ALGUNAS PRUEBAS DE CITOGENETICA MOLECULAR

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FIGURA
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Cariotipo espectral por M-FISH, coctel de 24 sondas de tinción completa conjugadas con combinaciones y
concentraciones de cinco fluorocromos de manera tal que cada sonda adquiere un espectro diferente;
posterior a la obtención de la imagen de los cinco fluorocromos en la misma metafase y su procesamiento
con software adecuado se observa un color específico para cada par cromosómico. En este cariotipo se
observa la ventaja de la metodología, en una sola hibridación se analizan todos los cromosomas y es posible
conocer el origen de las alteraciones estructurales o translocaciones complejas.
 
 
HIBRIDACIÓN GENÓMICA COMPARATIVA SOBRE
CROMOSOMAS (CGH) Y SOBRE MICROARREGLOS
(aCGH)
El CGH es útil en aquellos casos en donde no fue posible determinar el origen de
marcadores cromosómicos, en muestras con escasa división mitótica o bien, en tumores
sólidos, ya que al utilizar el genoma completo como sonda no son necesarios cultivos
celulares, ni metafases. El CGH detecta ganancias y/o pérdidas de segmentos
cromosómicos de 10 a 20 Mb aunque no detecta alteraciones balanceadas. La resolución del
CGH se aumenta con el análisis sobre microarreglos o aCGH, en donde es posible detectar
alteraciones hasta de menos de 1 Mb, imperceptibles con el CGH sobre cromosomas. Los
aCGH han sido muy útiles en muestras tumorales revelando posibles oncogenes o genes
supresores y en el estudio del genoma completo, dando lugar al establecimiento de la
Citogenómica.
 
FISH EN CÉLULAS EN INTERFASE
El FISH en interfase tiene la gran ventaja de no requerir de células en metafase, sólo es
necesario una suspensión de prácticamente cualquier tipo celular; esto confiere a esta
técnica una capacidad casi ilimitada de posibilidades para estudiar cualquier tejido ya que
se puede aplicar en casos donde la capacidad proliferativa de las células es baja o nula y aún
en tejidos embebidos en parafina o de colección.
 
SONDAS UTILIZADAS EN INTERFASE
El tipo de sondas de DNA que se aplican en células en interfase serán aquellas que cumplan
los requerimientos para un diagnóstico o a la pregunta de investigación. Es importante
señalar que las sondas de tinción completa de los cromosomas son útiles en interfase para
detectar territorios cromosómicos en el núcleo, sin embargo, no son recomendables para
diagnóstico de aneuploidías o alteraciones estructurales. El uso de sondas centroméricas en
interfase ayuda a la detección de aberraciones cromosómicas numéricas y provee
información sobre el número de centrómeros presentes; son de gran utilidad para detectar
aneuploidías y poliploidías para diagnóstico citogenético pre o postnatal (figura 3); su
mayor aplicación ha sido en amniocitos no cultivados para realizar una detección temprana
de embriones aneuploides en diagnóstico prenatal.
 
FIGURA
3
Hibridación in situ con fluorescencia (FISH) en células de descamación de vejiga para la detección de
mosaicismo en un paciente con Síndrome de Down.
 
 
El uso de sondas de FISH de secuencia única en células en interfase ha sido en extremo
útil en la detección de genes de proteínas quiméricas y oncogenes que ayudan en el estudio
de enfermedad residual, pronóstico y diagnóstico para algunos tipos de cáncer, se pueden
usar tanto en células de médula ósea como tumorales prácticamente de cualquier tipo. El
gran éxito de la citogenética de interfase en el campo del cáncer se debe a que, por lo
general, es difícil obtener cromosomas metafásicos de células tumorales y, cuando se
obtienen, no presentan una morfología apropiada para su estudio, aunado a lo anterior, en
algunos casos es necesario estudiar cientos de células para obtener la información que se
requiere, de manera que el estudio de núcleos ha sido muy exitoso en el estudio de cáncer.
Las sondas locus específicas también se pueden utilizar en interfase para la detección de
microdeleciones o microduplicaciones menores a 1Mb y han sido determinantes para el
diagnóstico de algunos síndromes genéticos.
En la actualidad, en el campo de la investigación biomédica se han implementado técnicas
específicas para la detección de aneuploidías en células de mucosa bucal, de orina,
espermatozoides y otros tejidos en los cuales la citogenética de metafase no había podido
ayudar. Un ejemplo muy exitoso ha sido la aplicación del FISH para detectar
espermatozoides aneuploides, asimismo, con sondas centroméricas combinadas con sondas
locus específicas se han desarrollado elegantes metodologías, útiles para la detección de
alteraciones cromosómicas estructurales en interfase (figura 4).
 
FIGURA
4
Ensayo de FISH en interfase X, Y, 18, 21 para la detección de aneuploidías en espermatozoides. Cada una de
las sondas aplicadas se observa en un color diferente. CEP, centrómero; LSI, sondas de secuencia locus
específica.
 
 
ANÁLISIS DE FISH EN INTERFASE
El análisis de FISH en interfase debe seguir criterios específicos, el primero de ellos es
asegurar un 98% de eficiencia en la hibridación con el fin de evitar errores, ya que la
pérdida de señales podría interpretarse como ausencia de un cromosoma o región
cromosómica.
Las células seleccionadas para el análisis no deben presentar núcleos encimados y la
membrana nuclear debe encontrarse lo más íntegra posible, para determinar esto, es
necesario utilizar contraste de fases para asegurar que la célula alterada no está rota, que no
son dos células encimadas o bien, que es el tipo celular en estudio. En cuanto a la
interpretación de la ganancia de cromosomas o regiones cromosómicas, se debe considerar
que, de encontrar señales múltiples de un mismo color, los dominios fluorescentes deben
ser del mismo tamaño e intensidad y deben estar separados por una distancia mayor a la
mitad del diámetro de las señales en estudio. Estos criterios son de gran importancia porque
de ellos depende la veracidad de los datos obtenidos.
Para considerar mosaicismo en células en interfase, no existen valores establecidos ya que
existen pocos trabajos aún; en algunas publicaciones se definen como mosaico aquellas
muestras en las que más del 20% de los núcleos tienen una variación en el número de
señales o siguen un patrón diferente al normal; por otro lado, también se considera como