TECNICAS DE ANALISI S MOLECULAR

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TECNICAS DE ANALISI.S 
MOLECULAR 
En la últimas tres décadas ha ocurrido un desarrollo exponen­
óa l de la, técnicas moleculares, to que ha penniiidü estud iar y:: ..
manipular las mo!écuias de DNA y RNA. El. disefi.o de estas me­
todologías se. ha basado fundarnemalmente en los conocimienios 
sobre la est1uc.tura y las propiedades ftsicoquimicas de los ácidos 
nudeicos. En e.! presente capítulo se. describen brevemente las 
técnicas bási cas de anál isis molecular más uii l iz.adas, final izando 
con una resefi.a acerca de las perspectivas fu.turas . 
ELECTROFORESIS 
En biología molecular se emplean distintas técnicas para el 
estudio de las macromolé{.�ulas o fragmentos de ellas. La mayoría 
de las macrmuoLéculas se encuentran cargadas eléctricamente y 
por !o tanto tienen la capacidad de migrar en ün campo elécirico. 
Este tipo de movilidad puede llevarse a cabo en soportes sólidos 
compuestos por agarosa o poliacrilamida. 
La migración de las distintas moléculas a través de un gel de­
penderá de las característicM de éste. La velocidad de migración 
electroforética de las moléculas está relacionada en gi-an medida 
con cuatro parámetros principales: 
l. . Tamaño molecular.
2. Conformación.
3. Corriente aplicada.
4. Tamafio del poro.
l ) Tamaño molecular: el tamaño de la molécula interviene
directamente en su velocidad de migraci.ón desde el cátodo al 
an.odo, o a la inversa, dependiendo de su carga. Las molécula� 
de menor tamaño son las que se desplazan más rápido, así vemos 
que la velocidad de migración es inversamente proporcional al 
Log
10 
de sus pesos moleculares-. 
2) Confol'mación: la velocidad de migración en los geles
depende de la c-0nform.ación de la molécula. Por ejemplo, el DNA 
puede presentar tres formas distintas: circular cerrado, circular 
mellado o l ineal . Las movilidades relativas de las tres fonnas 
dependen también de otros factores, tales como la fue17.,a íóni.ca 
del tampón de corrida o la concentración de a gentes intercalantes 
de bases como el btomuro de etidio (BrEt), que al co�jugarse 
con ellas hac.e que se desplacen con mayor o menor velocidad. 
Por ello es que en algunas condiciones, el DNA circular e.errado 
migra más rápido que el lineal y en otr.ts condiciones, el orden 
es inverso. Si desearnos conocer las diferentes fonnas del. DNA, 
un método muy út.i l puede ser la electroforesis e.n presencia de 
cantidades crecientes de BrEt Cuando la. concentración del BrEt 
se incrementa, la mayor parte del colorante se une al DNA y las 
moléculas de la superhélice negativa en conformación circular 
cerrada son desplazadas progresivamenie (en sentido inverso), lo 
que da como resultado que su velocidad de migración sea lenta. 
De este modo, al llegar a la concentración crítica de colorante 
l ibre, la velocidad de migración de la molécula circuiar cerrada
alc.anz.a. su mínimo valor. Por otra parte, si se añade más BrEL se
generan rotaciones de la superhel ice posiriva y la movilidad de 
la forma circular cerrada se incrementa rápidamente . Al mismo
riempn, las movilidades de la fonna circular mel lada y i.ineai del
DN A decrecen de manera diferente como resultado de una carga 
neutraiizantc y de la rigidez impartida al. DNA por el BrEt. Para
diferenciar la forma circular mellada de la lineal. se. debe recordar
que los fragmentos del DN A lineal migran a velocidades que rno
inversamente proporcionales al Log
1n de su peso molecular.
3) Corriente aplic-ada: a bajo voltaje, la velocidad derni.gración
de los fragmentos 1 ineales de las macromolécula.s es proporcionai aJ 
voltaje aplicado. Sin embargo, cuando la fuerza del campo elec.trico 
aumenta , !a vefocidad de los fragmentos de- alto peso molecular se 
incrementa; en otras palabras, a mayor voltaje. menor resolución. 
Por ejemplo, para obtener el máximo de resoluc.ión de los fragmen .. . 
tos de DNA en geles de agarosa, éstos deberán ser wrridos en un 
rango de aproximadamente 1 voltio por cada 5 cml . 
4) Tamaño del pom: un fragmento de DN A o una macromo­
lécula de un dete1minado tamaño molecular migra a distintas 
velocidades a través de geles que contienen diferentes tamaños 
de poro. Existe una relación lineal entre el loga¡itmo de la 
movilidad electroforética y la concentración del gei, o sea que 
con un poro de mayor tamafü) (menor concentración def gel). 
la separación de. las bandas será menor. Es por dio que cuando 
se desea obtener una buena nit idez entre diferentes bandas de 
al.t:o peso molecular, se elabt)ran geles de concentraciones bajas, 
mientras que cuando se desean separar fragmentos de. bajo peso 
molecular, las c.oncentra(:iones debc.n ser mayores. 
En la elaboración de geles se emplean dos matrices diforen1es, 
ya que sus características particulares permit.en la separación de 
moléculas de distinto peso molecular. La primera de ellas es ia 
agarnsa y la otra es la pol iacrilamida. 
Electroforesis en gel de agarosa 
El método estándar utilizado para separar, identificar y purifi­
car fragmentos de. DNA es la eLectroforesis en gel de agarosa. La 
técnica es simple y rápida en su ejecución, y resoiutiva en cuanio 
a la separación de los fragmentos de DNA de una mezcla que no 
puedan ser separados adecuadamente por otros procedimientos, 
como por ejemplo, centrifugación en gradiente de densidad. Otra 
ventaja de esta tecnica es que pemlite conocer en UJdo momento 
el sitio que va ocupando el DNA o los fragmentos de éi, mando 
ellos migran dentro del gel del cátodo (-) al ánodo (+), ya que ias 
· bandas de DNA son teñidas con eí colorante. La concentrnción
mas baja a la que puede ser visualizado el DNA en el gel es de 50
hg cuando es examinado directa.mente sobre un transilurninador 
de luz ultravioleta (UV) .
El nivei de concentración del gel depende del material a correr 
y del análisis que se desee hacer. La concentración puede estar 
entre 0.5 y 2ú- /) de agarosa para electroforesis DNA/RNA, c·orno 
se phmteó anteriom1ente , si el mareriai de cotTida posee varios 
fragmentos de diferemes ramaños. se urihza un gel de- O.8 <)/0. 
a.si el gel no ofrec.e mucha resistencia en la conic!.a y las bandas 
pueden separarse con mayor resoiudón. Para observar d producto 
ampl i fi cado de u.na reacción en cadena de b'! pol imerasa._ el gel 
recomendado es de I ,5%,, s! se desea concentrar mas !a banda se 
;rnmen:a la conc.cmración de agarosa . 
El compo-rtam iemo eie.ctroforé:t.ico del DN A en los gel-es de. 
agarosa no es afectado de manera significativa ni por la compo� 
sición de bases en ei DNA. ni por la temperatura a la cual el g.el 
se. encuentra durante la corrida. De este. modo, en los gele.s,..de 
agarns:a. la movil idad e!ectroforetica re.Ja1iva de íos fragmen;;)S 
de DNA de iama.ños di ferentes no cambia entre los 4 ,:;C y Yi 
'"'(' . En generaL los gel.es de agarosa son corridos a rempernrnr..i 
an1biente. Sin em bargo, lo$ geles que- contienen me.nos de 0,5º-',, 
de agarosa son más frágiles. por lo qu.e su corrida se. rea!íz.a a 4 
·•e para que adquieran rigidez. 
Electroforesis en campo pulsante 
La electroforesis de campo pulsa.me en gel de agarosa per­
mite sepanu moléculas de DNA de alto peso moiec.u l ar (hasta 
2000 kilobases [kb ]¡. El fundamento de este método se basa en la 
propiedad que. tienen las moléc.u las grandes de DNA de fraccio­
narse en los geles de agarosa_ al ser sometidas a lternativamente 
a dos campos e- 16ctricos no homog_6neos (en pulsac iones) y de 
orientación perpendicular. A diferencia de otras e.iecrrofores.is, ia 
muestra es procesada dentro de un gel de bajo punto de fusión. 
La corrida electroforétic.a ::.e real iza. en un gel de agarosa de 
l .5º1ó que es sometido a la acción de los dos campos e-léctricos
que se a.lternan cada ciena cantidad de tiempo con ia final idad
de. lograr una migración diferencial en función del tamaño de
las múléculas de DNA.
En esta técnica es fundamental controlar la homogeneidad 
de ia temperatura y la conductibilidad en e l. gel . Luego de 
obtener la separación de las bandas, los resultadosse pueden 
analizar por transferencia a una mernbrana para realizar la hi­
bridacíón del material o por med i () de un aná l isis con enzimas 
de restricción (RFLP) . 
Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) 
Los geles de poliac-ri lamida son muy usados en estudios de 
proteínas. por el alto poder de resolución que ofrecen para la 
sepa.ración de fragmentos de DNA de hasta l kb de longitud. 
Estos geles pueden separar y acomodar más fraccíone.s que los 
de agarosa y el DNA recuperado es extremadameme puro. Los 
ge. les de poliacri lamida pueden ser de dos tipos: no desnatura­
lizantes y desnaturalíz.antes 
Los geles no desnaruralizantes se util izan en la separación y 
purificación de fragmentos de DNA de dobie cadena. Se corren 
a b�jo \10!.taje ( i -8 V/cm) para prevenir la desnaturalización de 
pequeños fragmentos de DNA debído al calor generado por el 
paso de la corriente elé:ctric.a. En la mayoría de las especies, el 
DNA de doble cadena migra a una velocidad inversamente pro­
porcional al. Log
1!1 
de su tamañ.o o muy cercano a ella. 
Los ge les desnaru.ralizantes se emplean para correr frag­
mentos de cadena simple, por ejemplo. para e.!. aislamiento de 
sondas marcadas. En !a separación de fragn1entos, las cadenas 
1 Denominada as\ por su inventor. 
c:omplememarias no migran a igual veíoc idü.d: las dos caderias 
adquieren esr.rucrurns secundarias diferentes. corno rnnsecuenc-i.a 
de un apareamiento de ba.ses intracatenario. 
La concentración de los geles p-uede variar entre 3 .5 y 20%. 
dependiendo del ta.man.o de ios fragrnent.os <le inten!s. La longitud 
de éstos puede. variar entre 1 O y l. 00 cm_ según ia separación que 
se requiera entre las bandas. La e!ecrroforesis >,t' rea i iza invaria� 
b!emente en posición vertical . 
Sí la electroforesis se rea l iza para estudios de pmteinas. ,.:_;: usual 
el empleo de geles mixtos confonnados por un gel concentrador 
y un gel separador_ los que se diferencian e-.mre. sí por tl ramaño 
del· poro (concentraciones diferente.s de acrilamidaihi:;acíi.l:1mida) 
La rc-iación enrre estas dos úl timas y entre ellas y e-.1 resro de !os 
cornponentes del ge ! dctemüna el tamaño del poro_ De e-s1e modo. 
mic.ntras mayor sea la diferencia entre acri!amida y bisacri iamiili1. 
mayor será el tamaño del poro . Así como tambié-n si el porcentaje 
de ac.ri lamidathisacrilamida es mayor en relación con los demás 
componente:s del geL e l 1.amaño dd poro será menor. 
TECNICAS DE HIBRIDACION EN FILTROS 
POR TR.\NSFERENCIA SOUTHERN BLOT
Para comprende,r la utilidad de ía técnica de transferencta_ 
se hace necesario fomml.ar la siguiente pregunta : ¿Por qué, si ia 
separación de fragmentos de DNA de di fereme peso molecular 
puede hacerse eficientemente mediante e!ec.trofore-si. s en gele.s 
de agarosa, es inevitable transferir el DNA desde el gel hacia 
una membrana? Porque los gele.s de agarosa se dal1an fácilmente. 
durante· los procesos de hibridac.frm , lavado y detección. Además._ 
las bandas de ADN se difunden rápido dentro del gel. Esta¡:; 
dificul.tades metodológicas fueron resueltas por primera vez por 
E. Southern ( 1 975 } med í.ante c. l desarrollo de la metodología de
transferencia que l leva su nombre.
Sonda: se defme. como una secuenci.a de ADN marcada que 
es cornpiementaría a la secuencia que se de-sea derectar. T1-J.s la 
h ibridación, si e:;tá marcada rad.iactivamente. será detectada por 
autorradiografia: mientras que, si !a marca es no�isotópica, podría 
ser revelada mediante un sustrato cromogénico. fluore-sc.encia o 
quimioluminíscencia. 
Hibridación: apareamiento de dos cadenas simples de DNA. 
cuyas secuencias de bases son complementarias. 
La técnica de Southem I cons iste en transferir los ü·agrnentos 
de DNAseparados mediante. electroforesis desde la matriz del gel 
de agarosa a una membrana de nai lon o nitrocelu losa (e! Northem 
e::: u.n método equivalente al Southe.m pero referido al RNA). 
Como se detalla en la figura 1 8-l , dkha metodoiogia incluye 
varias etapas durante su desarrollo< El primer paso es extraer y 
purificar el DNA genómico, el que posterionnente. se di giere 
con una o varías enzímas de restricción. Los productos obteni­
dos en la dígestión, que consisten en numerosos fragmentos d,;:: 
restricción de un ampl io rango de- pes.o molecular, se separan 
mediante la técnica de. electroforesis en gel de agarosa. El paso 
siguiente consiste en desnaturaií1.,ar el DNA mediante un áicali 
y transferirlo desde- el gel hasta la membrana de nitrocelulosa 
o nailon. Como se observa en la figura I 8- l . la transfomnc ia
puede reali.zarse por simple. capil.aridad, haciendo pasar una
solución tampón de alta fuerza lónica, o empleando una bomba 
de vacío. Corno el movimiemo de. !os fra.gmemos de DNA si� 
gue un.1 trayectoria. venical, esto pennite que se cons:e.rve en la 
Pr(ieed imit:'.nto de la técn ic� de Southern 
Ex;:rnce:ión de D!"i!\ 
g:enóm1c.n 
Peso 
¡ 1 
l l l
) 1 ) 
P:,pe\ 
ab�orbentt 
-
Soporte 
Mut:stra i Muestni 2 
1 - ) 
Com<la eiectroforética i::n gd de ag.arus,1 
Muest�<-1 ! Muestra : 
Transfe-renci2 de íos fragmentos de DN A 
desde el t!.t-l a !ti. me.mbnm:i H idridación cor, la �ün<la 
Del'e.cuón de- la �onda 
Figura . Procedímientos empkados en !a técnica de So-uthem blot. 
mcrnbrana la posición relativa de los fragmentos e:n el ge-L Una 
vez fi nalizada la transferencia. el DNAde cadc.na simple. se fija 
a! nuevo soporte. por tratamiento a 8-0 ºC o por luz ultravioleta 
ante� de comenzar con la hibridación, En la. etapa siguiente, 
la inernbrana que contiene el DNA se pone en contacto con la 
:;onda, perm i t iendo la hibrid!Kión de !as secuencia.s homólogas . 
Fina lmenre, se prncede. a revelar la señal que contiene la sonda 
y, de esta manera, dete.ctar las bandas de. interés. 
Según e! típo de. sonda utilizado se pueden obtener patrones 
senci l los (sondas de locus simple) o complejos (sondas mu}ti­
locus). Las técnicas de hibridación en fil tros incluyen, además 
del Southem, las metodologías de punteado (dor h/01 y s/01 blal\ 
e h ibridación in sim de fagos, plásmidos, DNA bacteria.no y de 
genotecas. En estos casos, el O NA.correspondiente a las diferentes 
mues.tras (por ej ., clones de un cultivo bacteriano o de una geno­
teca) se coloca en la membrana en fmma de punto {d01 hlot) o de 
línea (slot hlot), y éste se trata con un álcali para desnaturalizar 
t�l DN A. En el caso del Southem, tras la hibridación con la sonda 
marcad� apaíecerán s.c11aks en los puntos que contengan ADN 
homólogo al de la sonda uti.l i.zada. 
Polimorfismo en la longitud 
de l.os fragmentos de reshi.cción 
(Restríction fragment lenght polymorplrism: RFLP) 
Las enzimas que hidro!iza:n tas uniones fosfodiéster de los áci­
dos nucleicos se denominan nucleasas. F.stas enzimas pueden actuar 
tanto en los extremos de la cadena ( ex()nuc.k:.asas) como en el interior 
de ésta ( endonucleasas ). Dentro de este último grnpo encontramos a 
!as enzimas de restricción. que. son proteínas bacterianas que digie­
ren al DNA de. doble. cadena aí reconocer un detenninado tnotivo
o diana <le restricción. Estas secuencias específicas se caracterizan
por ser pali.ndrómi.cas, es decir que tienen un eje de simetría, y ¡x>r
tener una longitud de 4 a l O pares de bases (fig. 18-2).
La.<; bacterias utli izan estas enzimas para protegerse de la 
infección causada por bacteriófagos. ya que las mismas hidrolizan 
el DNA foráne.o . Para preservarse de la hidrólisis de su propio 
material genético. las bacterias poseen enzimas de modificación 
que me.tílan su propio DNA e-n las regiones específicas re.cono­
cidas por las endonucleasas. 
Las enzimas de restricción se. nomhrun de acuerdo con b 
bacteria de la cual se han aislado� ast. por ejemplo. Hoelii füe 
aislada de !fllemophilus aegyprius y EcoR1 s·e obtuvo a partir de 
la cepa RY 1 3 dé J:scherichia coli. Este t ipo d-:.• en.donu.c:laas<-ls 
pueden efectuar dos tipos de cortes e-n la cadena de DN::\. CtLll.ndo 
el corte se reali z.1 por 1an1itad de ia secuencía de re.conocimiento 
genera extremos "romüs'·, y cuando es de.sigua! con respecto al 
eje de simetría se obtienen extremos ' ·pegajosos" (fig. ! 8-}J . 
La biología molecular se revolucionó a partir de.i descubri­
miento de las enzimas de restricción, ya que rc-:pre.sent.aron un2. 
nueva herramienta para el estudío de los polün.01tlsm()S a nivel 
del DNA. El análi sis del polimorfismo en la longitud de los frag­
mentos de restricción obtenidos a través del uso de endonucleasas 
se denomina RFLP. Por otra parte, estas enzima.s pem1itieron la 
realización de los mapas de restricci6n que indican la ubicación de 
los fragmentos de DNA en estudio a lo largo de! cro,nos<)ma. 
La técníca PCR-RFLP se basa en la detección de po-1 i.mor­
fismos a nivel de.! DNA mediante el estudio de. los. fragmentos 
de íestricción en el producto de amplificación. Las variaciones 
observadas mediante el uso de esta técnica pueden deberse a c.am­
hios moleculares tales como deleciones, inversiones, cambios 
de bases, o reordenamientos. Cualquiera de estos eventos puede 
crear, eliminar o translocar los sitios de. reconoC-lmiem.o de. las 
enzimas de restricción, Estos cambios pueden sucede; unto en 
zonas que se. transcriben como e.n z.ona.s que no se transc-!Lben_ 
por lo que a.portan un mayor grado de infom.1aciOn y amplfan 
los límites de lüs e.srudios. 
En la figura 1 8-3 se observa cómo mediante e.l uso de b. 
enzima HindIJl se pueden identificar los alelos A y B del gen 
de la k�caseina bovina a pani.r del producto de arnplificación 
del cuarto exón. 
CLONACION DE SECUENCIAS DE DNA 
El proceso de clonación o clon ado de DNA consiste en la in­
serción de un fragmento de DNA de interCs ( inseno¡ en un vector 
(pl:.i,,;mido, bacteriófago, etc. ) con e.l fin de producir múltiples 
copias de aquél en cantidad y pureza adecuadas para estudios 
moleculares posteriores. El inserto puede consisti r en uno o más 
Hael l l 
5' 
3' 
Aful 
5' 
3' 
Taql 
t 
GG ce - s·
ce GG - 3' 
t 
t 
AG CT - 5' 
TC GA - 3' 
t 
t 
5' - T CG A - 5' 
3' A GC T 3 ' 
t 
digestión 
digestión 
digestión 
Hinfl 
t digestión 
5' - G ANT C 5' 
3' - C TNA A - 3' 
t 
extremos " romos" 
5' 
3' 
5' 
3' 
GG 
ce 
AG 
TC 
ce - 5' 
GG - 3' 
CT - 5' 
GA - 3' 
extremos "pegajosos" 
5· -T 
3 ' - AGC 
5' -G 
3 ' - CTNA 
CGA - 5' 
G - 3' 
ANTC - 5' 
G - 3' 
Figura - . Representación es.quemática de sitios de digestión corret:.pondi-emes a. cuatro enzimas. dos que producen extremos romos 
(Hael!I y Alul) y dos con extremos pegajosos (foq! y Hin/!). 
genes, porciones de un gen, o fragmentos generados por PCR de 
una determinada región del genoma. 
El ligado del vector con el segmento de DNA da lugar a una mo• 
lécula: que conserva la capacidad de. autorreplicación del plásmido 
ori.ginal, de modo que la secuencia insertada se replica con e! vector, 
y se conoce como molécula de DNA recombinante (fig. l 8•-4). 
Vectores de clonado 
En la práctica experimental, la selección del vector apropiado 
dependerá del tamaño del fragmento que se desea clonar, deJ sistema 
de selección de los clones transfonnack)S, de la'1 enzimas de. restricción 
que sean compat:ibles entre- el vector y el ��ento, y de si el vector 
va a usarse para expresar secuencias clonadas en E, coli o en células 
de mamíferos. Los vectores de donado poseen diferente capacidad 
media de soponar distintos tamaños de insertos, que depende del tipo 
de vector elegido, de su longitud en pares de bases (pb \ de su huésped 
natural y de la fonna de integración o expresión en ese hospedador. 
Plásmidos 
Los piásmi.dús son moléculas circulares de. DNA extracro­
mosómico de. doble cadena, que contienen grupos de genes con 
capacidad de rep licar. Se encuentran naturalmente en la mayoría 
de las bacterias. Estos elementos episornales se identifican co­
múnmente con genes de resistencia a fármacos (plásmidos R), 
autotransmisibi lidad (plásmido F) y antibióticos conoCldos como 
bac.teriocinas ( sustancias colicinogénicas). 
Además de los plásmidos de ocurrencia natura l, se han cons­
truidos plás-midos ín viuo que contienen un origen funciona! , 
tales como los plásmidos oriC con el orígen de cromosomas 
bacterianos, l.os plásmidos ldv con el origen del fago 1, y aun con 
elementos ARS de levaduras , Los plásmidos mas esrudiados de 
las· bacterias gramnegat.ivas (tabla 1 8- 1 ) dependen de las proteinas 
del hospedador para la síntesis de DNA, pero contribuyen con 
factores propios para el proceso de iniciación . 
Los plásmidos se mantienen en m1 número fijo de copias por 
célula mediante controles que regulan la frecuencia de la inicia­
ción. Además, proveen vectores de intercambio genético entre. 
bacterias durante el. proceso de. conjugación, y algunos codífican 
funciones que les penniten invadir nuevas células,_ es decir. son 
autotransmisibles.. Este rasgo es de enorme importanc ia médica 
dado que- es responsable de la rápida propagación de la resistencia 
a farmacos en las poblaciones bacterianas. 
La resistencia a antibióticos es nna característica muy ú1il para 
!a selección de. la.s moléculas recombinantes. Asi, los plá.snüd-o:-
que han sido introducidos y propagados/replicados en la célula
bacteriana otorga., a esta última la. capacidad de degradar las
moléc.ul.as de antibióticos que de otra manera hubieran sido leta les ti
para ellas (por ej .. resistencia a ampicilina o a gemamicina). La
existenda de marcadores seleccionables permíte disc1iminar a los #..
plásmídos que han incorporado el inserto de interés; el mecanismo \t
de detección más utilizado consiste en !a a�complemcmación 
.;, 
(ver ejemplo). Los piásmidos se usan frecuentemente. para dcmar 
fragmentos de DNA pequeños, subclonar fragmentos de. Dl\A 
grandes o generar bibliotecas genómicas pequeflaB, 
Como ejemplo de! procedimiento general se describini el 
clonado de productos de PCR. Para esto se- ut i l izan piásmidos 
dY...tailed de la serie pGEM . Estos plásmidos son derivadüs 
*' 
Exón 4 
CASK 
C.A.SKP. 
A 
B 
583 ph 
380 pb 
203 pb 
583 pb 
380 pb 
t 
Hind iJl 
AA BB 
c:::::J c::J c::J 
artifieiales de la linealización del pGEM-5Zf (""). un plásmido 
multicopia (20-80 copías por célula) que posee un sitio autónomo 
de início de la replicación y puede modificar el fenotipo de la 
bacteria hospedadora. dado que en su genoma está presente el 
gen que codifica. para resistencia al antibíótico amp1Ci1ina. Como 
1:odos los vectores plasmídicos, tienen una región conocida como 
sitio múltiple de clonado MCS -Mu/tiple Cloní1'1g Site- con una 
sucesión de sitios de reconocimiento para enzimas de restricción, 
y en este vector en particular los extremos 3 · terminales poseen 
una t.imidína que facílíta la ligación de productos de PCR. 
Por medio de la reacción de ligación. el producto de. amplificación 
seleccionado se une a la timidina en posición 3 · tenninal del plásmido. 
Como en su DNA está codificada la porción NH, terminal del gen de
la ¡l-g-<llactosidasa o lacZ (promotor y p1imeros 146 aminoácidos), 
203 ph figura , Representación esquemática de los 
patrones de restricción correspon­die-.ntes 
al cuarto exón del ge-n k-caseína ( C4Sk) 
digerido con la enzima I!indif.l y B, -su 
posterior y\snahzac:ión e:r1 un ge\ de 
po!.íacrilamida. 
la inserción interrumpe la porción o. del gen lacZ codincada en el 
vector, de modo que. los plásmidos recombi.nantes no pueden expresar 
e.l gen en presencia, en el medio de cultivo, del inductor gratuito, 
isopropiltio-¡l-D-galactósido (Il'TG). Los plásmídos que no poseen 
el inserto sí expresan la porción a del gen lacZ, y al complcmeo1tir con 
la porción � codificada en la bacteria hospedadora, en pre.scnc.ia del 
sustmto cromogéníc0 5-brnmo-4-cioro-3-indo1il-f3-D-galacrósido {X­
(1al ). las colonias son de color azul, Este fenómeno se con.oc.e e.orno 
a-complementación, y es de gran utilidad en la se-lección de clones
recornbinantes en conjunción con el uso de antibióticos.
Las cepas. bac.te:rianas quese u.san como hospedadoras para el 
vector recombinan te generalmente son cepas bacterianas de. Escheri­
chia coli. Algunas son deficientes en recombinación para impe.dír ia 
multimerización del inserto y los rearreglos en el DNA, y carecen de 
Tabla 18-1. Plásmidos de ocurrencia natural en bacterias gramnegativas (kb =-kilobases de DNA) 
Plásmido 
Co1El 
R300B 
pSCJOl 
F 
ColV 
RK2 
Pl3.smidos de Agrabac1erium 
Plásmidos de Rhizohium 
Longitud 
(kb) 
6 
9 
9 
··90
-90
56
140-500
40-50
Autotrans­
misibilidad 
+ 
+ 
+ 
+ 
+ 
N"de 
copias 
10-20
10-20
4-6
l-2
5-8 
Característic2s 
Confiere inmunidad a colici.na El 
Resistenda a tetraciclina (Tcl<) 
Pili F 
Amplio rango de huésped 
Inducción de tumores en pi.amas 
Inducción de tumores en plantas 
! (\mstnicc1ón del vector rc.com-bmame 2.Transformac-ión: incorporación dei ,;ector
recombinantc demro de ia b:..ctem
o -- o 
Vector Fragmento de DNA Vector 
Figura . Etapas del proce­so 
de donación de una secuen­cia 
DNA . 
DNA bac.teriano plásm1do 
� I 
1"!11ifl
"""
· -.
-.
¡
Bactern1 transfonna.dii'c-or, e! 
vector recombin;mt.e 
recombinamt' 
}. Multip!icación del DN/\ r�:<:mnbina.nk. 
dentro de la bac.terill 
-- ¡@;;g;) 
4 . D1vis1ón cdu!ar de la cefo!;, hospedadora �- Fonnaciún de dones resul tado de nume­
rosas divi siones celulares 
sistemas de metilación-restricción. Además, estas cepas codtfican en· 
su DNA el fragmento COOH ierminal (fragmento �í del gen lacZ. 
El tratamiento con CaCl induce un estado de ''c.ümpetencia'' o 
de.sestabil.izac.ión en la pared de la bacteria receptora. durante e.l cual 
las células son capaces de recibir DNA de. distinta procedencia. El 
plásmido c.on el inserto de DNA introducido en la célula bacteriana 
se replica aprovechando la maquinaría enzimática de la hospedadora. 
El estado de .. competencia" se induce en las paredes bacterianas me­
diante un procedimiento químico que. involucra. un tratamit..>nto con 
sales de ca!..cio o de magnesio. También puede realizarse mediante 
electroporación, procedimiento más rápido y que rinde mayores 
eficiencias de. transformaclón, que oscilan alrededor de l x l. ff' a l 
x 1 O'' unidades fonnadoras de colonias (UFC)Jmg de DNA. 
La transfonnación por choque térmico se. realiz;i mezclando 
parte de la reacción de ligación con célula,; competentes. Este shock 
detennina la entrada del DNA foráneo /,plásmido 1- insel1o) a través 
de- la pared en estado "·competente" de la bacteria. Luego del tmta-
1niento, las células se incuban por un ciclo de generación en medio 
suplerri.entado con glucosa, que induce la expresión de los genes 
Jaez, cuyo producto servirá para selec-cíonar por color las colonias 
recombinames en el medio de selección (colonias blancas). 
La presencia del. inserto se veti.fica mediante- PCR con los 
mismos cebadores utilizados para obtener los productos iniciales 
y tos clones ''positivos" se almacenan en la fonna de cultivo 
saturado a -70 ºC con crioconservantes. 
PURIFICACION DE DNA PLASMIDICO 
El DNA de los plásmid.os recombinantes puede aislarse. 
y purificarse, de manera tal que el fragmento clonado puede 
posteriormente separarse del DNA c.romosómico y de los com­
ponentes macromoleculares de la bacteria. Uno de los métodos 
de purificación utilizados tradicíonalmente se denomina ' 'lisis 
alcalina". En este. último. las suspensiones de cultivos bacterianos 
saturados ( con plásmidos rec:.ombinantes) se lavan en medio de 
cultivo y se someten sucesivamente a tratamientos a pH e.levad.o 
--
Cultivo de. ha.cieria.s e.n un rn.edlo i;óíid(, 
( 1 2- 1 2,6). que producen fa l.isis celular y la desnatura.fizac.ión 
del DNA bacteriano, sin afectar al plásmido circular y cetTa<lo 
covalentemente. La neutralización del extracto con solución ríca 
en sales provoca la precipitación del cromosoma bacteriano y del 
RNA. y la presencia de detergentes aniónicos (SDS) produce la 
precipitación de las proteínas . El sobrenadante límpido resultante 
contiene en suspensión el DNA plasmídico, quedando los demás 
componentes celulares, incluido el DNA bacte1iano, en el fondo 
del tubo. La purificación posterior se realb .. a con solventes orgáni­
cos (fenol:clorofonno) y precipitación con etanol o isopropanol. 
El DNA plasmídico resuspendido en buffer o agua destilada 
estéril se cuantifica en gel de agarosa con est1.ndares de DNA de 
concentm.ción conocida. 
EI rendimiento de DNA puro de minipre.ps es de aproxima­
damente 100 ng/ml a partír de l -3 ml de cultivo saturado inicial, 
en ta.nto que las preparaciones a gran escala (midipreps y maxi­
preps) rinden hasta 3000 mg por cada 500 mi de medio de cultivo 
í.nicíaJ. Estas últimas preparaciones explotan las diferencias de. 
densidad entre el plásmido superenrol.lado
1 
otros ;kidos nucleicos 
y las proteínas en suspensión para la purificación. Alternativa­
mente, pueden utilizarse kits comerciales de extracción que, en 
aproxi1nadamente. l hora_ permiten obtener DNA puro en a l. tas 
concentracíones a partir de 1 .5 ml de cultivo. 
Cósmídos 
Las bibliotecas genómicas de organismos e.ucariotas s�: pre� 
paran. generalmente. con el bacteriófago A. (lambda} corno vector. 
El fago lambda puede funcionar de fonna litica o iisogénic.a ( in­
tegrado en el DNA de E. coli) y posee una región de. su DNA que 
contiene. los genes para las funciones l.isogénícas. de modo que 
es prescindibie a la hora de insertar un fragmento de DNA en ·esa 
zona . Para que sea útil en clonación molecular, sólo se- requieren 
sus funciones l.itlcas, que aseguran un alto número de copias por 
célula. La digestión con enzímas apropiadas pcnnite ia separa• 
ción del fragmento que codifica para !as funcicmes lisogénicas y 
la inserción en esa localización del inserto de DNA ( vectores de 
in:serción). que si es de. alrededor de 32-47 kpb, pem1ite la rege­
neración in vivo de partículas fágica.s con un empaquetamiento 
correcto. La inclusión. de un pequeño fragmento del genoma del 
fago l en un plásmido pe.m1 i te util izar el sistema de empaqueta­
miento in vitro con alta eficiencia de transfonnación, y son los 
vectores conocidos como cósmidos-, con las propiedades de los 
plásmidos y con capacidad de aceptar insenos grandes, 
Vectores de expresión 
Los vectores de. ex.presión son plásmidos construidos con 
propiedades especiales que les permiten expresar el fragmento in­
senado )/ delectar dicha expresión mediante. diferentes mecani.sn:10�. 
Las condiciones indispensab!.es de un vector de expresión son fa ..
µrc.'>encia en su DNA. de un prnmotOí reconocido por ia polimentsa 
de RNA de\ huéspe.d. ya sea fagi.co o bac-.terhmo (por ej . , prommor 
de TT): un sitio de reconocímient:o de1 ribosoma (RBS') o secuencia 
de Shine-Dalgamo antes del ATG inicial: y SL-'ñales de te1minación 
de la rran.s.cripcíón. La presencia de marcacfores seleccionables 
(_resistencia a antibióticos. sensibilidad a proteína tóxica, etc . ) de­
pende de! típo de vector. Existen diversas estrategias para producir 
ta proteína recombínante de fotma fikil de detectar y en cantidades 
adecuada..'; para su purificación. Algu11os �jemplos consisten en l.a 
generación de protefaas de fusión emre el inserto y una proteína 
wdificada en el vector, que pue.den detecrarse. por ejemplo, con 
emisión de. fluorescencia (Green Fluorescence. Protein. sistema 
pGlow-Topo) o cromatografia de afinidad a metales (IMAC) para 
detección de poli Histidinas ( sistema pEL B), etc, 
Para obtener una proteina recombinante in vitro existen varios 
sistemas de. expresión posibles, dependíendo de las característicai­
de la proteína (proteínas secretorias o estructurales, estado de gii­
cosílación en péptidü maduro, etc. ). la finalidad de la purificac.íón 
(estudios estructura.les, generación de anticuerpos monoclonales, 
etc . ). además de con..o::;iderar previamente la fonna en ia cual se desea 
purificar la proteína expresada. Estos sistemas de. expresión son : 
bacterias_, levaduras, bacutovirus y células de mamíferos. 
Extracción del Ci} 
DNA delvira.'> 
-�
DNA 
Plasmido 
ba.c.t:eriano 
� 
Aplicaciones 
L.as: aplicacione.s de.! uso de la tecno logía dei DNA recom­
binante son múltiples y en los Uitimos años se. ha incrementado 
notablemente dada la di sponibilidad de sistemas de- dete-eción 
e.standarizados que permiten acelerar los tiempos necesarios para 
obtener resuitadcts, haciendo la aplicación sencilla y repe-tible. En 
la fi.gura J 8�5 se esquematizan algunos usos y apl icaciones. 
Obtención de proteínas recombinantes de mamíferos 
Una serie de hormonas como la insulina. la hannona del ere� 
cimiento-. factores de coagulacíón. et.e . tienen W.i imerés médico 
y comercial muy grande . Antes, la obtcnCión de estas proteínas 
:-:.e realiz.a.ba mediante su extracción directa a partir de tej idos o 
fluidos corporales. En la actualidad. gracias a ia tecnologfa del 
DNA re:c.ornbiname. se donan íos genes de cie.rta� prote.inas 
humanas en microorganismo!'! adecuados para su fabricación 
comercial. Un ejemplo típico es la producción de insulina que
se obtiene a partir de. la levadura Sacclurromyas cerevisae. e.n 
la cual se dona e{ ge.n de la insulina humana. 
Vacunas recombinantes 
El sistema tradicional de. obtencíón de. vacunas a partir de. 
mlcroorga_riismos patógenos inactivos puede cornponar un riesgo 
potencial. Muchas vacunas, como la de. la hepatit is B. se obtienen. 
actualmente por ingeniería genética. Como la. mayoria de los 
factores antigénicos son proteínas, lo que se hace es clonar el 
gen de la proteína corres.pondieme. 
SECUENCIACION DE DNA 
El metodo enzimático de Sanger (fig. 1 8-6) se- basa en la 
extensión especifica de la cadena de DNA a partir de un primer, 
por la acción de la DNA polimerasa. y la intrnducción de di­
deoxinucleótidos (ddNTPs) trifosfato en la cadena en formación. 
In1.egrac.ión del plásmido híbrido 
en el núcle.o de- una celula ác 
levadura 
La levadura fabrica las 
protefaas vfri.c.as con poder 
ínmunológico -< �
•,---�� Inyección de proleir,as víricas 
ru- r:.n un chímpance 
Figura . Apl.icac.iones de la tecllOlogía del DNA recombinante. 
ódGTP ::WCTP 
oc:GTP dóATP dd'TTP ddCTP 
□ u u u 
t t t t 
G G+A C+T e
-
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O.ID 
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5 -AGGTCCGGGAATG-· 3' 
3· --TCCA.GGCCCTTAC-· 5· 
Figura 18-6. Procedimiento para se.cue-nciación de DN.,\ ideado 
por Sang:er y col . ( l 977:) . 
Los 2 . • .. 3 · d<lNTPs care.cen de un residuo -OH en posición 3 ' 
de. la deoxirribosa. Se íncorporan a la cadena en crecimiento 
por medio del tri fosfato 5 · . pero al carecer del hidroxi lo 3 ' 110 
pueden formar enlaces fosfodiéster con nucleótidos sucesivos 
y la cadena queda inte1rumpida, En la reacción se usan dNTPs 
convencionales, además de íos ddNTPs, de modo-ta-l que com­
piten entre elios y se producen poblaciones de oii gonucleótid.os 
temünad.os A, C. G o T en la cadena molde. 
Actualmente.. la- secnenciación se realiza en equipos aut:oma�· 
t.ízados que uti lizan los mismos principios básicos establee-idos 
por Sanger y coL <. 1 977), pero empleando los cuatro dideoxinu� 
cleótid.os (ddNTPs) trifosfato en una misma reacc.ión� los cuales 
se diferencian con cuatro fluorocromos distintos que son "leídos" 
por un láse.r, y la información se registra en forma de un cromato­
grama. que es la representación gráfica de. los picos de. luz emitida 
a d1ferentes longitudes de onda en cada posición leída. 
Estrategias de secuenciación d.e! genoma 
El DNA genómico se· corta aleatoriamente en fragmentos, 
que se separan en distintas cla.,;;es de tamaños y se insertan 
en distintos tipos de. vectores. e.ad.a uno con una capacidad 
media di ferente. (por ej ., los YAC portan ínsertos entre 100 
y 2000 kb; los cósmidos, unas 40 kb ). 
Se preparan mapas fisíc.os de baja resolución a base- de 
clones solapados de insertos de YAC. 
Se preparan mapas físicos de alta resolución, preparados 
para la secuenciac.ión, por medio de la subclonación en 
cósmidos de fragmentos aleatorios de insertos de YAC. 
Finalmente, se escoge un conjunto de dones de cósmidos 
con solapamientos mínimos, sus insertos se rompen aleato­
riamente y se subclonan en vectores para ia secuenci:1ción 
(derivados del fago M l 3, plásmidos de la serie pUC, etc.). 
Por cada cósmido hay que secuenciar unos 800 dones de 
fago M l 3, con un tamaño medio de inserto de 400 pb, y la se­
cuencia de 40 kb dei. inserto del cósmido original se ensambla 
computaciona!mente, Este enfoque de sec.uenciación aleatorfo 
(shmgun) obliga a secuenciar muchas veces (i.ma-; 8- o 10) el 
mismo segmento de secuencia, con la ventaja de asegurar una 
mayor fiabilidad de los datos obtenidos. Sin embargo, presenta 
varios. inconvenientes: hay que disponer previamente. de huenos 
mapas; lüs YAC son inestables y muchos de e.llos son quimeras. 
artefactos de donación que no reflejan. et orden genórnico, )-' esta 
mei.odología. no se puede- automatizar tmalmen1.e. 
Nuevas metodologías de 
análisis genético 
La revolución de-! DNA recombinante nos provee de herra­
mientas y técnicas para aislar y caracterizar genes individua.les: 
sin embargo._ esta metodología de estudio tiene- dos grandes 
l imitacíones. Primero, estudiar un gen a. la vez es laborioso y
costoso, Segundo, esta metodología de estudio se basa en un
punto de vista red.uccionist.a de la biología., ya que es sabidü que
ios genes no funcionan en forma aislada. sino que miles de. ellos
deben trabajar coordinadamente en las actividades biológicas
que ocurren en cualquier organismo. La segunda revolución en 
la biología mol.ecular comprende la genómica, que incluye el
estudio de los genomas enteros e incorpora las modernas tC:c.nicas
de. mapeo. secuenciación, hallazgo de genes y análisis füncionaL
Las herramientas de la genómica y la bíoinformálica pe-rmiten
obtener y analizar muchos más datos en cortos periodos.
La revolución gcnómíca comenzó en la década de 1990 con el 
Proyecto Genoma Humano. Los objetivos iniciales del prüyccí.o 
fueron el mapeo y la secuenciación del genoma con ei fin de 
identificar la totalidad de los genes. Su primera fase invoiucró 
la creación de un mapa genético de alta densidad que se utilízó 
como andamiaje para el ensamble del mapa fisico de los clones 
de DNA (http;//www.ncbi ,nlm.nih.gov). Durante el progreso del 
proyecto fueron secuenciados también los genomas de muchas 
bacterias y algunos eucariotas; éstos incluyen varios patógenos 
humanos y otros organismos de gran utilidad como modelos ex­
perimentales (Drosophila melanogaster, Caenorhabdiris elegans 
y Saccharomyces cerevisiae_). A medida que el volumen de datos 
de secuencias fue creciendo se desarrollaron paralelamente varias 
metodologías diseñadas para el estudio funcional de los ge.ne"s . 
Análisis de- la expresión génica. El desarrollo de nuevas 
tecno1ogíru; basadas en la secuenciac-.ión a gran escala de c.DNA 
y la utilización de microarreglos de DNA han permitido el 
estudio simultáneo de ia expresión de. mi les de genes. Estos 
estudios pueden de.mostrar el efecto de. difereme.s condiciones 
experimentales sobre el perfil de expresión génica, ayudando 
a reconocer grupos de genes que se expresan diferenci.almeme 
y en fonna- coordinada e.n respuef>ta al cambio producido. Los 
microarreglos uti l izan pequeños soportes sóiidos donde las 
secucncías de diferentes genes (DNA o cDN.A) son inmoviliza­
dos en locaiizaciones fijas. En generai se usan como soportes 
portaobjetos, chips síliconados o membranas de nailon, a los 
cuales se expone a una muestra cuyo perfil de expresión génica 
(transcripción de mRNA) se desea analizar. t,a importancia de 
BAC: Cromosoma aníilCia! de la bacteria (bacteria! ar1ijif:ial chronwsome). 
YAC: Cromosoma artificial de levadura (_veast artificial chromosome).
Clones conformados por un gran segmento de DNA (l 00,000 a 200,000 bases) de otras especies, insertado e.n el genoma de una bacteria o de leva� 
duras. respectivamente,esta metodología radica en que en un pequel'\o espacio se puede 
anaiízar la expresión de miles de genes. 
Análisis de l.a ex.¡m.>!.ión )' estructura proteica. Varia<; técnicas 
de separación de alta resolución, como ia electroforesis en geles de dos 
dímensiones, pueden utilizarse para el fraccionamiento de mezclas 
cnmplej1L� de proteínas. A su vez, otras tecnologías, como la espectro-­
mctria de masas, pueden ser utilidad en la identificzción de pmtcinas 
indiv¡duales en fr>m1a rápida y con.'1ahle. De esta fomra es posible
analizar y comparar la expresión diferencial de miles de. proteína,; en 
difercnies muestrns, Se han bnwdo varios programas mundiales de 
genómica estructural encargados d.e resolver la. estmctu.ra de- cientos 
de proteín?.s. Estos programas buscan cubrir la mayor parte de la!• 
familia .. � proteicas y de. esta manera incrementar la frecuencia de 
asignación de la función que. poseen los diferentes genes. 
Otro aspecto de la genómica que probablemente poseerá 
un gnm impacto en la medicina es el analisis de la variabilidad 
genética. de ios individuos. En este capítulo se describió el uso 
de secuencias de DNA como herramientas de diagnóstico para 
la identificación de variantes génicas particulares asociadas con 
enfermedades. Más recientemente .. estas técnicas basadas en !os 
mismos principios básicos han evolucionado para la tipificación 
a gran escala. de polimorfismos de simples nudeótidos (Single
Nucleoride Po�ymorphism, SNP). 
Los SNP consisten en cambios genéticos e-n un nucieótido 
que pueden ocurrir en ia secuencia de DNA de un organismo. 
En general, se hallan fuera de las zonas codificantes, por lo que 
no producen cambios físicos en los individuos._ sah-o aqueiíos 
cambios que estan involuc-rados en el desarrollo de al.gunas pa -­
tología.s, o que pue-dan intervenir en la respuesta a detenninado 
fánnaco o a regímenes. En no mucho tiempo, los clínicos podrán 
evaluar la susceptibilidad de sus paciente-s a una enfermedad dt-­
ierrninada, analizando sus DNA en la oúsquedi: de. determinados 
patrones de SNP. Otra ap!ic.ación potencial de los SNP es para el 
estudio de la respuesta a las drogas y la individualización de la 
terapéutica en medicina. 
RIBLlOGR.\FIA 
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