ESTUDIO POR SECUENCIACIÓN AUTOMATIZADA

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El estudio por secuenciación automatizada de varios pacientes o genes grandes
multiexónicos produce una gran cantidad de datos, que deben analizarse a través de
programas bioinformáticos, por ejemplo BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
para comparar las secuencias obtenidas del paciente con las de referencia. Otros programas
de cómputo más sofisticados pueden identificar inmediatamente todas las variantes génicas
patológicas y no patológicas observadas en un estudio de secuenciación a gran escala, tras
conectarse automáticamente con las bases de datos disponibles en línea como dbSNP
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/index.html) o de mutaciones (The Human Gene
Mutation Database, http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php), con lo cual se incrementa la
rapidez del análisis y la certeza de los resultados.
La enfermedad de Fabry (MIM #301500) es un padecimiento ligado al cromosoma X, con
una frecuencia de 1/40 000 a 117 000 varones debido a la deficiencia de la enzima
lisosomal alfa-galactosidasa (GLA), lo que provoca una acumulación progresiva de
glucoesfingolípidos en el endotelio vascular de diversos tejidos. Las manifestaciones
clínicas que producen una alta morbimortalidad son hipertrofia ventricular izquierda,
insuficiencia renal y episodios vasculares cerebrales a temprana edad. Hasta 70% de las
mujeres heterocigotas puede presentar manifestaciones clínicas tan graves como las
observadas en varones, aunque por lo general de aparición más tardía. El diagnóstico de la
enfermedad se determina al cuantificar los grados de actividad de la enzima GLA en los
varones; sin embargo, la actividad enzimática en las mujeres se puede superponer a los
valores normales, por lo que el estudio diagnóstico de primera línea es la secuenciación
automatizada del gen GLA (Xq22). Este gen está constituido por siete exones y las variantes
génicas patológicas que se han identificado son puntuales de sentido erróneo y sin sentido,
que afectan a los sitios donador y aceptor de la remoción de intrones y empalme de exones,
así como microinserciones/microdeleciones, por lo que la técnica de secuenciación
automatizada logra identificarlas hasta en 99% de las mujeres heterocigotas con las formas
típicas y atípicas de la enfermedad de Fabry (figura 3-3). La identificación de un mujer
heterocigota permite ofrecerle asesoramiento genético que incluye definir el seguimiento y
tratamiento médico que requiere, determinar los riesgos de tener descendencia afectada, así
como extender el estudio en la familia para reconocer a otros afectados con expresión
clínica variable, dado que en esta enfermedad, existe un predominio de casos familiares,
puesto que son excepcionales los pacientes originados a través de mutaciones de novo.
 
FIGURA
3-3
Electroferograma parcial del exón 7 del gen GLA (cadena F) en una paciente con enfermedad de Fabry. El
análisis del electroferograma muestra una posición con una base mixta C/T en la posición 1087 del cDNA
(flecha roja) de acuerdo con las secuencias de referencia (NG_007119.1 y NM_000169.2), lo cual indica un
estado heterocigoto para la mutación patogénica de tipo puntual y de sentido erróneo c.1087C>T o p.
(Arg363Cys), genotipo condicionante de la enfermedad.
 
 
La automatización del procedimiento de secuenciación de DNA ha hecho posible que un
genotipo patogénico pueda identificarse en pocas horas, en particular cuando la variante
patogénica se ha caracterizado con anterioridad en una familia, en un individuo afectado o
portador, lo cual permite su aplicación para el diagnóstico prenatal molecular de entidades
mendelianas, tal y como se ilustra con un caso familiar de la mucopolisacaridosis de tipo II
o síndrome de Hunter (figura 3-4).
 
FIGURA
3-4
Diagnóstico prenatal molecular del síndrome de Hunter a través de secuenciación automatizada dirigida del
exón 7 del gen IDS (Xq28). Esta entidad se hereda con un patrón recesivo ligado al cromosoma X. El caso
índice cuenta con diagnóstico clínico, enzimático y molecular. La identificación de la mutación causante del
padecimiento en II-1 se llevó a cabo mediante la amplificación por PCR y subsecuente secuenciación de los
nueve exones que comprenden la secuencia codificante del gen IDS. La comparación del electroferograma
parcial del exón 7 de II-1 con la secuencia normal revela un genotipo hemicigoto para la mutación
c.1003C>T (flechas verdes). Después se llevó a cabo la búsqueda dirigida de esta mutación en I-1 mediante
PCR y secuenciación de sólo el exón 7, ya que es allí donde se ubica la mutación causante. Dicho análisis
reveló un estado heterocigoto (portadora) para la mutación presente en su hijo. La madre solicitó diagnóstico
prenatal después de asesoramiento genético y se estableció a la semana 20 de gestación. La amplificación por
PCR de un fragmento del gen SRY de 270 pb (dato no mostrado) se correlacionó con la fórmula 46,XY de un
cariotipo realizado a partir de un cultivo de amniocitos. Se efectuó de inmediato la secuenciación directa del
exón 7 a partir de una muestra de DNA obtenido de los amniocitos en cultivo. El electroferograma del
producto de la gestación reveló que heredó el mismo genotipo IDS que su hermano afectado. El genotipo
alterado se corroboró en la hebra antisentido del mismo exón (dato no mostrado). El tiempo requerido para el
estudio prenatal molecular fue de sólo dos días. El mismo procedimiento puede realizarse en células
amnióticas o muestras de vellosidades coriónicas sin cultivo, aunque con este material biológico debe
considerarse que existe la posibilidad de falsos positivos o negativos por contaminación con DNA genómico
de origen materno.
 
 
Es importante mencionar que la secuenciación automatizada de tipo Sanger no es capaz de
identificar estados heterocigotos para deleciones y duplicaciones muy grandes (de kilobases
o megabases), como ocurre en el 6 a 8% de los casos con el complejo de esclerosis tuberosa
por deleciones en TSC2 o en >95% de los casos con neuropatía periférica de Charcot-
Marie-Tooth de tipo 1A (MIM #118220) que presentan una duplicación completa del gen
PMP22. Por ello es importante conocer el espectro de mutaciones descritas en el trastorno
mendeliano a diagnosticar en el paciente y reconocer esta limitante de la técnica cuando se
interpretan los resultados para evitar la asignación de un genotipo erróneo y el subsecuente
asesoramiento genético inadecuado. En ciertas enfermedades, un análisis de secuenciación
normal no descarta el diagnóstico clínico y, en caso de existir deleciones o duplicaciones
grandes, éstas deberán caracterizarse mediante otras metodologías moleculares como la
MLPA, descrita a continuación.
 
Amplificación múltiple dependiente de la ligación de sondas o
MLPA
La MLPA (del inglés, multiplex ligation-dependent probe amplification) es una variante de
la PCR en la cual se pueden amplificar diferentes fragmentos de DNA (sondas ligadas) en
una misma reacción mediante un solo par de cebadores y bajo las mismas condiciones de
ciclos de temperatura. Por esta técnica se pueden amplificar regiones génicas cercanas o
adyacentes con la finalidad de determinar con certeza la dosis génica en muestras de DNA
de pacientes con mutaciones como deleciones o duplicaciones grandes en estados
heterocigoto, homocigoto o hemicigoto. En la técnica se recomienda emplear como
controles muestras de DNA con deleciones o duplicaciones génicas grandes ya
caracterizadas, desde un exón hasta varios de ellos o incluso loci contiguos. La capacidad
de amplificar varias sondas en la misma reacción hace posible delimitar con mayor
precisión los puntos de rotura y los sitios génicos de reunión de las deleciones o
duplicaciones, así como la extensión de dichos rearreglos.
En la MLPA es posible el análisis por medio de electroforesis capilar hasta de 45
diferentes sondas ligadas y amplificadas en una sola reacción. Cada secuencia del DNA
blanco, por ejemplo un exón, es reconocida por una sonda conformada por dos mitades,
denominadas extremos o sondas 5’ y 3’. Si existe una complementariedadde las dos sondas
5’ y 3’ con la muestra de DNA en estudio, se forma un enlace fosfodiéster entre ambas
mediante la acción de una ligasa. Los extremos de ambas sondas poseen una secuencia
diseñada en forma artificial que es complementaria de un solo par de oligonucleótidos o
cebadores universales que permiten la amplificación de cada sonda por PCR, siempre y
cuando las sondas 5’ y 3’ se hayan ligado. Los cebadores universales permiten que la
amplificación de las sondas se realice bajo las mismas condiciones de PCR. Las tecnologías
más recientes incluyen un cebador universal marcado con una molécula fluorescente en el
extremo 5’, que posibilita la detección de los amplicones generados por PCR de cada una
de las sondas a través de un análisis de fragmentos por electroforesis capilar en un equipo
de secuenciación automatizada. La distinción entre los diferentes productos de PCR
correspondientes a cada una de las regiones blanco del DNA en estudio se basa en el
tamaño en pares de bases de cada sonda ligada y amplificada, que es diferente dado que
posee una secuencia artificial o stuffer en la sonda 3’ y cuya longitud en nucleótidos varía
para cada sonda. En consecuencia, cada sonda específica de un exón o región génica tiene
un tamaño determinado y es fácil identificarla mediante análisis electroforético (figura 3-5).
 
FIGURA
3-5
Fundamento de la técnica de MLPA. A) Las dos mitades 5’ y 3’ de una sonda contienen una secuencia
nucleotídica para hibridar o unirse con el DNA en estudio del paciente y una secuencia específica para un par
de cebadores universales (X y Y). B) Las sondas 5´y 3´en presencia del DNA desnaturalizado del paciente se
unen a éste por complementariedad. C) Si la secuencia de reconocimiento está presente en el DNA del
paciente las sondas 5´y 3´ quedan adyacentes y pueden unirse por la acción de una ligasa para formar una
sonda única. Esto sucede con cada par de sondas que están incluidas en la técnica. D) Las sondas ligadas son
amplificadas por PCR con el uso de un par de cebadores universales. La distinción entre las diferentes sondas
ligadas y amplificadas se establece a partir de las variaciones en su tamaño, lo cual se determina por la
secuencia artificial o stuffer presente en cada sonda. E) Los productos obtenidos por PCR se analizan por
electroforesis capilar y se comparan con un control normal para determinar si existen deleciones o
duplicaciones en el DNA del paciente.
 
 
La técnica de MLPA puede ser complementaria del estudio de secuenciación para
incrementar la certeza diagnóstica en algunas entidades mendelianas; por ejemplo, en
poblaciones distintas a las de origen askenazí o del norte de Europa la secuenciación
automatizada del gen CFTR causante de la fibrosis quística identifica a cerca de 99% de las
mutaciones, pero <1% de los alelos mutados CFTR corresponde a deleciones grandes que
se identifican por MLPA. Las deleciones de uno o más exones en el gen BRCA1 están
presentes hasta en 20 a 30% de los casos afectados de origen holandés con síndrome de
cáncer de mama y ovario familiar, por lo que este tipo de mutación no se reconoce en la
secuenciación automatizada. Por consiguiente, en pacientes con un resultado de
secuenciación negativo, pero con datos clínicos y genealógicos indicativos de este síndrome
de cáncer familiar, está indicado el estudio de MLPA. La identificación de mujeres
portadoras o heterocigotas para deleciones de uno o más exones en el gen DMD causante de
40 a 60% de los casos con distrofinopatías puede documentarse de manera certera con
MLPA y, de igual forma, las duplicaciones de uno o más exones de este gen y causantes del
6 a 8% de los casos con distrofinopatía pueden reconocerse por la misma técnica tanto en
casos masculinos afectados como en mujeres portadoras.
El complejo de esclerosis tuberosa (CET, MIM #191100 y #613254) es un ejemplo de
patología autosómica dominante cuyo abordaje diagnóstico molecular requiere el uso de
diversas metodologías, como secuenciación automatizada de tipo Sanger, MLPA e incluso
secuenciación de nueva generación para identificar la variante génica patológica. Los genes
causantes TSC1 (9q34.13) y TSC2 (16p13.3) codifican a las proteínas hamartina y tuberina,
respectivamente, las cuales forman un complejo que regula la división celular, entre otros
procesos. En estos genes se observan en el 75 a 85% de los casos variantes génicas
patológicas puntuales, microinserciones o microdeleciones, por lo que para el diagnóstico
molecular la primera opción es la secuenciación automatizada; sin embargo, en un 6 a 8%
de los casos no se identifica la mutación causante por esta técnica y es necesario el uso de
MLPA para el reconocimiento de deleciones o duplicaciones que incluyen más de un exón
de TSC2 (figura 3-6). La utilidad de contar con el genotipo caracterizado en un paciente con
CET es diversa, pero destaca la confirmación diagnóstica, ya que la identificación de una
variante patogénica en TSC1 o TSC2 de acuerdo con las guías de diagnóstico actuales, per
se, es un criterio diagnóstico absoluto, además de que el genotipo puede orientar al
pronóstico clínico del paciente, dado que la mayoría de las veces los individuos con
alteraciones en TSC2 muestran un compromiso neurológico más grave y de presentación
más temprana, en comparación con los que poseen variantes patogénicas en TSC1.
Asimismo, en el CET, puesto que es una entidad con expresividad muy variable, pueden
identificarse mediante el diagnóstico molecular a individuos con expresión mínima, lo cual
permite contar con un diagnóstico preciso en familiares del caso índice e instituir un
asesoramiento genético de certeza, que incluye la explicación de un pronóstico reproductivo
con relación a los riesgos de recurrencia en su descendencia y la posibilidad de ofrecerles la
opción del diagnóstico prenatal.
 
FIGURA
3-6
Identificación de una deleción grande en el gen TSC2 por MLPA en un paciente con diagnóstico clínico del
complejo de esclerosis tuberosa. En este paciente, el primer estudio efectuado fue la secuenciación de Sanger
automatizada de las regiones exónicas de los genes TSC1 y TSC2 sin identificación de la variante patogénica.
Dado que entre 6 y 8% de los casos con el complejo de esclerosis tuberosa presenta deleciones grandes que
incluyen varios exones del gen TSC2, se realizó un análisis de dosis génica por MLPA con sondas dirigidas a
los 43 exones codificantes de este gen. Posterior al análisis de fragmentos de los amplicones y de
compararlos con un individuo control se observó en el DNA del paciente una deleción heterocigota de los
exones 17 a 33 (una copia) de TSC2, lo cual corrobora el diagnóstico clínico y le confiere un mayor riesgo de
presentar un fenotipo clínico grave (cortesía de Miriam Erandi Reyna Fabián y Nancy Leticia Hernández
Martínez, Laboratorio de Biología Molecular, Instituto Nacional de Pediatría).
 
 
El advenimiento de la secuenciación de nueva generación ha permitido mejorar la
identificación de variantes génicas patológicas en pacientes con alteraciones mendelianas;
más aún, algunos autores consideran que debe ser la técnica inicial para establecer el
diagnóstico molecular; no obstante, los autores consideramos que, debido a su costo aún
elevado y a que se requiere personal capacitado para la adecuada interpretación de
resultados, es recomendable indicarla en patologías genéticas que muestran una
heterogeneidad alélica amplia o de locus y considerar todavía las metodologías más
accesibles y rápidas, por ejemplo la secuenciación automatizada y la MLPA, como primera
línea de estudio en entidades mendelianas definidas.