VENTAJAS Y LIMITANTES DE LA SNG

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VENTAJAS Y LIMITANTES DE LA SNG
Las principales ventajas de las tecnologías de SNG son la cantidad de bases nitrogenadas
caracterizadas en cada procedimiento (gigabases a terabases), el tiempo de la reacción y el
costo por nucleótido secuenciado, que se reduce al aumentar el número de muestras para
una misma corrida. Además, esta tecnología tiene la capacidad de identificar cualquier tipo
de variante genómica en un experimento único e incluso puede detectar inversiones génicas,
una clase de variación cuyo estudio es complicado por otras técnicas de análisis genómicos,
como aCGH o CMA.
A pesar que se ha postulado que la SNG reemplazará más adelante a las técnicas como el
aCGH y la amplificación múltiple de sondas ligadas (MLPA) para identificar ganancias o
pérdidas de segmentos génicos o cromosómicos, aún resulta difícil determinar con precisión
a las CNV, translocaciones cromosómicas y aneuploidías, a menos que más adelante se
perfeccionen los métodos de análisis bioinformático.
En cuanto a las lecturas cortas, si bien permiten identificar VNS e indel, es difícil o casi
imposible detectar variantes de secuencias más grandes como los repetidos en tándem
cortos (STR, short tandem repeat), incluidos los causantes de enfermedades genéticas como
el síndrome de X frágil y la enfermedad de Huntington, entre otras.
Otras desventajas a considerar se relacionan con el parámetro de cobertura y profundidad,
ya que si bien dichos parámetros dependen del tipo de plataforma utilizado, las coberturas
de la mayor parte de ellas son menores a las de la secuenciación de Sanger. Asimismo, debe
preverse que la tasa de error de secuenciación, aunque es relativamente baja (0.1 a 1%),
puede conducir a falsos negativos en la asignación de genotipos, por lo que se asume que
variantes génicas de interés diagnóstico deben corroborarse idealmente mediante la
secuenciación automatizada de tipo Sanger.
 
APLICACIONES DE LA SNG EN LA GENÉTICA CLÍNICA
Hasta la fecha existe un gran número de pruebas moleculares que incluyen la secuenciación
masiva en paralelo de un solo gen, un grupo de genes, exoma (región codificante del DNA)
y genoma completo. El cuadro 3-2 muestra algunos ejemplos de enfermedades genéticas
que se pueden estudiar mediante SNG.
 
CUADRO 3–2. Ejemplos de trastornos monogénicos abordados con un estudio molecular de SNG
plataforma
Enfermedad Tipo de estudio /
analizados
# pacientes
analizados
# genes
patogénicas
variantes
% detección de
nuevas
variantes
% Referencia
MiSeq
gen / Illumina
Fibrosis quística SNG de un solo
lactantes
165
238. doi:10.1038/gim.2014.209
1 (CFTR) 100% Ninguna Genetics in Medicine 2015,18(3):231-
neurosensorial
Sordera
Illumina HiSeq
Panel de genes /
individuos
14
doi: 10.1016/j.heares.2016.01.018.
146 100% Ninguna Hearing Research 2016,333:179–184.
retiniana hereditaria
Degeneración
Illumina Miseq
Panel de genes/
individuos
3 familias, 5
doi:10.1038/jhg.2016.83
184 100% 3 Journal of Human Genetics 2016,1–8.
Enfermedades
neuromusculares
primarias
Panel de genes /
Illumina HiSeq
65
individuos
180 34.4% 13 Neuromuscul Disord 2016, 26(1):7-15.
doi: 10.1016/j.nmd.2015.10.003.
 
 
Secuenciación de un solo gen (single-gene testing) por SNG
La secuenciación de un solo gen se justifica cuando las características clínicas y los
resultados de otros estudios de laboratorio de un paciente son indicativos de una
enfermedad genética y cuando se ha demostrado su causalidad por un gen específico. En
estos casos, la sensibilidad de la prueba es muy alta ya que el fenotipo apunta claramente a
una enfermedad que se atribuye a defectos en un gen en particular. La SNG en la distrofia
muscular de Duchenne (DMD) ha permitido identificar >99% de las CNV y 99.99% de las
VNS causantes de la enfermedad. Lo que puede reducir el tiempo y los costos en el proceso
del diagnóstico molecular. Además, la SNG del gen DMD también es aplicable en la
identificación de mujeres portadoras. El estudio de Wang y colaboradores (2014), en el que
se analizaron todos los exones, intrones y regiones promotoras del gen DMD por SNG
(plataforma Illumina HiSeq 2000 con lecturas pareadas de 100pb) en 10 pacientes, permitió
caracterizar el genotipo del 100% de los casos, 50% con VNS y 50% con CNV de tipo
deleciones y duplicaciones, los cuales se confirmaron por MLPA y secuenciación de
Sanger. Además, con el diseño de oligonucleótidos específicos que cubren las regiones de
las deleciones y duplicaciones y mediante secuenciación tipo Sanger se lograron identificar
los puntos de ruptura y reunión (figura 3-12).
 
 
VENTAJAS Y LIMITANTES DE LA SNG
Las principales ventajas de las tecnologías de SNG son la cantidad de bases nitrogenadas
caracterizadas en cada procedimiento (gigabases a terabases), el tiempo de la reacción y el
costo por nucleótido secuenciado, que se reduce al aumentar el número de muestras para
una misma corrida. Además, esta tecnología tiene la capacidad de identificar cualquier tipo
de variante genómica en un experimento único e incluso puede detectar inversiones génicas,
una clase de variación cuyo estudio es complicado por otras técnicas de análisis genómicos,
como aCGH o CMA.
A pesar que se ha postulado que la SNG reemplazará más adelante a las técnicas como el
aCGH y la amplificación múltiple de sondas ligadas (MLPA) para identificar ganancias o
pérdidas de segmentos génicos o cromosómicos, aún resulta difícil determinar con precisión
a las CNV, translocaciones cromosómicas y aneuploidías, a menos que más adelante se
perfeccionen los métodos de análisis bioinformático.
En cuanto a las lecturas cortas, si bien permiten identificar VNS e indel, es difícil o casi
imposible detectar variantes de secuencias más grandes como los repetidos en tándem
cortos (STR, short tandem repeat), incluidos los causantes de enfermedades genéticas como
el síndrome de X frágil y la enfermedad de Huntington, entre otras.
FIGURA
3-12
Distribución de la cobertura de un segmento del cromosoma X que incluye al gen DMD en tres pacientes con
distrofia muscular de Duchenne: paciente 2 sin cambio en la dosis o CNV, paciente 8 con CNV de tipo
deleción, y paciente 22 con CNV de tipo duplicación. A) Gráfica de la cobertura contra posición en el
cromosoma X de las lecturas de tres pacientes (líneas rojas). Una distribución homogénea de las lecturas en
todo el cromosoma X indica que no hay deleciones o duplicaciones (paciente 2), mientras que las regiones
sin cobertura indican una deleción (flecha en el paciente 8) y una alta cobertura en una región señala un
suceso de duplicación (flecha en el paciente 22). B) Identificación precisa por PCR y secuenciación de
Sanger de los puntos de rotura de la deleción en el paciente 8 (tomado y modificado a partir de Chan et al.,
2015).
 
 
Secuenciación de grupos de genes (gene panels) por SNG
En enfermedades cuya causa se atribuye a variantes patogénicas residentes en genes de gran
tamaño, sin una distribución o tipo predominante (heterogeneidad alélica), o bien cuando
existe heterogeneidad de locus, la SNG de un grupo de genes es una herramienta más
accesible y rápida comparada con la secuenciación tipo Sanger. Un ejemplo de ello es el
complejo de esclerosis tuberosa (CET), enfermedad autosómica dominante causada por
variantes patogénicas en los genes supresores de tumor TSC1 y TSC2. Debido a que son
genes de gran tamaño (>40 Kb cada uno) y se han descrito más de 1 500 variantes
patogénicas sin una distribución particular, la SNG es una herramienta que permite el
análisis de los dos genes en varios pacientes en un solo procedimiento y al final a un costo
menor que el de la secuenciación tipo Sanger. Además, hace posible estudiar regiones
intrónicas profundas que por lo general no se analizan con MLPA y secuenciación tipo
Sanger. La figura 3-13 muestra la utilidad de la SNG en la caracterización del genotipo en
dos pacientes con criterios definitivos para CET y a los cuales no se les había identificado
ninguna variante patogénica en TSC1 y TSC2 por técnicas de diagnóstico molecularconvencional.
 
FIGURA
3-13
Análisis por SNG de los genes TSC1 y TSC2 en un caso con diagnóstico clínico definitivo de CET. Caso
índice: paciente masculino con nódulos subependimarios, discapacidad intelectual, angiofibromas faciales,
manchas café con leche y máculas hipomelanóticas. El padre también presenta características clínicas de la
enfermedad por lo que se trata de un caso familiar. A) Visualización de una región del alineamiento de las
lecturas de la SNG (Illumina) que muestra la variante patogénica en TSC1 (NM_000368.1): c.2227C>T,
p.Gln743* (flecha) en estado heterocigoto, la profundidad que se alcanzó en esta posición fue de 942X.B)
Electroferogramas producto de la secuenciación Sanger que confirman el cambio en estado heterocigoto
tanto en el caso índice como en el padre afectado (flechas).
 
 
En enfermedades con heterogeneidad de locus, el número de genes a analizar por paciente
puede alcanzar cientos de ellos, incluidos los causantes de epilepsias infantiles, distrofias
musculares, displasias óseas, miocardiopatías primarias, trastornos mitocondriales, entre
otras. La decisión del tipo y cantidad de genes incluidos en los diversos paneles puede no
seguir lineamientos consensuados y también se requiere un esfuerzo de los genetistas para
establecer suficiente evidencia clínica que delimite los criterios clínicos de los pacientes
sometidos a estos abordajes por SNG, así como el peso específico del resultado obtenido en
la atención del paciente. Para la inclusión de genes en paneles diagnósticos se han sugerido
los siguientes criterios: a) genes que muestren una sólida relación con la enfermedad, b)
genes relacionados con enfermedades que tienen un fenotipo sobrelapado, c) genes
relacionados con enfermedades de una vía o estructura en común y, por último y de forma
opcional, d) genes relacionados con formas sindromáticas del rasgo o enfermedad.
En el caso de enfermedades cardiovasculares existe un ensayo de NGS para el análisis de
~3 000 genes causantes de alteraciones mendelianas (mendeliome assay) dentro de los
cuales se encuentra un panel (31 genes) específico para miocardiopatías. Este panel se
empleó para estudiar a 243 pacientes con miocardiopatía dilatada, cardiopatía congénita,
arritmias o aneurismas aórticos. Los resultados permitieron caracterizar variantes
patogénicas en el 28% de los casos. Esta cifra por número de genes analizados, costo y
tiempo sería impensable de alcanzar mediante la técnica de secuenciación automatizada de
tipo Sanger. Se calcula que la sensibilidad promedio que alcanza la tecnología
“mendelioma” para diversas enfermedades es del 43%, lo que representa un incremento en
comparación con un estudio de exoma (25 a 28%) y su costo también resulta
considerablemente más bajo: 75 a 150 dólares (precio por panel/paciente) contra 1 300
dólares (exoma).
 
Identificación de mosaicos
La SNG permite identificar mosaicos germinales, somáticos y gonosomales (combinación
del somático y germinal) en proporciones menores de 5%, a diferencia de la secuenciación
de Sanger que sólo identifica VNS o indel en proporciones mayores de 10 a 15%. Su
identificación es de gran importancia para la confirmación diagnóstica en pacientes con una
sospecha clínica alta del padecimiento, pero sin genotipo caracterizado por los estudios
moleculares tradicionales y en cuya enfermedad se han identificado mosaicos (figura 3-14).
Es el caso del CET en el cual en ~10 a 15% de los casos con diagnóstico clínico definitivo
no se logra caracterizar el genotipo causante por estudios convencionales; una de las
posibles explicaciones es la presencia de mosaicos. La identificación de estos casos es de
gran importancia para proporcionar un asesoramiento genético y la identificación de casos
únicos o casos familiares.
 
FIGURA A) Estudio en un paciente con hepatopatía y síndrome colestásico de origen indeterminado que incluyó el
3-14 análisis de un grupo de genes relacionados con colestasis (ABCB4, ABCB11, AKR1D1, ATP8B1, JAG1,
SERPINA1 y SLC25A13). El estudio de SNG en el caso índice detectó una variante patogénica en JAG1:
c.1499delG o p.(G500Vfs*64) en estado heterocigoto (43%). El estudio en los padres sin manifestaciones
clínicas reveló la presencia de la variante c.1499delG en mosaico de baja proporción (9%) en la muestra de
sangre de la madre. La proporción de mosaicismo materno determinado por SNG se consiguió mediante el
total de lecturas obtenidas para el alelo mutado*100/total de lecturas obtenidas en esa misma posición. Esta
situación se correlaciona con lo descrito en esta entidad, en la que se prevé que hasta el 8% de los pacientes
puede presentar la variante patogénica en estado de mosaico somático. B) Confirmación por secuenciación
de Sanger de la variante c.1499delG en estado heterocigoto (corrimiento del electroferograma) en el caso
índice; sin embargo, el estado de mosaico en la madre pasa prácticamente inadvertido mediante la misma
metodología, dado que ésta no es capaz de reconocer un mosaico de baja proporción (9%), por lo que la
familia pudo haber recibido un asesoramiento erróneo basado en un trastorno autosómico dominante
originado por una mutación de novo; por su parte, el padre muestra una secuencia normal. Lo anterior ilustra
una utilidad de la SNG en la identificación de mosaicismos gonosomales, cuyo resultado modifica de manera
positiva el asesoramiento genético de este tipo de familias (tomado y modificado a partir de Qin et al., 2016).
 
 
Secuenciación de exoma por SNG
Alrededor de 1 a 2% del total del genoma humano es DNA codificante, lo que representa
más de 20 313 genes (http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/Info/Annotation). En el
estudio de enfermedades en las que se pretende dilucidar la causa genética, y en las cuales
no existen reportes de las vías genéticas alteradas o genes posibles, la resecuenciación de
exoma (RE) es una de las herramientas más usadas, ya que posibilita el descubrimiento de
variantes y genes causantes de enfermedades, tal y como lo ilustró el descubrimiento de la
causa genética del síndrome de Kabuki, bien reconocido en clínica desde 1981. El gen
MLL2 responsable de este síndrome se identificó hasta el año 2010 por secuenciación de
exoma mediante SNG en 10 casos no relacionados. Los resultados permitieron caracterizar
variantes patogénicas en 7/10 casos y posteriormente por secuenciación de Sanger se
detectaron variantes patogénicas en dos de los tres pacientes restantes y en 26 de 43 casos
adicionales, lo cual aportó evidencia suficiente para confirmar la participación de dicho gen
en la etiología del síndrome. Asimismo, un estudio piloto de 12 pacientes con cuadros
clínicos muy indicativos de un trastorno genético subyacente (discapacidad intelectual,
cuadro dismorfológico, sin evidencia de efecto de teratógenos o episodios adversos al
nacimiento, CMA normal), logró identificar el genotipo causante en el 50% de los casos. En
consecuencia, en genética médica, esta herramienta ha resultado muy útil para definir
nuevas entidades sindromáticas y genes etiológicos en pacientes con retraso
psicomotor/discapacidad intelectual, con o sin un cuadro dismorfológico de causa no
establecida y sin anomalías evidentes por aCGH/CMA.
Por otro lado, en estudios de tríos (caso afectado y padres sanos), la RE ha hecho posible
identificar genes relacionados con enfermedades neurológicas, como epilepsia, autismo,
discapacidad intelectual, enfermedad de Parkinson y algunas otras entidades
neurodegenerativas. Desde el punto de vista económico, la RE es una opción racional
aplicable en individuos con una enfermedad genética sin un diagnóstico etiológico.
La RE también se justifica en los casos en los que el fenotipo es indistinto y la causa
subyacente real no es fácil de identificar, como en el caso de los trastornos peroxisomales,
como el síndrome de Zellweger (MIM #214100).
 
Secuenciación de genoma completo por SNG
En teoría, el estudio del genoma completo podría representar una herramienta diagnóstica
más poderosa comparada con la resecuenciacióndel exoma; sin embargo, su uso es
limitado debido a su costo aún elevado y a un conocimiento incompleto de la función de las
variantes encontradas en regiones no codificantes y de las variantes de significado clínico
desconocido. Esta metodología se ha empleado con éxito en algunos casos particulares
como el estudio de 50 pacientes con discapacidad intelectual grave que no tenían
diagnóstico molecular incluso por estudios de resecuenciación de exoma y aCGH/CMA. El
estudio de genoma completo determinó un diagnóstico en 43% de los casos y los
principales hallazgos fueron VNS y CNV de novo en regiones codificantes.
Aun cuando existen patrones simples de herencia en síndromes bien caracterizados, el
espectro mutacional subyacentes puede ser complejo. Un ejemplo de ello es el extenso
grupo de neuropatías hereditarias, las cuales (a excepción de la tipo CMT1A) imponen un
reto diagnóstico en el plano molecular. Uno de los protocolos pioneros de estudio del
genoma completo por SNG lo ilustra una familia con neuropatía hereditaria sometida a
SNG de genoma completo con el que se lograron identificar dos variantes, p.(Arg954*) y p.
(Tyr169His), en el gen SH3TC2 en relación con al menos dos fenotipos de neuropatía
periférica, tanto en heterocigotos (enfermedad de Charcot-Marie-Tooth tipo 4C, MIM
#601596) como en heterocigotos compuestos (fenotipo leve de mononeuropatía del nervio
mediano, MIM# 613353).
 
Aplicaciones de la SNG en el diagnóstico prenatal no invasivo
La SNG también se ha utilizado en estudios prenatales no invasivos para detectar
aberraciones cromosómicas fetales, como las trisomías 21, 13 o 18, síndromes de
microdeleción y aneuploidías de cromosomas sexuales. La aplicación de esta técnica tiene
cada día mayor aceptación, dado que es un método no invasivo basado en el estudio del
DNA fetal libre en sangre materna (cffDNA). Comparado con la prueba combinada de
primer trimestre para establecer un riesgo para trisomía 21 en el feto, el estudio del cffDNA
tiene un valor de detección muy similar (99 vs 95%). Sin embargo, en comparación con el
estudio de tamiz bioquímico del segundo trimestre, el estudio en cffDNA detecta >99% de
los casos con trisomías 21, 18 o 13 respecto de un 55% del tamiz bioquímico. La SNG para
la detección de aneuploidías se basa en la comparación relativa de la cobertura y
alineamiento de las lecturas. El conteo de las lecturas que se alinean en cada cromosoma
permite calcular el número de copias relativo en los cromosomas.
Por lo tanto, en los casos con aneuploidías, el número relativo de lecturas obtenidas del
cromosoma en número alterado (trisomías) se sobrerrepresenta de forma significativa en
relación con las demás lecturas derivadas del resto del genoma.
Las dos limitantes principales del estudio en cffDNA para aplicarlo como un método de
detección universal son los costos aún altos de la prueba y la tasa de fracaso (0.5 a 6%) para
proporcionar un resultado. Esta última se debe en particular a problemas en la recolección y
transportación de la muestra, volumen inadecuado de sangre, hemólisis, identificación
incorrecta de las muestras, retraso en el arribo al laboratorio, una fracción baja de cffDNA
(<4%) que se correlaciona con un índice de masa corporal alto o fallas en la extracción de
DNA, amplificación o secuenciación inadecuadas.