Teorico 23 Metabolismo del ADN 2021

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Es importante conservar
el ADN ya que existen
poco número de
copias.hay no más de
una dos copias de cada
gen por célula. Y a lo
largo de un día son
innumerables las
posibilidades de daño
que tiene una molécula
de DNA. Hay
aproximadamente un
millón de daños por día.
Es la única molécula que
tenemos en nuestro
órgano que se repara,
todas las demás se
reemplazan. Hay aproximadamente 100 genes que codifican para proteínas que van a
dedicarse a reparar el DNA. Una de las consecuencias más conocidas de las mutaciones
es el cáncer.
Este cuadro muestra que tipo
de daños se pueden producir
en los nucleótidos. Y cual es
la frecuencia estimada y la
mutación predominante.
Fijense que la desaminación
de la citosina es uno de los
errores más frecuentes,
ocurre aproximadamente 200
veces por días. hay algunas
muchísimas más frecuentes
como los procesos de
depurinación,
depirimidinacion. La
modificacion de la 8-oxoG
tiene una frecuencia de 2,800. Es por todo esto que la célula tiene que invertir tanta energía
para reparar el DNA.
Es muy importante
diferenciar daño de
mutación. Un daño es un
cambio en la estructura
química del dna que puede
haber sido producido por
factores exógenos o
endógenos. Nosotros
estamos expuestos
permanentemente a los
factores físicos y
químicos.Estamos muy
expuestos a los rayos UV.
Los factores endógenos
tienen que ver con el
metabolismo aeróbico normal. Estamos sometidos a la posibilidad de generar ROS, los
cuales deben ser controlados por un sistema de defensa antioxidante, aunque este control
no es siempre muy preciso. Cuando hay un exceso de producción de ROS hay daño
oxidativo y ese daño se ve reflejado en los lípidos, las proteínas y en el dna. Cuando este
daño no puede ser reparado, tenemos como consecuencia una mutación. Y esta mutación
implica un cambio en la secuencia del DNA, y trae como consecuencia llevar a una
dormición(detención, enlentecimiento) del proceso de replicación de dna. Las
consecuencias que también se ven pueden ser las apoptosis y el cáncer
.
Es importante diferenciar
cuando el daño al dna se
produce en células que
tienen que ver con la
replicación y cuando se
produce en células
somáticas que no tienen
que ver con la
replicación. Las
consecuencias van a ser
sumamente distintas. La
reparación del dna en
células que no tienen
que ver con la
replicación trae como
consecuencia un
envejecimiento
prematuro, a veces con pérdida de funciones y daño a la salud. En cambio,con las células
replicativas la apoptosis y el cáncer van a ser las consecuencias que vamos a tener
La mutación tiene que implicar un cambio PERMANENTE en el cambio de la secuencia de
DNA. Es permanente y heredable. Esta es la importancia de la conservación del DNA, ya
que tiene información genética y es heredable.
Esas mutaciones pueden ser de
diferentes tipos.
Consecuencias del
cambio en un
nucleótido.Acá tenemos
la tirosina, y vemos lo
que pasa cuando hay un
cambio en cada uno de
los nucleótidos.
Aca vemos cual es el
cambio que se
produce cuando hay
una mutación en un
nucleótido de la beta
globina. El codón
normal es CAG, y
termina dando
Glutámico. Si hay un
cambio y es GUG, en
vez de glutámico va a
ser valina. Esto traerá
consecuencias
realmente importantes
en la fisiología.
Es extremadamente importante el
grado de exactitud en la molécula
de ADN. El ADN no solamente
está en el núcleo guardado y
protegido, es una molécula como
cualquier otra que tiene
participación en muchísimas
reacciones químicas. Esta
participación activa en el
metabolismo es lo que justamente
lo expone a sufrir modificaciones y
daños que lleven a una mutación.
Estas mutaciones pueden ser
espontáneas, en el proceso normal
de replicación por parte de la
polimerasa. Pero además están
las inducidas. Dentro de los agentes químicos pueden ser endógenos y exógenos. Los
agentes físicos principales son los rayos UV, los gamma, los X, y el humo del cigarrillo. Los
agentes biológicos tienen que ver con virus, hongos, diferentes tipos de microorganismos
que tienen vida.
Hay muchísimos compuestos químicos
que desconocemos que sean agentes mutagénicos. Hubo un señor que tuvo una idea
interesante para poder identificar compuestos mutágenos a través de un método
sencillo.Este es el método de Ames, en una placa de petri donde hay un medio de cultivo
que no tiene histidina pongo el mutágeno y si hay un crecimiento significa que el mutageno
indujo reventantes.
La estructura a la izquierda
es un dímero de timina. Es
una lesión muy frecuente que
se produce entre las
cadenas. Es el tipo más
común de daño generado por luz UV.
Los oxidación pueden ser
generadas por los ROS.
La guanina se aparea
mediante 3 puentes H
con la citosina. Pero
cuando hay una
metilación( uno de los
daños que se puede
producir) en el residuo
6 de la guanina hay un
cambio en la
estructura del
nucleótido y como
consecuencia habrá un
error en el
apareamiento. En vez
de aparearse con la
citosina, se va a
aparear con la timina.
La citosina
cuando se
desamina, puede
formar uracilo. La
única diferencia
que tiene el
uracilo con la
citosina es la
presencia del
grupo amino. La
citocina
normalmente se
aparea con la
guanina. Pero el
uracilo va a
aparearse con la
timina. Esto trae
como
consecuencia una mutación. La desaminación de la citosina es un evento muy frecuente.
El grupo metilo en la timina en la molécula de ADN es clave ya que indica que esa timina
que está en el adn es la que corresponde y no es un uracilo que viene de la desaminación
espontánea de la citosina. Esta es la razón por la que la naturaleza eligió a la timina para el
ADN y no al uracilo, porque de lo contrario no podría diferenciarse un uracilo producto de la
desaminación del adn y un uracilo que fue normalmente ubicado en la molécula del adn. Si
la citosina no tuviera este fenómeno de desaminación espontánea, no habría sido necesario
crear una molécula de timina.
La adenina puede desaminarse pasar a hipoxantina,y la guanina a xantina y como
consecuencia no aparean con su correspondiente base complementaria.
La depurinación
es otro de los
fenómenos que se
consideran
mutaciones. La
guanosina en el
dna por un
fenómeno de
liberación de la
guanina queda un
residuo apurínico
que tiene que ser
necesariamente
reparado
El fenómeno de alquilación es otro
fenómeno químico exógeno que lleva al
daño en el adn. Es un compuesto común
que lleva a alquilación sin las aflatoxinas,
que son típicos compuestos provenientes
de hongos que crecen en el maní. Por
acción del citocromo p450 la aflatoxina se
convierte en un agente altamente
alquilante. Esta alquilación hace que en ves
de que la guanina se aparea con la citosina,
la timina se aparea con la adenina.
Los dímeros de timina se forman
mayormente por LUZ UV pero NO ES
LA ÚNICA CAUSA. ESTE TIPO DE
DÍMEROS DE TIMINA SE FORMA EN
LA MISMA CADENA DE ADN, ES
INTRACATERANIO. PERO TAMBIÉN
HAY ALGUNOS COMPUESTOS
COMO EL PSORALENO QUE
PRODUCE QUE SE FORMEN
DÍMEROS DE TIMINA
INTERCATENARIOS.
¿Cuáles son los 3 pasos
fundamentales que se van a poner en
marcha cuando haya un daño que
todavía no es mutación para tratar de
corregirlo? Primeramente la célula
tiene que poner la maquinaria en
funcionamiento para reconocer que
hay una base errónea en alguna de las
cadenas del DNA. Después tiene que
poner en funcionamiento todo su
equipamiento proteico para remover
esa base. Y después otras proteínas
que van a reparar el hueco que va a quedar, van a participar la ligasa y la polimerasa. Estos
3 pasos son los 3 pasos en común que en cualquier tipo de daño van a ocurrir.
Durante la replicación es el primer sistema ya que ocurre en simultáneo a la replicación del
DNA, es el primero y más inmediato.
Acá tenemos el tipo de daño que se
puede producir y una lista de las
enzimas que participan en cada uno
de estos procesos. Y como les dije al
principio, la reparación del adn es un
proceso muy ineficiente desde el
punto de vista energético. O sea, si
no fuera tan indispensable la célula
no invertiría tanta energía en un solo
fenómeno metabólico.
No son reacciones complejas,son
reacciones sencillas pero
extremadamente importantes. Hay
que invertir lo que sea necesario para llevarlas a cabo.
Hay un apareamiento
erróneo detectado , hay un
sitio donde reconoce una
exonucleasa. La
polimerasa va a detenerse
y como tiene una función
exonucleasa cambia la
posición, se acomoda
diferente sobre la doble
hebra y cambia su función.
Va a producir un corte
sobre la doble hebra y va a
liberar el nucleótido erróneo. Una vez que sucede esto la polimerasa vuelve a cambiar de
posición e incorpora el nucleótido correcto con un gasto de ATP y continúa el fenómeno de
copia
El proofreading es
inmediato. Si esto
fuera 100% eficiente
la celula deberia
trabajar menos para
reparar danos
posteriormente. Pero
como no lo es, hay
otros mecanismos
que van a
complementar la
reparacion del DNA
Este es un mecanismo de reparación de
apareamiento erróneo pero donde
interviene un complejo enzimático que se
aprovecha de un fenómeno que tiene que
ver con el proceso de replicación. Esta
enzima dam metilasa identifica una
secuencia GATC que es una secuencia
palindrómica y metila la adenina cuando
encuentra esta secuencia. Esta es una
secuencia bandera que va a indicar que
tiene que metilarse la adenina. Mientras
la polimerasa va copiando sobre la hebra
molde durante el proceso de replicación
existen unos minutos, un periodo muy corto de tiempo donde la adenina que se incorpora
para aparearse con la timina no va a ser metilada. Esa adenina queda sin metilar en la
nueva hebra que se está copiando sobre la hebra molde durante este tiempito. Queda
entonces el DNA hemimetilado, es decir va a estar la adenina de la cadena molde metilada
pero no está metilada la adenina de la cadena nueva. Entonces, luego la DAM metilasa va a
metilar a la adenina de la cadena nueva. A partir de ahí uno no puede distinguir la cadena
nueva y la cadena molde ya que ambas están metiladas en la misma adenina en el sitio
palindrómico.
Y para qué sirve esto?
De esta manera:
En un determinado
momento la célula
reconoce que hay un
apareamiento erróneo en
determinado lugar de la
hebra de adn. Entonces
lo que hace es reclutar
un sistema de 3
proteínas. MutS y MutL
son las dos primeras que
son reclutadas en el
lugar donde se identificó
este apareamiento
erróneo. Este lugar va a
estar a determinada
distancia de una zona GATC metilada. Lo que ocurre es que se fijan estas dos proteínas
sobre ese sitio, mientras sigue transcurriendo la copia. En algún momento alguna de las
secuencias metiladas llega hasta el lugar donde está MutL/MutS. Cuando llega el metilo al
lugar, la MutH que es una nucleasa se va a fijar sobre este complejo. Entonces una vez que
se identificó este metilo que está sobre la hebra vieja y no sobre la nueva ya que estamos
aprovechando esos minutos, la MutH cliva la hebra no metilada. Se corta la hebra nueva.
La MutH seguirá comiendo la hebra y
degradando hasta encontrar el lugar del
apareamiento erróneo. Luego libera el lugar
para que la polimerasa ponga el nucleótido
correcto.\
Este mecanismo ha sido identificado tanto en E Coli como en mamíferos. El que está a la
izquierda es el de E Coli y el de la derecha el de mamíferos. No participan las mismas
enzimas pero el proceso de reparación es igual. Entonces dijimos que se produce un corte
por la nucleasa, luego habrá una degradación de la cadena nueva hasta llegar al lugar
donde está el nucleótido erróneo, la polimerasa copia y finalmente la ligasa liga y cierra.Así
queda curado el daño. Hay un gran gasto de ATP
Otro de los procesos tiene que ver con la escisión de base. No es necesario escindir un
nucleótido completo, sino que la célula tiene mecanismos para reparar una base específica.
Primero se identifica cual es la base incorrecta que está en el nucleótido. Hay una
glicosilasa que lleva el nombre de la base nitrogenada que tenga que reparar, la cual
elimina la base incorrecta y va a quedar en su lugar un sitio AP. Entonces ahora viene una
endonucleasa que corta la cadena y en este caso no solamente se incorpora la base, sino
que se remueve una parte de la
cadena para asegurarse que la
reparación sea correcta.
La polimerasa va a tomar NTPs del
medio celular y va a incorporar nuevos
nucleótidos y luego el nick(hueco que
queda) va a ser cerrado por la ligasa.
Luego
tenemos un
mecanismo
más
sofisticado que
es la
reparación por
escisión de
nucleótidos.
Este también
se produce en
E.Coli y en
humanos.
Participa un
complejo de
nucleasas que
tienen la
particularidad
de romper la
cadena de dna en dos puntos simultáneamente.Hace un corte a la izquierda y uno a la
derecha del lugar danado. Ese complejo enzimático recibe el nombre de excinucleasa. Es
parecido en E.Coli y en humanos. Está codificado por los genes UvrABC. Las enzimas de
este complejo excinucleasa van actuar cada una en un momento diferente pero forman un
verdadero complejo enzimático. El lugar danado lo identifica ya que produce un cambio en
la estructura, una deformidad en la molécula del adn. Hay un nucleótido erróneo que
produce una deformación, se hace como un loop en la doble cadena y esto es lo que
identifica la excinucleasa. Actúa produciendo un corte a la izquierda y otro a la derecha, que
está con mucha precisión determinado el número de nucleótidos que corta a la derecha y a
la izquierda. En el caso de la E. Coli el fragmento liberado es de 13 nucleótidos y en el caso
de los mamíferos es de 29. Esa es una de las diferencias en un caso y en el otro, pero el
procedimiento es igual. Cuando se reconoce este loop, las proteinas UvrB y UvrA se
localizan en el lugar, fijan el loop y cuando está identificado y perfectamente fijado
primeramente se libera la uvrB, la uvrA queda fijada y esto permite el ingreso de la uvrC que
produce el corte definitivo, o sea la liberación del fragmento de 13 o 29 nucleótidos según
sea el caso. Una vez que quedó un extremo para empezar a copiar por la polimerasa, la
polimerasa empieza a copiar usando la otra cadena como molde hasta que viene la ligasa y
cierra el nick. Así queda completamente reparada. La polimerasa es la polimerasa I en el
caso de las bacterias y la epsilon en el caso de los mamíferos. Y en este caso habíamos
dicho que los dímeros de piridina se pueden reparar por escisión de nucleótidos.
Todos los mecanismos que vimos hasta ahora escisión de bases, proofreading, escisión de
nucleótidos son mecanismos de reparación INDIRECTOS. Ahora vamos a ver los
mecanismos de reparación directa. Acá no hay necesidad de remover ni la base, ni el
nucleótido, ni el fragmento de adn. Aca la reparación se produce in situ, el gasto de energía
es menor. No participan tantas enzimas, la reparación se hace sin modificar la cadena de
adn.
Este mecanismo
ocurre tanto en plantas
como en humanos.
Las proteínas
específicas que
participan se llaman de
otra manera. Este
ejemplo es de
PLANTAS: Acá
participan dos
cromóforos.Aprovechan la energía lumínica que viene del sol en un rango que va desde
300 a 500nm. El mthf-polyglu absorbe la energía, se excita y transfiere esa energía a la
flavina dinucleótido. Esa energía de excitación pasa al sitio activo de la flavina dinucleótido
que se va a transformar en un compuesto activo que necesita volver a su estado basal. Y
para eso transfiere esa energía y el electrodo correspondiente al dímero de pirimidina que
es un ciclobutano que es lo que hay que reparar. Este electrón que se transfiere junto con la
energía de excitación hace que se genere un radical inestable en este compuesto erróneo
que hay que romperlo. Esta deslocalización electrónica comienza un transporte de
electrones que se va relocalizando hasta que finalmente se rompe el ciclobutano y luego el
electrón vuelve a la flavina y
esta vuelve a su estado de
deficiencia electrónica.
Otro tipo de reparación directa
es cuando se produce un
daño por alquilación de
nucleótidos. La guanina es
uno de los nucleótidos
susceptibles a sufrir
alquilación, el MMS es uno de
los compuestos que produce
alquilación. La guanina
transformada en metilguanina
va a aparearse contimina y
esto producirá la mutación
correspondiente. Y esto,
¿Cómo se repara?
Se repara con la
participación de
unas enzimas
metiltransferasas
que no son enzimas
verdaderas, pero
cumplen el rol de
enzimas. Cumplen
este paso para
reparar el nucleótido
de guanina y no
pueden volver a su
estado original. Su
sitio activo es
bloqueado por el
metilo que proviene
de la metilguanina.
Se va a metilar el
sulfhidrilo de la
cisteína de la metiltransferasa. Y esto es irreversible, por eso se lo denomina suicida. La
metiltransferasa ya no puede ser utilizada nuevamente.
El tercer caso de
reparación directa
de bases alquiladas
descripto en E.Coli
donde la
metiladenina y la
metilcitosina van a
ser reparadas por
una enzima
llamada AlkB que
depende de ferroso
y alfa cetoglutarato.
La AlkB es un
deshidrogenasa.
Utiliza el
alfacetoglutarato, lo
pasa a succinato y
el metilo de la
metiladenina forma formaldehído utilizando uno de los carbonos del alfacetoglutarato y
libera la adenina reparando. De manera similar, la metilcitosina se repara liberando
formaldehído. En este caso la AlkB no es bloqueada como ocurría con la metiltransferasa.
Uno de los fenómenos
más graves es la rotura
de la doble cadena, ya
que se suele producir de
forma masiva. Esa doble
rotura de cadena de
ADN se repara por
rembonicacion genética.
El fenómeno de
recombinación necesita
como molde un
cromosoma homólogo
Cuando se produce
el corte de la doble
hebra va a haber
una irregularidad,
diferencias de
longitudes ya que la
exonucleasa corta
más la 5 que la 3’.
El extremo 3’ queda
casi intacto. Va a
haber un desplazamiento y una invasión de la doble hebra intacta por parte de una de las
dos cadenas que han sido cortadas. Esto se hará para poder usar como molde la doble
cadena.
El extremo 3’ se introduce dentro de la otra doble cadena y la comienza a usar como molde
para poder reconstituir la copia . Hay una horquilla de replicación que se reconstruye
usando otra doble cadena.
Hay otra manera de hacerlo mediante la recombinación de extremos no homólogos que es
mucho más inexacta.
Recombiancion homologa, paso a paso:
La respuesta SOS es una respuesta de socorro que se activa cuando hay un daño muy
extenso y que hay que repararlo como sea. No importa la prolijidad, ni los recursos que se
utilicen hay que hacerlo. Ocurre un daño masivo y hay un bloqueo en la replicación, se
detiene la replicación. La cantidad de mutaciones que aparecen cuando se detiene la
replicación es enorme. La célula va a destinar todos los recursos posibles para reparar el
dna.
Actúa la proteína RecA
(proteasa) y la LexA . La LexA
es una proteína que
normalmente reprime al sistema
SOS, es decir impide la acción
de la RecA. La proteína RecA
está siempre en una forma
inactiva mientras no sea
necesario. Pero cuando se
produce la necesidad de la
respuesta SOS la proteína RecA
que es una polimerasa 5 activa
una digestión de la LexA para
que esta se libere del DNA y lo
deje propenso a ser reparado.
La reparación del DNA por este
mecanismo es muchísimo menos fiel. Por eso es que las polimerasas 4 y 5 no tienen la
fidelidad ni el proofreading que tienen las 1,2 y 3.