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ESPECTROSCOPIA DE MASA → mido masa
Es un equipo que produce iones a partir de una muestra y los separa en función de su relación masa-carga
(m/z.). Aporta información sobre:
Composición cuali-cuantitativa de analitos orgánicos e inorgánicos en muestras complejas
Estructuras de especies moleculares complejas
Relaciones isotópicas de los átomos de las muestras
Estructura y composición de superficies sólidas
La MS tiene capacidad de identificación, gran sensibilidad, es una técnica universal y específica, rápida; lo que
mido es la relación masa/carga del analito; se basa en la teoría de que un analito da siempre los mismos
fragmentos
Espectrómetro de masa
Componentes:
✔ Sistema de introducción de muestras: es el sistema de entrada donde se introduce la muestra, con la
mínima pérdida de vacío. La elección del sistema de introducción de muestra depende de la
complejidad y características físico - químicas de las mismas. Puede ser a través de sistemas directos o
previo a un acople a un sistema cromatográfico (G-MS, GPLC-MS, EC-MS, FIA-MS). Si la fuente de
ionización trabaja a presión atmosférica, la introducción de la muestra también puede ser en esas
condiciones, pero el analizador y el detector siempre están a alto vacío.
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✔ Fuente de ionización: se generan iones. La molécula original neutra sufre una ionización (con o sin
fragmentación), de la cual se obtendrán 1) moléculas enteras cargadas (ion molecular) con carga
positiva o negativa; 2) fragmentos cargados (positivos o negativos) o 3) radicales libres (neutros,
cargados). Me va a definir el rango de masas con el que voy a trabajar. La elección entre una u otra se
realiza en función de la muestra y la información que quiera obtenerse del espectro de masa.
✔ Analizador: permiten la llegada de cada ion por separado o selectivamente al detector en función de su
m/z. Se diferencian según el principio por el cual realizan el análisis.
✔ Detector: es un electrodo colector de iones, ubicado a la salida del analizador, que traduce el número
de iones recibidos en intensidad de señal.
✔ Sistema de vacío: aseguro camino libre de colisiones, que no impacten con ninguna molécula, se
neutralicen y pierdan su carga, evitando así, ser detectados.
✔ Procesador de la señal
✔ Dispositivo de lectura o registrador
Variables del equipo: entrada de la muestra (introducción directa u acoplada a otra técnica→ GC, HPLC, EC);
variantes en la cámara de ionización (fase gaseosa, condensada y a p.atm), la separación y la detección
Métodos de ionización
Según el método que usamos para obtener el ion molecular, podemos hacer que este quede con un exceso de
energía interna y que se produzca fragmentación
• Ionización en fase gaseosa: los analitos se encuentran previamente volatilizados, ya sea por aplicación de
altas temperaturas en alto vacío en el puerto de inyección o por acoplamiento de la entrada de la fuente de
ionización a la salida de un cromatógrafo gaseoso. Técnica no útil para analitos termolábiles.
❖ Impacto electrónico (EI): cuando un electrón es acelerado por medio de un campo eléctrico, este
adquiere suficiente energía cinética para capturar un electrón de una molécula si pasa cerca o a través
de su recorrido; esta reacción deja un ion cargado positivamente como catión radical (ion molecular
). Si el electrón acelerado tiene suficiente energía cinética, esta se transfiere a la molécula y queda𝑀•+
vibracionalmente excitada promoviendo su fragmentación. Esto genera iones positivos, negativos o
neutros, los cuales pueden ser radicales. Se pueden analizar iones positivos o negativos. Es un método
de ionización fuerte; produce una fragmentación importante del analito y es poco probable observar el
pico del ion molecular. Los espectros típicos muestran una abundancia relativa importante de
fragmentos de m/z baja y abundancia baja para los de m/z alta. Según la corriente iónica el número de
electrones puede ser mayor (a causa de la alta energía del haz de electrones, dando > ionización, hasta
alcanzar el máximo). Se obtiene información estructural del analito (por fragmentos característicos y
sus abundancias, e isotopos). La cámara se halla en alto vacío para minimizar las colisiones azarosas y
lograr espectros reproducibles y característicos. Solo sirve para moléculas volátiles, analitos de bajo
peso molecular (termoestables). Se puede acoplar a GC, LC; no acepta sales.
❖ Ionización química (CI): se produce por la colisión de un gas reactivo con el analito (ejemplo metano),
dicho gas es generado a través de un haz de electrones acelerados, que produce la ionización de este
gas, generando un catión radical con alta energía, el cual reaccionará con otras moléculas detrás del gas
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transfiriendoles carga y energía cinética, obteniendo
así el gas reactivo. Este gas colisiona con las moléculas
volatilizadas del analito ionizándolas por la
transferencia de un protón, observándose el pico del
ion molecular más H (del gas) . También[𝑀 + 𝐻]+
pueden observarse . El alto vacío es[𝑀 − 𝐻]−
necesario para evitar reacciones intermoleculares. En esta técnica los iones tienen menor tendencia a
fragmentar por lo que se observa al ion molecular en alta abundancia relativa; útil para analitos
termoestables, de bajo peso molecular y volátiles (o derivatizables); me permite determinar pesos
moleculares (por ser una técnica suave). Según el gas reactivo se determina el grado de fragmentación
y que especies presentes se ionizaran y la formación de aductos. Es acoplable a CG, APCI; no acepta
sales.
❖ Ionización por campo (FI): sobre un electrodo se aplica un potencial eléctrico, al estar en contacto una
molécula (M) con dicho electrodo experimentará un campo eléctrico tan intenso (proyectil de
ionización), que el campo eléctrico generado por el movimiento de sus electrones puede deformarse
de tal manera que un electrón de la molécula pasaría a la superficie del electrodo, si el potencial
aplicado es positivo ( ), o un electrón de la superficie a la molécula, si el potencial es negativo𝑀•+ (𝑀•−)
. Por una rendija de enfoque va al analizador (2do electrodo) Dado que no produce fragmentación
(técnica suave) se evidencia en gran abundancia al ion molecular ( o ), rara vez .𝑀•+ 𝑀•− [𝑀 + 𝐻]+
Los analitos son previamente volatilizados. Se utiliza para analitos volátiles y de bajo PM, requiriendo
alto vacío en la cámara de ionización para evitar las colisiones entre moléculas repetidas por el
electrodo. Se utiliza para determinar PM. Acoplable a GC; no acepta sales.
• Desorción / ionización: hay una transferencia de energía de la fuente a la muestra, la cual se halla
depositada en un soporte (en estado sólido o líquido). La energía entregada al analito es la necesaria para
provocar su Desorción del soporte (pasaje al estado gaseoso) y posterior ionización. Son generalmente
métodos suaves, útiles para analitos termolábiles.
❖ Desorción por campo (FD): la muestra se disuelve en un disolvente volátil y se deposita en la punta de
un electrodo y se deja evaporar el solvente. Luego de la generación de un alto campo eléctrico, la
muestra se ioniza desorbiendose de la superficie del electrodo. Con mayor abundancia relativa se
obtiene o , sin observarse fragmentación, en el caso de uso de sales inorgánicas [M + catión .𝑀•+ 𝑀•− ]+
Puede utilizarse para muestras no volátiles y termolábiles, lo que aumenta el rango de PM con el que
se puede trabajar (usado para glúcidos, ácidos nucleicos, sales organicas e inorganicas). Trabaja en alto
vacío y da información de pesos moleculares.
❖ Desorción láser (LD): las fuentes láser producen haces de fotones de alta energía, que al ser focalizados
(se irradia) sobre una pequeña sección de muestra (depositada en un soporte), le transfiere su energía;
la energía interna de la molécula comienza a crecer, así la mayoría de la energía se convierte en energía
cinética y el analito es vaporizado (ablación). Algunas moléculas tienen tanta energía interna que
pierden un electrón ionizándose, así se obtienen iones molecularesde tipo . La sustancia a analizar𝑀•+
debe ser capaz de absorber a la λ de emisión de la fuente láser (desventaja, se soluciono con MALDI).
Utiliza alto vacío; sirve para obtener información de PM y dada la posibilidad de obtener el patrón de
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fragmentación del analito se utiliza en elucidación estructural; útil en la resolución de analitos
complejos de alto peso molecular. (como hueso, cerámicas, rocas, polímeros sintéticos).
❖ Desorción / ionización láser asistida por matriz (MALDI): Es una modificación de LD para evitar la
limitación de tener sustancias que no absorban fotones de la misma longitud de onda que el láser. La
muestra se disuelve en una matriz, la cual poseerá un máximo de absorción de la misma λ de los
fotones emitidos por el láser, ionizando a la muestra. La ionización de la muestra (generalmente por
protonación) genera [M + H , el protón es generalmente cedido por la matriz, la cual suele ser un]+
ácido. El método se generaliza pudiéndose analizar muestras sin importar sus espectros de absorción o
la λ de onda de emisión láser. Posibilita el análisis de moléculas de alto PM (ej. Proteínas, péptidos) y
termolábiles (no volátiles). Utiliza las mismas fuentes láser que LD; la λ del láser suele ser baja, para
que tenga alta energía. Se trabaja en alto vacío; es un método suave, sirve para la investigación de PM;
si se busca la elucidación estructural se utiliza métodos de ionización acoplados ej. EI, CI o un segundo
pulso láser. Hay que tener en cuenta los fragmentos obtenidos para la matriz; requiere analizador
compatible (por rango de masas); dificultad para MS-MS y para compatibilizar LC-MS.
● MATRIZ: deber absorber a la λ del láser, ser compatible con la muestra, ser
químicamente inerte, no debe sublimar, que posea el menor número posible de
aductos, y producir escasa fragmentación.
● CO-MATRICES (aditivos): se agregan a la preparación cuando agrego la muestra a la
matriz, se usan para aumentar la homogeneidad del depósito de matriz/analito; para
aumentar/disminuir la cantidad de fragmentación, los niveles de cationizacion,
producción de iones; para aumentar la reproducibilidad y la resolución. ej.: glutatión
❖ Desorción por plasma (PD): usa como proyectil de ionización, iones pesados.
❖ Bombardeo de átomos acelerados (FAB): utiliza la energía de un átomo acelerado dirigido hacia una
suspensión donde se halla disuelta la muestra para lograr su desorción/ionización [estos átomos son
gases inertes (Ar y Xe)]. El impacto de los mismos poduce un aumento en el movimiento de los
compuestos de la suspensión, liberando iones positivos, negativos o moléculas neutras. La ionización
se produce por transferencia eléctrica debido a la cercanía en que se encuentran el átomo
bombardeante y la muestra. El exceso de energía cinética produce una fragmentación azarosa que
genera en el espectro muchos fragmentos de baja abundancia relativa sin información estructural, por
lo cual solo se usa para la investigación de PM. Se obtienen iones o [M + H o [M + H𝑀•+ 𝑀•− 𝑦 ]+ ]−
(según matriz) así como también [M + MATRIZ (cuando la matriz tiene afinidad por la muestra).]+
Puede utilizarse acoplado a equipos de cromatografía líquida.
❖ Espectrometría de masa por iones segundarios (SIMS): se bombardea a la muestra con iones cargados
(Cs+) y se da un fenómeno similar a FAB. El exceso de energía cinética produce una fragmentación
azarosa que genera en el espectro muchos fragmentos de baja abundancia relativa sin información
estructural. Puede utilizarse acoplado a equipos de cromatografía líquida. Tanto FAB como SIMS se
utilizan en sustancias termolábiles de 100 a 2000 Da como péptidos, carbohidratos y compuestos
organometálicos.
• Ionización por nebulización: una muestra disuelta en un solvente al pasar por un capilar puede ser
nebulizada en finas gotas, que debido a las características de dicho solvente pueden cargarse negativa o
positivamente. Cuando las gotas poseen múltiple carga la evaporación del solvente contenido produce un
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aumento de la densidad de carga de esta, lo que hace que la gota se vuelva inestable por repulsión de las
cargas, produciendo la partición de la gota en varias más pequeñas y más estables.
Los iones del analito se separan de su superficie
pudiendo entrar al analizador para su análisis, estos
iones están generalmente multicagados. Si en el
solvente existen electrolíticos, se facilita la formación
de iones con lo cual aumenta la sensibilidad por el
aumento del número de iones detectados. Trabaja a
presión atmosférica sin la necesidad de calentar la
muestra, posibilitando el análisis de sustancias no
volátiles de medio y alto PM, con mínima o nula
fragmentación. Se usa para elucidación de PM.
❖ Ionización por electrospray (ESI): la muestra disuelta en un solvente pasa por un capilar para lograr la
nebulización; en el extremo de la salida del capilar se aplica un alto potencial (positivo o negativo), lo
que crea un campo eléctrico muy intenso, y el solvente que salga del capilar se dispersará en forma el
spray de finas gotas cargadas. Las gotas se van volviendo más chicas hasta alcanzar un punto de
inestabilidad donde los iones dejan la gota del solvente. Se usa para determinación de altos PM;
posibilidad de acoplamiento a HPLC o EC, lo que permite la resolución de muestras complejas no
purificadas previamente. Se utiliza ampliamente en la actualidad con el fin de investigar los pesos
moleculares de moléculas de gran tamaño como nucleósidos, proteínas, péptidos, polímeros glucídicos,
carbohidratos y otras moléculas polares.
❖ Ionización química a presión atmosférica (APCI): una vez que el spray está formado al salir por el
extremo del capilar, este puede ser bombardeado por un gas reactivo. Símil CI; se obtiene y[𝑀 + 𝐻]+
aductos (modo positivo) y (modo negativo), útil para compuestos termolábiles de no[𝑀 − 𝐻]− 𝑦 𝑂
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muy alto PM y resolver compuestos por cromatografía líquida (HPLC) previamente al análisis de masa;
para compuestos termoestables; extremadamente sensible; útil para determinar PM.
❖ Fotoionización a presión atmosférica (APPI): una vez que el spray está formado al salir por el extremo
del capilar este puede ser bombardeado por haz de fotones mediante un láser. Se obtienen iones
múltiplemente cargados . Símil LD; útil para compuestos termolábiles de alto PM y[𝑀 + 𝑛𝐻]𝑛+
resolver compuestos por cromatografía líquida (HPLC) previamente al análisis de masa; depende la
lámpara puedo aumentar la sensibilidad y la cantidad de analitos a ionizar. Puedo utilizar dopantes
(para ionizar la muestra); Puedo variar la entrada a la fuente (según flujo).
❖ Thermospray (TSP): ingreso desde la columna de HPLC (muestra líquida), luego va a una zona de
nebulización, donde se producen las gotas (cargas concentradas) y la desolvatación de las mismas (por
t°). Luego se enfocan los iones al analizador y por último se usa una bomba de vacío para eliminar las
moléculas neutras o solvente. Se utilizan electrolitos para la ionización (favorece la formación de iones
cargados); poco grado de fragmentación; útil para moléculas pequeñas. Flujo compatible con HPLC;
para compuestos termolábiles; buena sensibilidad; difícil de reproducir y cuantificar; útil para
determinar PM; se puede tener información estructural con un electrodo repulsor; se usan
temperaturas altas y electrolitos.
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Tipo de analizadores
1. Sectores magnéticos (B): Se trata de dos imanes, por entre medio de los cuales pasarán los iones que salen
de la fuente de ionización. Estos imanes modificarán la trayectoria del analito con la cual ingresan al
analizador generando trayectorias circulares con diferentes radios según la relación m/z de estos (esto da
una separación en el espacio). A mayor m/z el radio de giro se incrementa y a menor m/z se acorta. El
enfoque hacia la entrada del detector se produce variando la fuerza de campo magnético aplicado. De esta
manera a determinado campo magnético solo los iones con un radio de curva determinado pasaran al
detector. La variación de campomagnético o voltaje llevará a la separación en el tiempo. Baja resolución.
2. Doble enfoque (B/E): Utilizan una combinación de sector magnético a la salida de la cámara de ionización y
un sector eléctrico (filtro de relaciones m/z determinadas por medio de un barrido de campo eléctrico,
incrementa la resolución) a la salida del anterior. El segundo sector (eléctrico) sirve como filtro de
relaciones m/z determinadas por medio de un barrido de campo eléctrico, de esta manera se incrementa
la resolución del espectro resultante Alta resolución (menor que ion ciclotrón); se puede acoplar a otros
analizadores (BE, TOF, Q) y varias fuentes de ionización Requiere alto vacío para asegurar que los iones no
impacten en el equipo. E equipo es muy grande, ocupa mucho espacio, engorroso de mantener y operar;
permite hacer MS-MS en el tiempo. No es adecuado para MALDI.
Existen dos geometrías según la ubicación del campo, geometría nier-jonson (EB) y geometría inversa (BE).
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3. Cuádruplo (Q): cuatro barras paralelas, cada barra se encuentra enfrentada con la correspondiente del
mismo signo de carga eléctrica (conectados a una fuente). Los iones salientes de la cámara de ionización
describen una trayectoria sinusoidal debido a la aplicación simultánea de campos eléctricos continuos y de
radiofrecuencias. Solo llegaran al detector los iones cuya trayectoria les permita pasar por entre las barras
hasta el detector (según m/z), quedando los otros en el camino por colisión con las barras (siendo atraídos
o repelidos por las mismas), perdiendo su carga, se neutralizan y se pierden. Si voy modificando el
potencial, permito que otros iones lleguen al detector. A mayor velocidad de barrido, más cantidad de
iones vamos a ir detectando. Bajo costo y mantenimiento, pequeño tamaño, rápido análisis (alta velocidad
de barrido) y baja resolución (unitaria, debe haber 1 unidad de masa de diferencia), método robusto, para
analitos de no muy alto PM, requiere alto vacío. Se lo utiliza mucho acoplado GC (también se acopla a IC);
se puede acoplar a otros analizadores (BE, TOF, IT) para hacer MS-MS.
4. Trampa iónica (IT): los iones entran a la trampa por la aplicación de un pulso de potencial electrostático.
Dentro, los iones describen una trayectoria particular según su m/z; Interaccionando con un campo
eléctrico continuo y uno de radiofrecuencias (potencial alterno a los electrodos externos), dando
trayectorias circulares (debido a la disposición en forma de anillo de las barras). Así dependiendo de los
campos aplicados, diferentes m/z pueden mantener una trayectoria circular hasta ser seleccionados para
su detección (eyección secuencial por radios de giro) o chocar contra las barras (dejando de ser
analizables). Se lo utiliza para el análisis de moléculas mayores; permite hacer MS-MS con un solo
analizador (dejando a los iones dentro de la trampa y los puedo hacer colisionar con un gas reactivo dando
fragmentos y analizarlos, en cambio sino debería poner dos cuadropolos en serie para hacer MS.MS). Tiene
más amplitud de análisis que el Q; baja resolución (unitaria); se puede realizar MS-MS en el tiempo. Se
puede acoplar a numerosas fuentes de ionización. Muy sensible; rápida velocidad de escaneo; requiere
vacío. Económico, escaso tamaño, simple de operar; acoplable a GC y CL.
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5. Resonancia ion ciclotrón con transformada de Fourier (FT-ICR): Al introducir un ion en un campo
magnético constante, puede lograrse que este describa una órbita circular (ciclotrón) por medio de la
aplicación de radiofrecuencias (las cuales, tienen varias frecuencias). La órbita depende de la inversa de
m/z. Teniendo los iones atrapados en un espacio cúbico bajo un campo magnético, puede lograrse la
detección de iones según su órbita (si la frecuencia del ciclotrón es igual a la frecuencia del campo
alternante, el ion absorbe energía, aumentando su radio de giro), sin sacarlos de este espacio. La celda
consiste en dos placas opuestas de confinamiento, dos placas opuestas de excitación (radiofrecuencias) y
dos placas opuestas de detección. Cuando los iones en movimiento son excitados por un pulso de
radiofrecuencias, el radio de la trayectoria circular aumenta y todos los iones de una determinada m/z
empiezan a moverse juntos en fase (limitada por tiempo) generando una corriente imagen en las placas de
detección (la señal es alta cuando los iones están cerca de las placas y va disminuyendo). Al apagar el pulso
los iones van a volver a su órbita de giro original. La señal con dominio de tiempo puede ser convertida por
medio de la FT en una señal con dominio de frecuencia y se traduce en el espectro de masa. Requiere
mucho espacio; alta resolución (la más elevada); alta velocidad de escaneo; permite el análisis de
moléculas de alto PM; posibilidad de MS-MS; requiere alto vacío (para que no se vea afectada la
frecuencia de giro del ion).
6. Tiempo de vuelo (TOF): Los iones se separan en función de su tiempo de vuelo en una distancia dada. A la
salida de la fuente de ionización los iones son acelerados por un potencial V, para que todos tengan la
misma energía cinética al entrar al tubo de vuelo y el tiempo que tardan en llegar al detector solo depende
de su m/z. A menor masa (menor m/z) mayor deberá ser su velocidad y más corto el tiempo de vuelo hasta
el detector. Sirve para el análisis de moléculas de alto peso molecular (no tiene límite de masa); mayor
rango de trabajo, por eso se lo acopla a MALDI; alta resolución y MS-MS (requiere acople); requiere alto
vacío. Para mejorar la resolución → aumento el largo del tubo; disminuyo la dispersión de energía.
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Interpretación de un espectro de masas
Contiene información estructural de una molécula, puede representarse en un gráfico de barras donde la
señal mayor se le asigna el valor 100% y se lo denomina pico base, al resto de las señales se las expresa como
porcentajes relativos a este. Los distintos iones aparecen en el valor de su m/z y con una determinada
abundancia. Tipo de iones:
✔ Ion molecular: molécula que perdió o gano un electrón y adquirió una carga positiva o negativa.
Requisitos de Ion molecular: 1) Debe ser el de mayor m/z, 2) debe ser un OE (Odd Electrón) o ser una
molécula neutra con adición de un grupo cargado 3) todas las diferencias de masas que existan entre el
ion molecular y demás fragmentos deben ser químicamente lógicas; Se usa para determinación de
estructura. Su masa es proporcional al peso molecular del analito en estudio; puede no aparecer en el
espectro. El pico del ion molecular puede no aparecer en el espectro, esto va a depender del método de
ionización que se utilice y de la estabilidad de cada molécula en estado ionizado.
✔ Pico base: es el ion más abundante (más estable) y se le asigna el valor de 100% de AR, puede o no
coincidir con el ion molecular
✔ Fragmentos: iones formados por rupturas de uno o más enlaces en la molécula, puede dar iones
cargados, radicales o moléculas neutras. La molécula se fragmenta donde este el enlace químico más
débil; depende de la energía interna del ion (según tipo de ionización) y su estructura.
✔ Reordenamiento: iones formados por rupturas de enlaces y migración de átomos, dando un ion y un
radical.
✔ Doblemente cargados: iones que adquieren 2 cargas, al perder dos electrones (aparecen a la mitad de
su masa)
✔ Iones odd electron (OE): radicales, tiene 1 electrón desapareado (𝑋•+)
✔ Iones even electron (EE): tiene todos sus electrones apareados )(𝑋+
ISOTOPOS → átomos de un mismo elemento con igual número atómico y distinto número másico, en general
el isotopo de menor masa es el más abundante. Es decir, el núcleo de los isótopos tiene igual número de
protones y por lo tanto las mismas propiedades químicas; pero diferente número de neutrones. La proporción
de cada isotopo se puede expresar como % absoluto o % relativo al más abundante (este es el que se utiliza en
masas).
En Espectrometría de Masa se utilizan siempre abundancias porcentuales relativas al isótopo más abundante.
- El espectrómetro de masa discrimina entrelos distintos isótopos de un elemento. Por lo tanto
siempre se utiliza el peso de cada isótopo, y nunca el peso atómico o de tabla periódica, que es un
promedio ponderado por la abundancia natural de cada isótopo.
- Como para cada elemento la proporción de cada isótopo es un valor constante y conocido, el estudio
de las relaciones isotópicas es de gran utilidad para determinar la composición elemental de una
molécula y por lo tanto su fórmula molecular.
- En los espectros de masa aparecen picos a masas mayores que el ión molecular. Estos picos se
atribuyen a iones que tienen la misma fórmula química, pero diferente composición isotópica.
Fragmentación
Una vez formado el ion molecular, la abundancia del mismo, dependerá de la estructura de la propia molécula
y del método de ionización que se utilice. Los iones moleculares de baja energía interna, no sufrirán
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descomposición y aparecerá en el espectro como ion molecular; los de alta energía interna podrán sufrir
posteriormente descomposiciones y dar otros iones y especies neutras. Los picos de fragmentación más
abundantes corresponden a las reacciones que forman los productos más estables, algunos tipos se verán más
favorecido cuando: un heteroatomo (como N, S, O) esté presente (la estabilidad del producto implica la
formación de un enlace con el heteroatomo), por resonancia y por ultimo por la estabilidad del carbocation
formado (3rio>2rio>1rio) y también del radical que se va a formar con más probabilidad el de cadena más larga
(para deslocalizar mejor su electron desapareado).
a) Clivaje sigma: se da en hidrocarburos, involucra la localización de la carga en el enlace sigma; en
hidrocarburos lineales no existe un lugar preferencial de ruptura; en cambio en hidrocarburos
sustituidos, a carga se ubicara según el orden del carbono (3°>2°>1°), ya que el ion carbono más
sustituido es el más estable, por lo cual está más favorecido, junto con el radical alquilo más largo (para
deslocalizar mejor el electrón desapareado).
b) Clivaje alfa (α): cuando hay un heteroátomo en la molécula, la carga y electrón desapareado del ion
molecular se localiza sobre este, se crea así un sitio radical con fuerte tendencia a aparear electrones;
el electrón impar es donando para formar un nuevo enlace con el átomo adyacente y se acompañe por
el clivaje del enlace del átomo en alfa. La tendencia para iniciar la reacción en el sitio radical dependerá
de la tendencia para donar electrones: N > S > O, π, R > Cl, Br >H. Se genera con mayor probabilidad el
radical más largo y el carbocatión más estable (mayor estabilidad).
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c) Clivaje inductivo: con elementos electronegativos la estabilidad del ion formado depende también del
efecto inductivo. La carga se ubica sobre el elemento electronegativo, la iniciación de la reacción de
clivaje comienza con la atracción de un par de electrones. La tendencia para formar R+ a partir de RY
es: Cl>Br, O, S>I>> N, C, H. Este clivaje requiere migración de carga, por lo que está menos favorecido
que el clivaje alfa.
d) Reordenamiento del H-γ (Mc. Lafferty): en moléculas de 4 o 5 átomos y con función insaturada es
probable que se den reordenamientos, mediante intermediarios de 6. El átomo de hidrógeno en
posición gamma con respecto a la función insaturada es transferido por medio de un anillo de 6
átomos. Este estado de transición es estéricamente favorable; luego del reordenamiento se produce el
clivaje en general de tipo alfa, dando un OE y una molécula neutra (olefina)
Fragmentación en aromáticos
a) Ruptura del enlace bencílico correspondiente al grupo alquilo: se obtiene un ion estable capaz de
resonar y convertirse en el catión tropilo (m/z=91)
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b) Ruptura alfa al anillo: se obtiene m/z característico m/z=77
c) Reordenamiento con posterior clivaje:
Acoplamiento de CG con MS (GC/MS)
Permite la identificación de los componentes de una mezcla compleja con alta sensibilidad y especificidad.
1. Volatilización de la muestra: ambas técnicas permiten el análisis de componentes con bajos puntos de
ebullición y estables térmicamente.
2. Sensibilidad: en cromatografía gaseosa es común la inyección de pequeñas cantidades de muestra (Ej. 1
µl de una solución orgánica volátil en una concentración de 1 ppm). La alta sensibilidad de los
espectrómetros de masas permite realizar espectros con cantidades de muestra en el orden de los
nanogramos (ng) e inclusive de femtogramos (fg).
3. Temperatura: El rango de temperaturas de operación de las columnas de GC es similar al de los
sistemas de entrada y fuentes de ionización de MS.
4. Velocidad: los espectrómetros de masas actuales permiten el barrido rápido de los componentes que
van eluyendo de la columna cromatográfica.
5. Obtención del cromatograma: es importante la obtención no sólo del espectro de masas de cada
componente en particular sino también del cromatograma (gráfico de concentración en función del
tiempo de elución) ya que el tiempo de retención de cada componente es un parámetro muy valioso
que contribuye a la identificaciónde los analitos. El espectrómetro de masas puede detectar el total de
iones producidos en la cámara de ionización en función del tiempo (sin discriminar las distintas m/z)
obteniéndose lo que se conoce como cromatograma de iones totales (TIC) y que es similar a un
cromatograma obtenido con los detectores convencionales del cromatógrafo gaseoso.
Problema a solucionar de ambos métodos acoplados -> La muestra en el GC está diluida por el gas portador, y
se debe eliminar antes de la introducción de la muestra en el espectrómetro de masas, esto se hace con un
separador de chorro. Presentación de datos:
▪ Cromatograma de iones totales (TIC): se registra la intensidad de todos los iones en función del tiempo,
bajo límite de detección.
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▪ Cromatograma de uno o más iones seleccionados (SIM): se registran las intensidades de uno o más
iones seleccionados en función del tiempo, gano sensibilidad en detección. Modo SCAN
▪ Espectro de masas: se registran los espectros de masas de los diversos picos cromatográficos donde las
intensidades relativas de los iones se presentan en función de la relación m/z
Se aplica vacío para eliminar molec. livianas. Molec
grandes son el analito que pueden pasar al ionizador. La ionización es después de aplicar vacío.
Análisis cuantitativo: de drogas o sus metabolitos en muestras
biológicas (plasma y orina) con alta sensibilidad (ng/ml), contando con
los estándares internos necesarios. A la muestra se le agrega el o los
estándares internos adecuados y se realiza la extracción del componente
a analizar junto con los estándares (a veces es necesario una
purificación, cc o derivatización de la muestra), luego se pasa la muestra
por un GC-MS. El MS registra los iones en modo SIM (monitoreo
selectivo de iones, en este caso que son característicos del compuesto;
se registra un numero pequeño y el tiempo de registro es mayor para
c/u), esto aumenta la sensibilidad en el orden de los pg; por último se
compara con una curva de calibración y cuantifico. El estándar interno y
el componente a analizar deben tener un comportamiento similar en el
GC-MS ej. de std: isotopo marcado y estable del analito (droga
trideuterada) este tiene unidades de masa que el compuesto natural
Cromatograma:
● Determinación del tiempo de retención de la droga a analizar y del estándar interno, pasando las
drogas patrones por el GC, para la obtención del cromatograma se una el MS.
● Se selecciona los iones a monitorear en el modo SIM, que permitan una buena sensibilidad y
selectividad, por lo que se buscan las m/z con abundancia relativa alta y que sean específicas del
compuesto en estudio.
ION PARA LA CUANTIFICACIÓN → del cual se obtendrá el dato de área o intensidad de pico
(generalmente es el pico base)
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DOS IONES CARACTERÍSTICOS → de la fragmentación del compuesto en estudio, estos tienen una m/z y
AR con respecto al pico base, esto sumado al tiempo de retención del analito en CG hacen que esta
técnica sea altamente específica.
● El estándarinterno se agrega en una cantidad fija tanto a la muestra como a los patrones de calibración
y se procesan, el uso del mismo permite mejorar la precisión de la técnica.
● Se construyen curvas de calibración y se inyecta la muestra, las muestras patrón son inyectadas en el
GC-MS, se hace el registro en modo SIM en función del tiempo; para cada cc se obtiene un pico de la
sustancia en estudio y un pico del estándar interno, se grafica la relación de las aéreas en función de la
cc; posteriormente se inyecta la muestra problema y se determina la relación de aéreas y se interpola
en el grafico
● El uso del modo SIM y específicamente el monitoreo del pico base hacen la alta sensibilidad de la
misma, la alta especificidad está dada por el tiempo de retención cromatográfico y las m/z y AR de los
picos seleccionados.
• Incompatibilidades LC-MS:
HPLC genera flujos de masa,
mayores a los que soporta un MS y
necesito una interface que me
permita reducir el flujo que se
formaría al conectar directamente
una interface de HPLC con un MS.
Solución: aumentar la capacidad de
bombeo (caro), eliminar el solvente,
hacer Split (baja sensibilidad), hacer
Split con enriquecimiento (difícil) →
técnicas API (generación de interfaces para acople) ej. Electrospray, ionización qca a p.atm
• Tanden en el espacio: ionización → espectro de masa 1→ colisión (nuevos fragmentos) → análisis de
fragmentos (MS 2) → detección
• Tanden en tiempo: dentro del mismo analizador, selecciono un ion y eyecto los demás. Luego de la
ionización obtengo el espectro de masa para todos los iones, nos quedamos con 1, lo volvemos a fragmentar y
hago el nuevo análisis de masa
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