1 - Aminoácidos, péptidos y proteínas

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Proteínas: Macromoléculas biológicas polipeptídicas, cuya estructura primaria consiste en
una secuencia lineal de aminoácidos unidos por uniones peptídicas
FUNCIONES DE LAS PROTEÍNAS
● Proteínas estructurales: colágeno, queratina (sostén), elastina
● Proteínas transportadoras: hemoglobina, citocromos
● Proteínas de almacenamiento: ovoalbúmina, caseína
● Proteínas motoras: actina, miosina
● Enzimas
● Hormonas
● Proteínas protectoras: Anticuerpos; cascada de coagulación
● Señalización intracelular: receptores, enzimas
ESTRUCTURA DE LOS AMINOÁCIDOS+CLASIFICACIÓN
Los grupos R de los aminoácidos son los que hacen que éstas difieran entre sí, y sean distintas
propiedades, las cuales las transfieren a la proteína cuya secuencia primaria determinan.
Las distintas propiedades de los aminoácidos hacen que se clasifiquen en=
- NO POLARES ALIFÁTICOS= la Gly, al no tener R sino un H, NO ES ASIMÉTRICO y la Prolina
es el único aminoácido cíclico
Leucina e Isoleucina son isómeros de cadena, por lo que las técnicas de aa como la
espectrometría de masas no pueden diferenciarlos
- AROMÁTICOS (presencia de un benceno en la molécula)= Tirosina, Triptofano y
Fenilalanina⇒ Al tener anillos aromáticos absorben en el UV a 275-280 nm, cosa que a los
demás no.
El Trp absorbe mucho más. La detección de la cc de proteínas que contienen estos tres aa
se efectúa a partir de la Ley de Lambert Beer⇒ Conociendo la absortividad molar de una
proteína particular, se puede determinar su cc por espectrofotometría: A = ε b c
- AMINOÁCIDOS CARGADOS⇒ BÁSICOS Y ÁCIDOS
Aminoácidos básicos= Cargados positivamente a pH fisiológico
Aminoácidos ácidos= Cargados negativamente a pH fisiológico
- AMINOÁCIDOS POLARES SIN CARGA⇒ La serina o la treonina, que poseen grupos OH, al
igual que la Tyr que tiene un fenol, van a ser sustrato de múltiples regulaciones
enzimáticas por fosforilación, acetilación o metilación.
La Cisteína, al tener un SH libre, en condiciones de oxidación puede dar lugar a la
formación, entre los residuos SH, de un PUENTE DISULFURO (postraduccionalmente), que
es un enlace covalente de mucha energía que sirve para estabilizar la estructura
tridimensional de la proteína.
Al encontrarse formando parte de estructuras polipeptídicas, resulta incómodo referir a la
secuencia aminoácidos (que son 20) nombrando cada uno de los aa por su nombre completo⇒
SE USA UN CÓDIGO DE TRES LETRAS, en donde las mismas coinciden con las primeras tres
letras del aa en inglés
PROPIEDADES DE LOS AMINOÁCIDOS: ZWITTERIONES
La presencia de grupos ionizables en la molécula de cualquier aminoácido (sin que tengan en su
R otro grupo ionizable) hace que a pH
fisiológico la carga neta es cercana a 0,
pero NO PORQUE NO ESTÉ CARGADO,
SINO PORQUE LAS CARGAS ESTÁN
COMPENSADAS⇒ Especie zwitteriónica
Es decir que los aa son afectados por el
pH. El momento en que el aminoácido se
encuentra con carga neta 0 por tener sus
cargas compensadas se denomina PUNTO
ISOELÉCTRICO (pI), que está alrededor
de 6,00
Hay aminoácidos que son poco sensibles
al cambio de pH ⇒ SE USAN COMO
BUFFERS
AHORA⇒ ¿Qué pasa en el caso de un aa con grupo R ionizable?
Vamos a seguir teniendo a los grupos α-amino y carboxilo, pero además al grupo ionizable de la
cadena lateral
En el caso de un grupo R ácido⇒ Vamos a tener distintos estadíos de carga= +1; 0; -1; -2
Para estimar el pI, vamos a buscar los dos estadios cercanos a carga neta 0⇒ Esto aparece entre
el pKa del Carboxilo propio del aa y el del COOH de la cadena lateral
En en caso de un grupo R básico⇒ Vamos a tener un grupo ácido y dos básicos⇒ Vamos a tener
un estado +2; +1; 0; -1, y el pI va a ser la medio entre el pKa R y el pKa2
NO VALE LA PENA SABERSE LOS pKa DE LOS aa LIBRES EN SOLUCIÓN PORQUE SIEMPRE
ESTÁN FORMANDO PARTE DE PÉPTIDOS Y LA PRESENCIA DE OTROS aa CERCA SEGURO
AFECTA A ESOS VALORES TABULADOS
PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS
Los péptidos son las estructuras que se forman por unión a través del ENLACE PEPTÍDICO entre
dos o más aminoácidos.
La formación del enlace peptídico es una CONDENSACIÓN (reacción en donde se pierde una
molécula neutra pequeña, en este caso agua), que se da entre el grupo COOH de un aa y el
α-NH2 de otro=
- Los péptidos se nombran DESDE EL N TERMINAL (aa con su grupoα-NH2 libre) HACIA EL
C TERMINAL (aa con su grupo Carboxilo libre), y se escriben de izquierda a derecha de la
misma forma en que se nombran
- Los péptidos y las proteínas (polipéptidos) tienen nombres de fantasía, a veces remitidos
a su función
- Según la cantidad de residuos (aa), se los denomina de distinta forma (esto es a modo de
orientación, hay excepciones)=
2 < PÉPTIDO < 4-5 < OLIGOPÉPTIDO < 10 < POLIPÉPTIDO < 50 < PROTEÍNA
- En una secuencia de aminoácidos, las uniones peptídicas marcan el ESQUELETO
PEPTÍDICO
- TITULACIÓN DE PÉPTIDOS⇒ Vamos a tener un COOH y un NH2 sí o sí como grupos
ionizables, y luego en las cadenas laterales tenemos que ver si tenemos extras. Por
ejemplo, en el
tetrapéptido
Ala-Glu-Gly-Lys
tenemos el amino
terminal del Ala, el
Carboxilo
terminal de la
Lys, el carboxilo
en gamma del
glutámico y el
amino en epsilon
de la Lys. Para
determinar la
carga neta que
tendrán a
distintos pH, se
construye el
cuadro de la
derecha.
CUADRO COMPLETO=
El pI sería 7????
NIVELES DE ORGANIZACIÓN DE LAS PROTEÍNAS
1) Estructura primaria= Secuencia lineal de aminoácidos de la proteína
2) Estructural secundaria= Ordenamiento local de la cadena
3) Estructura terciaria= Disposición tridimensional espacial (plegado de la proteína)
4) Estructura cuaternaria (en aquellas que se agrupan en subunidades)
SECUENCIA DE AMINOÁCIDOS DETERMINA ESTRUCTURA (forma que adopta), Y ÉSTA
DETERMINA FUNCIÓN. Es por esto que hay posibilidades de que el cambio de un solo aa
provoque modificaciones en la función
ESTRUCTURA PRIMARIA⇒ Secuencia u orden en que están dispuestos los aminoácidos
- Cada proteína tiene una secuencia ÚNICA ⇒ IDENTIDAD, que incluso se ve ENTRE
ESPECIES (ej.: homología del 84% en la mioglobina de cachalote y humano, insulina
humana vs porcina que cambia en un sólo aa)
- Los aa que se incorporan a las proteínas están codificados en los genes de todo nuestro
organismo
- La forma científica de encontrar la posición exacta de un aminoácido es a partir de una
tabla=
- La diversidad estructural y funcional las proteínas está dada por las distintas cadenas
laterales (y ello está relacionado a la secuencia lineal, estructura primaria)
- Entrecruzamientos de la cadena lineal por formación de PUENTES DISULFURO, los cuales=
➢ Ocurren por oxidación de pares de cisteínas
➢ Adoptan una conformación no plana e imponen restricciones a la estructura
proteica Aportan gran estabilidad a la estructura
➢ Pueden ser inter o intramoleculares (inter o intracatenarios)
Para conocer la estructura primaria de un proteína , es necesario conocer su codificación
por el ADN (secuenciación del DNA), PERO TAMBIÉN la secuenciación de proteínas, ya que
la misma permite analizar modificaciones post transcripcionales
ANÁLISIS DE LA COMPOSICIÓN DE AMINOÁCIDOS
Para conocer qué aminoácidos componen una proteína, se necesitan romper los enlaces
peptídicos, los cuales son muy estables, de manera que se necesitan condiciones muy drásticas
para lograrlo⇒ HCl 6N, 110°, 24 hs
El problema de esta hidrólisis es que muchos aa se degradan como, por ejemplo, el Trp, que
posee un indol que es afectado en condiciones de acidez. Por otro lado, la Gln y la Asn sufren
hidrólisis de sus grupos amida del R.
IDENTIDAD PROTEICA
Cuando analizamos la identidad de una proteína y comparamos entre especies, vamos a tener un
cierto grado de homología que generalmente no es del 100%, lo cual está dado por=
➢ Sustituciones conservadoras= Cambios de aminoácido que suponen una variante
de secuencia que conserva la naturaleza de la cadena debido a darse entre aa que
son muy parecidos. Ej.: Asp x Glu, Asn x Gln, o Ile x Leu.
➢ Sustituciones no conservadoras= Cambios de aminoácido que suponen una
variante de secuencia que no conserva la naturaleza dela cadena por no presentar
similitud entre ellos. Puede o no afectar la función.
TIPOS DE MUTACIONES O CAMBIOS QUE AFECTAN LA SECUENCIA CODIFICANTE
SECUENCIAS CONSENSO⇒ Aminoácidos (o bases) más frecuentes encontrados una posición
determinada luego de comparar varias secuencias (referencia).
Conocer las secuencias consenso es muy relevante para ver homología entre distintas isoformas
de una misma proteína, que cumplan funciones similares, ej.: familia de los citocromos. Aquella
secuencia que no se vea modificada en X lugar será la determinante de la función de la familia ya
que no cambia entre las distintas isoformas=
HOMOLOGÍA DE SECUENCIA⇒ Es un concepto similar a la identidad de secuencia pero suele ser
aplicado en el ámbito del estudio filogénetico u evolutivo⇒ Se construyen árboles filogenéticos a
partir de variaciones en proteínas de distintas especies.
Cuanto más parecidas sean las secuencias de las proteínas de dos especies, más relacionadas
filogenéticamente estarán.
Las proteínas homólogas presentan similitudes en secuencia de aa y estructura 3D; comparten
características estructurales y funcionales
SECUENCIACIÓN DE PROTEÍNAS
La estrategia para secuenciar proteínas requiere de una serie de pasos secuenciales=
1) Purificación proteica= Obtención de la proteína de interés PURA
2) Determinación de la cantidad de cadenas que posee ⇒ Si hay más de una, deben ser
separadas
3) Desnaturalización = Ruptura de la estructura tridimensional
4) Ruptura de los puentes -S-S- y bloquear los SH que se forman como consecuencia para
que no vuelvan a unirse
5) Determinación de la composición de aminoácidos de la cadena peptídica
6) Determinar los residuos amino y carboxilo terminal de cada cadena
7) Determinar de la secuencia de aminoácidos por reacción de Edman (hidrólisis secuencial
del aa a partir del amino terminal, alrededor de 30 aa), proteólisis específicas,
ordenamiento de los fragmentos y superposición
8) Localización los puentes disulfuro
1) Purificación de proteínas= Los procedimientos que se efectúan para separar y aislar una
proteína se van a basar en las diferencias en las propiedades fisicoquímicas=
● Solubilidad (precipitación por salado)
● Tamaño (diálisis, ultracentrifugación, cromatografía de exclusión molecular,
SDS-PAGE)
● Carga eléctrica (intercambio iónico, electroforesis)
● Polaridad (cromatografía en fase reversa, de adsorción)
● Afinidad de unión (cromatografía de afinidad)
2) Determinación de la cantidad de cadenas que posee (información obtenida del seminario)=
Se efectúa a partir de la comparación entre el PM total de la proteína, determinado por la
espectrometría de masas en condiciones nativas (un pico de X Daltons o kDaltons), y la
cromatografía de exclusión molecular (CEM) en condiciones disociantes (en donde se
pueden obtener distintos picos, que, comparándolos con lo anterior, nos van permitir
sacar una conclusión). En el cuadro a continuación, un pico de 120000 Da es el resultado de
la EM en condiciones nativas, el resto son las posibilidades en la CEM=
Un pico 120000 Da Un pico de 60000 Da Dos picos de ≠ PM
Un pico 120000 Da
(la proteína pesa en
total 120000 Da)
Proteína con una
sola cadena
Proteína con dos
cadenas iguales
(c/u pesa 60000 Da)
Proteína con dos
cadenas distintas
(c/u tiene distinto
PM)
3) Desnaturalización= Implica la pérdida de la estructura secundaria y terciaria, pero no la
estructura primaria, ya que se rompen uniones débiles (no se rompen ni los enlaces
peptídicos ni los puentes disulfuro, sino las uniones H, electrostáticas, hidrofóbicas y
fuerzas de Van der Waals) ⇒ La proteína pierde su estructura y, por lo tanto, su actividad
La desnaturalización se logra gracias al uso de AGENTES DESNATURALIZANTES (ácidos y
bases, solventes orgánicos, calor, detergentes, urea y cloruro de guanidinio)
● Proteína en condiciones nativas ⇒ Plegada
● Proteína desnaturalizada ⇒ Desplegada. Cuando hablamos de un % de
desnaturalización, el mismo no refiere a que la proteína esté parcialmente
desnaturalizada, sino a que algunas proteínas lo están y otras no.
(Los pasos 4-6 no los explica)*
7) Determinación de la estructura de aminoácidos por reacción de Edman= Es una reacción
que permite secuenciar péptidos debido a que se produce una reacción con el amino
terminal que provoca su separación de todo el resto de la cadena. Es distinta a otros
métodos de determinación del N terminal ya que éstos implican la hidrólisis total de la
proteína, no se puede secuenciar.
Solapamiento de péptidos= Se necesitan tener fragmentos cortos, para lo cual es de gran
ayuda usar más de un reactivo para efectuar cortes en los enlaces peptídicos, que sean
reactivos específicos (digestión enzimática), por separado.
Una vez que se tienen esos fragmentos, se van armando por superposición, por ver en
dónde se solapan.
Otra forma de secuenciar es utilizar ESPECTROMETRÍA DE MASAS=
* Paso 4: En el caso de las reducciones, usamos determinados agentes como el
beta-mercaptoetanol o el DTT (ditiotreitol), que reducen y dejan los grupos sulfhidrilo
libres. Éstos, al ser muy reactivos, pueden volver a formarse, por lo cual hay que
bloquearlos con agentes bloqueantes, que se unen covalentemente los sulfhidrilos para
que éstos no puedan volver a oxidarse a puentes disulfuro (ej.: ácido yodoacético,
yodoacetamida).
Paso 5: Hidrólisis exhaustiva con HCl 6 N, 110°, 24h
Paso 6: Residuo carboxilo terminal se puede determinar con Hidrazinolisis, mientras que
el amino puede determinarse a partir de la reacción con el reactivo de Sanger, o mismo la
reacción de Edman=
SÍNTESIS QUÍMICA DE PÉPTIDOS
Por síntesis química obtenemos péptidos pero no proteínas⇒ AHÍ TENEMOS QUE RECURRIR A
LAS SÍNTESIS BIOLÓGICAS
Para poder efectuar una síntesis de péptidos, tengo que controlar muy bien todas las
condiciones, debido a la reactividad de los grupos amino y carboxilo de cada molécula, lo cual
podría dar lugar a múltiples combinaciones de orden de secuencia.
¿Qué se hace entonces?
1. Deben poder añadirse los aminoácidos de a uno
2. Los aminoácidos deben activarse de algún modo para favorecer la reacción
3. Para evitar reacciones secundarias, deben bloquearse todos los grupos reactivos distintos
del amino y carboxilo que formarán el enlace peptídico
Síntesis química de péptidos⇒ Síntesis en fase sólida
1) Vamos a tener una base sólida en donde un primer aminoácido se va a unir POR SU
CARBOXILO TERMINAL (el amino va a estar protegido), de manera que ese carboxilo
queda anclado al soporte sólido y no puede reaccionar para hacer un enlace peptídico, de
forma que la síntesis es DE C TERMINAL A N TERMINAL (por lo cual, al final de la síntesis,
el primer aa que yo metí va a terminar siendo el último), a diferencia de la biológica.
2) Hay que desproteger al amino para que pueda reaccionar con el carboxilo del siguiente aa
3) El siguiente aa, que va a tener su amino protegido y SU CARBOXILO PREVIAMENTE
ACTIVADO CON
UN REACTIVO DE
ACOPLAMIENTO
(ej.: DCC), se
coloca y forma el
enlace peptídico
en el primer aa
Se van repitiendo los
pasos 2 y 3
sucesivamente hasta
obtener la secuencia del
péptido deseado, y ahí
lo último que se hace es
separarlo del soporte
sólido.
UTILIDAD= Hormonas
cortas, anticuerpos,
medicamentos, arreglos
de proteínas.