PRÁCTICA4 Araceli Labourdette

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Facultad de Bioanálisis
Región Xalapa
Microbiología General.
Docente: Edith Pozos Mestizo
Practica 4: Tecnicas de tinción
Araceli Labourdette Calderón
Universidad Veracruzana
PRÁCTICA No. 4
Fundamento
Un colorante se define como una sustancia capaz de dar color a células, tejidos, fibras, etcétera. De acuerdo con su origen, se pueden dividir en: colorantes naturales, los cuales son extraídos de plantas o animales, y colorantes artificiales, que son aquellos de minerales procesados y manipulados en el laboratorio. Todo colorante, se caracteriza por presentar un grupo cromóforo que tiene como función teñirla estructura y una grupa auxocromo, el cual participa de la reacción, para que se dé la tinción.
Los colorantes se clasifican en catiónicos (básicos), aniónicos (ácidos); basados en la carga presente en el grupo cromóforo. Aunque los microorganismos vivos se pueden observar directamente en fresco al microscopio óptico, la mayoría de las veces es necesario teñirlos para que, por medio del uso de colorantes, sea mucho más fácil su identificación; además, la presencia de ciertas estructuras, así como su reacción a determinadas técnicas, nos permite clasificar a las bacterias. Así pues, los colorantes tienen las siguientes funciones:
1. Permiten hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes.
2. Revelan su forma y tamaño.
3. Muestran la presencia de estructuras internas y externas.
4. Producen reacciones químicas específicas. 
Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se tiñe del mismo color y se utiliza un sólo colorante (azul de lactofenol o tinta china); tinción diferencial, cuando se visualiza más de un color porque se utiliza más de un colorante (Gram o Ziehl-Neelsen); tinción específica, cuando se utilizan anticuerpos marcados con una molécula fluorescente para identificar una estructura celular en particular (inmunohistoquímico) o para identificar estructuras como flagelos, cápsulas y/o esporas.
 
Objetivos
· Hacer visibles a los objetos microscópicos y transparentes.
· Revelar su forma y tamaño.
Material
· Microscopio
· Cultivo puro
· Portaobjetos
· Colorantes
· Puente para tinción
· Asa bacteriológica
· Aceite de inmersión
Tinción de Gram
Esta tinción es un procedimiento de gran utilidad empleado en los laboratorios donde se manejan pruebas microbiológicas. Es definida como una tinción diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica a las bacterias en dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y bacterias Gram positivas.
En microbiología clínica resulta de gran utilidad, ya que a partir de muestras clínicas directas provenientes de sitios estériles se puede saber de manera rápida las características de la muestra y hacer una diferencia de los potenciales microorganismos causantes de una infección.
PROCEDIMIENTO
1. Recoger la muestra de bacterias a estudio mediante un isopo.
2. Extender dicha muestra sobre un portaobjetos y dejarla secar.
3. Fijar la muestra mediante un alcohol (metanol).
4. Aplicar el tinte de violeta de genciana sobre el portaobjetos y esperar un minuto.
5. Enjuagar la muestra con agua y aplicar un fijador del violeta de genciana (lugol). El Lugol y el violeta de genciana forman un complejo insoluble en agua capaz de penetrar en la pared de las células bacterianas.
6. Lavar de nuevo el portaobjetos con una mezcla de alcohol y acetona durante unos segundos.
7. Añadir safranina o fucsina para distinguir las gram negativas que aparecerán bajo el microscopio (en lugar de incoloras) con un tono rosado o rojo. 
8. Lavar con agua.
9. Ya se puede observar la muestra al microscopio donde se visualizarán de color violeta las gram positivas y de color rosa-rojizo las gram negativas.
TINCIÓN SIMPLE
La tinción simple es un procedimiento de tinción rápido y sencillo en el cual se emplea un solo colorante, por eso se denomina simple. Se utiliza principalmente para determinar la morfología y la organización de las células presentes en una muestra.
Naturalmente las células no tienen color, por lo que es necesario hacerlas visibles de alguna manera cuando se observan en el microscopio.
Colorantes empleados en la tinción simple
· Azul de metileno.
· Violeta de cristal.
· Verde malaquita.
· Fucsina básica.
PROCEDIMIENTO
1. Colocar el portaobjeto sobre un estante de tinción y aplicar el colorante deseado. Dejar actuar el tiempo correspondiente.
2. Lavar cuidadosamente el frotis del portaobjetos con agua destilada de una botella, o también con agua del grifo que fluya lentamente, hasta que la escorrentía se vuelva transparente. Por lo general esto tarda de 5 a 10 segundos.
3. Secar el portaobjetos con toallas de papel absorbente en un solo sentido y sin frotar. Asegurarse de que la parte inferior del portaobjeto quede limpia.
4. Observar el frotis teñido en el microscopio. Comenzar por los objetivos más lejanos para ubicar adecuadamente la zona que se desea observar con más detalle. Cambiar de objetivo para acercarse cada vez más a la muestra.
Resultados
Tinción Gram:
Tinción simple:
 
Conclusiones
La gran aportación práctica de la tinción de Gram es que permite determinar el tipo de antibiótico, así como su eficacia. Por otro lado, la tinción simple solo sirve para denotar la morfología celular. Las tinciones se basan en la utilización de colorantes que pueden clasificarse como naturales o sintéticos. Los naturales se utilizan principalmente con fines histológicos. La mayor parte de los colorantes que se utilizan para teñir bacterias son sintéticos, muchos de ellos son las anilinas y derivados del benceno.
Referencias
1. Moyes, R. B., Reynolds, J., & Breakwell, D. P. (2009). Preliminary staining of bacteria: Simple stains. Current Protocols in Microbiology, (SUPPL. 15), 1–5.
2. (2001). Microbiological Applications: Laboratory Manual in General Microbiology (8 th ed.). The McGraw-Hill Companies.
3. Harisha, S. (2006). An Introduction to Practical Biotechnology (1st). Firewall Media.