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Química Biológica PROTEÍNAS III. ELECTROFORESIS EN GELES DE POLIACRILAMIDA EN PRESENCIA DE DODECIL SULFATO DE SODIO (SDS-PAGE) Jefa de Trabajos Prácticos: Dra. Julieta Marino Electroforesis en geles de poliacrilamida en presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) En el SDS-PAGE: la densidad de carga y la conformación son iguales para todas las moléculas. → la separación es por PM Principio de separación Método analítico de alto poder resolutivo que combina la migración en un campo eléctrico y la filtración molecular a través del gel de corrida. En una electroforesis la separación es por: - densidad de carga - tamaño: PM y conformación Acrilamida: puede polimerizar en largas cadenas Bisacrilamida: reactivo bifuncional que permite el entrecruzamiento de las cadenas de poliacrilamida. Persulfato de amonio: Inicia la reacción de polimerización a través de la formación de radicales libres TEMED: catalizador de la formación de radicales libres del PA acelerador Video SDS-PAGE: https://www.youtube.com/watch?v=i_6y6Z5UvwE Composición del gel: reacción de polimerización https://www.youtube.com/watch?v=i_6y6Z5UvwE %T = (g de acril + g de bisacril ) x 100 / 100 ml % de T de trabajo habituales: 5-15% % C = g de bisacri / (g de acril + g de bisacril) x 100 C% en general se usa fijo Tamaño de poro % T 5% Tamaño de poro % C Tamaño de poro del gel 7,5 % Las más pequeñas corren juntas 12 % Las más grandes corren juntas Es importante seleccionar el % T según el PM de las proteínas a separar 7,5 % Las más pequeñas corren juntas 12 % Las más grandes corren juntas Proteínas de ↓ PM Proteínas de ↑ PM % T Migración Tipos de geles de poliacrilamida Electroforesis bidimensional Geles disociantes (SDS-PAGE) Geles no disociantes/ nativos Geles en cilindro Geles en lámina Geles contínuos Geles discontinuos (gel stacking o concentrador y gel running o de separación) Geles en gradiente Se pueden hacer geles en gradiente para mejorar la resolución de mezclas complejas Gel stacking o concentrador %T= 4% Gel de separación %T= 7,5-15% Principio de concentración de la muestra y de separación de las proteínas Ánodo (+) Cátodo (-) Gel de apilamiento: Tris-HCl (pH 6,8), 4% A-BA Gel de corrida: Tris-HCl (pH 8,8), 10 % A-BA Buffer de corrida: Tris (pH 8,3), SDS, glicina Concentración de las proteínas Separación de las proteínas Curva de titulación de la glicina Gel Running 10% (ml) Gel Stacking 5% (ml) Acril/Bisacril 30% 3,3 0,83 Buffer Tris-HCl pH 8,8 2,5 - Tris-HCl pH 6,8 - 1,25 H2O 4 2,88 SDS 10% 0,1 0,05 PSA 10% 0,1 0,05 TEMED 0,01 0,005 1 2 3 4 5 6 https://www.youtube.com/watch?v=i_6y6Z5UvwE Calibración y determinación del PM Azul de bromofenol (ABF) Distancias de migración Migración relativa o Rf = Distancia Proteína X Distancia del frente de corrida (ABF) Se obtiene el PM de la proteína desnaturalizada. En presencia de β-ME se obtiene el PM. Sin β-ME se calcula el PM aparente Simulador: http://biomodel.uah.es/lab/SDS- PAGE/inicio.htm Pueden ver cómo afectan los distintos parámetros (voltaje, %T) los resultados de la corrida electroforética (migración, resolución) http://biomodel.uah.es/lab/SDS-PAGE/inicio.htm http://biomodel.uah.es/lab/SDS-PAGE/inicio.htm http://biomodel.uah.es/lab/SDS-PAGE/inicio.htm SDS-PAGE: APLICACIONES Determinar el PM de una proteína (desnaturalizada, reducida o no) Investigar la estructura de una proteína: - presencia o no de subunidades, comparando con el PM de la proteína nativa (estructura cuaternaria) - presencia de una o más cadenas y de uniones covalentes S-S Evaluar la pureza y para seguir un proceso de purificación (se discutirá en seminario de Purificación). Es 1 criterio de pureza, pero para garantizar pureza deben utilizar al menos 2 métodos basados en diferentes propiedades de las proteínas. Debe observarse que se ve que va disminuyendo la cantidad de bandas de otras proteínas y que queda la banda de la proteína de interés Detección de proteínas marcadas radiactivamente. Autorradiografía. Posibilidad de transferir las proteínas a una membrana (Western blot, o inmunoblot) para identificar una proteína en particular por la especificada de los anticuerpos. Transferencia a membranas de nitrocelulosa o PVDF (para secuenciación de péptidos o proteínas) Hacer un análisis semicuantitativo. Por densitometría es posible comparar los niveles de expresión de las proteínas presentes en el gel. Transferencia húmeda (+) Video de Western blot https://www.youtube.com/watch?v=IoVzpL_heFo Western blot Nitrocelulosa o PVDF Transferencia semi seca (-) https://www.youtube.com/watch?v=IoVzpL_heFo https://www.youtube.com/watch?v=IoVzpL_heFo H2O2 Autorradiografía: revelado en cuarto oscuro Sistema de detección y captura de imágenes digitales Luminol Revelado del Western blot ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL 1° Dimensión Isoelectroenfoque 2° Dimensión SDS-PAGE Se identifican proteínas diferenciales en distintas condiciones. → Secuenciación Video: https://www.youtube.com/watch?v=uwVgfDOpdPI https://www.youtube.com/watch?v=uwVgfDOpdPI LANAIS-PRO Laboratorio Nacional de Investigación y Servicios en Péptidos y Proteínas (F. Farmacia y Bioquímica) ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL Análisis de una electroforesis bidimensional ¿Qué características presentan las proteínas presentes en A y en B? ¿Qué resultado se hubiera obtenido si se realzaba un SDS-PAGE para las proteínas en A y B? ¿Y qué resultado se hubiera obtenido en un isoelectroenfoque? A B TRABAJO PRÁCTICO Gel 1 Calle1: Patrones de PM Calles 2 y 3: OVO + β-ME Calles 4 y 5: OVO – β-ME Calles 6 y 7: γ-Glob – β-ME Calles 8 y 9 γ-Glob + β-ME - Confeccionar una curva de calibración con los valores de Rf o las distancias migradas por los patrones de PM. - Estimar el PM de las muestras sembradas con βME y el PM aparente obtenido en ausencia de 2-ME - Evaluar la presencia de puentes disulfuro intra o intercatenarios en la OVO y en la γGlob. - ¿Qué pasaría con la migración si usara un %T mayor? Gel 1. Estimación de PM de dos proteínas y evaluación de su estructura En un SDS-PAGE con un %T del 10% se corren muestras de ovoalbúmina (OVO) y γ-glubulina (γ-Glob) en presencia y en ausencia de β-mercaptoetanol (β-ME). Luego se realiza la tinción con Coomassie blue. Buffer de muestra (sample buffer): Tris-HCl, pH 6,8 SDS detergente que aporta cargas (-) y desnaturaliza a las proteínas 2-ME (+ o -) reductor de S-S Sacarosa o glicerol: da mayor densidad a la muestra para evitar que difunda de la calle ABF colorante marca el frente de corrida - En el Campus encontrarán un archivo con los resultados del análisis densitométrico de las bandas utilizando el programa Gel Pro Analyzer. https://www.youtube.com/watch?v=7gDCGJ4aMfk - Se obtiene un valor de intensidad óptica integrada (IOD) - Confeccionar una curva de IOD en función de la masa de OVO sembrada en el gel. Obtener la ecuación de la recta - A partir de la curva obtenida, calcular cuál sería la concentración estimada de una muestra de ovoalbúmina de concentración desconocida utilizando su valor de IOD. Gel 2. Análisis semi-cuantitativo Se analizan por SDS-PAGE 15 µl de distintas soluciones de OVA A:1,5 mg/mL - B:2,5 mg/mL - C: 3,5 mg/mL diluidas al 1/10 (1,5 µL de A, B o C + 13,5 µL de buffer de siembra) Gel 2. Calle 1: Patrones de PM Calles 2 y 3: OVO A dil Calles 4 y 5: OVO B dil Calles 6 y 7: OVO C dil https://www.youtube.com/watch?v=7gDCGJ4aMfk https://www.youtube.com/watch?v=7gDCGJ4aMfk https://www.youtube.com/watch?v=7gDCGJ4aMfk https://www.youtube.com/watch?v=7gDCGJ4aMfkhttps://www.youtube.com/watch?v=7gDCGJ4aMfk https://www.youtube.com/watch?v=7gDCGJ4aMfk https://www.youtube.com/watch?v=7gDCGJ4aMfk https://www.youtube.com/watch?v=7gDCGJ4aMfk https://www.youtube.com/watch?v=7gDCGJ4aMfk https://www.youtube.com/watch?v=7gDCGJ4aMfk https://www.youtube.com/watch?v=7gDCGJ4aMfk
