaciones gracias a las in-
novaciones digitales, esto permite observar estructuras que 
no son perceptibles a simple vista o queno destacan entre 
infi nidad de distintas estructuras. En el pasado tampoco era 
factible realizar fi lmaciones mediante videomicroscopia y re-
gistrar tales imágenes con la precisión con que se obtienen 
hoy en día. Es tal el avance de la tecnología actual que las 
imágenes obtenidas pueden ser analizadas, reconstruidas, 
proyectadas y hasta visualizadas en tres dimensiones (3D) 
con la aplicación de paquetes computacionales. Tales pa-
quetes hacen posible realizar viajes virtuales al interior de 
las células y los tejidos, e incluso generar animaciones de lo 
observado, como se ha venido haciendo con Plasmodium 
falciparum (Wickert, Krohne, 2007). Este tipo de estrategias 
tiene un potencial importante que podrá encontrar su apli-
cación en todos los aspectos de la biomedicina relacionados 
con la investigación científi ca, la docencia o la difusión.
Con la fi nalidad de ofrecer mejores opciones de obser-
vación microscópica y mostrar las diferentes formas de ob-
servación disponibles tanto en microscopia fotónica como 
electrónica, se han generado sitios en internet que permiten 
manejar en forma interactiva la información y en dónde es 
posible encontrar simulaciones en tiempo real, con ejem-
plos abiertos a todo público que muestran situaciones de 
diversos tipos de observación microscópica y el alcance 
1 http://www.molecularmovies.com/movies/berry_malaria_part1.html 
2 http://www.molecularmovies.com/movies/berry_malaria_part2.html
Capítulo 44 Técnicas para visualización de parásitos mediante microscopia364
de las mismas.3,4 Con el fi n de presentar la información 
visual de lo que se logra paso a paso mediante la microscopia, 
y otras estrategias experimentales, y que no puede ser presen-
tada dinámicamente en publicaciones convencionales, surgió 
una revista electrónica: Journal of Visualized Experiments.5 
Sin embargo, en la mayoría de las revistas especializadas de 
parasitología ya se ofrece material suplementario en video.
Microscopia sin microscopio
La evolución de la tecnología asociada con los microscopios 
ha sido tal que en el caso de la microscopia de campo claro, 
con el uso de microchips, no hay necesidad de hacer obser-
vaciones directas de las muestras y, por consiguiente, no se 
requiere emplear oculares ni otros elementos ópticos de un 
microscopio convencional. Parece paradójico que se hagan 
observaciones microscópicas sin recurrir para ello a un mi-
croscopio clásico. Este tipo de observación presenta varias 
ventajas en comparación con la observación clásica, entre 
ellas las siguientes: las observaciones ya no son individuali-
zadas; no requieren de la capacidad visual del observador; 
hay mayor precisión en la estimación del tamaño y la forma 
de las estructuras u organismos que se observan; los regis-
tros de las imágenes se realizan de manera digital, lo cual per-
mite su mejor preservación y optimización con programas 
computacionales de acceso público o de acceso particular. La 
observación con el sistema de microscopia sin microscopio se 
efectúa tanto con sistema fotónico como electrónico. La obser-
vación con sistema electrónico se basa en el uso de monitores.
El microscopio optofl uídico (OFM, del inglés optofl ui-
dic microscopy) es un equipo desarrollado recientemente, y 
equivale a un microscopio de campo claro que integra la 
tecnología microfl uida y una técnica de óptica basada en 
apertura que permite efectuar observaciones de alta resolu-
ción en un equipo de bajo costo para capturar imágenes mi-
croscópicas. Este sistema registra y almacena en un chip lo 
que el equipo “ve” a lo largo de un canal que conduce una 
microcorriente fl uida que se observa a través de pequeños 
agujeros en la base del canal. Una vez decodifi cada la señal, 
se reconstruye lo observado y logran “visualizarse” hasta las 
estructuras internas de los organismos (Cui et al., 2008). 
Debido a que con esta tecnología se logran observaciones de 
cientos de nanómetros, se le considera como un microsco-
pio óptico de alta resolución contenido en un chip (Heng et 
al., 2006). Su costo es tan bajo y su tamaño tan compacto 
que se ha considerado que este aparato debería ser impres-
cindible en los maletines de laboratorios portátiles, los cua-
les serían de suma utilidad en casos de epidemias, guerras o 
hasta viajes espaciales. Este tipo de microscopia es aún inci-
piente en el campo de la parasitología. Se ha reportado la 
utilidad del sistema en la observación del nematodo Cae-
norhabditis elegans (Lee et al., 2008), así como de trofozoí-
tos y quistes de Giardia lamblia (Lee et al., 2009), para el 
cual se ha encontrado que tiene un plano focal de resolución 
de 0.8 micras (fi gura 44-1). Se considera que este sistema de 
observación es de uso potencial en la investigación biomédica 
y cuya tecnología puede ser usada de forma autónoma, con 
bajo costo y con un equipo compacto para monitorear suple-
mentos de agua o alimentos y para realizar diagnósticos.
Videomicroscopia
Es un sistema de observación que está consolidándose como 
una herramienta indispensable para la captura y el registro 
de sucesos microscópicos mediante microfi lmaciones. El 
sistema está constituido por un microscopio compuesto de 
fi ltros de luz defi nidos (para generar observaciones bajo 
contraste de fases o de contraste de interferencia diferen-
cial), así como una videocámara sofi sticada equipada con 
dispositivo CCD (del inglés charge-coupled device, o circui-
to de cargas eléctricas interconectadas) que requiere ser en-
friada y con la calidad necesaria para fi lmar películas con 
alta sensibilidad y durante largos periodos. Algunos ejem-
plos de videofi lmaciones microscópicas obtenidas bajo las 
condiciones indicadas pueden ser consultadas en Internet.
La videomicroscopia se ha convertido en una herra-
mienta vital y necesaria en el campo de la parasitología 
(junto con la combinación de técnicas microscópicas de 
fl uorescencia, las cuales se refi eren más adelante) para vi-
sualizar y registrar las interacciones entre patógenos y sus 
hospederos. Con esta tecnología no sólo se ha registrado el 
3 http://www.microscopyu.com/articles/livecellimaging/index.html 
4 http://www.olympusmicro.com/primer/virtual/virtual.html
5 http://www.jove.com/index.stt
Figura 44-1 Visualización de quistes y trofozoítos de Giardia lam-
blia mediante los microscopios optofl uídico (OFM) y convencional. 
A, Comparación del tamaño del chip en el que se colocan las muestras 
con el de una moneda. B, Comparación de la morfología y el tamaño 
de quistes detectados por el OFM (a-d) con los obtenidos mediante 
microscopia convencional bajo un objetivo 20 (e-f). C, Comparación 
de la morfología y el tamaño de trofozoítos detectados por el OFM (g-j) 
con los obtenidos mediante microscopia convencional bajo un objetivo 
20 (k-l). (Cortesía del Dr. Lap Man Lee.)
A
B
C
a b c d e f
g h i j k c
Videomicroscopia 365
comportamiento de los patógenos aislados, sino que tam-
bién es posible monitorearlos y determinar su conducta di-
rectamente en los tejidos en que se encuentren, principal-
mente cuando a los organismos se les ha aplicado algún tipo 
de marcaje intravital, lo que reviste gran importancia para 
la mayor comprensión de los procesos infecciosos (Melican, 
Richter-Dahlfors, 2009). Diversos trabajos publicados re-
fuerzan la importancia de visualizar el marcaje intravital de 
los parásitos y su seguimiento dentro de sus hospederos. 
Además, dicha estrategia es útil porque permite evaluar 
directamente el efecto de sustancias preparadas con fi nes 
terapéuticos, como en los casos de Schistosoma mansoni 
(Krautz-Peterson et al., 2009) o de Leishmaniasis murina 
(Mehta et al., 2008).
Microscopia de fl uorescencia
El empleo de esta tecnología ha demostrado de manera con-
tundente su utilidad, cuyo uso en el campo de la microsco-
pia depende de los requerimientos de la observación. Entre 
las variantes de la microscopia basada en fl uorescencia des-
tacan la de epifl uorescencia de amplio campo, la de barridoconfocal y la multifotónica (Lang et al., 2009). Sin embargo, 
el empleo de todas ellas se basa en la utilización de marca-
dores fl uorescentes sintéticos o biosintéticos, los cuales sin 
duda han favorecido los estudios de la dinámica de localiza-
ción de moléculas defi nidas en células vivas y permitido un 
incremento en la comprensión de los procesos celulares 
(Asan, Drenchkhahn, 2008). Los marcadores fl uorescentes 
sintéticos generalmente están elaborados con proteínas o 
sustancias específi cas conjugadas a fl uoróforos, los cuales 
poseen una composición química que les permite emitir luz 
fl uorescente cuando incide en ellas un haz de luz de cierta 
longitud de onda. En los ensayos de inmunocitoquímica se 
emplean fl uoróforos que emiten luz fl uorescente de colores 
contrastantes, lo que permite evidenciar estructuras especí-
fi cas de las células en una misma observación. Existen varie-
dades de fl uoróforos que emiten luz fl uorescente de diferente 
color, lo cual ha sido aprovechado para obtener imágenes 
que muestran marcajes fl uorescentes diversos en una mis-
ma célula u organismo. (Al respecto, se recomienda una vi-
sita a la página de Internet de Invitrogen para consultar el 
texto digital Molecular Probes. Th e Handbook.6) En la ac-
tualidad, con el empleo de microscopia de barrido confocal 
puede determinarse espacialmente la distribución de los 
marcadores fl uorescentes, e incluso, mediante programas 
de computadora, pueden hacerse reconstrucciones tridi-
mensionales que permiten defi nir los sitios dentro de las 
células en los que se encuentran tales fl uoróforos. Los mar-
cadores biosintéticos también son conocidos como marca-
dores fl uorescentes intravitales porque se sintetizan como 
parte de la maquinaria proteica celular y forman parte de la 
vida de la célula; sólo se requiere del estímulo fotónico ade-
cuado para que estas proteínas fl uorescentes emitan su luz 
fl uorescente. La utilización de los marcadores fl uorescentes 
permite grabar eventos biológicos que suceden dentro de los 
organismos microscópicos vivos, lo cual en otras circuns-
tancias sería difícil de apreciar. Entre los fenómenos que 
han sido estudiados destacan los relacionados con la dinámi-
ca intracelular, tales como la división celular o el movimiento 
vesicular.7 Es tal la variedad de marcadores fl uorescentes con 
los que se cuenta en la actualidad, que es posible visualizar 
en un instante varios componentes intracelulares marca-
dos. Los resultados se refl ejan en imágenes de células, en 
cuyo interior hay una variedad de marcajes fl uorescentes 
coloridos, como los que se obtienen con el empleo de proteí-
nas fl uorescentes.8 El descubrimiento y la caracterización de 
una de ellas, la proteína verde fl uorescente (GFP, del inglés 
green fl uorescence protein), le valió la obtención del Premio 
Nobel en 2008 por este trabajo pionero al doctor R. Tsien,9 y 
a partir de dicho trabajo se han obtenido diversos genes que 
codifi can para proteínas fl uorescentes de diferentes colo-
res.10 El fundamento de las observaciones por sustancias 
fl uorescentes se basa en que este tipo de proteínas poseen 
ciertas características químicas que les permiten absorber 
energía luminosa de cierta longitud de onda, lo cual produ-
ce la excitación de sus átomos y emiten una energía lumino-
sa de otra longitud de onda menor, la cual se visualiza como 
energía fl uorescente. Por ser proteínas de muy bajo peso 
molecular, y a las que se les ha caracterizado completamente 
hasta la obtención de la secuencia génica correspondiente, 
ya se comercializan promotores génicos de las diferentes 
proteínas fl uorescentes. Estos promotores se introducen en 
combinación con genes que se expresan de manera consti-
tutiva (como los de actina o tubulina) en los núcleos de las 
células, se incorporan al material genético en los sitios co-
rrespondientes, y después las células resultantes modifi ca-
das genéticamente presentan como característica la expre-
sión de la proteína constitutiva, pero asociada con la 
proteína fl uorescente. Ha sido tan evidente el éxito del em-
pleo de los marcadores fl uorescentes producidos con proteí-
nas modifi cadas que en la actualidad se generan moléculas 
sintéticas no proteicas con características específi cas (fi gura 
44-2). Su utilidad se basa en que cuando las células expresan 
a las proteínas modifi cadas, no sufren cambios importantes 
que alteren su funcionalidad. Los resultados que se han ob-
tenido de la evaluación de la dinámica de infección de Leish-
mania amazonensis transfectada con GFP en ratones vivos 
infectados experimentalmente son las aplicaciones del uso 
de proteínas acopladas a GFP en el campo de la parasitolo-
gía, el seguimiento del desarrollo de estructuras como el 
6 http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-
Probes-Th e-Handbook.html)
7 http://www.microscopyu.com/articles/livecellimaging/fpimaging.html
8 http://www.tsienlab.ucsd.edu/Images.htm 
9 http://www.tsienlab.ucsd.edu/Default.htm
10 http://www.tsienlab.ucsd.edu/Images/General/IMAGE-%20Composite.jpg
Capítulo 44 Técnicas para visualización de parásitos mediante microscopia366
apicoplasto durante la evolución de los parásitos que produ-
cen paludismo, y la evaluación de sustancias antiparasitarias 
como en el caso de Leishmania panamensis (fi gura 44-3).
Aun cuando es factible el empleo de marcajes fl uores-
centes con la proteína GFP, en muchos de los casos sólo se 
obtienen marcajes pobres, fugaces o inestables, y ello ha 
motivado a buscar otros tipos de fl uorocromos, como los 
nanocristales (conocidos como QD, o “quantum dots”). Éstos 
se diseñan de forma tan precisa que su visualización en el 
interior de las células brinda marcajes fl uorescentes de gran 
brillo (hasta 3 000 veces más que los fl uoróforos convencio-
nales), calidad por su fotoestabilidad, y son producidos en 
una amplia variedad de colores (Medintz et al., 2005). Ade-
más, por su diseño se les puede seleccionar por los interva-
los de excitación y de emisión estrecha, y pueden ser manio-
brables para los fi nes experimentales que se deseen 
(Molokanova et al., 2008). El uso de los nanocristales tiene 
la ventaja adicional de que, al ser electrodensos al microsco-
pio electrónico, se les ha utilizado como marcadores que 
pueden ser vistos tanto en microscopios de fl uorescencia 
como en electrónicos de transmisión, por lo cual sirven 
como puente de unión entre ambos tipos de sistemas de 
observación. Debido a ello, los nanocristales permiten vi-
sualizar al mismo tiempo la marca fl uorescente y electro-
densa, con lo cual es posible cotejarla en las células, con lo 
que se identifi can los sitios blancos en que se depositan los 
nanocristales (Giepmans, 2008). Como los QD no destru-
yen a los parásitos se les ha utilizado para evaluar el desa-
rrollo de organismos como Leishmania (Lang et al., 2009).
El poder de marcaje específi co de los compuestos fl uo-
rescentes en general se incrementa cuando se les conjuga 
con otro tipo de sustancias, como los anticuerpos u otras de 
naturaleza química. De esa forma se generan conjugados 
con capacidad de interacción con blancos defi nidos.11 Por 
estas razones su utilidad es evidente en casos de estudios de 
colocalización, cuando se desea evaluar el marcaje fl uores-
cente de dos o más fl uorocromos distintos (fi gura 44-2). Si 
durante el marcaje fl uorescente se hace uso al mismo tiem-
po de alguna de las otras técnicas de microscopia, como la 
iluminación de contraste de fases o de interferencia de con-
traste diferencial (DIC, del inglés diferential interference 
contrast), bajo la cual sólo destacan estructuras intracelula-
res y se delimita la forma de las células, se logra una locali-
zación precisa en el interior de las células de los marcajes 
fl uorescentes en estudio, como lo demostrado en la expresión 
del GFP en Leishmania (Varela et al., 2009), o la detección de 
lisosomas en T. cruzi (Sant́ Anna et al., 2008) (fi gura 44-4).
Además de la utilidadde los marcadores fl uorescentes, 
la tecnología de microscopia confocal por barrido con rayos 
láser (MC) se ha consolidado como la forma de observación 
de los marcajes fl uorescentes con las cuales se logran exce-
lentes condiciones de observación y se obtienen imágenes 
de gran nitidez, las cuales pueden ser combinadas con ob-
Figura 44-2 Expresión de proteínas fl uorescentes en parásitos de 
Trypanosoma cruzi transfectados. Se muestran parásitos que expresan 
a la proteína verde fl uorescente (A-C) y a los que expresan a la proteína 
roja fl uorescente (D-F). Se observan células VERO infectadas con los 
parásitos transfectados con GFP (en verde; B y C) y con RFP (en rojo; 
E y F). Los núcleos están teñidos de azul con DAPI. En C y F se muestra 
la combinación de fl uorescencia y DIC. Tomada de Pires SF et al., 
Cell culture and animal infection with distinct Trypanosoma cruzi 
strains expressing red and green fl uorescent proteins. Int J Parasitol 
38(3-4):293. Elsevier. 2008.
Figura 44-3 Expresión de GFP en parásitos de Leishmania panamensis 
transfectados. Los parásitos que expresan a la proteína fl uorescente y 
observados por MC se muestran en B, D, F y H. Los mismos, observados 
por DIC, se muestran en A, C, E y G. Tomada de Varela M RE et al. Leis-
hmania (Viannia) panamensis: an in vitro assay using the expression of 
GFP for screening of antileishmanial drug. Exp Parasitol 122(2):136. El-
sevier. 2009.
11 http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-
Probes-Th e-Handbook.html
A
D
B
E
C
F
A CB
D E F
G H
Microscopia de fl uorescencia 367
servaciones de los mismos tejidos o células en ausencia de 
algún tipo de marcaje. Debido a que con el uso de los rayos 
láser es posible hacer barridos en la orientación “Z” (en di-
rección de la profundidad de las muestras), a diferencia de la 
microscopia de fl uorescencia convencional, se logran obte-
ner series de imágenes que pueden ser integradas y recons-
truidas para capturar imágenes que muestren la distribu-
ción espacial de los marcajes fl uorescentes. Como se indica 
más adelante, las imágenes obtenidas pueden ser procesa-
das para lograr reconstrucción en tercera dimensión (3D) 
de los objetos observados (fi gura 44-4C).
Aunque en la actualidad los microscopios fotónicos se 
han complementado con sistemas fotográfi cos complejos, 
prevalece la resolución con la que se obtienen las observa-
ciones y aún no se han logrado en otro nivel que no sea el 
micrométrico. Los sistemas fotográfi cos han dotado de ma-
yor capacidad a los equipos para lograr amplifi caciones más 
nítidas de las imágenes obtenidas, así como preservarlas en 
distintos formatos para su posterior edición.
A pesar de lo exitoso que ha sido el empleo de micros-
copios de fl uorescencia como los mencionados, tienen 
varias desventajas que no favorecen su uso en ciertas condi-
ciones. Los diferentes tipos de microscopios que emplean 
luz (aun seleccionada en ciertos intervalos de longitud de 
onda para generar los rayos láser de uso en la MC) generan 
cierto grado de fl uorescencia contaminante, lo que hace ne-
cesario el empleo de fi ltros o la disminución de la intensidad 
de los rayos láser, con la consiguiente pérdida de la fl uores-
cencia emitida por las células o los tejidos en estudio. Otro 
problema adicional por el cual se tienen que hacer observa-
ciones en células fi jadas o en intervalos de tiempo muy cor-
tos es la cantidad de fototoxicidad que se genera tanto por el 
calor como por la concentración de los rayos, lo que afecta 
la viabilidad y las condiciones fi siológicas de las células. Si a 
lo anterior se asocian los problemas relacionados con la in-
fraestructura tanto para el uso de luz fotónica, proveniente 
tanto de lámparas de mercurio (en el caso del uso de mi-
croscopios de fl uorescencia), como de las fuentes producto-
ras de los rayos láser (en el caso del uso de MC), los costos de 
adquisición de los equipos, su mantenimiento y la infraestruc-
tura que necesitan (por ejemplo, se requiere de temperatura 
ambiental controlada, de un cuarto oscuro, de sufi ciente espa-
cio para acomodar el microscopio y los monitores, y de un 
sistema antivibración que no genere ningún movimiento) de-
mandan altos costos, con lo que se reduce la posibilidad de 
utilizarlos a nivel de campo o en laboratorios modestos. 
Con la fi nalidad de resolver los problemas del uso de 
equipo de microscopia de fl uorescencia como los referidos, 
y con la intención de utilizar sus bondades para el diagnós-
tico en campo, recientemente se han diseñado microscopios 
de fl uorescencia basados en fuentes de diodos que emiten 
luz (LED, del inglés light-emitting diodes). Estos equipos 
tienen la capacidad de contar con un sistema que genera el 
sufi ciente poder de intensidad de luz para estimular a los 
fl uoróforos. Son equipos sencillos que brindan alta resolu-
ción de las imágenes, y se les encuentra a precios accesibles. 
El sistema de LED se basa en el aprovechamiento de la 
energía luminosa de un intervalo específi co y defi nido de 
longitud de onda, la cual es transmitida por los diodos. Los 
intervalos de luz están dados por diversos colores de los LED, 
ya que éstos emiten luz en longitudes de onda específi cas, y la 
intensidad de la luz es sufi ciente para estimular la emisión de 
la fl uorescencia (fi gura 44-5). 
Además de los intervalos defi nidos de luz, el sistema 
no produce calor y es lo sufi cientemente estable para mante-
ner la intensidad de la luz por el tiempo que el fl uoróforo 
emita su luz fl uorescente. Debido a la efi ciencia de los LED, 
es posible utilizar varios de ellos en un mismo equipo y con 
ello activar distintos fl uoróforos a un mismo tiempo, o bien 
cambiar de uno a otro sin que haya pérdida de tiempo o de 
intensidad de la fl uorescencia de la muestra. 
Con el empleo del estímulo multifotónico de los LED, 
sólo los fl uoróforos involucrados son estimulados, brillan con 
toda su intensidad y hay ausencia casi total de fl uorescencia 
Figura 44-4 Observaciones por diferentes tipos de microscopia y re-
construcción 3D de Trypanosoma cruzi. A, Colocalización por MC de 
tres tipos de marcaje fl uorescente: DAPI (azul); fl uoresceína (verde) y 
rodamina (roja). B, Identifi cación de las estructuras marcadas fl uores-
centemente mediante microscopia electrónica de transmisión con en-
sayos de inmunooro; C, Reconstrucción tridimensional. Tomada de 
Sant’Anna C et al. All Trypanosoma cruzi developmental forms present 
lysosome-related organelles. Histochem Cell Biol 130(6):1191,1192,1194. 
2008. Las escalas corresponden a 5 y 3.3 mm. SpringerLink.
A
B
C
Capítulo 44 Técnicas para visualización de parásitos mediante microscopia368
contaminante. El uso de la microscopia de fl uorescencia por 
LED se ha vuelto indispensable para detectar la fl uorescencia 
de determinados marcajes fl uorescentes débiles (como en el 
caso de modifi caciones genéticas de los organismos), o la que 
emiten células vivas en el momento de su desplazamiento. En 
la microscopia de fl uorescencia convencional (o MC) se pro-
duce fototoxicidad, lo que genera calor; además, hay movi-
mientos vibratorios producidos por los fi ltros usados para 
bloquear la fl uorescencia no deseada, y dichos factores alte-
ran el comportamiento de las células y les producen daños 
irreversibles.12
Debido a lo anterior, los sistemas de LED empiezan a 
dominar el ámbito de la investigación de microscopia de 
fl uorescencia, y en el caso de los microscopios convenciona-
les de fl uorescencia se considera que deben reemplazarse las 
lámparas de mercurio pues producen mucho calor, tienen 
una vida media corta, generan color de fondo indeseable, 
producen fl uorescencia indeseable y no son fáciles de insta-
lar en varios tipos de microscopios fotónicos.13 Aun cuando 
la microscopia de fl uorescencia en la que se usan LED apa-
rente ser una alternativa cómoda, efi ciente y barata para la 
observación de marcajes fl uorescentes, aún se halla en etapa 
de desarrollo;por tanto, aún hay aspectos que no se han 
evaluado y para los cuales la microscopia de fl uorescencia 
convencional y la MC parecen ser superiores. El uso de mi-
croscopios de fl uorescencia basado en LED constituye una 
herramienta poderosa para realizar diagnósticos en campo, 
como se propuso en la detección de eritrocitos infectados 
con P. falciparum y teñidos con naranja de acridina (Jones 
et al., 2007), lo cual demuestra su gran versatilidad.
Microscopia electrónica
La microscopia electrónica (ME) es sin duda una de las he-
rramientas de observación indispensable en el campo de 
la parasitología. Su uso permite obtener información de la 
morfología y la estructura de los organismos y las células a 
nivel ultraestructural. Tanto la microscopia electrónica de 
transmisión (MET) como la de barrido (MEB) mantiene su 
hegemonía en la obtención de información tanto de las 
muestras seccionadas como enteras. Con la MET se obtiene 
información del interior de las muestras en observación y 
con MEB se capturan imágenes en 3D de su superfi cie, pero 
con la ventaja de que es posible observar dichas muestras 
desde diferentes planos. No obstante, las bondades del análisis 
morfológico que ofrecen estos tipos de microscopia, permane-
cen algunos inconvenientes que no serán fáciles de superar; 
por ejemplo, las muestras sometidas a observación requieren 
de un procesamiento largo, complejo y costoso. 
En el caso de MET, si se desea utilizar las secciones o 
cortes de las muestras para hacer reconstrucciones de su in-
terior (a fi n de comparar lo obtenido con las observaciones 
al MEB de la misma muestra), es necesario efectuar gran 
cantidad de cortes, obtener las imágenes seriadas y unirlas 
una a una, lo que demandaría gran cantidad de trabajo y 
tiempo, lo que además podría generar errores. Además, el 
observador debe estar bien entrenado y conocer lo que está 
bajo observación, con la fi nalidad de que pueda extraer toda 
la información del caso. Por desgracia, en ambos tipos de 
microscopia podría darse el caso que si el tratamiento de las 
muestras no es el adecuado o se aplica de manera incorrecta, 
es muy probable que se generen alteraciones morfológicas 
que deriven en equivocaciones e interpretaciones inadecua-
das. A pesar de tales inconvenientes, la ME es una herra-
mienta vital de observación ultraestructural, pues en torno 
a ella se han realizado avances para ahondar en múltiples 
padecimientos en busca de su solución.
A continuación se refi eren las nuevas tecnologías de 
observación ultraestructural con equipos de microscopia 
Pieza ocular
Filtro-barrera
Espejo
dicroico
Luz
excitadora Fuente
excitadora de LED
Lente-objetivo
Filtro 
excitador
Luz emitida
aumentada por
desviación
Muestra en 
portaobjetos
Figura 44-5 Principio de la microscopia de epifl uorescencia con tecno-
logía de LED. Tomada de Jones D et al. McArthur revisited: fl uorescence 
microscopes for fi eld diagnostics. Trends Parasitol 23(10):469.Elsevier. 
2007.
12 http://www.photonics.com/Article.aspx?AID=32390
13 http://microscopy-uk.org.uk/mag/indexmag.html?http://microscopy-
uk.org.uk/mag/artjun08/rp-LEDsummary.html
Microscopia electrónica 369
electrónica de vanguardia, con los cuales se han logrado 
nuevos avances. Mediante congelamiento ultrarrápido con 
etano líquido (el cual permite alcanzar temperaturas de 
congelación por abajo de los –180 °C en fracción de nanose-
gundos) y al alto vacío, es posible la vitrifi cación inmediata 
de las muestras, y la preservación de casi todas sus estructu-
ras como se encontraban al momento de ser procesadas. Las 
muestras son observadas de inmediato (si así se requiere) sin 
otro tipo de procesamiento. Esta estrategia de observación 
ultraestructural se denomina tomografía crioelectrónica 
(Lucic et al., 2008), y se basa en la forma de congelación de las 
muestras, ya que así se evita la formación de cristales de hielo, 
que altera las estructuras de los tejidos y las células. Después 
de la congelación, las muestras pueden ser procesadas y cor-
tadas en secciones “gruesas” de unos 400 nm (en la MET 
convencional se emplean cortes de aproximadamente 0.5-1 
nm de grosor) y así ser observadas al microscopio. La cuali-
dad de los nuevos microscopios electrónicos para este tipo 
de observaciones es que cuentan con una platina que permi-
te la posibilidad de rotación de la muestra, con lo que se ge-
neran varias imágenes de la misma muestra con diferentes 
ángulos de inclinación. Mediante diversos programas com-
putacionales, las imágenes son integradas, reconstruidas y 
proyectadas en 3D, con lo cual se logra detallar la observa-
ción de las estructuras celulares a un nivel de resolución 
molecular (MacIntosh et al., 2005). Sólo algunos laboratorios 
de EUA, Inglaterra y Japón poseen este tipo de microscopios. 
Sin embargo, es una tecnología que ya se está aplicando en 
parasitología para estudiar la caracterización de la zona fl a-
gelar de T. brucei brucei (Lacombie et al., 2009) (fi gura 44-6), 
de lisosomas durante el desarrollo de T. cruzi (Sant Ánna et 
al., 2008) (fi gura 44-4C) y de otros organelos involucrados 
en el desarrollo de Leishmania (Lang et al., 2009). 
Microscopia de fuerza 
atómica (MFA)
Tecnología que se ha revelado como una excelente estrategia 
de observación de la topografía de organismos en el plano 
nanométrico y en muchas partes del mundo se le utiliza con 
fi nes de estudio de material biológico, porque en un inicio 
se usaba en áreas no biológicas. Es una tecnología práctica,14 
rápida, de fácil manejo y, como en el caso de los chips, no 
requiere del uso de un microscopio convencional; todo se 
realiza mediante sistemas computacionales. En la actuali-
dad, ya hay compañías que presentan equipos que combi-
nan la MFA con la MC. El diseño de una MFA permite que 
una punta que se encuentra adherida a un listón fl exible 
(cantilever) se desplace y barra la superfi cie de la muestra, lo 
cual es detectado por un sistema acoplado a un programa 
computacional, y con ello se generan las imágenes que el 
equipo interpreta y analiza. Este sistema tiene tal resolución 
que es posible visualizar en tiempo real la superfi cie de or-
ganismos vivos (para ello se incluye un minimódulo en el 
sistema, en el que se ajustan las condiciones de humedad, 
temperatura y gases). Con base en estas adaptaciones, este 
sistema de observación mejora lo que se puede obtener me-
diante las MET y MEB, ya que estas tecnologías exigen la 
observación de muestras de organismos muertos, fi jados, 
tratados y que hayan sufrido posibles cambios en su estruc-
tura debido a los tratamientos. A pesar de estas bondades, la 
MFA tiene una gran desventaja: sólo se puede efectuar la 
visualización de las superfi cies de las muestras analizadas, y 
en el caso de las células, sólo es posible analizar algunos na-
nómetros por abajo de sus membranas plasmáticas. Sin em-
bargo, a pesar de esas limitantes, esta estrategia de observa-
ción de las células tiene el mejor poder resolutivo conocido 
hasta el momento, superior a cualesquiera de las ME, por lo 
que su uso tiene mayor demanda (Tsien, 2003). Este sistema 
de observación ha empezado a tener importancia en la vi-
sualización de lo que sucede en la superfi cie de células que 
son infectadas por parásitos. Ejemplo de ello es la invasión 
de los protozoarios Babesia bovis (Hutchings et al., 2007) y 
Plasmodium (Li A et al., 2006) en eritrocitos (fi gura 44-7), así 
como la visualización de la superfi cie de Trypanosoma cruzi 
(Rocha MG et al., 2008). Se han obtenido algunos avances en 
estudios mediante esta estrategia de células fl ama de cisticer-
cos de Taenia crassiceps cepa ORF (fi gura 44-8C).
Visualización 3D
Tras lo referido en relación con las tecnologías de observación 
microscópica por fl uorescencia y tomografía crioelectrónica, 
así como por lo expuesto acerca de la MFA, es evidente que 
una vez que las imágenes se han adquirido, se les procesa 
Figura 44-6 Reconstrucción tridimensional de tomografía crioelectróni-ca del sistema fl agelar de Trypanosoma brucei. En la imagen A se mues-
tra la reconstrucción tridimensional en la que se esquematizan los dife-
rentes planos en Z en que se sitúan las observaciones de microscopia 
presentadas en la imagen B. Tomada de Lacomble S et al. Three-dimen-
sional cellular architecture of the fl agellar pocket and associated cytos-
keleton in trypanosomes revealed by electron microscope tomography. J 
Cell Sci 122(Pt 8):1083. 2009. The Company of Biologists. 14 http://es.wikipedia.org/wiki/AFM
A
B
b
c
d
b c d
Capítulo 44 Técnicas para visualización de parásitos mediante microscopia370
mediante computadora. Es ya una práctica común y me-
diante el uso de programas computacionales específi cos se 
obtiene mayor información que de otra manera no hubiera 
sido posible adquirir y que permite una mayor aproxima-
ción respecto de lo que sucede al interior o exterior de lo que 
se estudia. Sin embargo, debido a que gran parte de la pa-
quetería computacional es especial por la cantidad de infor-
mación que requiere ser analizada, es necesario contar con 
equipos de cómputo que tengan sufi ciente capacidad tanto 
para almacenar como para efectuar los análisis; asociado a 
ello, se debe contar con una infraestructura humana técni-
camente preparada para efectuar lo que se requiera al res-
pecto.15 En este sentido, es común que en los artículos publi-
cados que incluyen análisis microscópicos y que usan 
procesos computacionales, estén incluidas unidades o insti-
tuciones que realizan cómputo o visualización científi ca. 
En la Universidad Nacional Autónoma de México 
(UNAM) se han desarrollado grupos de investigación multi-
disciplinarios en los que participan médicos, biólogos, inge-
nieros en computación, matemáticos, médicos y químicos, 
quienes realizan estudios en el área biomédica con enfoques 
hacia el estudio de la biología celular de parásitos, y que inclu-
yen observaciones microscópicas, análisis de tipo bioquímico 
e inmunoquímico, combinados con análisis matemáticos 
computacionales que permiten generar imágenes para que 
sean analizadas mediante visualización científi ca. 
Figura 44-7 Imágenes de MFA y sus correspondientes imágenes teñidas 
con Giemsa de eritrocitos infectados por Plasmodium falciparum en 
distintas etapas de infección. Se observa la superfi cie de los eritrocitos 
mediante MFA y la correlación con la progresión de la infección, de 
acuerdo con las imágenes de tinción con Giemsa anexas. Tomada de Li A 
et al. Observations on the internal and surface morphology of malaria 
infected blood cells using optical and atomic force microscopy. J Micro-
biol Methods (3):436. Elsevier. 2006.
Figura 44-8 Cisticercos de Taenia crassiceps ORF. Se presentan tres dis-
tintos tipos de observaciones: A, MEB a bajo aumento. B, MC con inmu-
nocitoquímica para tres diferentes marcadores fl uorescentes localizados 
en la pared vesicular y la capa germinal de los cisticercos. C, Ultraestruc-
tura de la superfi cie de las larvas vistas por MEB y MET, en donde se ob-
servan las microvellosidades (en MET alcanza a observarse parte del te-
gumento), y por MFA, del ápice de un penacho de cilios de una célula 
fl ama (*). Al nivel de MC, las células fl ama se indican con fl echas, en 
donde los penachos se revelaron con anticuerpos antitubulina conjuga-
dos a fl uoresceína (verde), mientras que la actina se reveló con faloidina 
conjugada a rodamina (roja) y los núcleos con DAPI (azul). Cortesía de 
QFB América Pérez (MC) y de la Dra. Teresa Fortoul y el Biól. Armando 
Zepeda (MEB). 
15 http://www.super.unam.mx
A
D
G H
E F
B C
A
B
C
En particular, uno de los principales objetivos de llevar a 
cabo tales estudios consiste en determinar la dinámica del ci-
toesqueleto o la estructuración del mismo en los parásitos que 
se han estudiado; para estos fi nes se han combinado los re-
sultados experimentales de estudios de diferentes tipos de 
microscopia (de epifl uorescencia y confocal), que incluyen 
evaluaciones inmunocitoquímicas con marcadores fl uores-
centes, observaciones por microscopia electrónica (tanto de 
barrido como de transmisión), y se han iniciado observacio-
nes mediante MFA (fi guras 44-8 y 44-9). Luego, la informa-
ción visual y experimental obtenida se procesa para obtener 
su reconstrucción tridimensional, proyectarla en pantallas 
especiales para observación en tercera dimensión y efectuar 
inmersiones virtuales hacia su interior (fi gura 44-9). Final-
mente, usando esta clase de análisis con fi nes de demostra-
ción y aplicación docente, se generan animaciones interacti-
vas tridimensionales de lo observado a nivel microscópico y 
*
Visualización 3D 371
pio. Bajo estas condiciones, la inmersión virtual en un viaje 
hacia el interior de los organismos rebasa lo que se puede 
apreciar en imágenes como las que se muestran en este capí-
tulo. Esta forma de admirar lo microscópico es nuevo, está 
acorde a lo que la tecnología actual ha desarrollado, y con el 
paso de los años sin duda tendrá un importante impacto no 
sólo en la enseñanza del conocimiento de las ciencias bioló-
gicas, sino también en la comprensión global de lo que exis-
te al interior de una célula o un parásito. Con estos avances 
podrán efectuarse demostraciones de realidad virtual del 
interior de los parásitos, lo que podría ser utilizado no sólo 
para conocer lo que sucede en ese sitio, sino para evaluar 
aspectos que afecten la biología y la fi siología de los parási-
tos, como los tratamientos terapéuticos.
Con la visualización tridimensional de las imágenes ge-
neradas se pueden llevar a cabo análisis computacionales adi-
cionales. Por ejemplo, mediante el programa AMIRA, no sólo 
se puede reconstruir lo que se encuentra marcado fl uorescen-
temente en las imágenes generadas en MC; si las imágenes de 
los marcajes fl uorescentes se combinaron con observaciones 
bajo la técnica de DIC o Nomarsky, los espacios que no tienen 
marcaje también son reconstruidos y se les pueden asignar co-
lores falsos. Además, dado que con el programa es posible 
efectuar seccionamientos tanto digitales como transversales y 
un barrido computacional, las imágenes resultantes permiten 
evaluar la distribución espacial de lo marcado fl uorescente-
mente y la asociación con su entorno.
Es verdad que en primera instancia parece complicado 
utilizar la tecnología computacional para apoyar lo obteni-
do mediante observación microscópica —algo semejante a 
lo que ocurrió al inicio de la microscopia convencional—, 
pero es importante tener en mente que se encuentra en vías 
de crecimiento y cabe esperar que en un futuro cercano será 
de uso general y se le aplicará siempre que sea requerida. No 
cabe la menor duda de que la tecnología computacional 
brinda una nueva forma de observación que amplía el cono-
cimiento que antes se adquiría sólo con la observación mi-
croscópica. En el campo de la parasitología, el uso que de 
ella se haga permitirá conocer más acerca de la estructura 
interna de los organismos durante su desarrollo o de las 
afecciones que causan.
Bibliografía
Asan E, Drenckhahn D. State-of-the-art technologies, current 
opinions and developments, and novel fi ndings: news 
from the fi eld of histochemistry and cell biology. Histo-
chem Cell Biol 130:1205-1251. 2008.
Giepmans BNG. Bridging fl uorescence microscopy and electron 
microscopy. Histochem Cell Biol 130:211-217. 2008.
Heng X, Erickson D, Baug LR, Yagoob Z, Sternberg PW, Psaltis D, 
Yang C. Optofl uidic microscopy-A method for implemen-
ting a high resolution optical microscope on a chip. Lab on 
a Chip 6(10):1274-1276. 2006.
Hutchings CL, Li A, Fernandez KM, Fletcher T, Jackson LA, Mo-
lloy JB, Jorgensen WK, Lim CT, Cooke BM. New insights 
into the altered adhesive and mechanical properties of red 16 http://lab3d.facmed.unam.mx/?q=node/5
Figura 44-9 Microscopia confocal y reconstrucción 3D de trofozoítos de 
Giardia intestinalis. A, En las imágenes coloridas obtenidas por MC que 
se muestran en el lado izquierdode la fi gura, se presenta el marcaje 
fl uorescente de tubulina (verde) y de núcleos (azul), y en las imágenes en 
blanco y negro se muestran los mismos parásitos observados por DIC. B, 
Reconstrucción 3D, con el paquete computacional AMIRA, de las imáge-
nes de los trofozoítos presentados en las imágenes de A. Se mantienen 
los colores originales; el color rojo sólo se usó para mostrar la reconstruc-
ción del resto del cuerpo celular que no fue marcado fl uorescentemente. 
(Cortesía de Vania Galván Loredo.) 
A
B
ya se han producido varios modelos computacionales ani-
mados.16
Las imágenes tridimensionales obtenidas han permiti-
do la navegación virtual dentro de ellas al proyectarlas en 
salas diseñadas ex profeso para visualización en 3D; las 
imágenes brindan una sensación envolvente, lo cual es 
muy diferente a lo que se observa directamente al microsco-
Capítulo 44 Técnicas para visualización de parásitos mediante microscopia372
Nitschke C, Garin A, Kosco-Vilbois M, Gunzer M. 3D and 4D 
imaging of immune cells in vitro and in vivo. Histochem 
Cell Biol 130:1053-1062.
Sant Ánna C, Parussini F, Lourenco D, de Souza W, Cazzulo JJ, 
Cunha-e-Silva NL. All Trypanosoma cruzi developmental 
forms present lysosome-related organelles. Histochem Cell 
Biol 130:1187-1198. 2008.
Stanway RR, Witt T, Zobiak B, Aepfelbacher M, Heussler VT. 
GFP-targeting allows visualization of the apicoplast 
throughout the life cycle of live malaria parasites. Biology 
of the Cell 101(7):415-430. 2009.
Tsien RY. Imagining imaging ś future. Nature Reviews Molecular 
Cell Biology 4:SS16. 2003.
Varela MRE, Muñoz L, Robledo SM, Kolli BK, Dutta S, Chang KP, 
Muskus C. Leishmania (Viannia) panamensis: An in vitro 
assay using the expression of GFP for screening of antileis-
hmanial drug. Experimental Parasitology 122(2):134-139. 
2009.
Westphal V, Rizzoli SO, Lauterbach MA, Kamin D, Jahn R, Hell 
SW. Video-rate far-fi eld optical nanoscopy dissects synap-
tic vesicle movement. Science 320(5873):246-249.
Wickert H, Krohne G. Th e complex morphology of Maureŕ s cle-
ft s: from discovery to three-dimensional reconstructions. 
Trends in Parasitology 23(10):502-509. 2007.
 1. En el caso del uso de los microscopios optofl uídico y de 
fl uorescencia con LED, ¿será posible hacer observaciones a 
nivel ultraestructural en condiciones de campo o de consul-
torio y que no requieran equipo sofi sticado?
 2. ¿A qué grado podría llegar la nanotecnología para hacer obser-
vaciones de microorganismos en el campo de la parasitología?
 3. ¿Será posible llegar a visualizar todos los eventos biológicos 
intracelulares que ocurren en los parásitos, y que ello pueda ser 
utilizado para el desarrollo de mejores agentes terapéuticos?
Preguntas para refl exionar
 1. De los mencionados en este capítulo son: microscopio de cam-
po claro, microscopio confocal, microscopio electrónico de 
transmisión, microscopio electrónico de barrido, microscopio 
de fuerza atómica, microscopio optofl uídico.
 2. Microscopio optofl uídico y microscopios con fuentes de dio-
dos que emiten luz (LED). Este tipo de microscopios parecen 
ser prácticos, podrían resultar baratos y accesibles en cual-
quier sitio.
 3 . Se pueden visualizar fenómenos específi cos dentro de los or-
ganismos vivos, los cuales pueden ser fi lmados y grabados. 
Una vez que se tengan adaptados en los modelos de estudio, 
pueden ser utilizados para evaluar el efecto de sustancias con 
valor terapéutico, como fármacos o agentes vacunales.
 4. Microscopio de fl uorescencia, microscopio confocal, mi-
croscopios con fuentes de diodos que emiten luz (LED) y 
microscopia multifotónica.
 5 . Microscopio electrónico de transmisión, electrónico de barri-
do y de fuerza atómica, todos los cuales permiten realizar 
observaciones a nivel nanométrico.
 6 . La ventaja de las reconstrucciones tridimensionales a partir 
de imágenes obtenidas por microscopia confocal, electró-
nica de transmisión o tomografía es que existe la posibili-
dad de hacer observaciones de la distribución espacial de 
componentes intracelulares o de organelos de los parásitos, 
además de que se pueden realizar inmersiones virtuales 
para darse una idea de su constitución interior.
Respuestas a las preguntas de evaluación inicial
blood cells parasitized by Babesia bovis. Mol Micobiol 
65(4):1092-1105. 2007.
Jones D, Nyalwidhe J, Tetley L, Barret MP. McArthur revisited: 
fl uorescence microscopes for fi eld diagnostics. Trends in 
Parasitology 23(10):468-469. 2007.
Lang T, Lecoeur H, Prina E. Imaging Leishmania development in 
their host cells. Trends in Parasitology 25(10):464-473. 2009.
Lee LM, Heng X, Zhong W, Sternberg PW, Psaltis D, Yang C. 
Lensless high-resolution on-chip optofl uidic microscopes 
for Caenorhabditis elegans and cell imaging. PNAS 105 
(31):10670-10675. 2008.
Lee LM, Cui X, Yang C. Th e application of on-chip optofl uidic 
microscopy for imaging Giardia lamblia trophozoites and 
cysts. Biomedical Microdevices 11(5):951-958. 2009.
Li A, Mansoor AH, Tan KS, Lim CT. Observations on the internal 
and surface morphology of malaria infected blood cells 
using optical and atomic force microscopy. J Microbiol 
Methods 66(3):434-439. 2006.
Lucic V, Leis A, Baumeister W. Cryo-electron tomography of 
cells: connecting structure and function. Histochem Cell 
Biol 130:185-196. 2008.
McGill, G. Molecular Movies...Coming to a lecture near you. Cell 
133:1127-1132. 2008.
McIntosh R, Nicastro D, Mastronarde D. New views of cells in 3D: 
an introduction to electron tomography. Trends in Cell 
Biology 15(1):43-51. 2005.
Medintz IL, Uyeda, Uyeda HT, Goldman ER, Mattoussi H. Quan-
tum dot bioconjugates for imaging, labelling and sensing. 
Nature Materials 4:435-446. 2005.
Mehta SR, Huang R, Yang M, Zhang X-Q, Kolli B, Chang K-P, 
Hoff man RM, Goto Y, Badaro R, Schooley RT. Real-time 
in vivo green fl uorescent protein imaging of a murine leis-
hmaniasis model as a new tool for Leishmania vaccine and 
drug discovery. Clinical and Vaccine Immunology 15 
(12):1764-1770. 2008.
Melican K, Richter-Dahlfors A. Multiphoton imaging of host-patho-
gen interactions. Biotechnology Journal 4(6):804-811. 2009.
Molokanova E, Bartel JA, Zhao W, Naasani I, Ignatius MJ, Treadway 
JA, Savtechenko A. Quantum dots move beyond fl uorescen-
ce imaging. Biophotonics International 15(6):26. 2008.
Respuestas a las preguntas de evaluación inicial 373
	Capítulo 44. Técnicas para visualización
de parásitos mediante
microscopia