Desarrollo de técnicas electroforéticas de proteínas e isoenzimas para la caracterización de germoplasma de ajo (Allium sativum L )

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SECCION AGRICOLA 
ARTICULOS CIENTIFICOS 
DESARROLLO DE TECNICAS ELECTROFORETICAS DE PROTEiNAS 
E ISOENZIMAS PARA LA CARACTERIZACION DE GERMOPLASMA DE AJO 
(Allium sativum L.) 
Gustavo A. Ugorrelo M. I.A. MSc.; Rodrigo Artunduaga S. I.A. Ph. D .• 
RESUMEN 
Debldo a clertas limltaclones que presentan los marcadores morfol6glcos para la Idenllflcacl6n de ma-
tenales cercanos genetlcamente (en colecclones de germoplasma), se hace necesano recurnr a meto-
dos mas confiables tales como los marcadores bloqwmlcos (Pro!einas e Isoenzlmas) que dlscnmlnan 
cuilivares comparando los productos de la acllvldad genlca En esta trabajo la electroforesls en gel de 
polyacnlamlda lue desarrollada para delermlnar eleclroforegramas de proteinas e Isoenztmas esterasas 
en cuilivares de ajO (AllrumsatlVumL) como marcadores potenClales de genotlpos Extractos de dtle-
renles tejldos (hoja, raiz y bulbillos) fueron probados En general, los extractos de butbillos dan patrones 
de proteinas con mayor numero de bandas, en relacl6n con los de ralz y hOjas, en el caso de Isoenzlmas 
los mejores patrones se presentaron con extractos de hOlas Los electroforegramas de protelnas e 
IsoenZlmas permlheron detectar vanacl6n mtervanetal entre los 14 cull1vares estudlados, se encontr6 
que hay dos grupos de vanedades que dlfieren en la morfologia de la planta, un grupo representado 
por los a)os sin tUOIca envolvente de los bulbos y el otro por los genotlpos de bulbo cublerto por tUOIcas, 
a la vez, conformado por los subgrupos a)os Peruanos pequenos, Chllenos, y ajos de bulbo grande 
"Glgantes· 
Palabras claves adicionales: electrof6resls, gel de polYGicnlamtda, proteina lolal, esterasas, a,o 
ABSTRACT 
DEVELOPMENT OF ELECTROPHORETIC TECHNIQUES BY ISOZYME 
AND PROTEINS FOR CHARACTERIZATION OF GARLIC 
(Allium sativum L.) GERMOPLASM 
Due to some limitatIons of the morphologic characters In the Identlfrcatlon of the closely related genetical 
matenals (presentend In germoplasm collection), It has been necessary to appeal to most trusting me-
thods such as Ihe Isozyme and proteins patterns wlch can dtscnmlnate cullivars by companng the pro-
ducts from the genetic achvlty In this experiment the polyacrylamIde gel electrophoresIs, was developed 
for determining Isozyme and proteins eleteclrophoregrams (patterns) of garlic (AII/um satIVum L ) culll-
vars as potentJal genotype markers Extracts of dlHerent tissues (leaf, root an cloves) were examined 
SeccI6n Legurnlnosas. ICA C I Tlbaltata A A 151123, Eldorado, Santafe de 80gota 
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REVISTA leA, Vol. 28, Abril- Junio 19H3 
In general. the cloves gave proteins patterns with the largest number of bands and Icaf gavo the best 
Isozyme patterns On the basis of the Isozyme and protein patterns waS possible to detect Intervarietal 
vanation among tho 14 cullivars used In thiS study It was found In the collection two varietal groups. with 
different plant's morphology. one of them IS represent end by the garlics without shoated tunics and the 
olherone represented by the garlics with their cloves covered by tumcs At the same time the lalest group 
was conformed by the lollowlng sub-groups Small peruanos. chllenos and garlics with big cloves called 
"Gig ants' 
Additional key words: electrophoresis, polyacrylamide gel, total proteins, esterases, garlic 
La producclon mundlal de 8)0 es de 2 8 
millones de tone ladas, en un total de 
460.000 ha cultlvadas 
La exportaclon de esta especle esta h-
derada principalmente por Espana, Italla y 
Argentina. Los palses latrnoamencanos 
producen volumenes apreciables, destina-
dos al consumo interno 0 a su comerciali-
zaclon en los mercados internacionates. 
Segun FAD (1991), se cultlvan 32.000 ha 
en America del Sur y America Central, con 
rendlmiento promedio de 5.9 tlha. 
Et ajo (AllIUm sativumL.) es una espe-
cie horticola de importancla en Colombia 
por el uso en la dleta allmentlcia, la alta de-
manda de mano de obra y por el volumen 
y el valor de la producclon generada de la 
slembra de cerca de 1200 ha, con rendl-
miento promedlo de 6.0 tJha, ICA (1991). 
Alliumes un genera muy d,verso de la 
famIlia de las Alhaceas (antes Lihaceas). 
Entre los AlllUmdomestlcados y mas popu-
lares estan la cebolla (A. cepa L ), el puerra 
(A porrum L ) Y el a)o (A. sa/lVum L.), ongl· 
nanos del Cercano Oriente a del Asia Cen-
tral y Onental, Astley et. al (1982). 
Se descanocen farmas silvestres de alo, 
y su paslble ancestro es A. long/cusp/s. En la 
domestlcaclon el aja sigUlo un camino distln-
to al de la cebolla y el puerro, que poseen 
grandes cantldades de semllla sexual para 
su prapagaclon; aquel, es exclusivamente 
de propagaclon por bulbillos 0 "dientes". 
EI alo presenta variablhdad genetica 
que se encuentra en los matenales cultiva-
dos en el mundo, dlferencladas en madu-
92 
rez, requerimlentos de frIO, tamano de bul-
ba, tamano y numero de bulbiilas, etc. No 
se sabe cuanta varrabihdad fue selecclana-
da cuanda A satlVum 0 su ancestro se 
multI ph caban sexual mente, a cuanto ha 
surgldo por mutaclanes en las yemas des-
pues de que se convlrtlera en una planta 
agamlca, vivlpara y esteril, FAD (1991). 
La eXlstencla de un banco de germo-
plasma y la dlstribuclon regional 0 interna-
Clonal de matenal sin prevIa evaluaci6n 0 
caractenzacion, puede conducir a mante-
ner y dlstnbuir duplicaclones a costos ele-
vados Igualmente es necesaria la perma-
nente y constante comprobaci6n de que no 
ha eXlstldo una erosIon genetica en el ma-
tenal conservado, tanto debldo a propaga-
cion In VItro, como a multipilcaclones en 
areas ecologlcas dlferentes a su origen, 
Huaman (1986). 
La caracterizacion morfologica por va-
rios ciclos de cultivo para eliminar el efecto 
ambiental 0 variacion fenotlpica, es un efi-
ciente sistema de evaluacion de las colectas 
de ajo. Sin embargo, estos mEHodos no 
slempre permiten una clara dlferenclacion 
entre tipOS comerclales, ecotlpoS, biotlpos y 
genotlpos, Burba (1988)_ Idealmante, las di-
ferenclas entre los genotipos deberlan ba-
sarse en la comparaclon directa de genes, 
pero resulta muy costoso y toma mucho 
bempo. No obstante, las diferencias de los 
cultivares se pueden medir en forma indirec-
ta comparando los productos de la activldad 
gemca, es declr, usando las protelnas como 
marcadores genotiplcos, Hussain e/. al. 
(1986). ' 
LIGARRETO M., G.A., ARTUNDUAGA S.R., Germoplasma de ajo 
De acuerdo can su potencial genetico, 
las diversas especies vegetales desarro-
!Ian sustancias qui micas especificas a un 
especie 0 variedad, detectables segun un 
adecuado proceso eletrofonHico. 
De este modo, la estabilidad de protei-
nas y enzimas solubles en agua, ha brinda-
do una excelente posibilidad de ser utiliza-
das en estudios taxonomicos, Contreras y 
Mansilla (1989). 
Las tecnlcas electroforeticas estan ba-
sad as en la migraci6n diferencial de molecu-
las, que varian en carga y tamafio, a traves 
de un campo elect rico usado como soporte, 
generalmente un gel de poliacrilamida, aga-
rosa 0 almid6n. Las proteinas codificadas 
par diferentes genes pueden tener distinta 
carga 0 tamano molecular y de esta forma 
tener diferentes movihdades en un campo 
electrico, Gonzalez y Gomez (1987). 
La electroforesis ha side adaptada a una 
variada gama de aphcaciones. En biologia 
se usa para comparar relaciones evolutivas 
entre organismos, asumiendo que tipos rela-
cionados pueden tener un gran numero de 
proteinas del mlsmo grupo. En bioquimica 
se ha utlllzado, para analizar proteinas y aCI-
dos nucleicos virales, componentes celula-
res y atros sistemas biol6gicos. 
La utilidad de las isoenzimas como 
marcadores se encuentra bien documenta-
da, y las variantes geneticamente deflnidas 
de las isoenzlmas han demostrado su im-
portancia en la evaluaci6n de la variabih-
dad genetica en varias especies como 
arroz, cebada, maiz, frijol, papa, trigo y so-
ya entre otras, Tanksley y Orton (1983). 
EI objetivo del presente estudio fue de-
sarro liar una metodologia electroforetlca 
de proteinas y esterasasque pueda ser 
usada para Identificar cultlvares de aJo 
(AllIUm sativum L.) 
MATERIAlES Y METODOS 
Se trabajaron 14 cultlvares de ala, co-
lectados en las principales zonas producto-
ras en los departamentos de Cundinamar-
ca y Nanna durante el pnmer semestre de 
1990, los cuales fueron evaluados en el . 
campo en el CI Tibaltata durante los se-
mestres B de 1990 y A de 1991, para for-
mara grupos de genotlpos como simi lan-
dad morfologica y de rendlmlento (Tabla 1). 
TABLA 1. Cultivares de ajo estudiados en el desarrollo de la electrof6resis. 
Grupo 1 Cultivar Caracteristicas 
AJos Costa Alca (CA) bulbos sin tunlcas, 
"Pata de perro' Cnollo (C) dlentes pequeniios, 130 
dias de cicIo de vida 
2 Peruanos AreqUipa (A) bulbos can tunlcas. 
pequeiios Morado pequeno (MP) suscept pudn ralz, 
140 dias cIcio de Vida 
3 Chllenos Chilena rOjo (CA) bulbos con tUnicas y 
Chilena blanco (CB) umformes. 140 dlas de 
cicIo de Vida 
4 AJos Morado claro (ML) 
"Glganles" Peruano (P) 
Aonsuno (A) bulbos gran des con 
Cnollo rosado (Cl) tUnlcas. y de forma 
Blanco (sabana) (B) ovoidal, 160 d'ias de 
Ronseiio morado (AM) Cicio de Vida 
Induslnal (I) 
Morado cnollo (MC) 
Vease Ligarreto (1992) 
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REVISTA leA, Vol. 28, Abril- Junio 1993 
Los 14 cultJvares se pudieron procesar 
en un mismo gel tanto para proteinas como 
para esterasas. En el desarrollo de la le~nica 
de eleclroforesis se utilizaron 11 soluclones 
de extracci6n de dlferenle concenlracion y 
pH (Tabla 2), para selecclonar.la que ongi.~a­
ra electroforegramas con meJor resoluclon, 
segregaclon y claridad de las bandas. 
TABLA 2. Soluclones buffer empleadas en la 
electroforesls. 
Sistema 
Extraccl6n 
Gel separador 
Gel concentrador 
Electrodos 
Solucl6n 
Agua desttlada 
SOSl% 
SDS5% 
TriS • Hel 0 5 M, pH 6 B 
Tns - Hel 0 05 M + 1% ME, 
pH68 
Tns· Hel 0 05 M + 1% ME. 
pHB3 
Tns • Her 0 05 M. pH 6 8 
Tns • Hel 005 M. pH B 3 
Urea 8M 
Sacarosa al 20% 
Elanol al 70% 
Tns Hell 5 M, pH 8 B 
Tns Hel 0 5 M pH 68 
Tns ghcrna 0 025 M. pH 8 3 
Tanto para espectro proteinico como 
para esterasas, se trabaJo con tejido de 
raices, hojas y bulbillos a dientes madu-
r~s. Las muestras fueron preparadas por 
maceracion manual de un gramo de teJldo 
fresco en aproximadamente dos ml de ni-
tr0geno IiqUldo, luego se agre90 un ml de 
buffer de extracclon, se agllo por dos mi-
nutos y se adlclono 20 mlcrolltros (Ill) de 
sulflto de Sodlo (10 g Na2 SO:l7.S g Na 
2S20slS0 ml de agua); la mezcla 0 pasta 
cruda fue centrrfugada a 145000 rpm 
(20904 g) a 4° C. durante 30 mlnutos. EI 
sobrenadante fue usado para 1a separa-
cion de proteinas e Isoenzimas. EI eqUipo 
utllizado fue una unrdad vertical de elec-
troforesis Protean II de Blo-Rad y una 
fuenle de poder Blo-Rad modelo 400. 
94 
Se empleo la metodologia propuesta 
por Stegemann el. a/. (1985) para determi-
nar la concenlracion de proteinas porprue-
ba de gotas, 10 mismo que para la prepara-
cion del gel de separacion al 10% Y gel de 
concenlracion aI4%. 
La muestra aplicada a cada una de 
las ranuras del gel fue de 7.5 a 30 micro-
htros de soluci6n (compuesta por 250 III 
de extracto de tejido, 62.5 III de soluci6n 
de sacarosa al 60% y dos III de azul de 
bromofenol) dependiendo de la concen-
tracion de proleinas detectada en la prue-
ba de gotas. 
Para la electroforesis en geles de polya-
cnlamida (PAGE) se utilizo e1 sistema dis-
continuo de Laemmll, Stegemann el. at. 
(1985). EI corrimiento se realize dentro de 
una nevera can recirculaci6n de agua fria; 
se aplico una corriente de 14 a 44 mA, con 
vo\taje de 60 v. incrementado gradualmente 
hasta 380 v., el proceso duro cinco horas. 
La tincion de proteinas se realizo con 
azul brillante de coomassie al 0.025% de 
acuerdo al procedimiento descrito por 
Stegemann el. a/. (1985). En la tincion 
de las IsoenZlmas esterasas se uso el 
procedimiento recomendado por Hussain 
el. al. (1986). Una vez destenidos los ge-
les fueron fotografiados y sec ados. La 
electrof6resis fue repetida cinco veces 
para estar seguros de la establlidad y re-
petiblhdad del patron. 
RESULTADOS Y DISCUSION 
Despues de cinco corrimientos de la 
electroforesis de proteina por el sistema 
dlscontinuo (PAGE), usando varios siste-
mas de buffer, se determlno que la cali-
dad de la separacion de las proteinas de-
pende de la soluclon buffer empleada. De 
acuerdo con los resultados preliminares 
se encontro que de los 11 buffers proba-
dos, Trls Hel 0.05 M + ME al1 %, pH 6.8 
presento mayor movilidad y mejor calidad 
de las bandas en los electroforegramas 
de teJido de bulbillos. 
LIGARRETO M" G.A., ARTUNDUAGA S.R., Gcrrnoplasrna de ojo 
o 
1.0 -
PRO.TEL -rOT. 
_ • . 0 
e:Q§ 
- ... :; = == ~ 
:= .~ o . 
Q · a~ 
o 
-05 
-10 
FIGURA 1. Patrones eletectroforeticos de proteinas totales en geles de poliacrilamida al 10% 
para determinar tejido y la cantidad de extracto. EI patron de albumina (referencia) 
aparece en los extremos derecho e izquierdo de los geles y las migraciones interio-
res son del cultivar de ajo CriolloRosado (Cl). 
La Figura 1 muestra los electroforegra-
mas de extracclon de protelnas de ralZ, ho-
Jas y bulbillos usando el buffer Tns HCI 0.05 
M + ME al 1 %, pH 6.B. De los tejidos utlhza-
dos, las hojas y bulbillos produJeron patro-
nes de protelnas mas intensos y claros, en 
relaclon a los de tejldo no pigmentado 0 ral-
ces. Por la facilidad en la disposicion del ma-
terial vegetal se uso bulbillos como muestra 
de tejldo para posteriores electroforesis. 
Comportamlento distmto se obtuvo en la de-
tecclon de esterasas, donde el extracto de 
hOjas presento palrones mas c1aros. 
Los resultados antenores estan de 
acuerdo can los reportados par el progra-
rna de papa del CI Tibaitata utlhzando tu-
herculos y hojas de papa en la caracteriza-
cion de germoplasma (informacion 
personal), y con Simmonds (1990) en la 
Identificacion de vanedades de arroz me-
diante esterasas de teJldos folia res Lo cual 
dlflere con 10 Indicado por Siqueira el. al. 
(1985), qUlenes enconlraron buena resolu-
cion de las bandas al usar teJldo de rakes 
Y bulbllios de ajo en electrororesls hOrizon-
tal en geles de almldon. 
En la delermmacl6n de la concentra-
cIon optIma de proteinas del extracto para 
obtener buenos electroforegramas, se rea-
ho comparaclon cuahlativa de manchas 
de los extractos y manchas de seroalbuml-
na de concentraclon conoclda (como refe-
Tencla) sobre papel de cromatografia. La 
concentraclon de proteinas en extracto de 
hOjas oscllo entre 40 y 160 I1g, can Incre-
mentos sucesrvos de 20 I1g La prueba per-
mltlo establecer que 120 )1g de prolerna en 
la muestra de hOJa es la canlldad adecuada 
para el desarrollo de las eleclroforesrs de 
cultlvares de aJo (FIgura 1). 
De la mlsma forma, se cuantrflco la 
concentraclon de proternas en los extrac-
tos de bulbillos, se vano drcha concentra-
cl6n entre 27 y 51 ~lg can Intervalos de 4 
)1g Se logr6 establecer que 47 ~lg de pro-
terna y una allcuota de aproxlmadamente 
10 ul de exlracto son cantldades adecua-
95 
REVISTA ICA, Vol. 28, Abril- Junio 1993 
das para apreciar bandas claras en los 
electroforegramas (Figura 1). 
Una vez estandarizada la melodolo-
gia se realiz6 la electroforesis con los ex-
tractos de bulbillos de los 14 cultivares es-
tudiados; posteriormente se evaluo la 
mOVIlidad de las bandas en los electrofo-
rogramas usando la combinacion del nu-
mero y localizacion de las mismas. EI me-
todo de electroforesis de proteinas de 
bulbillos mostro discriminacion de los cul-
Ilvares estudiados (Figura 2). 
En la evaluacion se tome como refe-
rencla el patron de albUmin a (clara de hue-
vo); se dlstinguen dos patrones bien defini-
dos, el de los materiales Costa Rica (CR) y 
Cnollo (C) patr6n A, el cual presenta las 
bandas Intensas 1 F con movilidad de 0.4 y 
2F con mOVIlidad de 0.73, ambas ausentes 
en el complejo de bandas homogeneas a 
los otros cultivares que contorman el pa-
tr6n B. De igual forma, el patron A presenta 
un conjunto de 12 bandas detimdas, mlen-
tras queel otro patron (8) solo posee entre 
acho a nueve, algunas de las cuales son 
o 
I'" p -
! 
. i 
de baja intensidad (Figura 2), 10 que sugie-
re que los cultivares dentro de cada patron 
pueden tener pedigrees simllares. 
La base genetica estrecha del ajo por 
descender de un solo tipo ancestral, su in-
capacidad para producir semilla sexual, el 
hecho de ser una especie introducida a 
Colombia y el reducido numero de cultiva-
res evaluados, inducen a pensar en la po-
ca variabilidad presente en esta colec-
ci6n. Sin embargo, el desarrollo de las 
tecnicas electroforEWcas refJeja la existen-
cia de diversidad genetica entre los mate-
riales examinados. 
Ugarrreto (1992), en la caracteriza-
cion morfologica y de rendimiento de los 
mismos cultivares de ajo, tambien encon-
tro diterenciaci6n genetica entre las acee-
slones (Costa Rica y Criollo) de patron 
electroforEHico A y los demas eultivares de 
patron 8. EI primer grupo se caracteriza 
por tener bulbos sin tunicas envolventes y 
dlentes pequenos de tamano inferior a 5 x 
15 mm y el segundo grupo son cultivares 
de bulbos protegides per tlinicas y con 
o 
0.5 
__ __., __ - : 2:1l 
_~~ ___ .. ~4(D hOj-a " "- 1~ blIlbiUo 
1 0 -fl' 1.0 
FIGURA 2. Patrones electroforelicos de proteinas totales de bulbillos y esterasas de hojas en 
geles de polyacrilamida de 10%. 
96 
LIGARRETO M., G.A., ARTUNDUAGA S.R., Gerrnoplasma de ajo 
dientes en su mayo ria grandes de tamano 
superior a 5 x 15 mm. 
Los patrones de esterasas de hOjas 
correspondientes a las variedades de los 
grupos 2, 3 Y 4 de la clasificacion morfo-
agronomica (Tabla 1) aparecen en la Fi-
gura 2; en los electroforegramas no se 
distinguen patrones c1aros por movilidad. 
Solo se aprecia que los genotipos chile-
nos (grupo 3) pose en las dos bandas de 
la mitad del gel (1 G) con mayor intensidad 
relativa que los genotipos Peruano (P) y 
Morado Claro (ML) representativos del 
grupo 4 y de menor intensldad relatlva 
que los genotipos Arequipa (A) y Morado 
pequeno del grupo 2. 
Aun cuando hay baJa resoluclon para 
algunas bandas de los patrones de este-
rasas, se observa que en el genotipo Chl-
leno rojo (CR) hay un grupo de tres ban-
das seguido a las dos primeras, a 
diferencia del Chileno blanco (CB), que 
solo tiene un par de bandas; a su vez, Ja 
ultima banda vIsible de color "negro" esta 
definida en el ajo rOJo (CR) y dlfusa en el 
Chilena blanco (CB). No tue posible una 
dlferenciaci6n clara de los genotipos de 
los olros grupos, debldo a la falta de VI-
sualizaclon de las IsoenZlmas. Resulta-
dos similares son los comentados por Si-
quelra et. al. (1985) qUienes utlhzando 
las isoenzimas: PGI, ADH, EST Y PRX 
obtuvieron ocho patrones de bandas en 
la caracterizaclon de clones de a)o. 
CONCLUSIONES 
1. La metodologia desarrollada es sencl-
lIa y rapida para hacer estudlos de des-
cnpcion electroforetlca en ajo (Allium 
sativum L.). 
2. Mediante la electroforesis de proteina 
total de bulbillos se dlferenciaron dos 
grupos de cultlvares, 10 que refleja la 
existencla de vanabilidad genetlca. 
3. Los cultivares que representan a los 
grupos 2 (Arequipa y Morado peque-
no), 3 (Chile no) y 4 (Peruano y Morado 
Claro) difieren en la intensldad relativa 
de las bandas en los patrones electro-
foreticos de esterasas de hojas. 
4. Para corroborar la c1asificacion entre 
vanedades de ajo se sugiere reahzar 
electroforesls con otros marcadores 
geneticos. 
5. La tecnica presenta una valiosa ayuda 
en la dlferenciaci6n de cultivares de 
ajo, 10 cual es importante en el mante-
nimlento de los bancos de germoplas-
ma y registro de variedades. 
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 
1. Aslley, D.; Innes, N.I.; Van Der Meer, O. 1982 
Genehc resources of allium species Roma, 
IBPGR 38 P 
2. Burba, J.L. 1988 Estudlo prehmmar de des-
cnpctores moriol6glcos para caractenzacI6n de 
Banco de Germoplasma de aJo ( AllIum satlVum 
L) En Hortlcultura Argentina 7 (15) 65-70 
3. Contreras, A.; Mansllla, R. 1989 Eleclroforesls 
de proleinas y esterasas como metoda qUlmlco 
de Identlficaclon en papas Turnalba 39 (2) 
193-198 
4. FAO.Organizacion de las Naclones Unldas 
para la Agncuttura y la ahmentaci6n. 1991 
Manual de mtercamblo y propagaclon de gerrno-
plasma de alo a traves de microbulbillos Santia-
go de Chile, 45 p 
5. Gonzalez, A.S.; Gomez, P.L. 1987 Caracten-
zaclon blOquimlca del gusano blanco de la papa 
(Premnotrypes vo~ por media de separacI6n 
electroforetlca Bogota, ICA, Programa de papa 
28p 
6. Huaman, Z. 1986 Conservaclon de recursos 
genetlcos de papa en el CIP Centro Internaclo-
nal de la papa Circular, 14 (2) 1-7 
7. Hussain, A.; Ramirez, H.; Roca, W. 1986 Ma· 
nual practlco para deteccI6n electroforetlca de 
Isoenzlmas y otras protemas Cail Cia!, 65 p 
(Documento de trabaJo No 19) 
8. Instltuto Colomblano Agropecuarlo. 1991 
Estadlsllcas colectadas por Creced Sabana de 
Bogota, ICA Seccl6n de Hortahzas (sin pubh-
car) 
9. Ligarreto, G A. 1992 CJasificacl6n morfologlca 
y rendlmlento de 14 cultlvares de alo (Afllum 
salwum L) 16 P (mlmeografiado. matenallne-
dlto) 
97 
98 
10. Simmonds, R. 1990. Ensayos para iden!rlicm 
varied.:ldcs comcrci.:llcs de arroz. Santal6 de 
Bogota (Colombi,,). Univcrsidod Nacional de 
Colombia, Tcsis Mag. Sci 84 p. 
11. Siquelra, .J.W.: Medina, H.P.; Lisbon, R.S.; 
fornaslcr, J.B. 1985. Caracterlza'Y<lo tsoenzi· 
matica e morfologica de clones 0 introducoes de 
alho Aevisfa Bragantia. Carnpinas, Sao Paulo-
BraSil). 44 (1)' 357-374 
13.