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Regulación de la expresión génica Sabemos que de todos los genes solo una fracción se expresa a la vez, ya que algunas vías metabólicas pueden ser necesarias solo un tiempo u otras sobre una determinada situación si hay o no disponibilidad de ciertos nutrientes. Otras vías van a estar activas durante toda la vida del organismo. También se sabe que algunos productos son necesarios en grandes cantidades e incluso pueden ser específicos de una sola línea celular por ejemplo la rubisco, la proteína de las células fotosintéticas o la hemoglobina en el eritrocito mientras que otros productos pueden ser requeridos en muy poca cantidad por célula. Entonces todas las células poseen los mismos genes, pero como hacen para que se exprese diferentes? El concepto de EXPRESION DE REGULACION GÉNICA es diferente del concepto REGULACION GÉNICA. La expresión génica es la conversión de las instrucciones genéticas del ADN hacia el ARN y las proteínas, por lo tanto, la regulación de la expresión génica involucra los procesos desde el gen hasta la proteína, en cambio la regulación génica solo se habla de lo que ocurre en la transcripción (activación o inactivación de un gen). Hay regulaciones similares que existen en procariotas y eucariotas y otras regulaciones que existen en uno, pero no en otro. ¿Por qué? En el caso de los procariotas la transcripción y la traducción existen en el mismo lugar y en los eucariotas en compartimientos diferentes, no son procesos simultáneos por ende esto determina que la regulación de la expresión sea diferente. Además, en el caso de los organismos multicelulares que poseen diferentes tipos celulares la coordinación de la regulación de la expresión génica es mucho más compleja que procariotas. Como ya venimos estudiando la concentración celular de una proteína viene determinada por un delicado equilibrio entre varios procesos. Un eficiente sitio de regulación es el comienzo de la vía ósea a nivel del inicio de la transcripción, pero también veremos que operan procesos de regulación post transcripcional y traduccional. Pero pensando en el control del inicio de la transcripción es que puede permitirá la regulación sincronizada de múltiples genes por ejemplo que codifiquen productos con actividades relacionadas. Empezaremos analizando un punto clave en la regulación transcripcional que es la interacción entre proteínas y ADN y lo hacen a través de dominios proteicos específicos que son capaces de reconocer secuencias especificas de ADN. La regulación requiere que interactúen el ADN y la proteína y se transmitan información. Esta interacción necesita muchas uniones débiles para lograr la especificidad. Para unirse a las secuencias de ADN las proteínas reguladoras deben reconocer características de superficie del ADN, lo harán a través de dominios proteicos específicos que son capaces de reconocer secuencias específicas de ADN. No es necesario abrir las hebras, la mayoría de los grupos químicos distinguen las cuatro bases y permiten la discriminación entre pares de bases, son los grupos dadores y aceptores de enlaces de hidrógeno que van a estar expuestos en la superficie. En el ADN existen cavidades mayores y menores en los lados opuestos. La mayoría de las interacciones con proteínas se dan en el surco mayor de ADN. La mayoría de los contactos proteína-ADN que confieren especificidad son entonces los enlaces de hidrogeno. Los aminoácidos con grupos amino o amida tienen mayor tendencia a interactuar con el ADN de forma específica ya que forman puentes de hidrógeno. En el reconocimiento también es importante la superficie no polar cercana al C 5 de la asparagina, donde si se fijan la timina se distingue bien de la citosina por su grupo metilo protuberante. Los contactos proteínas-ADN también son posibles en el surco menor del ADN, pero en este caso los patrones de enlace hidrógeno no permiten una fácil discriminación entre pares de bases. En el caso del surco mayor, los patrones posibles de enlaces diferencian el par de bases, por ejemplo, adenina timina del de timina adenina. En el esquema hay un patrón de círculos azul-rojo-azul-amarillo que va a ser distinto del patrón amarillo-azul-rojo-azul lo mismo ocurre con el par G-C y C-G. Sin embargo, esta diferencia de superficie no es posible discriminarse en el surco menor. Dentro de las proteínas reguladoras la cadena lateral de los aminoácidos que más a menudo forman enlaces de hidrógeno con las bases de ADN son los residuos de asparagina, glutámico glutamina glicina y arginina. La figura les muestra los dos enlaces de hidrógeno que se pueden formar entre él glutámico o la asparagina y la adenina y que no se pueden formar con ninguna otra base, mientras que por ejemplo un residuo de arginina puede formar dos enlaces de hidrógeno con la guanina. El análisis de muchas estructuras ha demostrado que no existe un código de reconocimiento simple de un aminoácido por una base, es decir que una proteína puede reconocer cada par de bases de mas de una manera lo cual ha llevado a la conclusión de que no existe un código universal de reconocimiento simple de un aminoácido por una base. En verde esta una proteína que sería un factor de transcripción y lo que se observa en la imagen es el residuo de asparagina de la proteína interaccionando con dos puente de hidrogeno en el surco mayor del ADN . Es importante destacar que sólo una pequeña porción un dominio de 60 a 90 aminoácidos de una proteína mucho más grande va a sobresalir de forma estable de la superficie de la proteína e interaccionar con las bases de ADN. Dentro de estos dominios los motivos de interacción con el ADN son todavía más pequeños. Los sitios de unión al ADN son repeticiones nucleotídicas invertidas o palíndromos de manera que un dímero de la proteína se puede unir a ambos sitios a la vez. La especificidad de una proteína respecto de la secuencia de ADN es considerada el mecanismo más importante y diverso de la regulación génica tanto en procariotas como en eucariotas. Motivos de interacción – estructura 3D Sobre la base de la estructura tridimensional de los motivos de interacción con el ADN se las puede clasificar a las proteínas en: ● Hélice básica – bucle - hélice ● Hélice- Giro- hélice ● Cremallera de leucina ● Dedo de zinc Las tres primeras forman dímeros cuando interactúan con el ADN. El dedo de zinc forma un trímero. Empecemos con el motivo: Hélice-giro-hélice Este motivo consta de alrededor de 20 aminoácidos que forman dos cortos segmentos α helicoidales, uno de los cuales será el de reconocimiento del ADN. Están separados por un giro beta. Estos motivos generalmente no son estables por sí solas, sino que son la porción de un dominio de unión al ADN que sobresale de una proteína mayor. Uno de los dos segmentos α helicoidales se denomina hélice de reconocimiento porque habitualmente contiene muchos de los aminoácidos que interaccionan con el ADN. Cuando está unida al ADN la hélice de reconocimiento se sitúa en el interior, o casi totalmente en el interior, del surco mayor del ADN. Se observa un ejemplo del represor Lac que tiene un motivo de unión al ADN de este tipo. Homeodominio Son factores de transcripción de eucariotas que están constituidos por aproximadamente 60 aminoácidos, donde el segmento de unión al ADN del dominio está relacionado con el motivo hélice-giro-hélice, pero en este caso son 3 α hélices. En la figura se muestra como blancas, azul y gris donde una de ellas en este caso la lila en el superior y la roja en el inferior es la hélice de reconocimiento del ADN. La secuencia de ADN que codifica estos dominios se las denomina homeosecuencias o homeobox, y son proteínas relacionadoscon la regulación del desarrollo en eucariotas. Dedos de zinc Cada dedo de zinc está compuesto por unos 30 residuos de aminoácidos que forman dos láminas betas y una hélice α que es la del reconocimiento del ADN. Los aminoácidos forman como un lazo donde se encuentra el átomo de zinc coordinado con cuatro residuos, que pueden ser cisteínas o dos cisteínas y dos cisteínas. Un punto muy importante es que el zinc no interacciona con el ADN, sino que su función es más bien estructural. Debido a que la interacción de un dedo de zinc con el ADN puede ser débil, en muchos casos se usan los dedos de zinc en tándem. Los dedos de zinc también pueden funcionar como motivos de interacción con el ARN. Cremallera de leucina En este caso hablamos de un dímero, donde cada monómero está compuesto por una α hélice que posee un extremo de reconocimiento al ADN y el otro extremo rico en leucinas. En este caso cuando decimos que es una cremallera de leucina hablamos de la forma en que los dímeros interaccionan entre ellos no hablamos de la de él sino que se habla en la interacción con la proteína. La figura se muestran cuatro proteínas que tienen este tipo de dominio. Tres son de mamíferos y una es de levadura. Los primeros aminoácidos representan la α hélice de reconocimiento al ADN y luego una hélice anfipática con una lisina cada siete residuos de aminoácido. Esta superficie hidrofóbica que se forma es usada para sujetar juntos a los dímeros, de allí el nombre de cremalleras o cierre, aunque fíjense que en el espacio las hélices se enrollan lado a lado. También es importante decir que cada hélice puede pertenecer a dos proteínas diferentes. Hélice básica – bucle- hélice En este caso una porción α hélice se va a unir al ADN, otra región puede formar dos α hélices anfipáticas cortas que están unidas por un lazo o loop. Ese lazo puede ser de longitud variable.stas dos α hélice junto con el lazo son las que interactúan en la dimerización con otras proteínas, similar a lo que hacía la cremallera de leucina. Ejemplo Se muestra un factor de transcripción humano. En rosa el segmento de unión al ADN que se une con la primera hélice del motivo de hélice lazo hélice, en rojo. El COOH terminal de la segunda hélice, en púrpura, se une con el extremo carboxi terminal de la otra subunidad y ambos monómeros adoptan esa conformación de hélice espiralada muy similar a la de la cremallera de leucina, pero en este caso con un solo par de la leucina interaccionado. VIMOS LAS PRIMERAS FORMAS EN LAS QUE LAS PROTEINAS REGULATORIAS PUEDEN INTERACCIONAR CON EL ADN. El vocabulario de la regulación génica Por convención las secuencias de ADN se muestran como existen en la hebra no molde, con el extremo 5 prima a la izquierda. De manera general describimos en estas figuras las regiones en las que dividimos un gen: ● La región promotora, sitio generalmente cercano a los puntos donde empieza la síntesis de ARN mensajero en el molde de ADN. ● La región codificante ● El terminador Los nucleótidos enumeran desde el sitio de inicio de la transcripción marcado en la figura como +1, con números positivos hacia la derecha, en dirección a la transcripción, y números negativos hacia la izquierda. A los genes los podemos dividir según si se expresan de manera constante, o sea que sus productos se requieren en todo momento de la vida de esa célula. A esos genes los llamaremos genes constitutivos o housekeeping. En contraposición tenemos los genes regulados, se corresponden a productos genicos que aumentan o disminuyen en una célula en respuesta a señales moleculares. Esto entonces divide a este grupo en aquellos cuyos productos aumentan en circunstancias determinadas, que son los genes inducibles y al proceso de su aumento se les denomina proceso de inducción, y aquellos que van a disminuir en respuesta a una señal como una molécula y serán los reprimibles y el proceso se denomina represión. RNA polimerasa La transcripción va a estar controlada por proteínas que se unen al ADN, y gran parte de ese control es tardado por la unión de la RNA polimerasa a los promotores en el ADN. Como estuvimos viendo, en las interacciones de proteínas con el ADN una secuencia proteica puede interaccionar con ciertas secuencias de nucleótidos, por lo cual, si las secuencias de nucleótidos de los promotores varían, eso va a influir en la afinidad de la unión de la ARN polimerasa, y por lo tanto en la frecuencia de inicio de la transcripción, controlando de esta manera la velocidad de la transcripción. En ausencia de proteínas reguladoras serán las diferentes secuencias del promotor las que pueden afectar la frecuencia del inicio de la transcripción. Miremos una secuencia en las bacterias la mayoría de los promotores de bacterias incluyen regiones conservadas en - 10 y el - 35 que van a interactuar con la RNApolimerasa. Algunos promotores también incluyen elementos corrientes arriba. Modelo de interacción entre la ARN polimerasa y el promotor. Los elementos en -10 son reconocidos por el dominio 2 de la subunidad sigma de la RNApol. Los elementos promotores -35 son reconocidos por el dominio 4 de la subunidad sigma de la ARN polimerasa. Sustituciones en estas dos regiones en - 10 y - 35 usualmente reducen la actividad de la ARN polimerasa por el promotor. El elemento ubicado corriente arriba del promotor es reconocido por los dominios de terminales de las unidades α de la ARN polimerasa. Genes constitutivos y regulados Los genes constitutivos pueden expresarse entonces a diferentes niveles debido a diferencias en la secuencia del promotor. Para los genes regulados la tasa basal de inicio de la transcripción también está determinada por la secuencia del promotor, pero la expresión de estos genes está además modulada por proteínas reguladoras, que pueden potenciar o interferir la interacción entre la ARN polimerasa y el promotor. Al menos tres tipos de proteínas regulan el inicio de la transcripción por la ARN polimerasa aumentando o inhibiendo la interacción entre la ARN polimerasa y el promotor: ● Factores de especificidad, que modifican la especificidad de la RNApolimerasa por un promotor determinado o un conjunto de promotores. ● Represores, que impiden el acceso de la ARN polimerasa al promotor. ● Activadores, que potencian la interacción de la ARN polimerasa y el promotor. Regulación de la expresión génica en procariotas Factores de especificidad La subunidad sigma de la RNA polimerasa constituye un factor de especificidad que interviene en el reconocimiento y la unión al promotor, entre otras funciones que se listan en la transparencia. El factor sigma 70 es el más común y reconoce la mayoría de los promotores. Si esta subunidad es reemplazada por otros factores de especificidad la RNA polimerasa será redirigida a otros promotores especializados, con secuencias consensos diferentes. Por ejemplo, si es el factor sigma 32 se activará la transcripción de genes en respuesta al choque térmico. Activadores En las bacterias los sitios de unión de los activadores se encuentran a menudo adyacentes a promotores a los que la ARN polimerasa se une, por sí sola o débilmente, de manera que en la ausencia del activador la transcripción es escasa. En los eucariotas algunos activadores se van a unir a sitios muy distantes de la secuencia que quieren regular. Estos sitios se denominan potenciadores o enhancer e influencian en promotores que están muy lejos, a miles de pares de bases de distancias. Hay dos mecanismos: En algunos casos el activador está unido al ADN, hasta que el reconocimiento de una molécula señal provoca su disociación. En este caso hay ausencia o escasa transcripción. En otros casosel activador se une al ADN solo después de la interacción con la molécula señal y se activa la transcripción. Las moléculas señal pueden entonces aumentar o disminuir la transcripción según como afecten al activado. Represores Lo opuesto ocurre con los represores, en células bacterianas se unen a sitios específicos denominados operadores que se encuentran generalmente cerca de un promotor. La unión de la RNA polimerasa o su movimiento a lo largo del ADN se bloquea cuando el represor está presente. Esta regulación se denomina regulación negativa. En este caso si la molécula señal se une al represor, provoca un cambio de conformación que lo disocia del sitio operador, entonces el promotor se libera para la unión de la ARN polimerasa y se inicia la transcripción. La molécula señal interacciona con el represor inactivo y favorece su unión al operador deteniendo o disminuyendo la transcripción. Operón La mayoría de los genes bacterianos están agrupados y se regulan en operones. Los operones son sistemas que agrupan en el cromosoma a varios genes involucrados en cierto proceso, y que se van a transcribir juntos, formando lo que llamamos un ARN mensajero policistrónico, ósea múltiples genes en un único transcrito. El esquema representa a uno con las típicas secuencias regulatorias con sitios para unir proteínas que activan o reprimen la transcripción, y un único promotor a partir del cual se transcribe en varios genes sobre un solo ARN mensajero. Además de la multitud de operones conocidos actualmente en bacterias, se han encontrado unos cuantos operones policistrónicos también en células eucariotas inferiores. En las células de eucariotas superiores, en cambio, casi todos los genes que codifican proteínas se transcriben separadamente. Operón lac Muchos de los principios de la expresión génica bacteriana fueron definidos por primera vez por los estudios del metabolismo de la lactosa en Escherichia coli. Estos microorganismos pueden utilizar lactosa como única fuente de carbono. Los genes implicados en el metabolismo de la lactosa están regulados de forma coordinada por un elemento génico situado en un extremo del grupo de los genes. Ellos son: la beta galactosidasa, que metaboliza la lactosa en la lactosa y glucosa, la lactosa permeasa, que transporta la lactosa al interior de la célula, y la tiogalactosido transacetilasa, que parece modificar los galactósidos tóxicos para facilitar su eliminación por la célula. La allolactosa es un isómero de la lactosa. Este es un esquema del operón lac. Incluye los genes de la beta galactosidasa (lac Z), la de la galactosido permeasa (lac Y) y tiogalactosido transacetilasa (lac A). Por delante del promotor vemos el gen lacI, que codifica para el represor al que llamaremos represor lac. Tiene su propio promotor y la transcripción del represor es independiente de la transcripción de las enzimas que regulan el represor. Hay tres sitios operadores, que son las secuencias donde se unen los represores, es decir que el operón lac sigue un modelo de regulación negativa. Los sitios de unión al ADN de las proteínas reguladoras son a menudo repeticiones invertidas y una secuencia de ADN corta, un palíndromo, a la que se unen cooperativamente subunidades, normalmente dos, y una proteína reguladora. Y los sitios de operadores secundarios se encuentran en la posición + 410, que está dentro del gen lacZ (el operador 2), y el operador 3, que está cerca de la posición - 90 dentro del gen lacY. El represor lac es inusual, ya que funciona como un tetrámero con dos dímeros unidos por los extremos más alejados de los sitios de unión al ADN. Para reprimir el operón, el represor lac se unirá tanto al operador principal como a uno de los dos sitios secundarios, formando un lazo de ADN. Cualquiera de las dos formas de unión bloquea el inicio de la transcripción. Si bien la unión es altamente específica, la represión no es absoluta: incluso en el estado reprimido las células van a tener unas pocas moléculas de beta galactosidasa y de galactósido permeasa, probablemente sintetizadas en las raras ocasiones en que el represor se disocia transitoriamente de los operadores. Este nivel basal de transcripción es esencial para la regulación del operón. En presencia de lactosa, ésta ingresa a las células bacterianas utilizando esas pocas moléculas de permeasa existente y el operón se des reprime, porque el isómero de la lactosa, la allolactosa, funciona como la molécula señal que se va a unir al sitio específico del represor lac, causando un cambio de conformación que provoca la disociación del represor del operador. Esto permite que los genes del operón lac se expresen. Varios beta galactósidos estructuralmente relacionados con la allolactosa son inductores del operón lac, pero no son sustratos de la beta galactosidasa. Al revés, otros pueden ser sustratos de la beta galactosidasa, pero no son inductores del operón lac. Un inductor muy efectivo, que no necesita de la permeasa y no es metabolizable es el isopropil-beta-D-tiogalactósido, o IPTG. Esto es importante para producir proteínas recombinantes, porque van a tener un inductor permeable y que no es degradable. Acá se muestran distintas imágenes representativas del represor lac: La interacción al ADN es a través de un dominio hélice-giro-hélice, que al unirse a las secuencias operadoras genera el bucle de ADN. La última imagen muestra como la unión a la molécula señal, allolactosa, o al IPTG genera un cambio de conformación que va a liberar al represor de su unión al ADN. Para la regulación del operón lac también debemos considerar si hay o no glucosa disponible. Si ya está disponible esta forma de carbono, o se ha degradado suficiente lactosa (recuerden que la lactosa es un disacárido galactosa-glucosa), no sería necesario activar o mantener activo el operón. En el caso del operón lac entonces hablamos que tiene represión por catabolito, en este caso por glucosa, y lo hace a través del AMPc y la proteína CRP (CAP). Estas moléculas están implicadas en la regulación coordinada de muchos operones relacionados con el metabolismo de azúcares, y entonces hablamos de un regulón, es decir, una red de operones coordinadas por un regulador común. En bacterias, la síntesis de AMPc se estimula cuando la concentración de glucosa es baja. Esta proteína es un homodímero con sitios de unión para el ADN, mediante un motivo hélice giro hélice, y esta unión aumenta en presencia de AMPc. Por otro lado, se une a la ARN polimerasa mejorando la unión de la misma a un promotor libre. Cuando la concentración de glucosa es alta, la de AMPc es baja, y si la lactosa está ausente, el operón está reprimido, lo que no va a permitir unirse a la ARN polimerasa. Si no hay disponible glucosa, aumenta el AMPc y se favorece la unión de CRP, pero si no hay lactosa, el represor lac sigue unido, por lo que la ARN polimerasa aún no puede transcribir los genes. Si hay una alta concentración de glucosa y lactosa presente, el AMPc estará bajo. La lactosa actuaría liberando al represor, pero si la glucosa es alta hay bajo AMPc, con lo cual la proteína CRP no se unirá. Como el promotor es débil, tendremos bajo nivel de expresión del operón. En ausencia de glucosa y lactosa presente, el represor se libera, entonces la CRP/AMPc se une al sitio cerca del promotor y estimula la transcripción de ARN mensajero unas 50 veces. En resumen, la CRP/AMPc es un elemento de regulación positiva sensible a los niveles de glucosa, mientras que el represor lac es un elemento de regulación negativa sensible a la lactosa. Operón triptófano Otro sistema de regulación importante de las bacterias se relaciona con las proteínasinvolucradas en la síntesis de aminoácidos. Por ejemplo, E. coli. puede sintetizar los 20 aminoácidos, pero estas enzimas se van a expresar siempre que no hay disponibilidad de este aminoácido, cuando hay un aminoácido presente el operón se reprime. El operón triptófano regula la síntesis de las enzimas requeridas para convertir corismato en triptófano. El represor es un homodímero que cambia de conformación cuando el triptófano es abundante y se une al ADN en el operador. La secuencia operadora se encuentra en el sitio del promotor, por lo que se bloquea la unión a la RNA polimerasa. Pero ésta tampoco es una regulación encendido-apagado del operón, sino que se puede regular según la concentración celular de triptófano. Este sistema funciona cuando se acaba la represión. La velocidad de transcripción se ajusta mediante un segundo proceso de regulación denominado atenuación de la transcripción, en el que la transcripción se inicia normalmente, pero es detenida. Entre el promotor y el primer gen existe lo que se llama una secuencia líder y la secuencia del atenuador está en la región 5´ de esta secuencia líder. El ARN mensajero contiene un codón de inicio y fin, por lo que codifica para una pequeña proteína antes de las enzimas alcalina en el número 1, luego las regiones dos en celeste, tres en amarillo y cuatro en rosa, seguidas de una secuencia de uracilos, que indican terminación de la transcripción del ADN por la ARN polimerasa. Estas regiones de a par pueden generar las horquillas o loops ricas en guanina y citosina en las regiones 2-3 y 3-4. El par atenuador está constituido por las secuencias 3 y 4. Para entender cómo funciona este sistema debemos tener presentes que en bacterias la transcripción a través de la ARN polimerasa y la traducción en los ribosomas, son procesos que pueden proceder simultáneamente, no como en eucariotas, que están separados entre el núcleo y el citoplasma. ¿Cómo funciona este sistema? en la secuencia 1 codifica un péptido guía de 14 aminoácidos, dos de los cuales son residuos triptófano, representados en esta cadena polipeptídica con la letra w. El péptido guía no tiene ninguna otra función celular conocida, su síntesis es simplemente un mecanismo de regulación del operón. Entonces, una vez que ocurre la transcripción, este péptido se traduce inmediatamente por un ribosoma, que sigue de cerca a la RNA polimerasa a medida que avanza la transcripción. ¿Qué pasa cuando las concentraciones de triptófano son elevadas? podemos suponer que también lo serán las concentraciones del ARN de transferencia cargado con triptófano (tRNATrp). Esto permite que la traducción proceda rápidamente, pasando por los dos codones triptófano de la secuencia 1 hacia la secuencia 2, la cual va a quedar cubierta por el ribosoma, imposibilitando que se aparee con la secuencia 3, y permitiendo que se forme la estructura atenuadora, secuencia 3 y 4, y se interrumpa la transcripción. La estructura que adquiere el ARN mensajero, sumado a los uracilos generan la señal para que la ARN polimerasa se desprenda del ADN. En cambio, cuando las concentraciones de triptófano son bajas, hay menos ARN de transferencia unido triptófano y el ribosoma se detiene en los dos codones triptófano de la secuencia 1. La secuencia 2 permanece libre mientras se sintetiza en la secuencia 3, permitiendo que estas dos secuencias se apareen, no se forme el par atenuador y se produzca entonces la transcripción del operón. De esta manera la proporción de transcriptos que se atenúa desciende a medida que disminuye la concentración de triptófano. Otros operones biosintéticos de aminoácidos utilizan una estrategia de atenuación similar, por ejemplo, el péptido guía de 15 aminoácidos producidos por el operón fenilalanina contiene 7 residuos fenilalanina, el péptido leucina contiene 4 residuos leucina y el péptido guía para el operón histidina contiene 7 residuos histidina, y resulta ser suficientemente sensible para hacer el único mecanismo de regulación. Lo interesante del mecanismo de atenuación es que no necesita interacciones de otras proteínas con el ADN, sino que es sensible directamente a la concentración del aminoácido. Ya se vio la regulación coordinada de muchos operones por el AMPciclico y la proteínas CRP y se dijo que el regulon es una red de operones con un regulador común. En el caso del AMPc y proteína CRP coordinan operones relacionados con el metabolismo de azucares entre ellos se vio la lactosa . Ahora se va a ver el regulon SOS Regulón SOS: daño extensivo del ADN El daño extenso del ADN en las bacterias desencadena la inducción coordinada de muchos genes distantes unos de otros, y que son utilizados en la reparación del ADN. La figura representa varios de ellos en el cromosoma de E. coli. A esta respuesta se la denomina SOS, y tiene dentro de sus principales actores a la proteína RecA y al represor lexA, que inhibe la transcripción de todos los genes SOS. La proteína RecA es capaz de formar un filamento de proteína alrededor del ADN monocatenario, pero sólo cuando el ADN está severamente dañado existieran suficientes espacios para que RecA se una en los espacios de una sola hebra. En esta condición, cuando está unida al ADN puede interaccionar con los dímeros de LexA, causando el cambio de conformación de LexA, que va a generar un auto cribaje de esta proteína lexA en dos péptidos iguales, que lo inactivan, se disocia del ADN y se elimina la represión de los genes de reparación SOS. Estructuralmente LexA contiene dos dominios unidos por una región de bisagra. Los dímeros de LexA se unen al ADN en sitios específicos altamente conservados, denominados cajas SOS, y evitan la expresión de los genes posteriores. La expresión de los genes del regulón SOS requieren la destrucción de LexA, que se produce cuando RecA se ha unido a la hebra de ADN. LexA cataliza su propia ruptura en enlaces peptídicos específicos alanina-lisina. Si bien para este clivaje se requiere de la proteína RecA, ésta no es una protesta es una co-proteasa. Algunos represores también mantienen a virus de bacterias, o bacteriófagos, en un estado latente dentro del huésped bacteriano. Estos represores, de manera similar a LexA, también sufren autocorte en el enlace peptídico alanina-glicina cuando interaccionan con RecA. Por tanto, la inducción de la respuesta SOS permite la replicación del virus, la lisis de la célula y la liberación de nuevas partículas de virus. Es un ejemplo de adaptación evolutiva, donde el fago se activa y sale de una célula huésped bacteriana cuando ésta está en peligro. Este sistema se activa cuando hay un severo daño al ADN, por ejemplo, por radiación. Regulación a nivel de traducción Cuando una bacteria necesita más proteínas las debe sintetizar, y esto lo hace incrementando el número de ribosomas (compuestos por proteínas ribosomales o proteínas r y ARN ribosomal). Los operones de proteínas r son regulados por retroalimentación traduccional. Cada operón codifica una proteína que actúa como un represor traduccional que se une cerca del comienzo del ARNm y bloquea la traducción. El represor también se une al ARN ribosomal, de hecho, tiene más afinidad por el ARNr que por el ARNm. Entonces, solo reprimirá el ARN mensajero si la concentración de la proteína ribosomal es mayor que la concentración del ARNr, manteniendo el equilibrio entre la síntesis de proteína ribosomales y la cantidad de ARNr. Los aminoácidos también controlan la síntesis de ARN ribosoma. El control de al menos 7 operones productores de ARN ribosomal está regulado por la disponibilidad de aminoácidos. Si hay disminución de los aminoácidos la síntesis de ARNr se detiene. Esta regulación se llama respuestagrave y ¿cómo sucede? si no hay aminoácidos no se pueden cargar los ARNr de transferencia, por lo que se unirán ARN de transferencia descargados al sitio A del ribosoma. Esto hace que una enzima, la proteína Rel A se una al ribosoma y catalice la formación de guanosina penta fosfato, que luego se hidroliza a tetra fosfato y que reduce la síntesis del ARNr en parte al disminuir la actividad de la ARN polimerasa. Fíjense que vivimos el AMPc como una señal de carencia de carbohidratos y ahora vemos otro nucleótido modificado como una señal de carencia de aminoácidos. Algunos ARN participan en la regulación génica Ciertas proteínas funcionan como represores traduccionales al unirse a la red de mensajeros (por ejemplo, las proteínas involucradas en la formación de los ribosomas), ahora veremos cómo el propio ARN puede controlar una función del ARN mensajero. ● Regulación trans: una molécula de ADN mensajero es afectado por otro ARN distinto. ● Regulación cis: la propia molécula es la que afecta a su función. Regulación trans Las regiones 5’ no traducidas o 5’ UTR pueden controlar su traducción. Ejemplo: un factor sigma de la RNA polimerasa (son los factores que dirigen la unión de la RNA polimerasa a ciertos promotores) este mensajero no se traduce porque la estructura de horquilla bloquea la unión la ribosoma, pero si un RNA pequeño, de menos de 300 nucleótidos, en este caso DsrA, que se induce durante la respuesta estrés por falta de nutrientes se unen al ARNm e inhiben la formación de la horquilla, se libera el sitio de unión al ribosoma y se sintetiza entonces el factor sigma, se activarán los operones de la respuesta correspondiente. Hfq es una chaperona que facilita la interacción entre ambos RNAs. En este otro caso otra vez está bloqueada la unión a ribosoma, pero frente a una situación de estrés oxidativo se une el pequeño ARN OxyS, bloqueando el sitio de unión al ribosoma. De esta manera se impediría más efectivamente la expresión de operones de rutas de reparación innecesarias. Regulación cis En este caso la secuencia es termosensora, cuando se incrementa la temperatura la horquilla desaparece y se libera la unión de sitio al ribosoma. Otra regulación en cis es la llevada adelante por los riboswitches. Es un segmento en el extremo 5´ del ARN mensajero que generará una estructura conocida con el nombre de aptámero, capaz de unir un ligando y cambiar de conformación. Según el riboswitch al unirse con la molécula señal puede tener efectos sobre la transcripción, por ejemplo, en ausencia del ligando la ARN polimerasa continúa y el mensajero se traduce en proteínas, pero si hay ligando se une con el aptámero y se genera un terminador, se libera la polimerasa y no se sintetiza el mensajero. El riboswitch también puede tener efectos sobre la traducción, por ejemplo, bloqueando un sitio de unión a ribosoma. En la imagen se muestra el riboswitch de la tiamina pirofosfato, o vitamina b1, pero se han identificado riboswitch para otros ligandos. Esta es otra forma de esquematizar lo que se acaba de comentar. Podemos ver un esquema del funcionamiento del riboswitch de la guanina en una estructura 3D. Naranja: mecanismos que funcionan en bacterias. Celeste: mecanismos que han sido identificado en las eucariotas. Círculo rojo: ligando La mayor parte de los genes regulados de esta forma están implicados en la síntesis o el transporte del ligando, que se une al ribo interruptor, por lo tanto, cuando el ligando está presente en elevadas concentraciones, el ribo interruptor inhibe la expresión de los genes necesarios para reponerlo. Usos: ● Blancos de fármacos, por ejemplo, de nuevos antibióticos. ● Los naturales se pueden rediseñar para detectar otros ligados o para construir nuevas plataformas modulares. ● En ingeniería aprovechan una ribozima, o sea un RNA con actividad catalítica. En este caso hammerhead, o cabeza de martillo, que la combinan con dos haptameros para generar haptacimas. ● Se pueden transformar en biosensores mediante funciones con otras estructuras y por ejemplo si hay un ligando presente se emitirá fluorescencia. Regulación por recombinación genética Algunos genes bacterianos se regulan por recombinación genética. Salmonela: es una bacteria que vive en el intestino humano y que utiliza un flagelo para su movilidad. Este flagelo posee unas proteínas llamadas flagelinas que pueden ser identificadas por el sistema inmune del humano. Cada mil generaciones la bacteria cambia de sintetizar flagelina B a flagelina C, como manera de evitar el sistema inmune. Este proceso es llamado variación de fase, que está controlado por la inversión periódica sitio específica de la secuencia promotora de la flagelina B. Es llevado a cabo por una recombinasa denominada HIC. En una orientación el promotor activa la transcripción de la flagelina B, ya que esta última es un represor de la expresión de la flagelina C. En la otra orientación el promotor hará que no se exprese ni la B ni la A, y por tanto se pierde la represión del gen de la flagelina C. Finalizamos esta tercera parte con varios ejemplos de mecanismos que nos describen la riqueza de la regulación de la expresión génica en procariotas. Regulación génica en eucariotas Un primer punto de diferencia entre procariotas y eucariotas se relaciona con el estado basal de la transcripción, o sea, la actividad inherente de los promotores y del mecanismo de transcripción en ausencia de secuencias de regulación. En las bacterias, el estado basal es no restrictivo, ya que la RNA polimerasa generalmente tiene acceso a todos los promotores y puede unirse e iniciar la transcripción en ausencia de activadores o represor. En eucariotas, el estado basal de la transcripción es restrictivo, ya que los promotores eucarióticos se encuentran por lo general inactivos en ausencia de proteínas reguladoras. El estado basal de la transcripción en procariotas es no restrictivo y en eucariotas es restrictivo. En los eucariotas, el acceso a los promotores está restringido por la estructura de la cromatina, y la activación de la transcripción está asociada con múltiples cambios en la estructura de la cromatina en la región a ser transcrita. A pesar de que en las células eucarísticas se encuentran tanto elementos de regulación positiva como negativas los mecanismos positivos, predominan, lo que significa que casi todos los genes eucarísticos requieren activación para ser transcritos. Las células eucarióticas tienen proteínas reguladoras multiméricas más grandes y complejas que las bacterias. Y como ya dijimos, la transcripción en el núcleo eucariota está separada tanto en espacio como en el tiempo de la traducción en el citoplasma. Entonces, en eucariotas la transcripción está fuertemente reprimida cuando el ADN está condensado en cromatina. En un cromosoma disperso y amorfo encontramos heterocromatina más condensada, transcripcionalmente inactiva y eucromatina menos condensada, aunque no toda activa. Para que sea transcripciónalmente activa tendrá que remodelarse en una estructura más abierta, los nucleosomas deberán re posicionarse o desplazarse. Se han identificado varios complejos enzimáticos involucrados en esta remodelación. La tabla describe varios de ellos, muchos hidrolizan ATP en el proceso. La cromatina transcripcionalmente activa tiende a ser deficiente en histona H1, que es la que se une al ADN enlazador entre las partículas del nucleosoma y estarán enriquecidas en las variantes de histonas H3.3 y H2AZ. Las alteraciones en el contenido de histonas están mediadas por enzimas especializadas y complejos proteicos. También es necesario la modificación covalente de histonas y del ADN para activar la transcripción. La acetilación y la metilación de las historiasinternas de los nucleosomas alteran la cromatina y activan la transcripción. Cada histona posee un dominio central implicado en las interacciones histona-histona y con el enrollamiento del ADN, y otro dominio en el exterior del nucleosoma rico en lisinas, donde se producen modificaciones covalentes. Por ejemplo, se metilan las lisinas 4 y 36 de la histona 3, facilitando la unión de las historias acetiltransferasas, enzimas que acetilan residuos particulares de lisina. Estas enzimas se dividen en dos tipos las B, que acetilan histonas en el citosol, que luego se transportan al núcleo y se ensamblan en el núcleosoma con la ayuda de otras proteínas y las tipo A, que actúan en el núcleo activando el núcleo soma para la transcripción. Para inactivar la transcripción se eliminan determinados grupos acetilos y nuevas modificaciones covalentes de las histonas marcan la cromatina como transcripcionalmente inactiva, por ejemplo, metilación en la lisina 9 de la historia 3. Los patrones de modificación podrían ser considerados un código de histonas para el reconocimiento de proteínas que hacen que la cromatina sea más accesible a la maquinaria de la transcripción. En esta diapositiva se muestran los dos mecanismos de remodelación de la cromatina que se venia discutiendo. La metilación del ADN en las citocinas generalmente apaga los genes, atrayendo proteínas que bloquean la expresión de genes. Esta metilación puede ser transmitida a las células de la progenie por una enzima que copia el patrón a la cadena de ADN hija inmediatamente después de la replicación, sin alterar la secuencia de nucleótidos, lo que se denomina herencia epigenética. La impronta genética o imprinting no está completamente definida, pero en estos casos la metilación regula la expresión de alelos maternos o paternos de ciertos genes al comienzo del desarrollo. En los eucariotas, la mayoría de los genes son monoscistrónicos. Las ARN polimerasa eucarióticas tienen poca o ninguna afinidad intrínseca por sus promotores, el inicio de la transcripción es en parte dependiente de la acción de múltiples proteínas activadoras. Estos activadores van a tener un dominio que se une a la DNA y otro de interacción con otras proteínas. ¿Por qué la transcripción en los eucariotas depende de activadores? porque si la cromatina bloquea el acceso al gen el represor es redundante. Y también porque se necesitaría tantos represores como genes. Y si todos los genes están reprimidos, sólo se necesitan unos pocos activadores para activar conjuntos de genes según sea necesario. La propia de regulación de los diferentes genes se logra utilizando diferentes combinaciones de un repertorio limitado de factores de transcripción, fenómeno conocido como control combinatorio. ¿Y por qué será necesario múltiples activadores? porque al ser los cromosomas más grandes hay mayor posibilidad de que una secuencia regulatoria ocurra al azar. Además, se disminuye la posibilidad de iniciación aleatoria accidental. Por tanto, en eucariotas el control de la transcripción se lleva a cabo utilizando diferentes combinaciones de un número limitado de factores de transcripción. Activadores transcripcionales → Las proteínas activadoras transcripcionales se unen a las secuencias potenciadoras o enhancers. → Algunos activadores facilitan la transcripción de centenares de promotores, mientras que otros pueden ser específicos de unos pocos promotores. → Muchos activadores son sensibles a la unión de moléculas señal, lo que proporciona la capacidad de activar o desactivar la transcripción en respuesta a un cambio en el ambiente celular. → Algunos están distantes de la secuencia TATA del promotor. → Múltiples potenciadores o secuencias enhancer, a menudo 6 o más, están vinculados por un número similar de activadores para un gen, lo que, como dijimos, proporciona control combinatorio y respuesta a múltiples señales. → Otras proteínas actúan como reguladores arquitectónicos, generando un bucle de ADN que acerca secuencias que pueden estar distantes. Ejemplo de este grupo son las proteínas de alta movilidad de electroforesis en gel de poliacrilamida o HMG. El complejo activador actúa indirectamente, ya que no se une al ADN y es necesario para la comunicación entre los activadores y el complejo formado por la polimerasa II y los factores de transcripción basales. El principal activador eucariota contiene entre 20 y 30 polipéptidos o más, que forman un complejo proteico denominado mediador, que se une al dominio carbonilo terminal CTD de la subunidad grande de la polimerasa II y a los activadores de la transcripción. Mucho de los polipéptidos del mediador están muy conservados desde los hongos a los humanos. Gran parte de la investigación estos últimos años se ha centrado en identificarlos y a estudiar sus interacciones. Otras proteínas son los factores de transcripción basal, como por ejemplo la proteína de unión a TATA, uno de los componentes del complejo de pre inicio, que incluye otros factores de transcripción basales. 1. Se unen los activadores, que interactúan con las histonas acetiltransferasas o con complejos de remodelación de la cromatina. 2. Se remodela la cromatina circundante. 3. Se desplazan y modifican las histonas. 4. Los activadores interactúan con el complejo mediador, que actúa como un andamio para ensamblar los factores de transcripción basales y se reúnen otros componentes del complejo de pre iniciación, incluyendo la polimerasa. Activación transcripcional reversible A las proteínas reguladoras ahora tenemos que sumarle los ARN no codificantes, que pueden actuar tanto en la activación como en la represión de la transcripción de genes. Algunas proteínas y ARNs no codificantes pueden actuar con represores interactuando diferentes niveles, pueden desplazar las proteínas en las secuencias activadoras, pueden inhibir la formación del complejo iniciador de la transcripción o pueden ser un mecanismo que ayude a desactivar los promotores, una vez que la transcripción ya no sea necesaria. Ejemplo: metabolismo de los genes de la galactosa en las levaduras ● Están sujetos tanto a regulación positiva como negativa. ● Los genes requeridos para el metabolismo de la galactosa están distribuidos en varios cromosomas. ● Cada gen se transcribe de forma separada, no en operón ● Tienen todos promotores similares. Cuando la galactosa está presente se une a gal3p e interacciona con el complejo gal4p-gal80 p y permite que gal4p actúe como un activador para el promotor, reclutando al complejo remodelador de la cromatina y al complejo mediador. Regulación de la transcripción por hormonas esteroideas Ejemplo: el estrógeno, la progesterona, los glucocorticoides Al ingresar a la célula blanco interaccionan en el citoplasma con el complejo hsp70. Cuando se une a la hormona se disocia hsp70, el receptor se dimeriza, y se expone una región de localización nuclear. El complejo hormona-receptor viaja al núcleo, reconoce y se une a los sitios de respuesta hormona HRE y actúa como un activador transcripcional. La actividad del represor puede ser reprimida por unión a un ARN no codificante. El tamoxifeno se une al receptor de estrógenos en el sitio de unión estrógenos cambiando la conformación, y bloquea el sitio de unión al co activador. En el caso de la hormona tiroidea actúa a través de un receptor tipo 2, que se encuentra en el núcleo unido al ADN y al co-represor X-retinoide o RXR. Al unirse la hormona se disocia el co represor, y el complejo receptor hormonal activa la transcripción. Las secuencias de ADN a las que se unen los complejos hormonas receptor de las diversas hormonas esteroideas son similares en longitud y estructura, pero diferentesen secuencias. Las secuencias consisten en general en dos segmentos de seis nucleótidos en tándem o repeticiones palíndromos. El receptor hormonal tiene dominios conservados de unión a ADN, dos dedos de zinc que se van a unir a los segmentos de seis pares de bases. Algunos receptores de hormonas usan como co activador un ARN de 700 nucleótidos, como parte de un complejo ARN proteína. Hay otras vías mediante las cuales las hormonas regulan la expresión de genes, por ejemplo, la fosforilación de factores de transcripción. También la regulación de la expresión génica se puede dar durante la traducción, por ejemplo, por fosforilando factores de iniciación de la traducción, o afectando sus interacciones, o por unión de proteínas a la región 3’ no traducible, o mediante ARN. Estos mecanismos son importantes en células sin núcleo, por ejemplo, los reticulocitos, que son los glóbulos rojos inmaduros, donde sólo será posible la regulación de la traducción de ARN mensajeros almacenados. RNA no codificantes Como vimos en la regulación de la expresión de genes en bacterias y en eucariotas los ARN no codificantes van adquiriendo cada vez mayor relevancia en el control de la expresión génica. No todos los ARN codifican para proteínas y mucho de ese ARN va a regular la expresión de genes. Esta flecha del tiempo nos muestra algunos hitos en relación al ARN: en 1993 se describe el primero ARN de interferencia. En el 2012 se reporta que el 80% del genoma que se transcribe son ARNs no codificantes. Estos ARN no codificantes se los encuentran agrupados para su clasificación de diferentes maneras. Por ejemplo, se los agrupa según su función, en constitutivos como el ARN ribosomal, o regulatorios. También se agrupan según su longitud: menos de 200 nucleótidos (un número arbitrario) son denominados pequeños, y más de ese número son los largos o grandes ARN no codificantes largos Los ARN no codificantes largos o grandes pueden producir muchos tipos de controles para regular la expresión génica. ARN no codificantes pequeños Pueden promover la inactivación de la transcripción generando modificaciones en la cromatina. Pueden afectar la traducción o la vida media de los ARN mensajeros, además de controlar virus, transposones. Con frecuencia se unen al extremo 3´ UTR, entre el codón STOP y la cola de poliadenilación. Los micros ARNs modulan el silenciamiento post transcripcional de genes. La mayoría de los micro ARN son transcriptos por la ARN polimerasa II en el núcleo, y luego los transcriptos denominados primicroARN son escindidos por troya y su cofactor esencial DGCR8. Después de la escisión se generan productos de micro ARN en forma de horquilla pre micros ARN, con una longitud de 60 a 70 nucleótidos, y se exportan al citoplasma por la exportina 5 y la GTPasa run. En el citoplasma run hidroliza GTP y luego se libera la proteína exportina y el pre micro ARN. Las proteínas runGTP y la exportina a 5 se transportan de regreso al núcleo. Dicer 1, un miembro de la familia de las ARNasa III es responsable de la maduración del micro RNA en el citoplasma, donde se une al final del pre micro RNA, y produce aproximadamente un micro ARN de doble cadena de 22 nucleótidos. Se comienzan a incorporar proteínas como las argonautas, se elimina la hebra de ADN complementaria, y se forma el complejo de silenciamiento inducido por ARN o risk. El complejo risk se unirá al ARN mensajero blanco. Si la complementariedad entre el microARN y el ARN mensajero es casi total, el ARN en mensajero es degradado. Pero si la complementariedad es sólo parcial, el complejo bloquea la traducción del ARN mensajero. Una vez que se produce el reconocimiento, se reclutará una serie de proteínas específicas para que se produzca la degradación o el silenciamiento del ARN mensajero. Los microARNs también podrían exportarse a otras células. Se sugiere que los micro ARN desnudos, o sea sin proteínas, podrían transferirse directamente a las células adyacentes mediante uniones gap. Además, se ha propuesto que los micro RNA individuales podrían secretarse a partir de la célula donantes y dirigirse a células receptoras a través de exosomas, microvesículas, cuerpos apoptóticos, lipoproteínas o proteínas capaces de unir ARN y transportarlo a través de la circulación. Todo este conocimiento nos ha llevado a poder silenciar genes de manera artificial mediante el método de ARN de interferencia. En la parte a de la diapositiva está el mecanismo natural, en la b el de interferencia. Si quieren silenciar un gen van a tener que diseñar una doble cadena, introducirlo en la célula, dicer lo va a activar, se unirá al ARN mensajero y lo silenciará. La mayor diferencia entre los ARN de interferencia y el micro ARN es que en el primer caso, al ser una ARN de diseño pueden ser específicos para un RNA mensajero, mientras que el otro puede tener múltiples blancos. Para diseñar a ARN para silenciamiento la secuencia deberá cumplir con ciertas reglas. Los ARN de interferencia ya poseen aplicaciones reales y además muchas más potenciales, y aún falta mucho por descubrir o posibilidades de rediseñar. Ya hay varias terapias que proponen su utilización para diferentes patologías. RNA circulares: podrían actuar como esponjas para absorber micro RNAs. Motivos de interacción – estructura 3D Hélice-giro-hélice Homeodominio Dedos de zinc Cremallera de leucina Hélice básica – bucle- hélice El vocabulario de la regulación génica RNA polimerasa Genes constitutivos y regulados Regulación de la expresión génica en procariotas Factores de especificidad Activadores Represores Operón Operón lac Operón triptófano Regulón SOS: daño extensivo del ADN Regulación a nivel de traducción Algunos ARN participan en la regulación génica Regulación trans Regulación cis Regulación por recombinación genética Regulación génica en eucariotas Activadores transcripcionales Activación transcripcional reversible Ejemplo: metabolismo de los genes de la galactosa en las levaduras Regulación de la transcripción por hormonas esteroideas RNA no codificantes ARN no codificantes largos ARN no codificantes pequeños
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