REPLICACIÓN

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REPLICACIÓN
 
La molécula de DNA debe duplicarse para que al dividirse la célula, cada descendiente
reciba la misma información genética; a este proceso se lo conoce como replicación. Las
moléculas hijas se forman por una cadena de la molécula original y una recién sintetizada.
Este mecanismo es semiconservativo y lo demostraron M. Meselson y F. Stahl en 1958.
Para el inicio de la síntesis del DNA, las dos cadenas de una molécula deben separarse y
cada cadena sirve como molde o templado. Las DNA polimerasas (DNA pol) sintetizan las
cadenas complementarias mediante los cuatro desoxinucleósidos trifosfatados (dATP,
dCTP, dGTP y dTTP) y con la energía producida por la liberación de pirofosfato forman los
enlaces fosfodiéster de la molécula en crecimiento.
La replicación del DNA se inicia en una secuencia específica llamada origen de
replicación (oriC en E. coli), a partir de la cual avanza en forma bidireccional y constituye
un replicón. Debido a la enorme cantidad de DNA en el genoma humano existen múltiples
replicones. A partir de cada uno se forma una horquilla, en la cual la replicación prosigue
en forma bidireccional y termina donde se encuentra con la horquilla del siguiente replicón.
La replicación se realiza durante la fase S del ciclo celular y los replicones en la
eucromatina (genes activos) inician antes que los replicones en la heterocromatina (regiones
inactivas). Las secuencias de los orígenes de replicación en eucariontes no están bien
definidas, con excepción de los de la levadura S. cerevisiae denominados ARS
(autonomously replicating sequences). La distribución en el genoma humano de los
orígenes de replicación se asocia con loci específicos localizados las más de las veces en
genes de mantenimiento activos codificantes, como los de la globina β, MYC (v-myc avian
myelocytomatosis viral oncogene homolog) o DNMT1 (DNA methyl-transferase 1), o no
codificantes como los de rRNA. La expresión génica permite establecer dominios en la
cromatina para que se establezcan las condiciones epigenéticas necesarias para determinar
su empleo como orígenes de replicación.
En general, todas las células eucariontes sintetizan una copia precisa de cada uno de sus
cromosomas en cada vuelta del ciclo celular. Esto significa que cada origen de replicación
debe activarse sólo una vez por ciclo y para ello se ensamblan complejos prerreplicativos
o preRC en los orígenes de replicación, los cuales sólo pueden activarse in situ en la fase S.
Estos complejos incluyen un heterohexámero formado por las proteínas ORC1-6 (origin
replication complex 1-6) que se ensambla al final de la fase M y al que se incorporan las
DNA helicasas replicativas al final de la fase G1. El complejo de helicasa es un
heterohexámero formado por seis proteínas relacionadas, denominadas MCM2-7
(minichromosome maintenance 2-7), que requiere otras proteínas para poder unirse al DNA,
como CDT1 (chromatin licensing and DNA replication factor 1) y CDC6 (cell division
cycle 6) que forman parte de los preRC de G1. La activación de MCM2-7 exige, entre otras
proteínas, la cinasa CDC7 (cell division cycle 7) e implica la incorporación de muchos
otros factores en los orígenes de replicación. Se han descrito mutaciones en componentes de
los preRC (ORC1, ORC4, ORC6, CDT1 y CDC6) relacionados con el síndrome de Meier-
Gorlin (MIM 224690), un tipo de enanismo autosómico recesivo con rótula hipoplásica o
nula y orejas muy pequeñas.
La abertura inicial de la doble hélice del DNA hace posible establecer dos horquillas de
replicación con direcciones opuestas en donde pueden actuar las DNA pol. Éstas catalizan
la adición de nuevos nucleótidos al extremo 3’ OH de la cadena en crecimiento, por lo que
en ambas cadenas la síntesis siempre avanza en dirección 5’→3’. La síntesis es continua en
la cadena líder que utiliza como molde a la orientada en la dirección 3’→5’, mientras que
la síntesis es discontinua en la cadena rezagada que usa como templado a la cadena
complementaria 5’→3’. Como resultado de esto, la replicación es un proceso
semidiscontinuo. Los segmentos de DNA sintetizados de forma progresiva durante la
síntesis de la cadena rezagada se llaman fragmentos de Okazaki; en E. coli, éstos abarcan
2 000 a 3 000 nt y en los eucariontes de 100 a 200 nt (figura 2-5).
 
FIGURA
2-5
Horquilla de replicación. Se muestran los complejos proteicos y actividades enzimáticas que actúan para
replicar el DNA humano. El origen de la replicación de este replicón se encuentra a la derecha de la figura
(no se muestra). Cuando los complejos prerreplicativos ORC1-6 atraen al complejo MCM2-7, su actividad
de helicasa abre la doble hélice y la replicación tiene lugar en forma bidireccional en cada horquilla y avanza
en dirección opuesta. FEN1, endonucleasa flap 1; MCM, complejo de mantenimiento de minicromosomas
(helicasa); PCNA, antígeno nuclear de proliferación celular (abrazadera); RFC, factor C de replicación (ancla
de la abrazadera); RPA, proteína A de replicación (proteína de unión a cadena sencilla).
 
 
Existen más de 20 tipos diferentes de DNA pol en las células de mamíferos, la mayoría
utiliza DNA como molde para sintetizar DNA y pertenecen a cuatro familias. La
replicación del DNA nuclear requiere las DNA pol α, δ y ε, en tanto que la DNA pol γ
replica al mtDNA; el resto de estas enzimas participa en procesos de reparación del DNA
(cuadro 2-4). La DNA pol α es la única que posee la capacidad de iniciar una nueva cadena
de DNA, tanto en la cadena líder como en la rezagada; el resto requiere una región de doble
cadena con un extremo 3’-OH libre. La DNA pol α forma parte del complejo
primasa/DNA pol α que se integra con cuatro subunidades: la subunidad B, necesaria para
el ensamblado, dos subunidades pequeñas que confieren la actividad de primasa (RNA pol),
y la subunidad catalítica de DNA pol. El complejo primasa/DNA pol α sintetiza el
cebador, una cadena pequeña de RNA-DNA (20 a 30 nt y 10 nt, respectivamente), que es
necesario para iniciar la replicación de la cadena líder y de cada uno de los fragmentos de
Okazaki de la cadena rezagada. Al complejo primasa/DNA pol α lo preceden el complejo
de helicasa y las proteínas de unión a cadena sencilla o RPA (replicating proteína A) que
mantienen las cadenas del DNA abiertas y forman el primosoma.
La acción de las topoisomerasas facilita el desenrollamiento de la doble hélice para
permitir el avance de la horquilla de replicación. Estas enzimas pueden cortar una sola
cadena del DNA (topoisomerasas I) o doble cadena (topoisomerasas II) para liberar la
tensión generada y evitar el superenrollamiento. Asimismo, las topoisomerasas pueden
aumentar los giros de la doble hélice para crear superenrollamiento. Una vez formados los
cebadores, al primosoma lo reemplazan las enzimas que extienden la cadena, en la cadena
líder actúa la DNA pol ε y en la rezagada la DNA pol δ. Las DNA pol de la familia B,
excepto la alfa y la zeta, pueden remover nucleótidos del extremo 3’, por lo que además
poseen actividad de exonucleasas 3’ →5’, lo que les confiere la capacidad de edición para
eliminar bases mal apareadas y aumentar la fidelidad de la replicación (cuadro 2-4).
 
CUADRO 2–4. Características de las DNA polimerasas humanas
DNA polimerasas dependientes de DNA
DNA polimerasa/gen subunidad
catalítica
Familia Función Otras características
Replicativas
α (alfa)/POLA1 B Inicia la síntesis en los orígenes de replicación y de los fragmentos de
Okazaki en la cadena rezagada
Forma parte del
primosoma
δ (delta)/POLD1 B Síntesis de la cadena rezagada, funciones múltiples en reparación; actúa
en reparación por escisión de nucleótidos
Capacidad de edición,
actividad de exonucleasa
3’→5’
ɛ (épsilon)/POLE B Síntesis de la cadena líder; funciones múltiples en reparación; actúa en
reparación por escisión de nucleótidos y bases
Capacidad de edición,
actividad de exonucleasa
3’→5’
γ (gamma)/POLG A Síntesis y reparación del DNA mitocondrial Capacidad de edición,
actividad de exonucleasa
3’→5’
De reparación
ν (ni)/POLN A Reparaciónde enlaces cruzados entre las cadenas del DNA Propensa a error
θ (teta)/POLQ A Reparación por escisión de bases y reparación de enlaces cruzados
intracatenarios en el DNA
Hipermutación somática
ξ (zeta)/REV3L B Síntesis sobre lesión Propensa a error
β (beta)/POLB X Síntesis en reparación por escisión de bases de parche corto Alta fidelidad en la
reparación
λ (lambda)/POLL X Reparación por escisión de base, roturas de doble cadena y recombinación
de VDJ
Propensas a error
µ (mi)/POLM X 
TDT/DNTT X Recombinación de VDJ Transferasa terminal de
desoxinucleótidos
ƞ (eta)/POLH Y Síntesis sobre lesión Libre de error en dímeros
TT
ι (iota)/POLI Y Síntesis sobre lesión, probable en reparación por escisión de bases y de
bases mal apareadas
Propensa a error; se
requiere en meiosis
κ (kappa)/POLK Y Síntesis sobre lesión, reparación por escisión de nucleótidos Propensa a error
REV1/REV1 Y Síntesis sobre lesión Propensa a error
Primpol/CCD111 AEP Síntesis sobre lesión, resíntesis de cebador después de la lesión Salta la lesión y reinicia
la síntesis con un cebador
nuevo
DNA polimerasas dependientes de RNA (transcriptasas inversas)
Retrotranscriptasas de elementos
LINE-1 o elementos retrovirales
endógenos
De modo ocasional convierten mRNA y otros RNA en
cDNA, los cuales pueden integrarse en cualquier sitio del
genoma
La mayor parte se encuentra silenciada
Telomerasa/TERT Replica el DNA de los extremos de los cromosomas
lineales para evitar su acortamiento
Utiliza un templado interno de RNA/TERC
*Recombinación; VDJ, reordenamientos en genes de inmunoglobulinas; AEP, familia de primasas (archae-eukaryotic primases).
 
 
La DNA pol ε es una enzima con alta eficacia en el proceso de incorporación de
nucleótidos, para lo cual requiere la interacción con otras dos proteína, PCNA
(proliferating cell nuclear antigen, por razones históricas) que forma una abrazadera
deslizante para la polimerasa y RFC (replication factor C) que la fija a la horquilla de
replicación. De manera similar, la DNA pol δ forma también un complejo de elongación
con PCNA y RFC para continuar la síntesis en la cadena rezagada. Cuando el complejo de
elongación encuentra el extremo 5’ de un fragmento de Okazaki (RNA), la síntesis de la
cadena lo desplaza y crea una estructura de tipo alerón (flap) en 5’, sobre la cual actúa la
enzima FEN1 (flap endonuclease-1) y libera la porción de RNA del cebador. La DNA
ligasa I (LIG1), con energía tomada de ATP, forma el enlace fosfodiéster entre el extremo
3’-OH recién sintetizado y el 5’-P generado por el corte (cuadro 2-5).
 
CUADRO 2–5. Funciones requeridas en las horquillas de replicación de E. coli y mamíferos
Función E. coli Mamíferos
Complejos prerreplicativos - ORC1-6
Fijación de la helicasa/primasa DnaC CDT1/CDC6
DNA helicasa DnaB Complejo MCM2-7
Mantenimiento cadena sencilla SSBP RPA
Síntesis del cebador DnaG DNA primasa/pol α
Abrazadera deslizante de la polimerasa β PCNA
Fijación de la abrazadera (ATPasa) Complejo γδ RFC
Síntesis de DNA Núcleo de la DNA pol III DNA pol δ + DNA pol ɛ
Dimerización de la holoenzima τ ?
Remoción del cebador DNA pol I FEN1
Unión de fragmentos DNA ligasa DNA ligasa 1
 
 
Otras helicasas, que pertenecen a la familia RECQ, hacen posible abrir estructuras
complejas que se generan durante la replicación, en particular en la cadena rezagada, como
la helicasa BLM (mutada en el síndrome de Bloom, MIM 210900) y la helicasa WRN
(mutada en el síndrome de Werner, MIM 277700), entre otras. Esta última también
participa en la apertura de los cuartetos de guanina presentes en los telómeros. Las
horquillas de replicación avanzan a lo largo de los cromosomas lineales, por lo general sin
ningún impedimento, y al final la replicación alcanza el extremo de la molécula o encuentra
a una segunda horquilla de replicación que se mueve en dirección opuesta. En eucariontes
no existen secuencias terminadoras homólogas a las de las bacterias, y la terminación
implica el ligamiento de los extremos cuando una horquilla se encuentra con la siguiente en
posiciones al azar.
Una consecuencia de que las DNA pol sólo puedan extender los cebadores en dirección
5’→3’ es que son incapaces de copiar los extremos 5’ de los cromosomas lineales. Este
problema lo resuelve la enzima telomerasa, que extiende la síntesis de la cadena líder. Esta
enzima tiene actividad de transcriptasa reversa y está formada por dos componentes
principales: uno de naturaleza proteica llamado TERT con la actividad de transcriptasa
reversa y otro una molécula de ncRNA denominado TERC, que sirve como plantilla para la
síntesis de novo del hexanucleótido TTAGGG repetido en la secuencia minisatélite
telomérica. En ausencia de actividad de telomerasa, los telómeros se acortan después de
cada ciclo de replicación.
Es importante recordar que en las células eucariontes, el DNA se encuentra en forma de
cromatina, por lo que en realidad la replicación implica la duplicación de esta estructura
durante la fase S del ciclo celular. Los nucleosomas se desplazan al azar hacia una u otra
molécula de DNA durante el avance de la horquilla de replicación y rápidamente se
incorporan histonas recién sintetizadas. Éstas llegan a las moléculas de DNA por la acción
de chaperonas como CAF1 (chromatine assembly 1) y ASF1 (antisilencing function 1), las
cuales interactúan con PCNA y permiten la incorporación de los dímeros de H3 y H4; por
último, la relación con dos dímeros de H2A y H2B mediada por NAP1 (nucleosome
assembly protein 1) completa el ensamblado de los nucleosomas nuevos. Las
modificaciones presentes en las histonas de los nucleosomas de la molécula progenitora se
conservan en las moléculas hijas por acción de las enzimas que generan las modificaciones
postraduccionales en las histonas canónicas recién incoporadas, con lo que se mantiene el
estado epigenético a través de la replicación de la cromatina.