Manual de introducción a la microbiología

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ENA LUZ TORRES ARROYO 
LISY GRACIA HERRERA 
EDUARDO THORRENS ROMERO 
ROSSANA VILLEGAS GRACIA 
 
 
 
 
MANUAL DE INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA 
 
 
 
 
 
 
 
Primera edición 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ENA LUZ TORRES ARROYO 
LISY GRACIA HERRERA 
EDUARDO THORRENS ROMERO 
ROSSANA VILLEGAS GRACIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
Fondo Editorial de la Universidad de Córdoba 
Montería, Colombia. 2021 
 
Ena Luz Torres Arroyo. M.Sc 
Lisy Gracia Herrera. M.Sc 
Eduardo Thorrens Romero. M.Sc 
Rossana Villegas Gracia. M. Sc 
Universidad de Córdoba 
Carrera 6 No. 77- 305 
Montería. Córdoba 
2021 
Fondo Editorial Universidad de Córdoba 
 
 
 
Manual de Introducción a la Microbiología 
Autores: 
Ena Luz Torres Arroyo. M.Sc 
Lisy Gracia Herrera. M.Sc 
Eduardo Thorrens Romero. M.Sc 
Rossana Villegas Gracia. M. Sc 
 
ISBN 978-958-5104-41-9 
 
Primera edición 2021 
 
137 p. 
 
Prohibida la reproducción total o parcial de esta obra, por cualquier medio, sin 
autorización escrita de los autores. 
 
Impreso en Colombia 
1 
 
1. Índice 
Capítulo 1. Microscopía ...................................................................................................... 7 
Tipos de microscopio ..................................................................................................... 12 
Pasos para la observación de muestras en el microscopio compuesto ......................... 17 
Cuidados del microscopio .............................................................................................. 18 
Capítulo 2. Técnicas para la observación microscópica de microorganismos .................... 22 
Preparaciones en fresco o no coloreadas ...................................................................... 22 
Tinciones o coloraciones ............................................................................................... 25 
Capítulo 3. Técnicas básicas para el aislamiento de microorganismos ............................. 40 
Procedimientos básicos en el laboratorio de microbiología ........................................... 40 
Técnicas de siembra ...................................................................................................... 44 
Capítulo 4. Metabolismo bacteriano. .................................................................................. 54 
Transporte transmembranal........................................................................................... 56 
Mecanismos de obtención de energía ........................................................................... 56 
Viabilidad y pureza de cepas de referencia ................................................................... 58 
Fundamentación de las pruebas bioquímicas para determinación de características 
metabólicas de las bacterias. ......................................................................................... 59 
Capítulo 5. Generalidades de bacterias. ............................................................................ 66 
Comparación de las características de las bacterias grampositivas y gramnegativas. 69 
Tamaño de las bacterias ................................................................................................ 70 
Formas de las bacterias ................................................................................................ 70 
Forma de las colonias bacterianas ................................................................................ 74 
Caracterización del crecimiento en medios líquidos como caldo nutritivo ...................... 76 
Capítulo 6. Morfología de los hongos. ............................................................................... 78 
Características de la célula micótica .............................................................................. 78 
Morfología de los hongos .............................................................................................. 78 
Características del cultivo de hongos. ........................................................................... 80 
Enfermedades micóticas ............................................................................................... 82 
Capítulo 7. Generalidades de parásitos. ............................................................................ 86 
Generalidades de los protozoos. ................................................................................... 86 
Generalidades sobre helmintos ..................................................................................... 90 
Diagnóstico de parásitos ...............................................................................................93 
Capítulo 8. Medios de cultivo. ............................................................................................ 97 
Generalidades de medios de cultivo .............................................................................. 97 
Control de calidad en los medios de cultivo ................................................................. 100 
Control de calidad de la esterilización mediante indicadores físicos, mecánicos, 
químicos o biológicos .................................................................................................. 102 
2 
 
Procedimientos para preparación de medios de cultivo, control de calidad de 
esterilización y valoración de la calidad de los mismos .................................................... 103 
Capítulo 9. Control de microorganismos .................................................................................. 107 
Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos ................................................................... 108 
Prueba de sensibilidad por difusión en agar con discos (método Kirby Bauer) ............. 110 
Limpieza y desinfección .......................................................................................................... 111 
Métodos de esterilización ........................................................................................................ 112 
Valoración de desinfectantes .................................................................................................. 113 
Capítulo 10. Bioseguridad en el laboratorio de microbiología ................................................ 116 
Principios de la bioseguridad .................................................................................................. 117 
Clasificación de los microorganismos por grupos de riesgo .............................................. 117 
Niveles de contención .............................................................................................................. 118 
Categorización de los laboratorios según el nivel de bioseguridad .................................. 119 
La bioseguridad como ejercicio práctico .............................................................................. 120 
Uso de elementos de protección personal .......................................................................... 120 
Cabinas de seguridad biológica CSB ................................................................................... 121 
Prácticas generales de seguridad en el laboratorio ........................................................... 123 
Prevención y control ................................................................................................................ 125 
Control del riesgo biológico .................................................................................................... 126 
Procedimientos de desinfección en el laboratorio de microbiología ............................... 128 
Medidas en caso de emergencia .......................................................................................... 130 
Otros aspectos de la bioseguridad en el laboratorio .......................................................... 131 
Simbología utilizada de acuerdo con los procedimientos de seguridad y bioseguridad 
establecidos..............................................................................................................................131 
3 
 
Autores 
 
Ena Luz Torres Arroyo. Bacterióloga y Laboratorista Clínico. Especialista en Microbiología 
Médica. Magister en Biotecnología. Docente de planta Programa de Bacteriología, 
Universidad de Córdoba 
 
Eduardo Enrique Thorrens Romero. Bacteriólogo. Magister en Salud Pública. Docente del 
programa de Bacteriologia, Universidad de Córdoba. 
 
Rossana Villegas Gracia. Bacterióloga. Magister en Microbiología y bioanálisis énfasis 
hematología, Universidad de Antioquia. Docente de planta Universidad de Córdoba. 
 
Lisy Gracia Herrera, Bacterióloga. Especialista en Microbiología médica. Magister en 
ciencias ambientales. Docente de planta de Universidad de Córdoba. 
4 
 
Prefacio 
 
El laboratorio de microbiología es el lugar en el cual se manejan y estudian los 
microorganismos, con la finalidad de establecer el diagnóstico de las enfermedades 
infecciosas. Este texto busca hacer de una manera didáctica una revisión precisa y 
actualizada de los procedimientos básicos empleados para la manipulación y el 
procesamiento de muestras clínicas, dirigidos al diagnóstico, seguimiento y tratamiento de 
las enfermedades de etiología microbiana. El objetivo principal de este manual es servir 
de guía para los estudiantes de pregrado que se forman en programas de bacteriología, 
microbiología y afines, quienes en su futuro ejercicio profesional se desempeñarán en el 
laboratorio de microbiología en el campo asistencial clínico humano o veterinario, de 
investigación o de docencia. 
Considerando que estos estudiantes inician su experiencia en el manejo de los 
microorganismos, estimamos de gran importancia incluir una serie de recomendaciones 
relacionadas con las reglas generales del laboratorio y los principales procedimientos que 
el estudiante deberá aprender, para manipular en forma adecuada los microorganismos, 
garantizando tanto su seguridad como la de sus compañeros, o sea la bioseguridad 
aplicada al laboratorio. Además, comprende temas fundamentales como los 
procedimientos para el aislamiento de microorganismos en medios de cultivo, microscopía; 
preparaciones y coloraciones para la observación microscópica de microorganismos; 
morfología macro y microscópica de bacterias, hongos y parásitos; generalidades y control 
de calidad de medios de cultivo; metabolismo bacteriano y viabilidad y pureza de cepas de 
referencia; y control de microorganismos: pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos, 
limpieza y desinfección y métodos de esterilización. En este contenido se enfatizan 
aspectos prácticos indispensables en el procesamiento bioseguro de muestras clínicas, 
para la realización del estudio microbiológico que incluye exámenes directos, cultivo y 
antibiogramas para el diagnóstico de enfermedades causadas por bacterias, hongos y 
parásitos. 
La inclusión de imágenes en 3D y la Realidad Virtual tiene la capacidad de potencializar el 
proceso de pedagógico al brindar una nueva perspectiva del contenido al mostrarse desde 
un escenario inmersivo en donde el estudiante activa la construcción del aprendizaje en 
base a la experiencia en primera persona. 
5 
 
Instrucciones para Reproducir la 
realidad virtual 
 
 
Instrucciones para reproducir la 
Realidad Virtual, Videos e Interactividad 
 
 
 
 
 
 
 
 
Intalar desde 
 
 
O 
 
 
 
 
 
A) Leer el Código QR 
presente en las 
diferentes secciones 
 
Las siguientes Apps: 
del Manual 
B) Abrir el link 
escaneado mediante estas 
Apps según lo solicite el 
teléfono, 
es opcional 
utilizar una CardBoard 
Escáner de QR 
 
 
 
 
Chrome Youtube 
6 
 
 
Capítulo 1. Microscopía 
 
El microscopio es un instrumento que permite observar estructuras con tamaño inferior a 
250 µm, correspondiente al nivel de resolución del ojo humano. El primer microscopio fue 
construido a finales del siglo XVI por dos holandeses fabricantes de anteojos, Hans Janssen 
y su hijo Zacharias; fue el también holandés Anton van Leeuwenhoek, quien vio y describió 
por primera vez las bacterias y levaduras presentes en una gota de agua. El primer 
microscopio electrónico, fue construido en el año 1931 por Max Knoll y Ernst Ruska en 
Berlin, Alemania. 
 
La microscopía se define como el uso de un microscopio para ampliar el tamaño de objetos 
tan pequeños que no pueden ser visualizados a simple vista. Este método es el más 
comúnmente usado para la identificación de microorganismos en muestras clínicas y para 
la caracterización de microorganismos aislados en cultivos. En muchas ocasiones, la 
combinación de coloraciones específicas con la microscopía permite identificar agentes 
etiológicos de enfermedades infecciosas de forma rápida, barata y efectiva. 
La microscopía se fundamenta en dos principios: poder de resolución y el aumento o 
magnificación. La resolución del microscopio es la capacidad para distinguir dos objetos 
muy cercanos el uno al otro y el aumento es la capacidad que posee un microscopio de 
amplificar una imagen en varias veces su tamaño original; esta propiedad está ligada con 
el poder de aumento de los lentes objetivos y oculares. Para optimizar la visualización, 
además de la magnificación, es esencial la resolución, la cual permite mantener el detalle 
del objeto ampliado. 
 
En la mayoría de los microscopios de luz, el lente del objetivo cercano a la muestra 
magnifica el objeto 100 veces 100X, y el lente ocular cercano a los ojos magnifica 10 veces 
10X. Usando estos dos lentes, el tamaño real de los organismos en las muestras son 
magnificados 1000X; este aumento permite observar hongos, la mayoría de las bacterias y 
parásitos, pero no es suficiente para observar los virus, los cuales requieren magnificación 
de 100.000 o más. 
 
Para lograr un óptimo nivel de resolución con aumento 1000X, se adiciona aceite de 
inmersión, que tiene las propiedades ópticas y características de viscosidad específicas 
para la observación microscópica; el tener igual índice de refracción que el vidrio, hace que 
el aceite de inmersión reduzca la dispersión de la luz entre el objetivo de 100X y la lámina 
portaobjetos. Los bajos aumentos de 100X y 400X son útiles para observar 
microorganismos como hongos y parásitos, mientras que el aumento de 1000X con aceite 
de inmersión se usa para la observación de bacterias. 
7 
 
El microscopio compuesto está constituido por tres sistemas articulados para garantizar 
un óptimo funcionamiento: Sistema mecánico, que sirve de soporte al sistema óptico, 
iluminación y elementos como el pie o base, columna, mecanismo de enfoque, platina, 
revolver, tubo; Sistema óptico, constituido por los objetivos y ocular, que son los lentes 
para el aumento y resolución; Sistema de iluminación, conformado por los elementos 
como lámpara o fuente de iluminación, espejo, condensador y diafragma, que producen las 
radiaciones y transmiten, reflejan y regulan la intensidad y la cantidad de rayos que van 
a incidir sobre el espécimen. Adicionalmente, el microscopio puede estar dotado de 
accesorios como cámaras fotográficas, de video, computadoras, accesorios para dibujar, 
entre otros; que permiten potenciar las capacidades del instrumento (figura 1.1). 
 
SISTEMA MECÁNICO 
 
Componente 
 
Características y Funciones 
Base o pie Parte inferior en la cual se apoya el microscopio, soporta 
el brazo o columna sobre el cual reposa el resto del aparato 
y contiene la fuente de iluminación. 
Brazo o columna Junto con la base constituyen el soporte del instrumento. 
Sitio por donde se debe tomar el microscopio. Tiene en su 
parte más inferior el condensador y en la parte superior 
posee una cremallera que permite desplazar en sentido 
vertical el condensador, la platina o el revólver y el tubo. 
Revolver Constituido por una semiesfera que posee una serie de 
anillos en los cuales van atornillados los objetivos. Permite 
el intercambio rápido de objetivos mediante un movimiento 
de rotación. 
La platina Placa cuadrada, soportehorizontal donde se colocan las 
preparaciones a observar. Presenta en el centro un orificio 
circular por donde pasa el rayo de luz producido por la 
fuente luminosa y proveniente del condensador. Posee un 
sistema de fijación e inmovilización de la lámina porta- 
objeto. Tiene un desplazamiento hacia adelante o hacia 
atrás y de derecha a izquierda y viceversa que permite el 
examen completo de la preparación. 
Carro mecánico Sistema de dos pinzas ubicado encima de la platina, que 
sirve para desplazar la muestra izquierda-derecha y 
8 
 
adelante-atrás, mediante perillas ubicadas en el costado 
de la platina. 
 
Tubo o cabezal Cilindro que soporta los oculares en la parte superior y el 
revólver en la parte inferior. Puede ser monocular o 
binocular. En estos últimos, tiene una escala de ajuste 
interpupilar que permite mover los oculares hacia los lados 
y hacia el centro, con el fin de ajustar a la distancia de los 
ojos de quien usa el microscopio. 
 
Tornillo macrométrico Localiza la imagen y permite hacer un enfoque grueso, 
son dos tornillos de cremallera ubicados en ambos lados 
del microscopio. 
 
Tornillo micrométrico Su precisión le permite hacer el enfoque adecuado o enfoque 
fino de la imagen obtenida con el tornillo macrométrico, 
proporcionándole la nitidez necesaria. 
 
SISTEMA ÓPTICO 
 
Componente Características y Funciones 
 
Oculares Aumentan la imagen real proyectada por el objetivo, 10, 40 o 
100 veces según el número inscrito en ellos. Posee dos lentes, 
una superior llamada ocular que queda cerca del ojo y es la 
que produce el aumento de la imagen real del objetivo; y una 
lente inferior denominada colectora encargada de aplanar y 
aclarar el campo. Generalmente en el ocular izquierdo, se 
ubica un anillo de dioptrías para ajustar la visión binocular. 
Objetivos Constituyen un sistema óptico formado por una o varias lentes 
que producen imágenes de las muestras aumentadas 4,10,40 
o 100 veces según el número grabado en ellos y con base en 
el cual se nombran. Su función es colectar la luz proveniente 
del espécimen y proyectar una imagen nítida, real, invertida y 
aumentada hacia el cuerpo del microscopio. Constan de dos 
lentes, la lente frontal que queda cerca de la preparación y 
la lente posterior ubicada en la parte superior. Hay dos clases 
de objetivos, los secos, correspondientes a los marcados 
como 5x, 10x y 40x y los de inmersión u objetivo de 100x, 
con el mayor aumento y 
9 
 
 
 
poder de resolución. 
 
 
SISTEMA DE 
ILUMINACIÓN 
 
Componente Características y Funciones 
 
Condensador Sistema de lentes convergentes ubicados debajo de la platina 
entre la fuente de luz y el espécimen. El microscopio tiene dos 
condensadores, el de abertura que concentra los rayos 
luminosos sobre la preparación mientras que el condensador 
de campo ubicado en la base del microscopio concentra la luz 
de la fuente hacia el condensador de abertura. 
 
Fuente de luz Proporciona la luz necesaria para la observación de la 
muestra. Además de la luz solar utilizada en microscopios con 
espejo, se dispone de fuentes de iluminación artificial como 
las bombillas de tungsteno y halógenas y lámparas de arco 
eléctrico utilizadas en el microscopio de fluorescencia. 
 
Diafragma Dispositivo colocado inmediatamente debajo de la platina, con 
diseño que permite cambios en la apertura en relación con el 
tipo de objetivo que se esté utilizando y con diámetros 
variables para ofrecer conos luminosos cada vez más 
estrechos y eliminar los rayos de luz sobrantes. 
 
Filtro Disco de vidrio mate o de algún color ubicado sobre un anillo 
transportable en la parte inferior del diafragma, que permite 
seleccionar la longitud de onda de luz a emplear. 
 
 
En ocasiones se coloca en el diafragma del ocular una estructura filamentosa denominada 
señalador, usada para indicar de manera específica alguna estructura en particular en el 
campo de observación. El señalador se aprecia como una línea oscura que parte del borde 
del campo hacia el centro de este. 
10 
 
 
 
Figura 1.1 Partes del microscopio 
 
Componente Función 
Oculares de 
medición 
Permiten cuantificar longitudes, células y ángulos. En la 
actualidad hay disponibles instrumentos para morfometría con 
tecnología digital que permite transmitir los datos obtenidos a 
un computador, adicionando el manejo automatizado, 
almacenamiento de datos y obtención de variables 
estadísticas a partir de ellos. 
Cámaras y 
dispositivos para 
dibujar 
Utilizadas para obtener una representación exacta del 
espécimen en estudio mediante el dibujo de las preparaciones 
microscópicas. 
Cámaras digitales 
de alta resolución 
La microfotografía permite preservar lo observado al 
microscopio mediante el archivo de las imágenes obtenidas 
que pueden ser empleadas en publicaciones científicas, 
docencia y banco de datos. 
Cámaras de video Con la videomicroscopía se capturan imágenes en 
movimiento de la actividad de muestras vivas como células en 
cultivo, para la demostración y análisis de procesos 
fisiológicos. 
Filtros y Transforman el microscopio de campo claro en un 
Ocular 
 
Tubo de observación Cuerpo del microscopio 
Tubo de lentes 
Objetivo 
Apertura de diafragma 
Condensador 
Diafragma de campo 
11 
 
condensadores 
especiales 
instrumento con microscopia de campo oscuro, contraste de 
fases o polarización, que facilita la observación de 
especímenes con una estructura particular y células vivas. 
 
 
 
 
Tipos de microscopio 
Existen varias clases de microscopios, según la conformación, la naturaleza de los 
sistemas de luz y otros elementos utilizados para obtener las imágenes. 
 
Microscopio vertical. Es el microscopio convencional y de uso más común, que posee la 
fuente de luz ubicada en la base, por debajo de la platina. 
 
Microscopio invertido. Su estructura es inversa a la del microscopio convencional, aunque 
el principio de funcionamiento y formación de la imagen es el mismo que el del microscopio 
tradicional; la fuente de luz está ubicada por encima de la platina, facilitando la observación 
de células vivas en cultivos celulares y el monitoreo de crecimiento y comportamiento. 
 
Microscopio estereoscópico. Este microscopio proporciona una imagen estereoscópica, 
en tres dimensiones del espécimen que por lo general son de gran tamaño, sin corte o 
preparación previa. Es ideal para realizar microdisección. 
 
Microscopio quirúrgico. Es un microscopio empleado en microcirugía porque proporciona 
un campo muy bien iluminado y un aumento de las estructuras anatómicas, facilitando 
mayor visibilidad de los tejidos sanos y patológicos que serán manipulados más 
cuidadosamente y con menores posibilidades de lesión. Hay modelos muy sofisticados que 
tienen piezas automatizadas robóticas. 
 
Microscopios fotónicos especiales. Permiten la observación de células vivas o muestras 
no coloreadas, con un incremento muy satisfactorio del contraste, en comparación con el 
obtenido con el microscopio común de campo claro. Los microscopios de campo oscuro, 
microscopio de luz ultravioleta microscopio de fluorescencia, microscopio de polarización, 
microscopio de contraste de fases y microscopios interferenciales están incluidos en este 
tipo de microscopios. 
Microscopio de contraste de fases. El microscopio de contraste de fases utiliza un haz 
de luz que pasa a través de la muestra que se desvía parcialmente por las diferentes 
densidades o espesores de las células microbianas o las estructuras celulares de la 
muestra; traduce las diferencias en las fases dentro de la muestra en diferencias en las 
intensidades de luz que resultan en contraste entre los objetos dentro de la muestra 
observada. Este método tiene la ventaja de permitir observar microorganismos vivos. Se 
12 
 
usa para identificar hongos de importancia medica aislados en medios de cultivo (Figura 
1.2). 
 
Los rayos de luzque 
salen del ocular viajan 
hacia el ojo 
Ocular 
 
 
 
Placa anular 
de fase en el 
objetivo 
 
 
 
Objetivo 
 
 
 
Luz retardada 
Muestra 
 
 
 
Condensador 
 
 
Diafragma anular 
 
Rayos de luz 
 
Figura 1.2 Microscopio de contraste de fases 
 
Microscopio de fluorescencia. La fluorescencia es un fenómeno físico por el cual ciertas 
moléculas conocidas como fluorocromos emiten luminiscencia tras ser excitadas 
previamente por un haz de luz de una determinada longitud de onda. La microscopía de 
fluorescencia utiliza la fluorescencia para la visualización y el estudio de la localización 
celular de estructuras biológicas que han sido previamente marcadas con fluorocromos 
(Figura 1.3). 
13 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Luz fluorescente 
 
 
 
 
 
 
Luz Exitada 
 
 
 
Filtro Exitado Espejo divisor de 
onda de luz 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Muestra (Contiene 
microorganismos coloreados con 
fluorocromo) 
Figura 1.3 Principio del microscopio de florescencia 
Microscopio de campo oscuro. El microscopio de campo oscuro se fundamenta en el 
efecto de Tyndall, que permite observar partículas casi invisibles bajo una iluminación 
normal que, al ser iluminadas oblicuamente en un ambiente oscuro, reflejan la luz y se 
muestran como objetos o puntos luminosos. 
En este microscopio el condensador no permite que la luz pase directamente a través de la 
muestra, sino que dirige la luz para que golpee la muestra en un ángulo oblicuo. Solo la luz 
que golpea objetos, como los microorganismos, se desviará hacia arriba en la lente del 
 
Fuente de 
luz 
14 
 
objetivo para su visualización. El resto de la luz que atraviesa la muestra perderá el 
objetivo, haciendo que el fondo sea un campo oscuro (figura 1.4). 
 
 
 
 
 
 
Objetivo 
 
 
 
 
 
 
Muestra 
 
 
Condensador 
Platina 
Filtro opaco 
 
 
Filtro de luz de día 
 
Fuente de luz 
 
Figura 1.4 Microscopio de campo oscuro 
Microscopio electrónico. El micoscopio electrónico usa electrones en lugar de luz para 
visualizar objetos pequeños y, en vez de lentes, los electrones son enfocados por campos 
electroagnéticos y forman una imagen en una pantalla fluorescente como una pantalla de 
televisión. Con este microscopio se logra magnificación por encima de 100,000,000X, 
permitiendo observar objetos con tamaño de 0,001µm que no se pueden observar con el 
microscopio óptico, como son los virus o estructuras bacterianas. 
Existen dos tipos de microscopio electrónico, el microscopio electrónico de transmisión 
(TEM), por su siglas en inglés y el microscopio electrónico de barrido (SEM, por su siglas 
en inglés). El primero pasa el haz de electrones a través de los objetos y permite la 
visualización de estructuras internas; la imagen se forma sobre una pantalla fluorescente 
(figura 1.5). El SEM usa los haces de electrones para escanear la superficie de objetos y 
proporciona vistas tridimensionales de estructuras superficiales; no tiene la resolución que 
se alcanza con el TEM pero tiene la ventaja de su excelente impresión tridimensional (figura 
1.6). 
 
Con el uso del microscopio electrónico, se han descubierto muchas nuevas características 
morfológicas de las bacterias y se han descubierto parásitos, hongos y virus. 
15 
 
 
 
Fuente de 
electrones 
 
 
Haz de 
electrones 
 
 
Lente 
condensador 
 
Muestra 
 
 
 
Lente objetivo 
 
 
Lente proyectora 
 
 
 
 
Imagen sobre una pantalla 
fluorescente 
Figura 1.5 Microscopio electrónico de transmisión 
 
 
 
 
Fuente de 
electrones 
 
 
 
 
Haz de 
Lente 
condensador 
electrones 
Deflector de 
electrones 
 
Lente de 
proyección 
Detector 
 
Muestra 
 
Figura 1.6 Microscopio electrónico de Barrido 
Imagen 
En TV 
16 
 
Microscopía digital automatizada. La automatización en microscopía digital utilizando 
software sofisticado y tecnología única permite adquirir imágenes digitales microscópicas 
de las coloraciones de Gram utilizando una interfaz basada en la web. Esta interfaz permite 
que las imágenes que utilizan un microscopio totalmente automatizado se vean en una 
sola pantalla. 
 
Microscopios fotónicos especiales: Permiten la observación de células vivas o muestras 
no coloreadas, con un incremento muy satisfactorio del contraste, en comparación con el 
obtenido con el microscopio común de campo claro. Los microscopios de campo oscuro, 
microscopio de luz ultravioleta y el microscopio de fluorescencia, están incluidos en este 
tipo de microscopios. 
 
Pasos para la observación de muestras en el microscopio compuesto 
Empleo del objetivo de 10x y 40x 
• Colocar el objetivo de menor aumento(4x) en posición de uso y bajar la platina 
 
• Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas. 
 
• Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya en posición) o colocar el de 10x. 
• Para realizar el enfoque, acercar al máximo la lente del objetivo 10x a la preparación, 
empleando el tornillo macrométrico, bajar el condensador y cerrar el diafragma. 
 
• Mirar a través de los oculares, separar lentamente el objetivo de la preparación con 
el tornillo macrométrico hasta observar algo nítida la imagen, girar el micrométrico 
para obtener un enfoque fino. 
 
• Si es necesario, mejore la iluminación de la preparación girando la perilla reguladora 
de intensidad de la luz. 
 
• Mover los oculares lateralmente, para ajustar la visión a su distancia interpupilar. 
 
• Ajustar la visión binocular con el tornillo de dioptrías así: Mirar con el ojo derecho por 
el ocular respectivo, cubrir el ocular izquierdo y enfocar con el tornillo 
micrométrico hasta lograr una imagen nítida. Luego mirar con el ojo izquierdo por el 
ocular izquierdo, cubrir el ocular derecho y enfocar con el anillo de dioptrías hasta 
lograr una imagen nítida. 
17 
 
• Colocar el objetivo de 10x en posición de enfoque girando suavemente el revolver, 
evitar girar por el objetivo para evitar su desajuste, luego aclarar la imagen haciendo 
uso solo del tornillo micrométrico. 
 
• Pasar al objetivo 40x, subir hasta la mitad el condensador y abrir hasta la mitad el 
diafragma, la imagen debe estar casi enfocada y suele ser suficiente con girar un 
poco el tornillo micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar el objetivo se 
pierde por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo anterior 
(10x) y repetir la operación. 
 
Empleo del objetivo de inmersión 100x 
• Después de haber realizado el enfoque inicial con el objetivo de 10x para escoger 
el mejor campo de lectura, girar el revolver dejándolo entre este y el de 100x. 
 
• Abrir completamente el diafragma para ver claramente el circulo de luz que indica 
la zona que se va a visualizar y donde debe echar el aceite de inmersión. 
 
• Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el circulo de luz. 
 
• Terminar de girar suavemente el revolver por el lado del objetivo de 4x hasta la 
posición del objetivo de inmersión 100x. 
 
• Subir el condensador. 
 
• Enfocar cuidadosamente con el tornillo micrométrico, la distancia de trabajo entre el 
objetivo de inmersión y la preparación es mínima por lo que el riesgo de daño de la 
preparación es muy grande. 
 
• Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede 
volver a usar el objetivo de 40x sobre esta zona pues se mancharía de aceite. 
 
• Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el 
objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento se puede retirar 
la preparación de la platina; nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en 
posición de observación. 
 
 
Cuidados del microscopio 
• Al finalizar el trabajo, dejar el objetivo de 4x en posición de observación, asegurarse 
de que la parte mecánica de la platina no sobresale del borde de esta y cubrir con su 
funda. 
18 
 
• Evitar tocar las lentes con las manos; si se requiere limpiarlos utilizarsolo el papel 
y la solución destinada para tal fin. 
 
• Evitar dejar láminas porta objetos sobre la platina en posición de observación. 
 
• Después de utilizar el objetivo de inmersión, limpiar el aceite con papel de arroz o 
paño de óptica con movimiento circular por la lente de adentro hacia afuera y con 
suavidad. Cuando el aceite se ha pegado al objetivo, limpiar con una mezcla de 
alcohol acetona o xilol. La aplicación en exceso de estos disolventes puede dañar 
las lentes. 
 
• No forzar nunca los tornillos giratorios de microscopio (macrométrico, micrométrico, 
platina, revolver y condensador). 
 
• El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a 
la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca de 
objetivo agarrándolo por el tubo de este ni hacerlo mientras se está observando 
a través del ocular. 
 
• Nunca retire la preparación con el objetivo de inmersión en posición de enfoque. 
 
• Encienda la bombilla únicamente en el momento de hacer las observaciones. 
 
• Mantener limpia y seca la platina del microscopio, en caso de derrame algún líquido, 
secar con un paño humedecido con xilol. 
 
• Para transportar el microscopio debe sujetarse siempre con las dos manos por la 
base y la columna o brazo. Nunca tener objetos adicionales en las manos. 
 
• Colocar el microscopio sobre la mesa, situado a 10 o 15 cm del borde. 
 
• Hacer mantenimiento correctivo y preventivo Al momento de apagar definitivamente 
el microscopio: colocar el objetivo de menor aumento en posición de enfoque, 
retirar la muestra, limpiar el objetivo de inmersión con papel especial o paño óptico 
sin frotar el lente, bajar completamente la platina, ubique en “cero” la perilla de 
intensidad de luz, apagar el interruptor de la fuente y desconectar del tomacorriente. 
Dejar enfriar el bombillo. Nunca enrolle el cable sobre el microscopio. 
19 
 
Referencias 
 
Tille P. Diagnostic Microbiology. 13a ed. Brookings: Elsevier Health Sciences; 2013 
 
Rodríguez-Cavallini E, Gamboa-Coronado M, Hernández-Chavarría F, García-Hidalgo JD. 
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Universidad de Costa Rica; 2012. 
 
Ruiz-Ruiz E, Porres-Osante, N. Microbiología clínica. Madrid: Ediciones Paraninfo SA; 2018 
 
Gamazo C, López I, Díaz R. Manual práctico de microbiología. 3ª ed. Barcelona: Masson; 
2005. 
 
Murray PR, Rosental KS y Pfaller MA. Microbiología Medica. 8a edición. Barcelona: Elsevier; 
2017. 
 
Rubio-Granero C, García-García A, Cardona-Serrate F. Técnicas básicas de microbiología 
y bioquímica. Madrid: Editorial síntesis;2017 
 
Gutiérrez-Romero AL, Arellano-Pimentel BE, Gutiérrez-Iglesias C, Escalera-Zúñiga E, 
Romero-Díaz GA, Saucedo-Constantino J etal. Manual de Laboratorio Microbiología 
General I[Internet]. Universidad Nacional Autónoma de México-Facultad de Estudios 
Superiores Zaragoza; 2017. Available from: 
https://www.zaragoza.unam.mx/wpcontent/Portal2015/Licenciaturas/qfb/manuales/ 
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Editorial Médica Panamericana; 2017. 
 
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nacional de Colombia. Sede Palmira;2011. Available from: 
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S. Docencia-Manual de Practicas de Microbiología Básica[Internet]. UAM-Cuajimalpa; 2016. 
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https://www.zaragoza.unam.mx/wpcontent/Portal2015/Licenciaturas/qfb/manuales
https://repositorio.unal.edu.co/bitstream/handle/unal/8391/albertorojastrivino.2011.pdf?sequence=1&isAllowed=y
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20 
 
 
Egas-Ribadeneira D. Microscopía Electrónica: Fundamentos, Teoría y Aplicaciones. 
Disponible en: https://bibdigital.epn.edu.ec/bitstream/15000/10421/3/T1421.pdf 
 
Ubero-Pascal N. Fundamentos Técnicos de la Microscopía Óptica. Disponible en: 
https://www.um.es/innova/OCW/Microscop%C3%ADa-aplicada-a-las-ciencias-forenses/ 
microscopia/material_clase/Sesion_Teorico-02.pdf 
https://bibdigital.epn.edu.ec/bitstream/15000/10421/3/T1421.pdf
https://www.um.es/innova/OCW/Microscop%C3%ADa-aplicada-a-las-ciencias-forenses/microscopia/material_clase/Sesion_Teorico-02.pdf
https://www.um.es/innova/OCW/Microscop%C3%ADa-aplicada-a-las-ciencias-forenses/microscopia/material_clase/Sesion_Teorico-02.pdf
21 
 
 
Capítulo 2. Técnicas para la observación 
microscópica de microorganismos 
 
 
La observación microscópica de los microorganismos proporciona información importante 
para su identificación precoz y definitiva; se hace por medio de métodos como las 
preparaciones en fresco o no coloreadas que permite observarlos vivos, o por medio de 
tinciones biológicas positivas o negativas, que mejoran la imagen a observar. En la tinción 
positiva, un colorante se une a ciertas estructuras bacterianas y en la negativa se utilizan 
compuestos que no penetran en la célula, sino que impregnan el medio circundante y los 
microorganismos aparecen refringentes en un medio negro. Las coloraciones más 
utilizadas en microbiología son las coloraciones o tinciones diferenciales, en las que se usa 
más de un colorante. 
 
Preparaciones en fresco o no coloreadas 
El término en fresco hace referencia a preparaciones o suspensiones de una muestra en 
agua u otro líquido que se colocan entre porta y cubreobjeto. Este procedimiento es la forma 
más simple para observar microorganismos vivos mediante un examen microscópico en el 
que se evidencia su morfología, tamaño, color y movilidad. Existen dos técnicas para su 
realización, la técnica en fresco simple entre porta y cubreobjetos y la técnica en gota 
pendiente entre cubreobjetos y portaobjetos invertido. Las muestras que generalmente se 
observan en fresco son: sedimento urinario, secreción vaginal, exudado uretral, esperma, 
heces, esputo, exudados de lesiones, líquido de aspiraciones, entre otros. 
Técnica en fresco Simple 
 
Procedimiento 
• Colocar una gota de líquido o muestra sobre un portaobjetos. 
 
• Cubrir con un cubreobjetos. Evitar la formación de burbujas (figura 2.2). 
• Observar al microscopio primero con objetivo de 10X y luego con objetivo de 40X 
(figura 2.3). 
22 
 
 
 
Figura 2.1 Frotis de la mucosa bucal 
Figura 2.2 Inmersión del hisopo en Solución 
Salina 
Figura 2.3 Colocación de la muestra y cobertura con cubreobjetos para 
observación al microscopio 
 
Técnica en gota pendiente. 
• Colocar una gota del material en un cubreobjetos (figura 2.4). 
 
• Cubrir con un portaobjetos invertido y con una excavación central (figura 2.5). 
 
• Sellar la preparación con vaselina alrededor de la excavación (figura 2.6). 
 
• Observar al microscopio primero con objetivo de 10X y luego con objetivo de 40X 
(figura 2.6). 
Por el sellado, esta técnica tiene la ventaja de poder ser observada durante un tiempo 
más prolongado. 
23 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2.4 Depósito de muestra en 
cubreobjeto 
 
Porta 
Objeto 
 
Figura 2.5 Posicionamiento de portaobjeto sobre el 
cubreobjeto 
 
 
 
Figura 2.6 Posicionamiento de porta objeto en la platina del 
microscopio para visualización 
 
Examen en fresco para el diagnóstico de parasitosis intestinales. 
Este examen es el más sencillo para la búsqueda y observación de características 
morfológicas de trofozoitos o quistes de protozoos, ooquistes de coccidios intestinales y 
huevos o larvas de helmintos; permite además evidenciar el movimiento de las estructuras 
quelo presentan. 
Procedimiento: 
• Colocar una gota de solución NaCl al 0.85%, en el centro de la mitad derecha de 
un portaobjetos y una gota de lugol en el centro de la mitad izquierda (figura 2.7). 
 
• Con un aplicador obtener aproximadamente 2 mg de la materia fecal y mezclarla 
primero en la gota de solución salina y luego en la gota de lugol (figura 2.8). 
 
• Hacer una suspensión uniforme y retirar los detritos macroscópicos si los hay. 
Vaselina 
Muestra 
Cubre 
objetos 
24 
 
 
• Colocar un cubreobjetos en ambos montajes y hacer la observación microscópica 
inmediatamente con los objetivos 10X y 40X (figura 2.9). 
 
 
Figura 2.7 Gotas de solución salina (S.S) y 
lugol sobre el portaobjetos 
Figura 2.8 Emulsión de la muestra con solución 
salina y lugol 
 
 
Figura 2.9 Cubrimiento de montajes con cubreobjetos para 
observación al microscopio 
 
 
Tinciones o coloraciones 
Los microorganismos poseen un protoplasma con índice de refracción cercano al del agua, 
lo que hace difícil el contraste con el entorno y por consiguiente la visualización detallada 
de sus características morfológicas, haciéndose necesario aplicar tinciones o coloraciones 
para facilitar su identificación. Existe una gran variedad de tinciones, desarrolladas para la 
detección de bacterias, hongos y parásitos. 
 
Los colorantes utilizados en las tinciones son sales compuestas por un ión positivo y un ión 
negativo, uno de los cuales está coloreado y se conoce como cromóforo. El color de los 
colorantes básicos está en el ión positivo y en los ácidos está en el ión negativo. Bajo 
25 
 
condiciones de crecimiento la mayoría de las bacterias tienen un pH interno de 7 y una 
superficie celular cargada negativamente, por lo que atrae el ión positivo coloreado del 
colorante básico. Los colorantes más utilizados son los básicos, entre los que se 
encuentran la violeta de genciana, safranina, verde de malaquita, azul de metileno. Son 
ejemplo de colorantes ácidos la eosina, la fuchina ácida y el rojo Congo, entre otros; se 
utilizan para teñir componentes como las proteínas. 
 
Todas las tinciones se realizan a partir de extensiones o frotis de microorganismos sobre 
un portaobjetos, secadas al aire y posteriormente fijadas; la fijación más utilizada es por 
calor y consiste en pasar el portaobjetos, con la extensión bacteriana seca, a través de la 
llama de un mechero; este método preserva la morfología externa de los microorganismos, 
pero no las estructuras internas. Además, se puede hacer fijación química con agentes 
como etanol, folmaldehido y ácido acético, utilizada cuando se requiere preservar las 
estructuras celulares. Si no se realiza la fijación, los microorganismos en el portaobjetos 
pueden ser arrastrados por el colorante. 
 
A continuación, se describe el fundamento y procedimiento de las coloraciones más 
utilizadas en el laboratorio de microbiología para la observación de muestras con 
microscopía óptica y microscopía de fluorescencia. 
 
Tinción negativa 
Este método es ideal para observar cápsulas de bacterias u hongos Cryptococcus spp. En 
esta coloración no se presenta reacción entre el colorante y las estructuras celulares, por 
lo general se utiliza tinta china o nigrosina, ambos insolubles, los cuales forman una película 
opaca. 
 
Procedimiento. 
• Agregar una gota de nigrosina o de tinta china sobre un portaobjetos (figura 2.10). 
 
• Tomar una porción de la colonia a estudiar y hacer un frotis. Si el montaje es a partir 
de una muestra líquida como líquido cefalorraquídeo, adicionar una gota (figura 
2.11). 
 
• Dejar secar la preparación si es in frotis. Para el montaje a partir de muestra líquida 
colocar un cubreobjetos encima del montaje, evitando la formación de burbujas 
(figura 2.12). 
 
• Observar al microscopio los microorganismos brillantes sobre un fondo oscuro con 
objetivo de 100x. El montaje líquido se debe observar con objetivo de 10x y 40x, con 
el condensador bajo (figura 2.12). 
26 
 
 
 
 
Figura 2.10 Gota de tinta china sobre el 
portaobjetos 
Figura 2.11 Mezcla con la muestra 
 
 
 
 
 
Tinción simple 
Figura 2.12 Mezcla con cubreobjeto dispuesto 
sobre la platina del microscopio 
Es un método muy sencillo y rápido en el cual toda la muestra se tiñe del mismo color 
porque se utiliza un solo colorante; brinda información acerca del tamaño, la forma y el 
tipo de agrupación de los microorganismos. 
Procedimiento. 
• Colocar con el asa de siembra estéril sobre un portaobjetos, una gota de agua 
destilada y una pequeña porción de un cultivo bacteriano. Hacer el frotis, formando 
una película homogénea sobre el portaobjetos con el asa de siembra (figura 2.13). 
Dejar secar. 
 
• Fijar con calor pasando el portaobjetos a través de la llama del mechero (figura 
2.14). 
27 
 
• Cubrir la preparación durante 1 minuto con una película de cualquier colorante 
básico (figura 2.15). 
• Lavar el exceso de colorante con agua (figura 2.16). 
 
• Dejar secar al aire. 
 
• Agregar una gota de aceite de inmersión. Enfocar con objetivo de 10X y luego 
observar con 100X (figura 2.17). 
 
Figura 2.13 Frotis de muestra sobre agua 
destilada 
 
 
 
Figura 2.15 vertimiento del colorante 
Figura 2.14 Fijación de la muestra al calor del 
mechero 
 
 
Figura 2.16 Lavado con agua destilada 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 2.17 Montaje de la placa coloreada para observación al 
microscopio 
Tinciones Diferenciales 
 
La forma más común de utilizar los colorantes en microbiología es en coloraciones o 
tinciones diferenciales, en las que se visualiza más de un color porque usa más de un tipo 
28 
 
de colorante de diferente color y para el caso de las bacterias, permiten distinguir entre 
varios tipos de células bacterianas, que por sus características estructurales, tienen 
comportamientos diferentes a los colorantes. Una tinción diferencial típicamente consiste 
de tres pasos principales: primero un colorante primario, el cual se utiliza para teñir a todas 
las células en la tinción; enseguida un paso de decoloración, el cual remueve el colorante 
solo de ciertos tipos de células y finalmente un colorante de contraste, el cual tiñe las células 
recién decoloradas pero no tiene efecto sobre las células que aún retienen el colorante 
primario. Las dos tinciones diferenciales más empleadas en microbiología son la tinción de 
Gram y la tinción de Ziehl-Neelsen. 
 
Coloración de Gram. 
 
Esta tinción fue desarrollada por el médico danés Christian Gram en 1884, la cual es una 
de las tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifica los cultivos 
bacterianos en menos de 24 horas en Gram positivos y Gram negativos. La tinción de Gram 
se fundamenta en una reacción basada en la cantidad de peptidoglucano presente en las 
paredes celulares de estas bacterias. Las bacterias Gram positivas tienen muchas capas 
de peptidoglucano, las cuales, a su vez, sostienen moléculas de ácido teicoico. El ácido 
teicoico reacciona con el cristal violeta y el yodo utilizado en este proceso de tinción. Un 
complejo de las moléculas cristal violeta-yodo-ácido teicoico es muy difícil de remover. 
Como la pared celular de las células Gram positivas retiene estos compuestos, es más difícil 
decolorar una célula Gram positiva que una Gram negativa. Una mezcla de alcohol remueve 
el cristal violeta de la célula Gram negativa, pero no de la Gram positiva. Esta mezcla de 
alcohol también disuelve mucho la capa exterior de lipopolisacáridos de la pared celular de 
la pared Gram negativa, lo cual acelera la remoción del colorante primario cristal violeta de 
estas células. Cuando otro colorante, usualmente safranina, se añade, las células Gram 
positivas siguen de color azul-violeta mientras que las Gram negativas absorben el color 
rojizo de la safranina. Al final del procedimiento de tinción, las células Gram positivas serán 
del color del cristal violeta, o colorante primario, y lascélulas Gram negativas serán del color 
de la safranina que es el colorante de contraste (figura 2.18). 
29 
 
Gram Positiva Gram Negativa 
Figura 2.18 Cambios en la tinción de la pared celular de las bacterias gramnegativas y 
grampositivas según los pasos de la tinción de Gram 
 
La coloración de Gram es la técnica más empleada en los protocolos rutinarios de 
identificación bacteriana. A excepción de clamidias, micoplasmas, ureaplasmas y 
espiroquetas, todas las bacterias pueden observarse con esta coloración. 
 
Procedimiento 
• Poner sobre un portaobjetos una gota de agua destilada y una pequeña porción del 
cultivo bacteriano con el asa de siembra estéril. Preparar un extendido fino del 
material en estudio y dejarlo secar al aire (figura 2.19). 
 
• Fijar el material al portaobjeto de modo que no sea arrastrado durante el proceso de 
tinción, pasando el porta objeto 3 o 4 veces por la llama de un mechero de Bunsen 
(figura 2.20). 
 
• Colocar el preparado sobre un soporte de tinción y cubrir la superficie con solución 
de cristal violeta por un (1) minuto (figura 2.21). 
Fijación 
Cristal Violeta 
Lugol 
Alcohol Acetona 
Safranina 
30 
 
• Pasado el minuto, lavar el exceso de colorante con agua destilada. Eliminar el 
exceso de agua (figura 2.22). 
 
• Añadir el mordiente lugol, dejar 1 minuto (figura 2.23). 
 
• Lavar el exceso de mordiente con agua (figura 2.24). 
 
• Lavar la preparación con alcohol acetona formando un ángulo con la preparación, 
hasta decolorarla, durante aproximadamente 20 segundos (figura 2.25). 
 
• Lavar con agua destilada y colocar nuevamente el portaobjeto sobre el soporte 
(figura 2.24). 
 
• Cubrir la superficie con Safranina, durante 1 minuto (figura 2.26). Lavar con agua. 
 
• Colocar el preparado en un soporte de tinción en posición vertical, dejando 
escurrir el exceso de agua hasta el secado completo del extendido. 
• Examinar la preparación al microscopio con objetivo de inmersión (100X) (figura 
2.27). 
 
 
 
Figura 2.19 Frotis de muestra sobre agua 
destilada 
Figura 2.20 Fijación del material con el 
mechero 
 
 
 
Figura 2.21 Vertimiento de cristal violeta Figura 2.22 Lavado con agua destilada 
31 
 
 
 
Figura 2.23 Vertimiento de lugol Figura 2.24 Lavado con agua destilada 
 
Figura 2.25 Vertimiento de alcohol cetona Figura 2.26 Vertimiento de safranina 
 
Figura 2.27 Montaje de la placa coloreada en el microscopio 
 
Control de calidad de la coloración de Gram 
 
El objetivo principal del control de calidad de la coloración de Gram es evaluar en primer 
lugar la realización adecuada del proceso de coloración, teniendo en cuenta el protocolo, 
los tiempos de tinción, la calidad y el estado de los colorantes y la organización al momento 
de realizar el procedimiento. Se utilizan dos microorganismos cuyas características 
tintoriales han sido previamente establecidas, con el fin de que el resultado de la coloración 
concuerde con dichas características. 
32 
 
 
Procedimiento. 
• Agregar una gota de solución salina estéril en un portaobjeto limpio, con un asa 
previamente esterilizada tomar una porción de cultivo de S. aureus (coco Gram 
positivo) para depositarla sobre la gota de solución salina. Esterilizar el asa y tomar 
una porción de cultivo de E. coli o Salmonella spp. (bacilos Gram negativos) para 
depositarla sobre la gota de solución salina donde se colocó la anterior bacteria. 
 
• Mezclar suavemente los dos microorganismos, sin tocar los bordes de la placa. Dejar 
secar el frotis a temperatura ambiente. Una vez seco fijar el frotis pasando 3 a 4 
veces sobre la llama del mechero. 
 
• Realizar la coloración de Gram. Dejar secar la placa y observar al microscopio con 
objetivo de 100x. 
 
Debe observarse claramente los cocos Gram positivos de color violeta y los bacilos Gram 
negativos de color rosado – fucsia. 
 
Coloración de Ziehl Neelsen. 
 
Las micobacterias están cubiertas por ácido micólico, un material grueso, ceroso, que 
resiste la tinción; no obstante una vez se tiñen las paredes celulares bacterianas resisten 
a la decoloración por solventes orgánicos fuertes, como el alcohol ácido. 
Consecuentemente dichas bacterias son conocidas como ácido alcohol resistentes, un 
fenómeno descubierto en 1881 por Ziehl Neelsen. Se requiere un tratamiento especial para 
que el colorante primario, la carbolfuscina, penetre en el material ceroso de los bacilos 
resistentes al ácido. En esta técnica se utiliza calor. Una vez que la carbolfuscina se 
deposita en la superficie del extendido, se pasa por debajo del porta objeto, hacia atrás y 
hacia delante de la llama de un mechero. También se puede utilizar un componente que 
permite la penetración de la tinción en la cápsula llamado Tergicol. Las bacterias resistentes 
al ácido, resisten a la decoloración con alcohol ácido y las no resistentes se colorean con 
colorantes de contraste como el azul de metileno o verde de malaquita. 
 
Las bacterias que retienen el colorante carbolfuscina luego de decolorarse con alcohol 
ácido son denominadas Ácido Alcohol Resistentes y se observan al microscopio de color 
rojo o rosado. Habitualmente se utiliza esta coloración para la observación de bacterias 
como Mycobacterium spp, Nocardia spp., Streptomices spp. La técnica de Ziehl Neelsen 
modificada es útil para el estudio de parásitos como Cryptosporidium, Isospora y 
Cyclospora. 
 
Procedimiento 
33 
 
• Hacer un extendido en una lámina porta objetos y dejar secar a temperatura 
ambiente (figura 2.28). 
• Cubrir el extendido con papel filtro y agregue carbolfuscina, calentar la lámina 
pasando la llama de un mechero por debajo hasta el desprendimiento de vapores. 
Si el colorante se empieza a secar, agregar más colorante. Este procedimiento se 
hace por 5 minutos (figura 2.29). 
 
• Descartar el papel con una pinza y lavar la lámina con agua (figura 2.30), cubrir el 
extendido con azul de metileno o verde de malaquita por 1 minuto (figura 2.31). 
 
• Lavar con agua y dejar secar a temperatura ambiente (figura 2.30). 
 
• Observar al microscopio con objetivo de inmersión. Las bacterias ácido alcohol 
resistentes se ven rojas o rosadas y las otras de color azul o verde dependiendo 
del colorante de contraste (figura 2.32). 
 
Figura 2.28 Extendido de muestra Figura 2.29 Vertimiento de carbolfuscina 
mientras la muestra es calentada 
 
Figura 2.30 Lavado de la Muestra con agua 
destilada 
Figura 2.31 Vertimiento de azul de metileno o 
verde malaquita 
 
 
 
Figura 2.32 Montaje de 
la placa coloreada en el 
microscopio 
34 
 
Coloración de Giemsa 
 
Es útil para la coloración de hemoparásitos como Trypanosoma cruzi, Plasmodium spp. y 
microfilarias, diagnóstico de micosis como histoplasmosis, neumocistosis, adiaspiromicosis 
y foliculitis por Malassezia spp. 
 
Procedimiento. 
• Fijar el extendido con metanol por 3 - 5 minutos (figura 2.33). 
 
• Cubrir la preparación con la solución de trabajo por 15 minutos (figura 2.34). 
 
• Retirar el colorante y lavar con agua (figura 2.35). 
 
• Secar la lámina y observar al microscopio con objetivo de inmersión (figura 2.36). 
Figura 2.33 Fijado de la muestra con metanol Figura 2.34 Vertimiento de giemsa 
 
 
 
 
Figura 2.35 Lavado de la muestra con agua 
destilada 
Figura 2.36 Montaje de la placa coloreada en el 
microscopio 
35 
 
Coloración con azul de lactofenol 
 
Esta tinción a pesar de no ser considerada una tinción diferencial, posee características 
tintoriales que permiten observar claramente las estructuras de los hongos para hacer una 
adecuada identificación de las diferentes especies de hongos de interés clínico a partir de 
los cultivos. 
 
Procedimiento 
 
• Colocar una gota de azul de lactofenol sobre un porta objetos. 
 
• Tomar con un asa o estilete una pequeña porción de la colonia o del crecimiento del 
hongo y depositarla sobre el colorante, enseguida disgregarla cuidadosamente con 
la ayuda del estilete(figura 2.37). 
 
• Cubrir la preparación con un cubre objetos y observar al microscopio con objetivos 
de 10X y 40X, el aspecto morfológico de las estructuras fúngicas (figura 2.38). 
 
 
Figura 2.37 Disgregación de la muestra en una 
gota de azul de lactofenol 
Figura 2.38 Montaje de la placa con 
cubreobjeto en el microscopio 
 
 
 
Técnicas de tinción para microscopía de fluorescencia 
 
La microscopía de fluorescencia supera a la microscopía óptica al aumentar el contraste, 
permitiendo visualizar muestras con concentraciones de microorganismos diez veces 
menores a las requeridas en la microscopía óptica. Hay dos tipos de técnicas de tinción por 
fluorescencia, tinciones directas con fluorocromos y tinciones indirectas con 
inmunofluorescencia. 
 
Tinciones Directas. En las tinciones directas existe una unión directa entre el fluorocromo 
y un componente de la célula microbiana. Las más utilizadas son la tinción de 
36 
 
naranja de acridina, la tinción de auramina-rodamina y Calcoflúor blanco con azul de Evans. 
 
El calcoflúor blanco con azul de Evans es un método muy sensible para identificar las 
estructuras micóticas en muestras clínicas, aunque su uso es limitado porque requiere de 
un microscopio de fluorescencia. El calcoflúor es un fluorocromo que se une a polisacáridos 
con enlaces beta 1-3 y beta 1-4, presentes en la pared celular de los hongos. 
 
Tinciones Indirectas. En las tinciones indirectas los colorantes fluorescentes se unen con 
anticuerpos específicos formando conjugados colorante-anticuerpo. Dichos conjugados se 
unirán a antígenos microbianos específicos permitiendo su detección mediante el 
microscopio de fluorescencia. Esta técnica combina el alto contraste de la fluorescencia con 
la alta especificidad de las uniones antígeno- anticuerpo. El fluorocromo más utilizado en 
los laboratorios de Microbiología es isotiocianato de fluoresceína por su estabilidad en 
soluciones acuosas, intensidad y ausencia de interferencia con la reacción inmunológica 
(figura 2.39). 
 
 
 
Figura 2.39 Principios de la técnica con fluorocromos y de la inmunofluorescencia. La técnica con 
fluorocromos (A) incluye la tinción de cualquier célula bacteriana con un colorante fluorescente. La 
inmunofluorescencia (B) utiliza aticuerpos marcados con un colorante fluorescente (es decir, un 
conjugado) para teñir de manera específica una especie bacteriana particular. 
37 
 
Referencias 
 
González de Buitrago JM. Técnicas y Métodos de Laboratorio Clínico. 3 a ed. Barcelona: 
Masson; 2010 
 
Rodríguez-Cavallini E, Gamboa-Coronado M, Hernández-Chavarría F, García-Hidalgo JD. 
Bacteriología General: Principios Y Prácticas de Laboratorio. Costa Rica: Editorial 
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39 
 
 
Capítulo 3. Técnicas básicas para el 
aislamiento de microorganismos 
 
 
 
 
Por su ubicuidad, los microrganismos se encuentran en la naturaleza en diversos ambientes 
y materiales cumpliendo funciones benéficas y perjudiciales. Pueden encontrarse en el 
suelo, el agua, el aire, los alimentos y superficies corporales; por lo tanto, las muestras en 
las que se pueden estudiar los microrganismos van desde especímenes biológicos como 
orina, pus, secreciones hasta muestras de alimentos, agua y suelo, entre otras. 
El estudio de los microorganismos requiere de la aplicación adecuada de las técnicas 
establecidas para el aislamiento en el cultivo y observación de características microscópicas 
y macroscópicas que permiten la identificación y conocimiento de propiedades, cualidades 
y rasgos distintivos. 
Para obtener cultivos puros se hace la siembra o proceso en el que se colocan los 
microrganismos en un medio de cultivo, empleando métodos asépticos, que exigen el 
mantenimiento de un ambiente estéril con el uso del mechero de Bunsen y las cabinas de 
siembra, la esterilización del material de trabajo como asas de siembra, frascos, tubos, 
entre otros. Cuando la siembra se hace de un cultivo microbiano a otra toma el nombre de 
subcultivo o repique. 
A continuación, se revisan algunos de los procedimientos básicos, utilizados de rutina en el 
adecuado procesamiento de muestras en el laboratorio de microbiología. 
 
Procedimientos básicos en el laboratorio de microbiología 
Preparación del área de trabajo 
Para el trabajo en el laboratorio de microbiología se requiere disponer de un ambiente limpio 
y ordenado, por lo que es necesario emplear una buena técnica de asepsia que garantice 
el mantenimiento de la esterilidad de los elementos a utilizar. Por lo general la superficie 
del área de trabajo se desinfecta con una solución de hipoclorito de sodio al 0.5% o 5 g/L 
de cloro libre, aunque también se puede utilizar un compuesto a base de peróxido de 
hidrógeno al 3%. 
El mantenimiento de condiciones mínimas de asepsia exige que todo el material que se 
va a emplear se encuentre estéril, disponible al alcance de la mano para evitar 
40 
 
desplazamientos innecesarios y mantener cerrados los medios de cultivo u otros recipientes 
con microorganismos aislados. 
Las necesidades particulares de la desinfección dependen del tipo de trabajo experimental 
a realizar y de la naturaleza de los agentes infecciosos manipulados. 
Cuando el trabajo se va a realizar en cabinade flujo laminar, se recomienda poner a 
funcionar la cabina entre 15 y 30 minutos antes de iniciar el trabajo y dejarla encendida este 
mismo tiempo después de finalizar. Colocar en el interior de la cabina solo el material 
necesario y de uso inmediato; dividir la superficie de la cabina en tres zonas, una zona 
limpia, una zona de trabajo y una zona de residuos en donde se ubicará un recipiente 
para descartar productos de desechos como muestras, placas, tubos, entre otros. Si se 
requiere introducir material adicional luego de iniciado el trabajo, se recomienda esperar 
dos minutos para reiniciar el trabajo, para que se restablezca el flujo laminar. 
Descontaminar semanalmente la superficie de trabajo y las superficies interiores de la 
cabina con etanol al 70%. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3.1 Materiales utilizados en el aislamiento de microorganismos 
 
 
 
 
 
Esterilización del asa. 
Para utilizar el asa bacteriológica, previamente debe esterilizarse en la llama del mechero, 
calentando el alambre de ferroníquel en toda su extensión incluyendo la base del mango 
hasta que se ponga roja (figura 3.2) o utilizando esterilizadores que funcionan mediante 
rayos infrarrojos 
Espátula de 
Drigalski 
Asa Recta Asa en 
Anillo 
Pipeta 
Pasteur Mechero 
Micropipeta 
41 
 
El flameado o proceso de esterilización por incineración destruye cualquier forma de vida 
sobre la superficie del asa. Al dejar de usar el asa también debe realizar este procedimiento. 
 
 
Figura 3.2 Método de esterilización del asa bacteriológica por incineración. 
 
 
Manejo de los tubos y el asa bacteriológica para hacer siembras o pases 
bacterianos de un tubo a otro. 
Procedimiento. 
• Tomar el tubo con la mano izquierda y quitar la tapa con la mano derecha, flamear 
de inmediato la boca del tubo (figura 3.3). 
 
• Sostener la tapa entre el dedo meñique y la palma de la mano derecha, cerca de la 
llama del mechero; con esta misma mano tomar el asa entre el dedo índice y el 
pulgar (figura 3.4). 
 
• Sembrar la muestra: Volver a flamear la boca del tubo antes de tapar de nuevo para 
evitar la formación de aerosoles o la contaminación del tubo con microrganismos del 
ambiente (figura 3.5). 
 
• Realizar estos procedimientos cerca del mechero. Del correcto manejo de los tubos 
depende el éxito de los cultivos y por consiguiente el resultado de los estudios 
microbiológicos. 
42 
 
 
Figura 3.3 Figura 3.4 
Figura 3.5 
 
Manejo de la caja de Petri. 
Procedimiento. 
• Ubicar la caja de Petri sobre la mesa con el medio de cultivo hacia arriba 
 
• Tomar la caja con la mano izquierda manteniendo la base y la tapa simultáneamente 
y voltear para destaparla con el dedo pulgar de la misma mano, abrir la caja 
parcialmente cerca de la llama del mechero para realizar la respectiva 
 
siembra y cerrar al terminar (figura 3.6). 
Figura 3.6 Apertura de la caja de petri 
43 
 
• La caja se debe marcar antes de llevar a la incubadora con cinta de enmascarar o 
marcador en el borde de la base, para evitar tapar la superficie de los cultivos y hacer 
difícil su observación. 
 
Técnicas de siembra 
Un cultivo puro se define como una población de células todas procedentes de una misma 
célula. Con el uso de diferentes tipos de siembra se obtienen cultivos puros, indispensables 
para la identificación y conocimiento de características morfológicas, bioquímicas y de 
tinción, patogenicidad, sensibilidad a los antibióticos. 
Para efectuar una siembra es fundamental trabajar bajo estricta asepsia, utilizar medios 
de cultivo y materiales estériles, esterilizar los instrumentos utilizados antes y después de 
cada procedimiento, no contaminar ni destruir el inóculo, depositar el inóculo sépticamente 
en el medio de cultivo, trabajar lejos de corriente de aire, usando mechero o en cabina de 
flujo laminar y realizar los procedimientos del protocolo específicos a seguir. 
Tipos de siembra 
Existen diferentes técnicas de siembra, entre las más utilizadas se destacan la siembra por 
agotamiento o siembra por estrías en caja de Petri y en tubo con agar inclinado, siembra 
masiva, siembra por estría sencilla, siembra por picadura en tubo, siembra en profundidad. 
Siembras en caja de petri 
Siembra por agotamiento o por estrías 
El aislamiento de bacterias a partir de muestras biológicas se realiza, en la mayoría de los 
casos, mediante la siembra por agotamiento. Este es un método en donde se da un 
agotamiento progresivo y continuo del inóculo sobre un medio sólido contenido en una caja 
de Petri, con el objetivo de obtener colonias aisladas y así disponer de un cultivo puro o 
axénico o cepa. 
Procedimiento. 
• Esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un mechero y enfriarla en el 
área cercana a este antes de usar (figura 3.2). 
 
• Introducir el asa en la muestra o suspensión bacteriana para tomar el inóculo (figura 
3.4). 
 
• Inocular o sembrar la muestra haciendo 4 o 5 estrías simples muy juntas de lado a lado 
sobre un área pequeña próxima al borde de la caja, luego cerrarla (figura 3.7 y 3.8a). 
44 
 
• Flamear de nuevo el asa y girar la caja de Petri un cuarto de vuelta. Abrir nuevamente la 
caja, tocar la superficie de las estrías recién hechas en un punto alejado del inicio para 
hacer un segundo grupo de estrías como las anteriores y cerrar la caja (figura 
3.8b). 
 
• Girar de nuevo la caja de Petri un cuarto de vuelta. Realizar el mismo procedimiento, 
cerrar la caja (figura 3.8c). 
 
• Hacer un último giro de la caja y sin flamear el asa de siembra hacer una estría más 
abierta (figura 3.8d). 
 
• Incubar las cajas con la base hacia arriba a la temperatura y condiciones óptimas para 
el cultivo procesado. La gran mayoría de las bacterias y levaduras de interés clínico se 
incuban a temperatura de 37°C durante 24-48 horas, los mohos se incuban a 
temperatura ambiente entre 24 y 28°C por 1 a 6 semanas dependiendo el agente 
sospechado. 
 
a) b) c) d) 
Figura 3.8 Siembra por agotamiento 
 
Siembra en superficie 
Figura 3.7 
45 
 
Con este procedimiento se obtiene el crecimiento de colonias en la superficie del agar que 
permite el recuento de microorganismos o recuento de UFC (unidades formadoras de 
colonias); se utiliza este método en el procesamiento de urocultivos y en el control de 
calidad microbiológico de alimentos. 
Procedimiento 
• Depositar en la superficie del medio de cultivo una asada de muestra de orina con 
asa calibrada para el caso de los urocultivos o 0.1 ml de cada dilución seriada del 
alimento a analizar, haciendo una única estría a través del centro de la caja (figura 
3.9a). 
 
• Esparcir el inóculo de manera uniforme en ángulos rectos respecto de la primera 
estría; girar luego 90° la placa y esparcir hasta cubrir toda la superficie del agar. 
También se puede extender la muestra sobre toda la superficie de la placa, usando 
un asa de Drigalski estéril (figura 3.9b). 
 
• Marcar y luego Incubar las placas a la temperatura y tiempo de incubación acorde 
con el cultivo realizado. 
• Evaluar el crecimiento en las placas de agar a través de la observación de colonias 
en la superficie y con base en el número de colonias, la cantidad de muestra 
sembrada y la dilución correspondiente, calcular el número de microorganismos 
viables en la muestra original (figura 3.9c). 
 
a) b) 
 
Asa 
Calibrada 
0.1 mL de 
muestra 
Asa de 
Drigalski 
46 
 
 
 
 
c) 
Figura 3.9 Métodos de siembra de superficie 
 
Siembra en profundidad. 
Este método al igual que la siembra en superficie en placa de agar, permite realizar 
recuento de UFC; consiste en mezclar el inoculo con el agar y durante la incubación las 
colonias crecen en el interior del agar. 
 
Procedimiento 
• Depositar 1 ml de cada dilución en cajas de Petri estériles, vacías. 
 
• Agregar a cada caja de 15 a 20 ml del medio de cultivo a emplear, previamente 
fundido y mantenido a temperatura de 45 – 50ºC.• Para mezclar el inóculo con el agar, agitar moviendo la placa tapada sobre la 
superficie de la mesa con movimientos circulares y de vaivén (siempre sin levantar la 
placa de la mesa). 
 
• Dejar solidificar y llevar las placas a incubar a la temperatura y tiempo de incubación 
acorde con el cultivo realizado. 
 
• Evaluar el crecimiento en las placas de agar a través de la observación de colonias 
en la superficie y con base en el número de colonias, la cantidad de muestra 
sembrada y la dilución correspondiente, calcular el número de microorganismos 
viables en la muestra original. 
 
Medio fundido 
1 mL de 
muestra 
atemperado 
 
 
 
 
 
 
Figura 3.10 Siembra 
Colonia 
Colonia 
por profundidad 
47 
 
Siembra para aislamiento de hongos 
Para el aislamiento de hongos causantes de micosis humanas, se debe introducir un poco 
en el agar la muestra obtenida de la lesión, haciendo uso del asa de punta o estilete o a 
través de incisiones con un bisturí en el medio de cultivo; se recomienda hacer varios 
inóculos separados por una distancia aproximada de 1 cm. Estos cultivos deben sellarse 
con parafilm, o cinta de enmascarar y se rotula con el nombre y la fecha correspondiente. 
Los cultivos se incuban a temperatura ambiente y se invierten las cajas colocando la tapa 
hacia abajo y la base hacia arriba; se revisan cada ocho días sin descartar antes de tres 
semanas o más dependiendo del agente sospechado. Al crecer la colonia se analizan la 
morfología macro y microscópica de ella (figura 3.11). 
 
 
Figura 3.11 Siembra de hongos 
 
Siembra en tubo 
 
Siembra en superficie de agar en tubo inclinado o bisel. 
Este tipo de siembra permite el cultivo de microorganismos aerobios o anaerobios 
facultativos, se utiliza además para almacenar cultivos a temperatura de 4ºC durante 
períodos cortos de tiempo, para la amplificación de un inóculo pequeño y para hacer 
algunas pruebas bioquímicas empleadas para la identificación de microrganismos. 
 
Procedimiento. 
• Tomar el recipiente que contenga la muestra con la mano izquierda, sujetando el asa 
(previamente esterilizada) entre el índice y el pulgar de la mano derecha. 
 
• recolectar con ella una porción de la muestra, seguidamente agarrando el tubo de 
siembra con la mano izquierda, quitar la tapa y sostenerla entre el dedo meñique y 
la palma de la mano derecha. 
Colonia 
48 
 
• flamear de inmediato la boca del tubo (figura 3.13) y esparcir el espécimen en la 
superficie del bisel en forma de zig-zag desde el fondo hasta la parte superior, 
cuidando de no dañar el agar, flamear antes de volver a cerrar el tubo(figura 3.12). 
 
También, para algunas pruebas bioquímicas se puede hacer siembra en este agar de forma 
simultánea en superficie (aerobiosis) y profundidad del agar (anaerobiosis). Para esto, se 
procede de la siguiente forma: 
• Tomar la colonia con asa de punta e introducirla primero por punción hasta el fondo 
del medio (figura 3.14). 
• Retirar el asa por el mismo sitio de entrada y luego sembrar en zigzag en superficie, 
flamear antes de volver a cerrar (figura 3.12). 
 
• Después de incubar en las condiciones apropiadas, se evalúa la presencia de 
crecimiento en el agar por la formación de una película o por el crecimiento de 
colonias en la superficie. Para el caso de pruebas bioquímicas se observará cambio 
de color, precipitados, formación de burbujas, entre otras características. 
 
 
 
Figura 3.12 Siembra en zig zag en tubo de agar inclinado 
 
 
Siembra en medio semisólido. 
Este tipo de siembra se utiliza para la conservación de cepas y en el procesamiento de 
pruebas bioquímicas como SIM-sulfuro indol movilidad. 
Procedimiento. 
• Flamear la boca del tubo en la llama del mechero luego de abrirlo para hacer la 
siembra (figura 3.13). 
49 
 
• Tomar el inoculo e introducirlo con el asa recta hasta el fondo del medio con un 
solo movimiento cuidando de hacer el mismo trayecto de entrada y de salida, flamear 
antes de volver a cerrar (figura 3.14). 
 
• Después de incubar en las condiciones apropiadas, se evalúa el crecimiento en el 
agar por la presencia de turbidez; la movilidad es positiva cuando se observa 
turbidez tanto en el inóculo inicial, como alrededor de este; las bacterias no móviles 
solo se desarrollan en el trayecto del inóculo inicial (figura 3.15). 
 
 
Figura 3.13 Flameado de tubo 
 
 
Figura 3.14 Siembra por punción en medio semisólido Figura 3.15 Evidencia de 
crecimiento con movilidad positiva 
 
Siembra en medio líquido 
La siembra en medio líquido permite aumentar una población microbiana a partir de un 
inoculo inicial, para obtener un elevado número de microorganismos, que por lo general 
serán utilizados en studios o procedimientos posteriores. 
Procedimiento 
50 
 
 
 
e) Crecimiento bacteriano en médio líquido 
Figura 3.16 Siembra en medio líquido 
• Flamear la boca del tubo después de quitar la tapa (figura 3.16a), introducir el asa 
previamente esterilizada y fría, tomar la muestra (figura 3.16b), retirarla del tubo ya 
cargada, manteniéndola siempre cerca del mechero y luego flamear de nuevo la 
boca del tubo antes de cerrarlo (figura 3.16a). 
• Mantener el asa cargada entre el índice y pulgar derechos, tomar el tubo donde va 
a colocar la muestra y retirar la tapa siguiendo el procedimiento del paso anterior, 
flamear la boca del tubo (figura 316.a), colocar la muestra en el medio de cultivo 
rotando con movimientos suaves el asa (figura 3.16d), luego de lo cual la debe retirar 
y flamear de nuevo la boca del tubo antes de cerrarlo (figura 3.16a). Flamear de 
nuevo el asa antes de colocarla en su soporte (figura 3.16c) . Esta siembra puede 
hacerse además con hisopo o pipeta. 
• Después de incubar en las condiciones apropiadas, el crecimiento microbiano se 
interpreta como positivo cuando hay presencia de turbidez, formación de una 
película o velo sobre la superficie o aparición de sedimento en el fondo del tubo, 
entre otros (figura 3.16e). 
a) Flameado del tubo b) Toma de muestra de medio líquido 
 
 
c) Inoculación en medio líquido d) Esterilización del asa 
51 
Referencias 
 
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Martínez-Flores MG, Ortiz de Montellano MG, Flores-Cabrera Y. Manual de Laboratorio 
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