Seminario de ácidos nucleicos_Con_Textos_2020

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Nucleótidos 
 
 
 
La unión de la base nitrogenada a la pentosa recibe el nombre de nucleósido y se realiza a través del carbono 
1’ de la pentosa y los nitrógenos en las posiciones 3 (pirimidinas*) o 9 (purinas⧫) de las bases nitrogenadas, 
mediante un enlace de tipo N-glucosídico. 
La unión del nucleósido con el ácido fosfórico se realiza a través de un enlace de tipo éster entre el grupo 
OH del carbono 5’ de la pentosa y el ácido fosfórico, originando un nucleótido. Los nucleótidos son las 
unidades o monómeros utilizados para construir largas cadenas de polinucleótidos. 
- Nucleósido = Pentosa + Base nitrogenada. 
- Nucleótido = Pentosa + Base nitrogenada + Ácido fosfórico. 
- Polinucleóotido = Nucleótido + Nucleótido + Nucleótido + .... 
*Las bases púricas derivadas de la purina (fusión de un anillo pirimidínico y uno de imidazol) son Adenina 
y Guanina. 
⧫Las bases pirimidínicas (derivadas de la pirimidina) son Timina, Citosina y Uracilo. 
 
 
Las bases nitrogenadas que forman generalmente forman parte del ADN son: adenina (A), guanina (G), 
citosina y timina (T). Las bases nitrogenadas que forman parte del ARN son: adenina (A), guanina (G), 
citosina (C) y uracilo (U). Es decir que la timina es específica del ADN y el uracilo es específico del ARN. 
Los tipos de bases nitrogenadas son: 
Pirimidinas: formadas por un único anillo (C, T y U). El enlace con el azúcar lo hacen a través del átomo 
N3 (Nitrógeno en posición 3 del ciclo). 
Purinas: formadas por 2 anillos (A y G). El enlace con el azúcar lo hacen a través del N9 (Nitrógeno en 
posición 9 del heterociclo). 
 
 
Además de las bases nitrogenadas citadas en la anterior diapositiva, es frecuente encontrar modificaciones 
de las mismas, tanto púricas como pirimídicas. Entre las más abundantes se encuentran: la 5-metilcitosina 
y la 5-hidroximetilcitosina, que reemplazan a la citosina en varios tipos celulares (ver tabla en diapositiva 
14); la 6-metiladenina, que se la ha relacionado con la regulación de la expresión del ADN; la 7-
metilguanina (Cap5’) y el dihidrouracilo, que forman parte de la estructura de los ARN (estas bases llegan 
a constituir el 10% del total de las bases); y la hipoxantina y la xantina, los cuales son intermediarios 
metabólicos y productos de reacción del ADN con sustancias mutagénicas. 
La inosina, nucleósido de hipoxantina, permite el apareamiento del anticodón del ARNt (ver diapositiva 35) 
con más de un codón (A, C y G). Adicionalmente, en el ARNt también se encuentran la seudouridina, 
formada por uracilo y ribosa unidos a través de un enlace β(1’-5); la ribotimidina (un nucleósido de timina 
y ribosa); y la dihidrouridina, formada por ribosa y dihidrouracilo unidos por enlace β(1’-1). 
 
El azúcar pentosa en el caso de los ácidos ribonucleicos (ARN) es la D-ribosa, y en el caso de los ácidos 
desoxirribonucleicos (ADN) es la 2-desoxi-D-ribosa. Esta última se diferencia de la primera por la pérdida 
del grupo OH en el carbono 2 del azúcar. Notar que ambas poseen 5 carbonos y estructura pentagonal (de 
furanosa). 
 
 
En esta figura se muestran, a modo de resumen, las estructuras de los nucleótidos que componen el ARN 
(las 4 estructuras ubicadas en la parte superior de la figura) y el ADN (las 4 ubicadas abajo). 
Las diferencias entre ellas son: la ausencia del grupo OH en los azúcares que forman parte de los nucleótidos 
constitutivos del ADN y la presencia diferencial de Uracilo y Timina en el ARN y el ADN, respectivamente. 
Si bien las estructuras mostradas poseen una única molécula de fosfato asociada, los nucleótidos pueden 
tener 1, 2 ó 3 grupos fosfato, unidos al carbono 5’ de la pentosa, existiendo por tanto, nucleótidos 5’ 
monofosfato (NMPs), nucleótidos 5’ difosfato (NDPs) y nucleótidos 5’ trifosfato (NTPs). 
 
Además de ser los pilares estructurales de los ácidos nucleicos, los nucleótidos desempeñan en las células 
otras funciones no menos importantes. 
● Los nucleótidos di y trifosfato (NDP y NTP) actúan como sustancias precursoras en la síntesis 
enzimática de los ácidos nucleicos. 
● El ATP es un transportador de fosfato en muchas reacciones enzimáticas en las que se requiere la 
fosforilación de una sustancia para obtener energía. Por ejemplo, en la degradación de glucosa, el 
primer paso es la fosforilación, que se realiza mediante una molécula de ATP que pasa a ADP. 
Los enlaces éster entre las moléculas de ác. fosfórico de los NDPs y NTPs son enlaces de alta energía. Estos 
enlaces son tan fuertes porque tienen que superar la repulsión electrostática que se genera entre las cargas 
(O- de los grupos fosfato). Tal característica es aprovechada en el metabolismo celular: cuando se produce 
el paso de ATP a ADP y de ADP a AMP, se cede una cierta cantidad de energía que es aprovechada para la 
formación de un enlace de alta energía entre el sustrato y el ác. fosfórico. 
● El AMPc (un fosfato cíclico de adenosina en el que el grupo fosfato está unido mediante enlace éster 
al hidroxilo de la posición 3' y al de la posición 5'), se forma a partir del ATP en el interior de las 
células. Actúa como mediador de muchos mensajeros extracelulares, como hormonas, 
neurotransmisores, prostaglandinas, etc. 
● Algunos nucleótidos no nucleicos (que no forman parte de los ácidos nucleicos), funcionan como 
coenzimas, por ejemplo: NAD, NADP, FAD, etc. Todas estas intervienen en las reacciones de 
oxidación-reducción y actúan asociadas a las deshidrogenasas, de forma que las enzimas quitan H+ y 
e- del sustrato (lo oxidan) y las coenzimas los captan quedando reducidas a NADH+H, NADPH+H y 
FADH2. De forma inversa pueden actuar provocando la reducción del sustrato y quedando las 
coenzimas reducidas. 
● Los nucleótidos NTPs y NDPs actúan como transportadores de determinadas sustancias sillares para la 
fabricación de macromoléculas. Por ejemplo, el UDP es el transportador de la glucosa durante la 
síntesis del glucógeno. La coenzima A incluye un nucleótido (ADP) en su molécula. 
 
 
Las pirimidinas y purinas libres son compuestos débilmente básicos y son por lo tanto llamados bases. 
Tienen una variedad de propiedades fisicoquímicas que afectan la estructura, y la función de los ácidos 
nucleicos. Las purinas y pirimidinas comunes en el ADN y el ARN son moléculas altamente conjugadas y 
ello influye sobre la estructura, distribución de electrones, y absorción de la luz de los ácidos nucleicos. La 
resonancia entre los átomos en el anillo otorga a la mayor parte de los enlaces el carácter de doble enlace 
parcial. Un resultado es que las pirimidinas son moléculas planas y las purinas son casi planas. 
Las bases púricas y pirimidínicas son hidrofóbicas y relativamente insolubles en las soluciones acuosas con 
pH casi neutro del interior celular. Contrariamente, en soluciones ácidas o básicas las bases adquieren cargas 
por lo cual su solubilidad aumenta. 
Debido a la presencia de anillos aromáticos que forman parte de la estructura de todas las bases 
nucleotídicas, éstas absorben luz ultravioleta presentando un máximo de absorbancia en longitudes de onda 
cercanas a 260 nm. 
Como puede verse en la figura, dependiendo de cuál de los nucleótidos se trate tanto la longitud de onda en 
la cual se observa la máxima absorbancia como la absortividad o coeficiente de extinción variará. 
El valor máximo de absorbancia de las distintas bases puede utilizarse no sólo para detectar y cuantificar 
las bases, los nucleósidos y los nucleótidos, sino especialmente para determinar la concentración de los 
ácidos nucleicos. 
 
 
Además, las pirimidinas y purinas libres pueden existir en dos o más formas tautoméricas dependiendo del 
pH, la ceto-enólica y la imina-amina. 
 
Ácidos Nucleicos 
 
 
A principios de 1900, Levene propuso que la nucleína se encontraba en las células animales y estaba 
compuesta por ácido fosfórico, una pentosa y bases nitrogenadas. Con el tiempo identificó que
la pentosa 
era una ribosa y varios años después se supo que era la desoxirribosa. Levene tuvo mucha importancia en 
el estudio de la química de los ácidos nucleicos, a pesar de su incorrecta propuesta de que los cromosomas 
vegetales eran de ARN y los animales de ADN. En 1926 propuso un modelo estructural de los ácidos 
nucleicos: el tetranucleótido plano, en el cual los ácidos nucleicos estaban formados por planos de cuatro 
pentosas, exponiendo hacia el interior los grupos fosfatos y hacia el exterior las bases nitrogenadas. 
En el año 1950 Erwin Chargaff demostró que las proporciones de las bases nitrogenadas eran diferentes en 
los distintos organismos sugiriendo que el modelo anterior era incorrecto. Además, en base al estudio de las 
proporciones relativas de cada uno de los nucleótidos planteó las reglas que se detallan en la diapositiva. 
Estas reglas se cumplen en los organismos cuyo material hereditario es ADN de doble hélice. 
 
 
De la observación de la tabla pueden extraerse las siguientes conclusiones: 
● Casi todos los ADN estudiados, provenientes de distintas fuentes, cumplen la relación A=T y G=C, 
con excepción del ADN del bacteriofago ØX174*. El ADN de este virus es de una sola hebra. 
● En los virus ARN no se cumple la equimolaridad de las bases excepto en el caso del virus del Tumor 
de las heridas y de los Reovirus que tienen ARN de doble hélice. En estos virus se cumple que A=U y 
G=C, además se cumple que A+G/U+C=1. 
● El fago T7 en vez de citosina tiene hidroximetil-citosina (HMC, ver diapositiva 6). 
● Algunos organismos tienen en su ADN una pequeña proporción de 5-metil-citosina (5-Me-C) que 
sustituye a la citosina (ver diapositiva 6). 
La proporción A+T/G+C es específica de cada organismo y como veremos más adelante cuando hablemos 
de las propiedades físico-químicas de los ácidos nucleicos, dicha proporción está relacionada con la 
densidad y la temperatura de fusión. 
*Este fue el primer organismo secuenciado completamente, trabajo que realizó Sanger en 1977 (ver 
diapositiva 62). 
 
 
Para determinar la estructura tridimensional o disposición espacial de las moléculas de ADN, se hace incidir 
un haz de rayos X sobre fibras de ADN y se registra la difracción de los rayos sobre una película fotográfica 
donde, al revelarse, se observan manchas en los lugares donde inciden los rayos X. El ángulo de difracción 
presentado por cada una de las manchas en la película suministra información sobre la posición de cada 
átomo en la molécula de ADN. 
La imagen es la famosa fotografía 51, un patrón de difracción de rayos X obtenido por Franklin y Gosling 
y publicado en el artículo de abril de 1953 de la revista Nature (abajo a la izquierda). En las conclusiones 
de dicho artículo los autores señalan que: 
(a) La estructura es probablemente helicoidal. 
(b) Posiblemente esté formada por dos hebras coaxiales (con un mismo eje). 
(c) Los fosfatos se encuentran hacia el exterior (y no hacia el centro como propuso Levene y apoyó Pauling 
en 1953*). 
(d) El diámetro de la hélice es de 20 Å. 
Mencionan además que sus resultados concuerdan con el modelo de Watson y Crick publicado en el mismo 
número de la revista Nature: “Thus our general ideas are not inconsistent with the model proposed by 
Watson and Crick in the preceding communication.” Asimismo, en Julio de 1953 publicaron otro trabajo 
donde mediante el uso de difracción de rayos X se observa con mayor claridad la naturaleza helicoidal de 
ADN. 
*El modelo de Pauling consistía en una hélice de tres cadenas, donde iones de magnesio sostenían los 
fosfatos, y hacia la periferia se encontraban las pentosas y las bases nitrogenadas. Watson y Crick lo 
mencionan en su trabajo, pero deciden no apoyarlo, entre otras razones, porque observan que algunas 
distancias de Van der Waals eran muy pequeñas. 
 
 
James Watson y Francis Crick (1953) fueron los primeros investigadores en proponer una estructura para 
los ácidos nucleicos. Para realizar su trabajo emplearon dos tipos de datos ya existentes: por un lado, 
utilizaron los datos obtenidos por Chargaff (1950) relativos a la composición de bases nitrogenadas en el 
ADN de diferentes organismos; y por el otro, estudios de difracción de rayos X sobre fibras de ADN 
publicados por Astbury (1947) y Maurice Wilkins (1953). 
Su teoría sobre la estructura helicoidal del ADN fue apoyada por los datos cristalográficos publicados por 
Wilkins, et al., y Franklin y Gosling, en el mismo número de la revista. Por este trabajo, Watson, Crick y 
Wilkins recibieron el Premio Nobel de Medicina en 1962. No compartieron el premio con Rosalind 
Franklin, ya que para entonces había fallecido. 
 
 
Watson y Crick propusieron un modelo de estructura para el ADN conocido con el nombre de Modelo de 
la Doble Hélice. Las características del modelo son las siguientes: 
● El ADN es una doble hélice enrollada helicoidalmente “a derechas” (sentido dextrorso). 
● Enrollamiento de tipo plectonémico: para separar las dos hélices es necesario girarlas como si fuera un 
sacacorchos. 
● Los grupos fosfato se encuentran hacia el exterior de la hélice, en tanto que las bases púricas y 
pirimidínicas están apiladas en el interior de la doble hélice. 
● Cada hélice es una serie de nucleótidos unidos por enlaces fosfodiéster en los que un grupo fosfato 
forma un puente entre grupos OH de dos azúcares sucesivos (posiciones 3’ y 5’ de uno y otro, ver la 
siguiente diapositiva). 
● Las hélices son antiparalelas (secuencias inversas), una hélice lleva la secuencia de átomos 5’P → 3’OH 
, mientras que la hélice complementaria sigue la secuencia de átomos 3’OH → 5’P. 
● Las hélices se mantienen unidas mediante puentes de hidrógeno producidos entre las bases nitrogenadas 
de cada una. Las bases se encuentran en sus configuraciones cetónicas, cumpliendo así las reglas de 
apareamiento A-T (mediante dos puentes de hidrógeno) y G-C (mediante tres puentes de hidrógeno). 
● Las bases nitrogenadas están apiladas a una distancia de 3,4 Å y cada 10 bases (34 Å) se produce una 
vuelta completa de la doble hélice (360º). 
● La secuencia de bases nitrogenadas puede ser cualquiera, no existe ninguna restricción. 
● El diámetro de la doble hélice es de 20 Å. 
En la diapositiva se muestran dos formas de representación de la estructura del ADN y el modelo original 
presentado por Watson y Crick. Observar los surcos mayor y menor, el diámetro de la hélice (20 Å), las 
distancias entre las bases (3.4 Å) y la vuelta que se completa cada 36 Å (10,5 pb). 
En el campus de la materia se encuentra un video donde se puede observar la estructura tridimensional del 
ADN (estructura ADN B_1bna.pdb.mpg). 
 
 
Los nucleótidos se unen entre sí para formar largas cadenas de polinucleótidos. Como mencionamos en la 
diapositiva anterior, la unión entre monómeros de nucleótidos se realiza mediante enlaces fosfodiéster entre 
los carbonos de las posiciones 3’ de un nucleótido y la 5’ del siguiente. 
También observar en la imagen el detalle en los puentes de hidrógeno que se establecen entre A-T (dos) y 
G-C (tres), y que, como se mencionó anteriormente, se trata de hebras antiparalelas. 
Además, la estructura en doble hélice de Watson y Crick (1953) planteó varias propiedades importantes del 
material hereditario: 
● Al no existir ninguna restricción en la secuencia de bases nitrogenadas, el ADN posee la suficiente 
variabilidad como para ser el material hereditario. Además, debe existir algún código que permita pasar 
de la secuencia lineal de bases nitrogenadas en el ADN a la secuencia lineal de aminoácidos en las 
proteínas. 
● Las reglas de complementariedad de las bases nitrogenadas A-T y G-C indican una forma sencilla de 
replicación del material hereditario, el método semiconservativo. Cuando el ADN se replica, sus dos 
hélices se separan y cada una de ellas sirve de molde para sintetizar una nueva hélice siguiendo las reglas 
de apareamiento
de las bases nitrogenadas. 
● La mutación a nivel molecular consistiría en un cambio en la secuencia de bases nitrogenadas. 
 
 
● Los enlaces de hidrógeno entre las bases permiten la asociación complementaria de dos (y de vez en 
cuando tres o cuatro -ver más adelante) hebras de ácido nucleico. Los patrones más importantes de puente 
de hidrógeno (A-T y G-C) predominan en ADN y ARN de doble cadena y es el que permite la duplicación 
de la información genética. Sin embargo, los cambios de pH, al afectar la ionización de los grupos 
químicos de las bases nitrogenadas y al equilibrio de tautómeros, modifican las posibilidades de formación 
de enlaces de hidrógeno y, por tanto, el apareamiento de bases. 
● El apilamiento de bases refiere al tipo de interacción que se da entre las nubes electrónicas de los anillos 
de las bases nitrogenadas (interacciones hidrófobas). El apilamiento no es un fenómeno cooperativo, 
puesto que dos bases se aparean a igual velocidad si están solas o si están formando parte de un 
polinucleótido. Sin embargo, se ha observado que el apilamiento se encuentra energéticamente favorecido 
cuanto mayor sea el número de bases que interaccionen. 
● La interacción hidrofóbica es un fenómeno descubierto por Wilkins y Astbury al tratar de validar el modelo 
del tetranucleótido de Levene. En esta disposición, se minimiza la interacción de los anillos de las bases 
nitrogenadas, de carácter hidrofóbico, con el entorno polar de la solución acuosa que los rodea. También 
disminuye la tensión superficial generada entre las bases y el agua. Al disponerse el agua por fuera del 
polinucleótido de una manera ordenada, éste tiende aún más a agregarse, por lo que se genera una especie 
de cavidad estable en el agua. 
 
 
El modelo de la Doble Hélice propuesto por Watson y Crick está basado en estudios del ADN en solución 
(hidratado). La denominada forma B ó ADN-B tiene un mayor interés biológico ya que es la que presenta 
el ADN en interacción con las proteínas nucleares, pero también existen otras estructuras posibles que puede 
presentar el ADN. 
ADN-A: cristalografía de ADN con 75% de humedad, requiere Na, K o Cs como contraiones, presenta 11 
pares de bases por giro completo y 23 Å de diámetro. Es interesante por presentar una estructura parecida a 
la de los híbridos ADN-ARN y a las regiones de auto-apareamiento ARN-ARN. El plano de los pares de 
bases de ADN-A se inclina 20º con respecto al eje de la hélice. Estos cambios estructurales profundizan el 
surco mayor al mismo tiempo que el surco es menos profundo. 
ADN-B: cristalografía de ADN en solución, 92% de humedad, se encuentra en soluciones con baja fuerza 
iónica y se corresponde con el Modelo de la Doble Hélice. 
ADN-Z: doble hélice sinistrorsa (enrollamiento a izquierdas), 12 pares de bases por giro completo, 18 Å de 
diámetro, se observa en segmentos de ADN con secuencia alternante de bases púricas y pirimidínicas 
(GCGCGC), debido a la conformación alternante de los residuos azúcar-fosfato sigue un curso en zig-zag. 
Requiere una concentración de cationes superior a la del ADN-B, y teniendo en cuenta que las proteínas 
que interaccionan con el ADN tienen gran cantidad de residuos básicos sería posible que algunas 
convirtieran segmentos de ADN-B en ADN-Z. La ranura principal es apenas evidente en Z-ADN, y el surco 
menor es estrecho y profundo. 
Se desconoce si hay estructura ADN-A en las células, pero hay evidencias de la presencia de tramos cortos 
de ADN-Z en células procariotas y eucariotas. Estas extensiones de ADN-Z pueden desempeñar un papel 
en la regulación de la expresión de algunos genes o en la recombinación genética. 
 
 
Otras variaciones estructurales que han sido detectadas en el ADN es el palíndromo. Un palíndromo es una 
palabra, frase u oración que se escribe de forma idéntica ya sea hacia adelante o hacia atrás (como Neuquén, 
o Yo dono rosas, oro no doy). 
El término se aplica a las regiones de ADN con repeticiones invertidas de secuencia de bases (una hebra es 
autocomplementaria consigo misma), y que tienen simetría en las dos hebras de ADN (es decir que la 
secuencia 5’→3’ de una cadena es idéntica a la secuencia 5’→3’ de la otra, el palíndromo). Las secuencias 
auto-complementarias tienen el potencial para formar horquillas o estructuras cruciformes (en forma de 
cruz). 
La medida en la que palíndromos forman estructuras cruciformes en las células no se conoce, aunque se las 
ha visto en E. coli, y se han encontrado estructuras conteniendo múltiples horquillas en hebras individuales 
de ADN (o ARN) en solución. Se cree que en algunos casos sirven para la reparación de secuencias dañadas, 
o como medios de regulación de la expresión génica, como en el caso de los Elementos de Respuesta al 
Hierro (IRE). Por ejemplo, la aconitasa es una enzima que une clusters de Fe-S, pero en su ausencia, la 
forma apo de la enzima se une a la secuencia 5’ del mensajero de la ferritina (una estructura de tipo 
horquilla), bloqueando su traducción, y disminuyendo la concentración de la enzima que almacena hierro. 
A su vez, también se une al extremo 3’ del mensajero del receptor de Fe (otra estructura de tipo horquilla), 
evitando su degradación. 
 
 
Cuando la repetición invertida se produce dentro de la misma cadena de ADN, la secuencia se llama 
repetición espejo. Las repeticiones espejo no tienen secuencias complementarias dentro de la misma cadena 
y no pueden formar horquillas ni estructuras cruciformes. Estos tipos de secuencias se encuentran en 
prácticamente todas las moléculas de ADN y pueden abarcar unos pocos pares de bases o miles. Su utilidad 
en la célula se ha asociado con el reconocimiento por enzimas de restricción, o para el reconocimiento de 
sitios de metilación. 
 
 
El ADN triple hélice o ADN-H, es una estructura poco habitual, formada por 3 hebras (una triple hélice, 
triplex, o tríplice). Se descubrió por primera vez en un ARN, aunque es en el ADN donde se encuentra con 
más frecuencia. Se forman en regiones ricas en pirimidinas (secuencia (CT)n) en una hebra y por lo tanto 
ricas en purinas (secuencia (AG)n) en la hebra complementaria. En condiciones normales, dichas secuencias 
se encuentran totalmente apareadas sin alteración alguna en la doble hélice. Sin embargo, puede ocurrir que 
parte de la doble hélice se abra y la hebra rica en CT se repliegue y aparee con la hebra AG, mediante una 
nueva clase de enlaces de hidrógeno (conocidos como enlaces de Hoogsteen). Aparece así una triple hélice 
(CT)n/(AG)n/(CT)n en dicho segmento del ADN, en tanto que la otra hebra desapareada (rica en A y G) 
forma una especie de bucle. 
 
 
Ciertas regiones del ADN (y ARN) ricas en guanina pueden plegarse en estructuras secundarias no 
canónicas, llamadas G-cuadruplex o ADN cuadruplexo. Estas estructuras comprenden dos o más tétradas 
de guanina que se forman cuando cuatro guaninas se mantienen en una disposición plana a través de enlaces 
de tipo Hoogsteen, y con una estabilización adicional proporcionada por un catión monovalente coordinado 
por los átomos de oxígeno de cada guanina. 
Los ADN cuadruplexos se han asociado con varios aspectos importantes de la función del genoma, incluidas 
la transcripción, la recombinación y la replicación. Dado que son estructuras que poseen una alta estabilidad 
termodinámica, estos motivos también se encuentran protegiendo los extremos de los cromosomas 
(telómeros*). De hecho, se ha visto cómo el desplazamiento de los componentes proteicos asociados al 
ADN cuadruplexo conduce a la muerte celular. 
*Por el descubrimiento de la telomerasa y la protección de los cromosomas por los telómeros fueron 
galardonados con el Premio Nobel en Fisiología y Medicina en 2009 Elizabeth Blackburn (ex estudiante 
doctoral de Sanger), Carol Greider (ex estudiante doctoral de la primera), y Jack Szostak. 
 
 
Se denomina desnaturalización de los ácidos nucleicos a la separación
de las hebras que lo constituyen. Es 
importante señalar, que esto se debe a la ruptura de puentes de hidrógeno e interacciones hidrofóbicas en la 
molécula y no a la ruptura de enlaces covalentes, siendo entonces un proceso reversible. Puede tratarse de 
un proceso total o parcial, que se ve favorecido por el aumento en la temperatura y por el cambio del pH de 
las soluciones (ver diapositiva 19). La renaturalización de una molécula parcialmente desnaturalizada es un 
proceso rápido, en tanto que es muy lento cuando la molécula se encuentra totalmente desnaturalizada. 
La desnaturalización espontánea suele darse en regiones ricas en A-T, en tanto que cuanto mayor es el 
contenido en G+C mayor es la cantidad de energía (calor) que hay que suministrar para alcanzar el mismo 
efecto (ver más adelante). 
 
 
Un parámetro relacionado con la desnaturalización del ADN, muy utilizado en técnicas de biología 
molecular, es la Temperatura de Fusión (Tm). Ésta temperatura se define como la temperatura necesaria 
para desnaturalizar la mitad del ADN de una mezcla (punto medio de la reacción ADN doble hélice → ADN 
hélice sencilla). 
La estabilidad de la doble hebra de ADN está relacionada con la proporción de A+T respecto de C+G; 
aumentando cuando el contenido de bases G + C sea mayor. Esto se debe a que estas bases interaccionan 
con un número mayor de puentes de hidrógeno (3 respecto de los 2 con los cuales interaccionan A y T) por 
lo cual será necesario suministrar una mayor cantidad de energía (temperatura) para separarlas. 
¿Cuál de las dos muestras de la figura de la izquierda tiene mayor contenido de C+G? ¿Por qué? 
 
 
La desnaturalización del ADN se produce en un estrecho intervalo de temperatura y da lugar a cambios 
relevantes en muchas de sus propiedades fisicoquímicas. En particular, el cambio en la absortividad es 
particularmente útil. 
Como mencionamos en la diapositiva 9, los anillos heterocíclicos de los nucleótidos absorben luz UV (con 
un máximo cercano a 260 nm, que es característico de cada base). Pero cuando las bases están apareadas 
(ADN doble cadena o dsDNA), la absorción del ADN es un 40% menor que la que mostraría una mezcla 
de nucleótidos libres con la misma composición y concentración. El cambio en la absorbancia debido a la 
renaturalización del ADN se denomina efecto hipocrómico y se debe a interacciones entre los sistemas de 
electrones de las bases, que es posible gracias a su apilamiento en una disposición paralela a la doble hélice. 
La absorbancia del ADN de cadena sencilla (ADN simple cadena, o ssDNA) es mayor que la absorbancia 
del dsDNA, y el cambio en la absorbancia debido a la desnaturalización del ADN se conoce como efecto 
hipercrómico (significa: "más color"). 
Cualquier desviación del estado bicatenario se refleja en un cambio en la absorbancia, es decir, en un 
aumento en la densidad óptica hacia el valor característico de las bases libres. Por tanto, se puede monitorear 
la desnaturalización del ADN mediante medidas de absorbancia. Como ejemplo podemos citar el estudio 
de la desnaturalización de dobles hebras para determinar el valor de TM en el cual se realizan cambios en 
la temperatura y se mide la absorbancia a 260 nm. 
 
 
El tamaño de las moléculas de ADN es considerablemente grande en comparación con el tamaño de una 
célula (observar en la figura aproximadamente a escala, los tamaños de la célula E. coli y su ADN), si el 
ADN humano dentro del núcleo de cualquier célula pudiese extenderse mediría más de metro y medio. Para 
poder contenerlo en su interior, las células deben desarrollar sistemas de almacenamiento o 
empaquetamiento llamados cromosomas. Los cromosomas son las moléculas más grandes dentro de una 
célula. 
En general bacterias y virus tienen un único cromosoma, en tanto que los eucariotas tienen varios. 
 
 
El ADN se encuentra muy compactado dentro de la célula, lo que implica que presenta un alto grado de 
organización estructural, ya que los mecanismos de plegado no sólo deben empacar el ADN, sino también 
permitir el acceso a la información contenida. 
El primer aspecto topológico del ADN, luego de la doble cadena, es el superenrollamiento. Esto es, un 
enrollamiento de una estructura que ya es espiralada. Un ejemplo de esto se observa en los tramos de cable 
entre la base y el receptor del teléfono que a menudo incluye uno o más superenrollamientos. El ADN se 
enrolla como una doble hélice alrededor de un eje (estado relajado), y cuando sigue espiralándose sobre sí 
mismo se produce el superenrollamiento del ADN. El superenrollamiento sólo permanece si los extremos 
se mantienen retenidos o sujetos, ya que de no ser así, el libre giro deshace las superhélices. Tal sujeción 
puede ser externa o bien debida a la unión de ambos extremos entre sí, de modo que la cuerda (o la molécula 
de ADN) forme un círculo. 
Cuando un ADN presenta 10 bp por vuelta de hélice aparece en estado relajado. Cuando un ADN presenta 
menos vueltas de hélice (porque hay más de 10 bp/vuelta), se produce un superenrollamiento negativo que 
dobla la hélice en sentido dextrógiro. Cuando un ADN presenta más vueltas de hélice alrededor de su eje 
imaginario (porque hay menos de 10 bp/vuelta) se produce un superenrollamiento positivo que dobla la 
hélice en sentido levógiro (ver videos en el campus de la materia). En el interior de las células, el ADN 
aparece superenrollado negativamente (en la forma menos compacta), lo que facilita la apertura de la doble 
hélice durante la replicación y la transcripción. 
 
 
Las topoisomerasas son las enzimas encargadas de modificar la topología del ADN in vivo catalizando los 
procesos de torsión y relajación, lo que ayuda a solucionar los problemas que surgen durante la replicación, 
transcripción, y reparación del DNA. El resultado de la acción continua de las topoisomerasas en las células 
es que el ADN se encuentre habitualmente en estado superenrollado (–). 
La función de estas enzimas es importante porque: 
● Ayuda en la compactación del ADN. 
● Permite el acercamiento de regiones alejadas en secuencia (clave en procesos de regulación). 
● Permite que tengan lugar los procesos de replicación y transcripción. Durante estos procesos se separan 
las dos hebras mediante el desenrollamiento local de la doble hélice (que es mediado por polimerasas 
y helicasas), esto provoca un superenrollamiento (+) en las regiones adyacentes, que es relajado por 
topoisomerasas (la de tipo IV). 
Topoisomerasas tipo I: 
● Relajan sup– en E. coli; en eucariotas relajan el (–) y el (+). 
● Hidrolizan un enlace fosfodiéster en una hebra, hacen pasar la otra hebra a través del corte y vuelven a 
unir los extremos de la primera. 
● No necesitan ATP. 
Topoisomerasas tipo II: 
● Relajan el (+) a (–) y pueden aumentar el (–) 
● Hidrolizan los enlaces fosfodiéster de ambas hebras, hacen pasar otro segmento de la doble hebra a 
través del corte, y sellan nuevamente los enlaces hidrolizados. 
● Requieren ATP 
gel: Visualización de topoisómeros. En este experimento, todas las moléculas de ADN tienen el mismo 
número de pares de bases pero exhiben diferentes grados de superenrollamiento. Debido a que las moléculas 
de ADN superenrolladas son más compactas que las moléculas relajadas, migran más rápidamente durante 
la electroforesis en gel (movimiento de arriba a abajo -se puede revisar este concepto en diapositiva 60). 
 
 
El material genético nuclear se encuentra estrechamente asociado a proteínas llamadas histonas. Estas 
proteínas (con carga positiva) unen al ADN delimitando un bucle donde la doble hélice tiene el giro 
restringido, y fuerzan el enrollamiento de la molécula de ADN a su alrededor. 
Todas las células eucariotas tienen cinco grandes clases de histonas (H1, H2a, H2b, H3, y H4), que difieren 
en peso molecular (entre 11.000 y 21.000 daltons) y composición de aminoácidos (son proteínas ricas en 
aminoácidos básicos,
como arginina y lisina). 
La hebra de ADN alrededor de las proteínas (aproximadamente 150 pb), más la hebra de conexión con el 
siguiente complejo ADN enrollado a las proteínas (apróx. 50 pb) constituye el nucleosoma (ver esquema). 
Cada nucleosoma contiene ocho moléculas de histonas: dos copias de cada uno de H2A, H2B, H3, y H4, y 
a su vez, una sucesión nucleosomas se asocian a la histona H1. 
Al microscopio electrónico es posible observar la estructura de la cromatina como cuentas de un rosario, en 
donde el ADN se une a las histonas. 
 
 
El nucleosoma es la unidad fundamental de organización sobre la cual se construye el embalaje de orden 
superior llamado cromatina. Esta se compone de fibras que contienen proteína y ADN en aproximadamente 
iguales masas, junto con una pequeña cantidad de ARN. En la cromatina también se encuentran otras 
proteínas no histónicas, algunas de las cuales ayudan a mantener la estructura cromosómica, o regulan la 
expresión de genes específicos. Empezando por el nucleosoma, el ADN cromosómico eucariótico se va 
empaquetando en una sucesión de estructuras de orden superior, dando finalmente la estructura compacta 
del cromosoma que puede ser visto al microscopio óptico. 
Durante el ciclo celular eucariótico se producen importantes cambios en la estructura de los cromosomas. 
En las células eucariotas que no se dividen (en G0) y en aquellas que están en la interfase (G1, S, y G2), la 
cromatina es amorfa y parece estar dispersa aleatoriamente en ciertas partes del núcleo. Durante la fase S, 
el ADN en su estado amorfo se replica, y cada cromosoma produce a su cromosoma hermano (llamado 
cromátidas hermanas) que permanecen asociados uno con el otro después de que la replicación se haya 
completado. Los cromosomas se vuelven mucho más condensados durante la profase de la mitosis. 
 
 
El ácido ribonucleico (ARN) está presente tanto en las células procariotas como en las eucariotas, y es el 
único material genético de ciertos virus. Se cree que las primeras formas de vida contenían ARN y no ADN 
como molécula de la herencia. Severo Ochoa ganó el Premio Nobel de Medicina en 1959 tras descubrir 
cómo se sintetiza el ARN. 
Entre otras funciones, los ARN cumplen un rol fundamental en la síntesis de proteínas. 
 
 
La estructura primaria del ARN es muy similar a la del ADN está formada por ribosa (observar el grupo 
OH en el C2 ausente en la desoxirribosa), las bases nitrogenadas, adenina, guanina, citosina y uracilo, y 
fosfato. 
 
 
Existen tres principales tipos de ARN. 
● ARN mensajero (ARNm o mRNA): transporta el mensaje genético del ADN a los ribosomas para 
dirigir la síntesis de proteínas. Representa el 5% del ARN total. En el extremo 3’ los ARNm 
contienen citosina y guanina metiladas, y una secuencia de poliadenilato (cola poliA) con 100 a 200 
nucleótidos. En el extremo 5’ contienen 7-metilguanina (Cap5’) que identifica a este ARN como 
mensajero. 
● ARN ribosomal (ARNr o rRNA): forma parte de la estructura de los ribosomas. Se compone por un 
grupo de moléculas que se clasifican en base a sus coeficientes de sedimentación como 23s, 16s y 
5s (en procariotas), o 28s, 17s, 7s y 5s (en eucariotas). Es el ARN que se encuentra en mayor 
proporción (constituye el 80% del total). Los ARNr poseen bases metiladas y la longitud de sus 
cadenas es variable (p. ej. el ARNr 5s tiene alrededor de 120 nucleótidos, mientras que el ARNr 
28s tiene aproximadamente 4000 nucleótidos). 
● ARN de transferencia (ARNt o tRNA): se trata de las moléculas más pequeñas de ARN (70 a 95 
nucleótidos) y constituye el 15% del total. Su función es acoplar la información del ARNm con los 
aminoácidos. Los ARNt tienen ribotimidina, seudourudina y dihidrouridina (DHU). Además, en el 
extremo 3’ se encuentra una secuencia constante CCA que es el sitio de unión del aminoácido. 
● Además, en el núcleo existe un grupo heterogéneo de moléculas de ARN (hnRNA) que cumplen 
funciones en diversos procesos (ver a continuación). 
 
Además de cumplir un rol fundamental en la síntesis de proteínas, existen diversos tipos de ARN que llevan 
a cabo gran variedad de funciones, que aún se siguen descubriendo y clasificando. En términos generales, 
las moléculas de ARN que no son del tipo ARNm se denominan ARN no codificante. La gran diversidad, 
la abundancia y la capacidad de intervenir en procesos regulatorios han llevado a la hipótesis de que ARN 
habría precedido en la evolución al ADN y a las proteínas. 
● Catalítico: Muchas enzimas están compuestas total (ribozimas) o parcialmente (ribonucleoproteínas) por 
ARN. El representante más importante es el ARNr que forma parte de los ribosomas. La Ribonucleasa 
P es una ribozima con actividad ARNsa, y la telomerasa es una ribonucleoproteína. 
● Replicación del ADN: la ARNsa de procesamiento de ARN mitocondrial (RMRP) es una 
ribonucleoproteína que inicia la replicación del ADN mitocondrial. La telomerasa se encarga de 
mantener los extremos de los telómeros en eucariotas durante la replicación. Además, en animales 
existen los Y-ARN que interaccionan con la cromatina y con proteínas iniciadoras de la transcripción. 
● Modificación postraduccional: en eucariotas y arqueas, los small nuclear RNA (snRNA)—en asociación 
con proteínas, que en conjunto se conocen como snurps-—y la ribonucleoproteína RMRP participan en 
la maduración del pre-ARNm para producir el ARNm funcional (splicing). Los small nucleolar RNA 
(snoRNA) son abundantes en los nucleolos y se encargan de procesar las moléculas de ARNr, mediante 
metilaciones y pseudouridilaciones de nucleótidos específicos. La Ribonucleasa P es una ribozima con 
actividad ARNsa que participa de la maduración del ARNt. 
● Regulación génica: la traducción de ciertos ARNm está regulada por moléculas de ARN, en base a 
complementariedad de secuencia. Los microRNA (miRNA) son pequeñas moléculas de 
aproximadamente 22 a 26 nucleótidos que se unen a regiones complementarias del ARNm y reprimen 
su traducción. Se demostró que participan durante ciertos estadíos del desarrollo, y que su concentración 
se encuentra alterada en ciertos tipos de cáncer y otras enfermedades. 
Por su parte, los small interfering RNA (siRNA) son moléculas de entre 21 y 25 pares de bases; una hebra 
de una molécula de doble cadena de siRNA se incorpora al complejo RISC, y este reconoce una secuencia 
de ARNm complementaria a la que unió previamente e inhibe su transcripción. Este mecanismo podría 
haber surgido como un mecanismo de defensa contra virus de ARN de doble cadena. 
Más recientemente se han descripto los denominados long noncoding RNAs (lncRNAs)--de más de 200 
nucleótidos--que regulan la expresión suprimiendo o promoviendo la transcripción, La evidencia actual 
sugiere que los lncRNAs podrían regular prácticamente todos los procesos celulares, y su expresión está 
estrictamente regulada. 
En varias especies bacterianas, incluyendo a Escherichia coli, se han descripto los small RNAs (sRNAs) que 
actúan en trans regulando genes. Algunos genes pequeños codifican para sRNAs que poseen 
complementariedad de bases con los ARNm de los genes que se regulan, pudiendo inhibir o estimular su 
traducción, o bien promover su degradación. Otro tipo de sRNA bacteriano es el 6S RNA, que inhibe a la 
ARN polimerasa uniéndose a la subunidad que estimula la transcripción para permitir a la bacteria entrar en 
fase estacionaria. 
De particular relevancia en bacterias y arqueas es el sistema CRISPR, que destruye moléculas de ADN o 
ARN (dependiendo de la especie) extrañas que ingresen a la célula y confiere resistencia a parásitos. Este 
sistema depende en parte de moléculas cortas de ARN denominadas crRNA que reconocen el ADN foráneo. 
Los riboswitches son secuencias antisentido que forman elementos de estructura secundaria y funcionan 
como sensores que detectan estímulos del entorno (por ejemplo: la temperatura o la concentración de 
metabolitos)
y responden a ellos regulando la traducción del ARNm. Han sido descriptos tanto en 
procariotas como en eucariotas. 
 
Las estructuras tridimensionales de muchos ARN, como las de las proteínas, son complejas y únicas, no 
existiendo una estructura secundaria simple que sirva como punto de referencia (como sí ocurre con la doble 
hélice del ADN). Interacciones débiles, especialmente las de base apilables, desempeñan un papel 
importante en su estabilización. La estructura de doble cadena predominantemente hallada es la de tipo A, 
con giro a la derecha; las hélices tipo Z solo se han obtenido en el laboratorio (en condiciones de alta 
concentración salina o en altas temperaturas); en tanto que no se ha observado la forma B en el ARN. 
La mayor parte de los ARN tienen bases y nucleótidos modificados, que probablemente les permiten resistir 
la acción de las nucleasas del citoplasma. 
(a) Estructura tridimensional del ARNt-fenilalanina de levadura. 
(b) Una ribozima cabeza de martillo (así llamado debido a que la estructura secundaria en el sitio activo 
parece la cabeza de un martillo), derivado de ciertos virus de plantas. Las ribozimas, son enzimas 
de ARN que catalizan una variedad de reacciones, principalmente en el metabolismo de ARN y 
síntesis de proteínas. 
(c) Un segmento de ARNm conocido como intrón, del protozoo ciliado Thermophila tetrahymena. Este 
intrón (una ribozima) cataliza su propia escisión de entre los exones en una cadena de ARNm. 
Se muestra un patrón de emparejamiento de bases inusuales que se encuentra frecuentemente en el tARN 
(G-U). El apareamiento entre G-U sólo está permitido cuando las hebras de ARN se pliegan o hibridan con 
ellas mismas. No hay polimerasas de ARN (las enzimas que sintetizan ARN a partir de un molde de ADN) 
que inserten un U opuesto a una G (o viceversa) en el templado de RNA durante su síntesis. 
 
Se muestra la estructura secundaria del componente ARN de la enzima ARNasa P de E. coli (contiene 
también un componente proteico que no se muestra), que interviene en el procesamiento de ARN de 
transferencia. 
Las diferentes estructuras secundarias que puede adquirir el ARN son producidas por bases no apareadas o 
mal apareadas, las cuales son comunes y dan lugar a protuberancias (cuando una o dos bases de una hebra 
no están apareadas) o bucles internos. También se forman horquillas entre secuencias autocomplementarias 
cercanas. Los dos corchetes indican secuencias complementarias adicionales que pueden estar apareadas en 
la estructura tridimensional del ARN. Los puntos azules indican pares no Watson-Crick (G-U). 
 
Debido a la presencia del OH en el C2 de la ribosa, el ARN presenta una menor estabilidad en soluciones 
alcalinas que el ADN. Observar la reacción química: esta propiedad será aprovechada en los métodos de 
purificación. 
 
 
El primer paso en la purificación es liberar los ácidos nucleicos de la fuente que lo contiene, por lo que 
dependiendo de la muestra se disgregará el tejido, o se lisarán los cultivos o las células aisladas (ej. sangre). 
La clarificación es una centrifugación donde se eliminan los restos de tejido y células. 
La purificación propiamente dicha consiste en separar el ácido nucleico de interés, de las proteínas, lípidos, 
carbohidratos, ácidos nucleicos no deseados, y otros compuestos inorgánicos. Se realiza por medio de 
diferentes técnicas que veremos a continuación. 
Dependiendo de si se trata de ADN o ARN se utilizan en cada paso algunas enzimas o reactivos que permiten 
la purificación de uno u otro ácido nucleico. Lo importante es mantener la integridad del mismo, y un alto 
grado de pureza. 
https://www.youtube.com/watch?v=a8d8ZNSX880 
https://www.youtube.com/watch?v=a8d8ZNSX880
 
Hay diferentes procedimientos para la disgregación del tejido que puede ser mecánica, química o 
enzimática. 
La homogeneización mecánica consiste en romper las uniones entre las células para facilitar su interacción 
con las soluciones de lisis, que son soluciones que desnaturalizan las proteínas y mantienen estable al ácido 
nucleico. Se puede realizar de varias formas, utilizando distintos tipos de morteros u homogeneizadores. 
Antes de iniciar la disgregación mecánica, es recomendable adicionar una pequeña cantidad del buffer de 
lisis, para asegurar que el pH del medio sea el adecuado, para inactivar enzimas que podrían dañar la muestra 
y también para ayudar en el proceso de homogeneización. 
En la homogeneización mediante agentes químicos, la muestra se mantiene en solución en presencia de 
detergentes, proteasas y agentes caotrópicos que rompen las uniones entre las células o que incluso pueden 
perforar la membrana celular. La disgregación química es recomendable para bacterias, muestras pequeñas 
de tejidos frescos o sangre. 
La disgregación enzimática involucra el uso de enzimas, como la lisozima (hidroliza las uniones β-1,4 entre 
el N-acetilmurámico y la N-acetil-D-glucosamina de la pared celular bacteriana), proteasas (rompen los 
enlaces peptídicos de las proteínas) y liticasas (hidroliza enlaces β-1,3-glicosídicos como los presentes en 
el glucano de la pared celular de levaduras). 
 
Durante el proceso de lisis se modifican o destruyen las interacciones entre las moléculas que conforman la 
pared y las membranas celular y nuclear, permitiendo que los ácidos nucleicos se liberen. En la diapositiva 
se listan, con su función, diferentes compuestos que podrían formar parte del buffer de lisis. 
Es importante tener presente que los compuestos deben mantener la integridad del ácido nucleico de interés, 
pudiendo o no degradar los contaminantes (proteínas, ácidos nucleicos no deseados, etc). Se utilizan 
soluciones básicas, detergentes o agentes caotrópicos que permiten disolver la membrana celular, así como 
inhibidores para inactivar las enzimas que degradan el AN. Muchas soluciones de lisis contienen EDTA, 
que forma un complejo con los iones de Mg2+ e impide el funcionamiento de las DNasas y RNAsas. 
A continuación, los componentes celulares no solubles, como el material fibroso y proteínas, que 
permanecen en solución, se separan del ADN por centrifugación (clarificación). 
 
La diapositiva muestra un ejemplo sobre el uso de Proteinasa K. Se observan diferentes resultados si se usa 
proteinasa K, subtilisina A (otra proteinasa, pero menos efectiva) o si no se usa ninguna. En el 1er tubo se 
puede ver una buena cantidad de ADN (desnaturalizado y blanquecino), en tanto que en el 2do se ve poca 
cantidad de ADN. 
Sin embargo, el resultado no sólo dependerá el uso de una u otra proteinasa (o ninguna), sino también de la 
muestra. Muchas veces los métodos utilizados varían en sus protocolos y en el orden de agregado de los 
reactivos, o bien el usuario confunde los pasos a seguir. En el 3er y 4to tubo se muestran resultados de 
realizar el tratamiento con proteinasa K después de realizar la separación ácidos nucleicos/contaminantes 
que veremos a continuación, y un caso en el que no se cuidó la muestra y se degradó parte del ácido nucleico. 
 
Se mencionan distintos métodos de purificación que detallaremos en las siguientes diapositivas. Los tres 
primeros pueden ser usados tanto para la purificación de ADN como de ARN. 
 
 
 
El procedimiento de purificación por extracción orgánica se basa en la separación de fases mediante 
centrifugación. El fenol es poco soluble en agua, y disuelve las proteínas formando la fase orgánica, el 
cloroformo solubiliza lípidos y mejora la separación de las 2 fases (quedaría difusa usando solo fenol), y el 
alcohol isoamílico reduce la formación de espuma. A su vez, estos disolventes son reconocidos por su color: 
una fase acuosa clara, superior y una fase inferior de color rosa brillante. 
ADN: En este caso se trabaja a pH 8, por lo que los ácidos nucleicos estarán cargados negativamente y 
quedarán en la fase acuosa. Sin embargo, el ARN será degradado por la acción de
ARNasas y el pH alcalino 
(ver diapositiva 39). Luego de recuperar la fase acuosa, el ADN se precipita con isopropanol o etanol en 
presencia de sales (iones de sodio o amonio): el agregado de alcoholes a una solución acuosa de ADN hace 
que disminuya la polaridad del medio; en tanto que las sales se unen a los grupos fosfato reduciendo las 
fuerzas repulsivas entre las cadenas. En ambos casos disminuyen las interacciones ADN-solvente (recordar 
que el ADN interacciona con el solvente acuoso a través de uniones polares), permitiendo que el ADN se 
pliegue sobre sí mismo y se insolubilice (el ARN degradado quedará en solución). Un paso de centrifugación 
permite que el ADN permanezca en el fondo del tubo mientras que el alcohol puede ser desechado. Sin 
embargo, dado que las sales utilizadas pueden co-precipitar con el ADN, se realiza este paso más de una 
vez, de modo de lavar el pellet de ADN y purificarlo (el etanol 70% tiene una polaridad intermedia que 
permite disolver muchas de las sales sin disolver el ADN). En el último paso se descarta el etanol y el 
remanente se elimina por evaporación. 
 
 
ARN: En este caso, se trabaja a pH 4, por lo que el ADN (doble cadena) tendrá sus grupos fosfatos 
protonados (y sin carga neta) y no se encontrará soluble en la fase acuosa, en tanto que el ARN (simple 
cadena) sí permanecerá en dicha fase. A pH ácido la mayoría de las proteínas se desnaturalizan y junto con 
los pequeños fragmentos de ADN (<10 kb) se fraccionan en la fase orgánica. También es frecuente adicionar 
una solución caotrópica, como el tiocianato de guanidina para favorecer la desnaturalización de las proteínas 
(entre ellas las ARNasas) y separar el ARNr de las proteínas que lo acompañan. Actualmente, se utiliza 
trizol que está compuesto por una mezcla de tiocianto de guanidina/fenol/cloroformo/isoamilico. 
El ARN se recupera de la fase acuosa mediante precipitación con 2-propanol o etanol. 
 
A bajas concentraciones de sal, muchas veces se observa un aumento en la solubilidad de las proteínas 
(salting-in) debido al aumento de las interacciones electrostáticas que tienden a mantener la proteína en 
solución. Al aumentar la concentración de sal, disminuye la solubilidad de la proteína, (salting-out) debido 
al aumento de las fuerzas hidrofóbicas que tienden a agregarlas y precipitarlas. Las sales de los iones 
divalentes (como el K2SO4 y el (NH4)2SO4), son mucho más eficaces en la solubilización de las proteínas 
que las sales de iones monovalentes (como el NaCl y el KCl). 
Para purificar el ácido nucleico, eliminando las proteínas y otros contaminantes celulares, se utiliza 
precipitación salina (que sustituye al tratamiento clásico con disolventes orgánicos tóxicos), y luego se 
centrifuga la muestra quedando el AN en el sobrenadante. Finalmente, el ácido nucleico se precipita en 
presencia de alcohol como estudiamos en la diapositiva anterior. 
 
La unión a soportes sólidos es el método más utilizado para la separación de ácidos nucleicos. Se trata de 
un mecanismo reversible de intercambio entre los iones en solución y los grupos funcionales de la fase 
estacionaria (insoluble) llamada resina. 
● En un primer paso, las moléculas en solución con cierta carga neta quedarán retenidas en la matriz que 
tendrá la carga opuesta. En este caso, para purificar un ácido nucleico, que tendrá carga negativa a pH 
7, se utiliza un intercambiador iónico con grupos funcionales cargados positivamente. 
● Al aumentar la concentración de sal, eluirán las moléculas contaminantes que se encuentran unidas a la 
matriz mediante interacciones débiles. 
● Para finalmente eluir la molécula de interés, se debe cambiar el pH del medio de elución de modo que 
una de las dos especies (la matriz o la molécula de interés) pierda o cambie su carga neta. En la 
diapositiva se muestra un intercambiador iónico capaz de perder su carga al aumentar el pH. 
Dado que el ácido nucleico eluido estará contenido en un volumen muy grande, y en soluciones de pH o 
concentración de sales inadecuados para el trabajo posterior, se lo suele precipitar con etanol y luego 
resuspender en el volumen y solución deseados 
 
Los ácidos nucleicos en solución acuosa también están recubiertos por una capa de hidratación de moléculas 
de agua (ver diapositiva 48). El mecanismo de purificación por unión a matrices de sílice se basa en la 
adsorción y desorción de los ácidos nucleicos en presencia de sales caotrópicas. Bajo estas condiciones, los 
ácidos nucleicos se unen a la membrana de sílica, mientras que las proteínas y otros contaminantes no se 
unen, y son eliminados durante los pasos de lavado. 
Posteriormente, los ácidos nucleicos se eluyen de la membrana de sílica utilizando baja concentración de 
sal o simplemente agua. 
 
Con esta tecnología, los ácidos nucleicos se unen selectivamente a pequeñas esferas paramagnéticas 
recubiertas de sílice (Si) en presencia de sales caotrópicas mientras que el resto de los contaminantes son 
eliminados de la muestra, al igual que como discutimos previamente. Las esferas son retenidas con un imán, 
lo que permite el lavado de los contaminantes para luego ser eluidas utilizando una solución de baja salinidad 
y están listos para ser usados en posteriores aplicaciones. 
 
Como mencionamos anteriormente, los distintos tipos de ARN están presentes en la célula en diferentes 
cantidades relativas (ver diapositiva 35). En ocasiones deseamos recuperar solo el ARNm, por ejemplo si 
nos interesa estudiar la expresión de algún gen en particular (ver más adelante), y para ello se puede utilizar 
este sistema. Se trata de una sucesión de timinas (oligo(dT)) unida a una matriz o a esferas paramagnéticas. 
Dado que el ARNm posee en su extremo 3’ una repetición de adeninas (cola de poliA), hibridará con el 
oligo(dT) de la matriz y los contaminantes podrán ser removidos. La elución se realiza con soluciones de 
baja fuerza iónica. 
 
Un plásmido es un fragmento de ADN doble cadena, extracromosómico y circular que puede replicarse de 
manera independiente al cromosoma bacteriano. En general estos fragmentos de ADN portan genes que les 
confieren ciertas ventajas adaptativas a las células (como la resistencia a antibióticos o la producción de 
sustancias tóxicas). Estas características han sido aprovechadas en la investigación científica y su uso está 
ampliamente distribuido en las técnicas de manipulación genética, como por ejemplo en la obtención de 
proteínas de interés en grandes cantidades. 
Para separar el ADN plasmídico del genómico es necesario hacer una desnaturalización y renaturalización 
rápida llamada lisis alcalina. 
● El buffer de lisis celular contiene: i) SDS, que solubiliza los fosfolípidos de las membranas y desnaturaliza 
proteínas e ii) hidróxido de sodio (NaOH), que desnaturaliza el ADN (genómico y plasmídico), ARN y 
proteínas. Debido a su gran tamaño, el ADN genómico se fragmenta durante este paso, en tanto que el 
ADN plasmídico solo se desnaturaliza y sus hebras continuarán vinculadas físicamente. Es importante que 
este paso se realice en forma rápida y eficiente porque largos períodos de incubación en estas condiciones 
pueden resultar en una desnaturalización irreversible del ADN plasmídico. 
● La solución de renaturalización (KAc/HAc, acetato de potasio a pH 4.8) neutraliza el pH básico de la 
solución de lisis y permite la renaturalización sólo del ADN plasmídico. Esto es debido, a que el ADN 
plasmídico es pequeño y puede renaturalizarse más fácilmente que el genómico el cual no se renaturaliza 
porque las largas hebras complementarias no se aparean correctamente (se producen apareamientos 
parciales) y a su vez forma un complejo con proteínas y otros componentes de la célula, que cubiertos por 
SDS, precipitan cuando este pierde solubilidad al reemplazar los iones sodio por potasio. 
● Luego de un paso de centrifugación, el ADN plasmídico permanece en solución en tanto
que los 
contaminantes quedan en el fondo del tubo. 
 
 
Luego de la purificación se puede determinar su rendimiento midiendo absorbancia a 260 nm, y su pureza 
e integridad por cromatografía en geles de agarosa. 
 
 
La concentración de ADN se puede estimar utilizando un espectrofotómetro de luz ultravioleta (UV), debido 
a que las bases púricas y pirimidínicas del ADN tienen la propiedad de absorber la luz UV a 260 nm (ver 
diapositiva 10). Dado que el ADN bicatenario absorbe menos que el monocatenario, y este menos que los 
nucleótidos sin oligomerizar (ver diapositiva 27), una unidad de densidad óptica (DO) a 260 nm equivale 
aproximadamente a 50 μg/ml de ADN de doble cadena, a 40 μg/ml de ARN ó ADN de cadena simple, y a 
33 μg/ml de oligonucleótidos. 
La determinación de la pureza de ADN se establece mediante la lectura de las absorbancias a 260, 280 y 
320 nm. En las preparaciones de ácidos nucleicos, son frecuentes las impurezas de naturaleza proteica. Dado 
que los aminoácidos aromáticos (Phe, Tyr, Trp) absorben luz UV (revisar seminario de proteínas), la 
presencia de proteínas lleva a sobreestimaciones de la concentración de ácidos nucleicos. La concentración 
de proteína puede ser evaluada a una absorbancia de 280 nm, por lo que es posible estimar el grado de 
impurezas de origen proteico a partir del cociente A260/A280. La presencia de proteínas en la muestra hará 
que el cociente A260 nm/A280 sea menor que el esperado para ácidos nucleicos puros. Una muestra pura 
debe presentar una relación 260/280 nm que exceda el valor de 1.7 para propósitos analíticos. 
Otro parámetro a considerar es la absorbancia a 320 nm, que está relacionada con la difracción de la luz por 
material particulado en la muestra. En algunos casos también se determina la absorbancia a 230 nm. Si 
Abs230/Abs260 es mayor de 0.5, sugiere contaminación con fenol, cloroformo o carbohidratos. 
Cuando la muestra es impura se revisa y repite el protocolo de purificación empleado. 
 
Al igual que las proteínas, la concentración de ADN también se puede determinar utilizando el equipo 
Nanodrop (revisar seminario de proteínas). La gran ventaja de esta técnica es que el volumen necesario 
para la cuantificación es muy pequeño (1ul). 
 
 
La electroforesis en geles de agarosa es una de las técnicas analíticas utilizadas en la caracterización de 
ácidos nucleicos en base a la forma y tamaño de las moléculas. La carga neta negativa, producto de los 
grupos fosfatos en el ADN y el ARN, resulta en una migración de las moléculas desde el polo negativo 
hacia el positivo cuando se aplica un campo eléctrico. La matriz, formada por agarosa (un polisacárido 
ramificado de unidades de D-galactosa y 3,6-anhidro-galactosa) ofrece resistencia al movimiento: las 
moléculas de mayor tamaño podrán migrar menos a través de la matriz por lo que quedarán en la región 
más cercana al punto de siembra, mientras que los fragmentos de menor tamaño se movilizarán con mayor 
velocidad. La conformación también afecta la migración, y en este sentido los ácidos nucleicos migran más 
cuanto más superenrollados se encuentran (observar en las diapositivas 30 y 60 las diferencias en la 
migración de un mismo ácido nucleico según su grado de enrollamiento). 
Generalmente los geles de agarosa en corrida horizontal son utilizados para separar fragmentos entre 100 
pb hasta 20 kb, en tanto que para la separación de moléculas de menor tamaño se utilizan geles de 
poliacrilamida. 
 
Uno de los métodos más utilizados para la visualización de los ácidos nucleicos en geles de agarosa es la 
tinción con el fluoróforo bromuro de etidio. Una molécula con grupos planares tricíclicos que se intercalan 
entre las bases del ADN sin especificidad de secuencia (debido a esto es que es altamente cancerígeno). Al 
unirse a los ácidos nucleicos, esta molécula aumenta su fluorescencia emitiendo luz visible (color naranja). 
 
Dependiendo de la concentración de agarosa en el gel, la matriz formada permitirá la separación efectiva de 
diferentes tamaños de ácidos nucleicos durante la electroforesis, y en consecuencia el tamaño (expresado 
en pares de bases o pb) puede ser calculado utilizando como referencia un marcador de peso molecular 
conocido. 
En la figura se pueden observar las diferencias en la migración del ADN de uno de los marcadores más 
utilizados, el bacteriófago lambda, antes (1 banda de 48.5 kbp) y después de ser digerido con la enzima de 
restricción Hind III. También se muestran otros marcadores, como el 1 kb ladder, que contiene bandas que 
aumentan su tamaño cada 500 bp (zona inferior) y cada 1000 bp (zona superior), y el 100 bp ladder, que 
como su nombre lo indica, contiene bandas cada 100 bp. 
Las concentraciones de ADN en cada banda son conocidas y en ocasiones los fabricantes incluyen más 
ADN de determinado tamaño de modo de producir una banda más intensa que sea fácil y rápidamente 
distinguible. 
Para que la estimación del tamaño sea efectiva, es importante que el ADN de la muestra también se 
encuentre linealizado. 
 
La purificación de ADN plasmídico (imagen de la izquierda) o de ARN (imagen de la derecha) también 
puede ser evaluada mediante electroforesis en geles de agarosa. En las dos figuras se muestran ejemplos de 
los mismos. 
En la imagen correspondiente al resultado de la purificación del ADN plasmídico se observa la presencia 
de tres bandas. Si bien la purificación fue exitosa, esto se debe a las formas lineal, circular y superenrollada 
que pueden encontrarse para un ADN plasmídico. 
Gel 1 (izquierda): calle 1: marcadores de número de pares de bases y en la calle 2: muestra de ADN 
plasmídico. Observar los perfiles de migración, ¿a qué se deben? 
Se puede obtener información de la integridad del ARN mediante la observación de la intensidad de las 
principales bandas de ARNr. Para ARNr de mamífero, una relación de 28S:18S de 2:1 es generalmente 
representativa de ARN de buena calidad. 
Gel 2 calle 1: marcadores de bp. 
 calle 2: ARN degradado por la presencia de ARNsas 
 calle 3: ARN purificado correctamente. 
 
En las siguientes diapositivas hablaremos de diferentes métodos de secuenciación. 
La flecha en la figura señala el -OH que se reemplaza por -H para obtener el dideoxi NTP (ddNTP) utilizado 
en el método de Sanger. 
 
 
El método de secuenciación de Sanger* se basa en la incorporación de dideoxinucleótidos (ddNTP) durante 
la replicación in vitro del ADN. El método hace uso de la capacidad natural de la ADN polimerasa de 
generar la hebra de ADN complementaria a otra, mediante la extensión de una cadena preexistente 
complementaria (primer). Durante la reacción, la enzima incorpora nucleótidos (dNTPs) en el sentido 5' → 
3', dejando el libre 3'-OH tras la incorporación de cada nucleótido, lo cual es necesario para la incorporación 
del siguiente. La técnica de secuenciación requiere un primer, complementario al extremo 5' de la región de 
ADN que se desea amplificar, marcado radiactivamente. Además, junto con los 4 deoxinucleótidos (dNTPs) 
debe agregarse--de a uno por vez--una baja proporción de uno de los ddNTP, que carecen del grupo OH en 
el C3 y que, por tanto, una vez incorporados por la polimerasa no permiten que continúe la elongación de 
la cadena. De esta manera, se generarán fragmentos con ddNTPs en todas las posiciones, dando lugar a 
fragmentos de distinto tamaño que permiten reconstruir la secuencia. 
Procedimiento: 
Se preparan cuatro mezclas de reacción en tubos diferentes. Todos las mezcla contiene los cuatro 
nucleótidos trifosfato (dATP, dCTP, dTTP y dGTP), ADN polimerasa I y un primer marcado 
radiactivamente. Sin embargo, a cada uno de los tubos se le incorporará uno solo de los dideoxinucleótido 
(ddATP, ddCTP, ddTTP o ddGTP); es decir, cada tubo tendrá un ddNTP diferente. 
El ddNTP utilizado competirá con su homólogo por incorporarse a la cadena de ADN que se está
sintetizando, produciendo la terminación de la síntesis en el momento y lugar donde se incorpora. De este 
modo, en cada mezcla de reacción se sintetizan moléculas de ADN de diferente longitud que terminarán 
todas cuando el ddNTP sea incorporado(ver secuencias en paso 2). 
A continuación se realiza una electroforesis en gel para separar los fragmentos de ADN producidos (como 
se indica en la figura, en cada calle se siembra el contenido de cada uno de los tubos de reacción). Para 
este procedimiento se utilizaban geles verticales muy finos (0,5 mm de espesor) y de gran longitud (50-100 
cm) que permiten distinguir diferencia de tamaño de 1 bp. 
Una vez terminada la electroforesis, el gel se pone en contacto con una película fotográfica de 
autorradiografía; recordemos que los primers utilizados se encuentran marcados radioactivamente. La 
aparición de una banda en una posición concreta de una de las cuatro calles nos indica que en ese punto de 
la secuencia del ADN está la base correspondiente al ddNTP utilizado en la mezcla de reacción 
correspondiente. Teniendo en cuenta que el ADN se sintetiza en dirección 5' → 3', los fragmentos de menor 
tamaño corresponderán al extremo 5' (es decir que de abajo hacia arriba es 5' → 3'). A su vez, como los 
ddNTP son agregados siguiendo las reglas de complementariedad, la secuencia obtenida es la 
complementaria a la que se desea secuenciar. 
https://youtu.be/FvHRio1yyhQ 
*En 1980 Sanger recibió su segundo Premio Nobel en Química por desarrollar esta técnica. 
 
 
El método automático, al igual que el método de Sanger, utiliza ddNTPs pero el análisis de los productos 
de reacción se realiza mediante fluorescencia ya que se emplean los 4 ddNTPs marcados con fluorocromos 
diferentes. La separación de los fragmentos se realiza una electroforesis en capilar lo que permite que la 
detección se lleve a cabo al mismo tiempo que la electroforesis, ya que los productos pasan por delante de 
https://youtu.be/FvHRio1yyhQ
un láser que excita los fluoróforos mientras un detector recoge la señal. A su vez, este sistema permite 
automatizar el proceso de manera que es posible leer al mismo tiempo los productos de reacción de cada 
una de las cuatro mezclas. Adicionalmente, como los fragmentos de ADN de menor tamaño que han sido 
detectados se dejan escapar del gel, la técnica permite aumentar el número de nucleótidos que se pueden 
determinar en cada secuenciación. 
https://youtu.be/wdS3j0TgbjM 
 
 
En la figura se muestra un ejemplo de una secuencia obtenida por el método automático de secuenciación. 
Cuando aparece la letra N significa que no ha sido posible determinar el nucleótido existente en esa posición 
de la secuencia. 
https://youtu.be/wdS3j0TgbjM
 
En la figura se muestra una tabla comparativa de distintos métodos de secuenciación. Observar los costos, 
la demora experimental y la longitud de la muestra a secuenciar. 
Next Generation Sequencing (NGS) es una plataforma que permite la secuenciación de miles de millones 
de ADN a la vez, por lo que revolucionó los campos de la medicina personalizada, las enfermedades 
genéticas y el diagnóstico clínico. Las diferencias en las 4 metodologías de NGS radican en los detalles 
técnicos de las reacciones de secuenciación: 
Pirosecuenciación: se incuba con un ddNTP a la vez y se detecta la liberación de PPi con cada nucleótido 
incorporado gracias a una reacción acoplada de la enzima luciferasa. Permite secuenciaciones largas, pero 
tiene mucho error. 
Secuenciación por síntesis: se basa en la incorporación secuencial y reversible de ddNTPs fluorescentes 
(con 4 colores distintos). Los 4 nucleótidos se incuban a la vez y luego de 1 reacción, se lavan los restantes. 
La señal se lee y el ddNTP se escinde de la secuencia, se lava y se continúa elongando. A medida que se 
extiende la secuencia aumenta el ruido por eliminaciones imperfectas de la sonda. 
Secuenciación por ligación: se diferencia por ser la única que no utiliza ADN polimerasa. En su lugar 
emplean fragmentos fluorescentes de 8nt con secuencias variables, donde cada color identifica sus 2 
primeros nucleótidos (ACxxxxxx → AC:rojo). Como las xxxxx son secuencias variables, siempre habrá 
una zona complementaria donde hibridar. Cuando esto sucede junto al primer, una ligasa los une, en tanto 
que todo lo demás se lava y luego se registra la señal. A continuación la sonda y los últimos 3nt se clivan y 
se repite todo hasta terminar la cadena. El proceso se repite usando un primer que hibrida en la misma región 
que el anterior, pero desplazado 1nt. Se repite unas 5 veces hasta secuenciar por completo. 
Secuenciación por Ion semiconductor: utiliza la liberación de hidrógeno durante la elongación. Con cada 
incorporación de nt hay un ligero cambio en el pH que es detectado por un semiconductor. Es muy similar 
a la pirosecuenciación, pero mucho más económica. 
https://youtu.be/jFCD8Q6qSTM 
 
 
Esta técnica también se basa en la replicación realizada por las ADN polimerasas, y utiliza reactivos 
similares. Una de las diferencias más importantes es que emplea 2 primers (en lugar de 1) que flanquean la 
secuencia de interés a amplificar, es decir que se diseñan para que sean complementarios a la región 3’ de 
cada hebra del ADN molde. Al hibridar el primer sobre la cadena molde, deja el OH 3’ libre para que la 
polimerasa realice la elongación de cada cadena (ver detalle en siguiente diapositiva). 
Esta técnica emplea ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para, separar las hebras de ADN formadas 
tras cada fase de replicación (desnaturalización), permitir que los primers vuelvan a unirse (hibridación), 
y duplicar nuevamente las hebras (extensión) (ver detalle en siguiente diapositiva). 
Inicialmente la técnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de 
temperatura y era necesario agregar nuevamente polimerasas luego de cada ciclo. Sin embargo, se 
comenzaron a utilizar ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos adaptados a vivir a 
altas temperaturas (como Thermus aquaticus (Taq polimerasa), Pyrococcus furiosus (Pfu), Thermococcus 
litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth)). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy 
procesivas (Taq) con otras capaces de hacer corrección de errores (proofreading). 
https://youtu.be/jFCD8Q6qSTM
En 1993 Kary Mullis y Michael Smith recibieron el Premio Nobel de Química debido a las mejoras que 
hicieron sobre esta técnica. 
 
 
La PCR se basa en la repetición de un ciclo formado por las tres etapas mencionadas anteriormente: 
1ª Desnaturalización del ADN doble cadena. La doble hélice de ADN se separa en dos hebras. Para ello se 
realiza una incubación de la muestra a altas temperaturas (93-97ºC). 
2ª Hibridación de los primers a las zonas que flanquean el fragmento que queremos amplificar. Se producirá 
cuando la temperatura disminuya (50-65º C, dependiendo de los primers utilizados). 
3ª Extensión por ADN polimerasa (68-72°C). La polimerasa utiliza el OH libre en la posición 3’ del primer 
y comienza a añadir dNTPs en dirección 5’→3’ siguiendo la secuencia de la cadena molde 
(complementaria). 
Una vez completado el primer ciclo, disponemos de 2 copias de la muestra original, al final del segundo 
ciclo tenemos 4, al final del tercero 8 y así sucesivamente. Si los ciclos se producen un número "n" de veces 
y suponiendo que el número de copias de ADN se duplica en cada ciclo, obtenemos una cantidad de ADN 
de 2n, por lo que la amplificación se realiza en forma de progresión geométrica (el amplificado será 
A=A0*2n, donde A0 son la cantidad de moléculas de molde iniciales, y n es el número de ciclos). 
Observar en la figura que la amplificación del fragmento de interés responde a una velocidad levemente 
menor: al final del primer ciclo dispondremos de la hebra original y 1 copia de cada cadena (no sólo la 
región a amplificar, sino también unos pb extra
-ver en figura productos largos), y será recién luego de 
finalizado el tercer ciclo que obtendremos dos copias de la región a amplificar ( productos cortos). En el 
siguiente ciclo tendremos 8 copias, y en el 5to ciclo tendremos 22 copias, 52, 114..etc.. Tanto el producto 
largo como el corto se amplifican en cada ciclo, pero es importante aclarar que, al finalizar todos los ciclos 
de la PCR, la cantidad del producto corto sintetizado es muy superior en comparación con el producto largo. 
https://www.youtube.com/watch?v=YgXOMp4RRtw 
 
 
La técnica llamada Transcripción Reversa o Retrotranscripción (RT-PCR) consiste en obtener, a partir de 
una hebra de ARN, una molécula de ADN complementaria (cDNA) a ella, en un proceso inverso al de la 
transcripción, mediante la enzima retrotranscriptasa. Es una técnica muy utilizada debido a que la mayoría 
de los procedimientos en el laboratorio de biología molecular (secuenciación, amplificación, clonado) 
utilizan ADN (y no ARN). 
Partiendo de un molde de ARN, implica la síntesis de una molécula híbrida de ADN/ARN, la degradación 
de la porción de ARN en el híbrido, y la síntesis de la hebra complementaria a la molécula de ADN simple 
cadena remanente. 
Existen diversos tipos de retrotranscriptasas disponibles. Algunas poseen actividad ADN polimerasa ARN 
dependiente, actividad ribonucleasa H y actividad ADN polimerasa ADN dependiente, de modo que permite 
catalizar la polimerización de ADN utilizando como molde ADN, ARN e híbridos ARN:ADN. Otras son 
solo ADN polimerasa ARN dependiente, y requieren de enzimas y pasos adicionales para completar el 
proceso de síntesis de cDNA. Requiere Mg2+ o Mn2+ y un primer, pudiendo utilizarse oligo(dT), hexámeros 
https://www.youtube.com/watch?v=YgXOMp4RRtw
al azar o primers específicos. Las condiciones de reacción varían según el primer utilizado, pero típicamente 
implican una incubación de 60 minutos a 37-60°C. 
El producto de retrotranscripción puede utilizarse directamente en una PCR porque la enzima se inactiva al 
calentarla a 95°C. 
https://youtu.be/0MJIbrS4fbQ 
 
 
Cuantificación mediante PCR (qPCR). Estas técnicas se basan en la amplificación de una molécula o de una 
región de interés de modo de poder cuantificarla. Actualmente la más utilizada es la qPCR en tiempo real 
(real time qPCR). Es una variante de la PCR convencional utilizada para amplificar un ácido nucleico de 
interés pero que permite simultáneamente cuantificar el producto de la amplificación en tiempo real. 
Utiliza un primer complementario a una parte del ADN que queremos amplificar por lo cual tiene alta 
selectividad. La cuantificación en tiempo real se lleva a cabo midiendo la fluorescencia emitida durante 
cada ciclo de la PCR la cual será proporcional a la cantidad de ADN que se está amplificando. Para ello, se 
pueden utilizar fluoróforos acoplados a primers o utilizar agentes intercalantes (ver siguiente diapositiva). 
 
https://youtu.be/0MJIbrS4fbQ
 
Se pueden utilizar fluoróforos acoplados a primers o utilizar agentes intercalantes. 
● Agentes intercalantes: Son sustancias que al formar complejos con el ADN doble cadena (sin interferir 
en su síntesis) aumentan su fluorescencia. Ejemplo: bromuro de etidio y SYBR Green (más sensible y 
menos tóxico). El intercalante es muy sensible, puede utilizarse con distintos moldes (no así las sondas 
marcadas) y es relativamente económico. La principal desventaja es que puede unirse a cualquier ADN 
de doble cadena, incluyendo dímeros de primers y productos inespecíficos. 
● Primer marcado: la sonda lleva adherida una molécula fluorescente y otra molécula que inhibe la 
fluorescencia de la primera (quencher), de tal forma que sólo cuando la sonda es desplazada de su sitio 
debido a la amplicicación del ADN, la molécula fluorescente se aleja del quencher y emite 
fluorescencia al ser iluminada. Las sondas marcadas permiten diferenciar los productos específicos de 
cualquier otro ADN de doble cadena. Existen diferentes estrategias para el diseño de sondas 
fluorescentes. Es posible realizar reacciones múltiples utilizando sondas con diferentes fluoróforos. La 
principal desventaja está dada en los mayores costos y en mayor complejidad en el diseño. Las sondas 
TaqMan (de Taq Pol y Pac Man) son las sondas más comúnmente usadas (ejemplo del panel derecho). 
Están compuestas por entre 13 y 18 nt, y poseen un fluoróforo covalentemente unido al extremo 5' de 
un oligonucleótido y un quencher en el extremo 3'. En cada ciclo de la reacción, el ADN de doble 
cadena es desnaturalizado, y la sonda puede hibridarse con su región complementaria; durante el paso 
de polimerización, la sonda es degradada por la polimerasa liberando el fluoróforo por lo que se observa 
un aumento de la fluorescencia. 
 
La cuantificación mediante real time qPCR requiere una curva de calibración con un estándar en distintas 
concentraciones conocidas (diferentes diluciones). Se obtienen cuantificaciones muy precisas, sensibles y 
rápidas. Una desventaja de esta técnica es que los reactivos y el equipamiento tienen un costo relativamente 
alto. 
Las reacciones se caracterizan por el momento (o ciclo de PCR) en que se detecta que ha habido 
amplificación (debido a la presencia del ADN objetivo). Este valor se denomina ciclo umbral (CT del inglés 
cycle threshold), y se define como el ciclo en el que la intensidad de fluorescencia supera un cierto nivel 
(ruido de fondo). En consecuencia, a mayor cantidad de DNA molde inicial, más rápido se observará un 
aumento apreciable de la fluorescencia, y menor será el valor de CT. 
https://www.youtube.com/watch?v=YhXj5Yy4ksQ 
https://www.youtube.com/watch?v=YhXj5Yy4ksQ
 
La PCR digital (dPCR) permite una cuantificación directa de las moléculas presentes en una muestra. 
Representa una mejora sobre la real time qPCR, ya que otorga una cuantificación absoluta (no depende de 
estándares), y es capaz de distinguir diferentes especies incluso si se encuentran a muy baja concentración 
(menos de 50 copias). Se basa en realizar PCRs a partir de 1 molécula de molde. Las reacciones se realizan 
en microarreglos con miles de posiciones. Para ello, la muestra es diluida y dividida en pocillos, de manera 
que en cada uno haya una o ninguna molécula de molde. Los productos se hacen detectables mediante 
fluorescencia utilizando sondas de tipo TaqMan. Además de la alta sensibilidad, el hecho de trabajar con 
muestras muy diluidas minimiza el efecto de interferencias e inhibidores que pudieran estar presentes. 
Cuando en qPCR se utilizan sondas marcadas con diferentes fluoróforos para distinguir cada molde, las 
moléculas que producen poca señal pueden no ser detectadas por la competencia con los demás fluoróforos. 
dPCR resuelve este problema, ya que la mezcla de reacción se diluye y distribuye en una gran cantidad de 
pocillos de modo lograr 1 molécula de molde por pocillo. 
Existe una variante a esta técnica que es la droplet digital PCR, el fundamento es el mismo, pero las 
moléculas no estarán distribuidas en pocillos, sino en burbujas de aceite. Las reacciones de PCR ocurrirán 
dentro de las burbujas que contengan al menos 1 molécula de molde (y todos los reactivos necesarios) y 
luego se hará pasar la emulsión por un detector que lee las burbujas por separado. El análisis posterior es el 
mismo que para dPCR. 
https://youtu.be/Qqdmw3wvMFo 
https://youtu.be/0Ta37aecY-I 
https://youtu.be/Qqdmw3wvMFo
https://youtu.be/0Ta37aecY-I
 
Esta técnica permite la detección de ácidos nucleicos de forma sencilla sin someter la muestra a ciclos 
térmicos. Son de especial relevancia dado que han permitido el point-of-care diagnosis que implica el 
diagnóstico en el lugar donde se encuentra el paciente, sin necesidad de equipamientos muy específicos, 
consumibles costosos o recursos humanos muy calificados. Esta estrategia utiliza una polimerasa que separa 
la doble hebra de ADN, como alternativa al calentamiento