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1 LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA GENERAL PRÁCTICA Nº 2 EL LABORATORIO BACTERIOLOGICO. ENUMERACIÓN, DESCRIPCIÓN Y PREPARACIÓN DEL MATERIAL UTILIZADO EN MICROBIOLOGÍA OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA Reconocer los equipos, materiales e instrumentos de empleo común en los laboratorios bacteriológicos. Aplicar los procedimientos de lavado y acondicionamiento de cristalería e instrumental empleados en laboratorios bacteriológicos. Interpretar él porque de los requisitos empleados en el lavado, cuidado y acondicionamiento de la cristalería e instrumental. MATERIALES DE VIDRIO: El material de vidrio que se utiliza en Microbiología debe ser de cristal, cuya composición especial permita una fácil fusión. El material debe ser neutro (para evitar alteraciones de los medios y materiales que se introduzcan), transparente, resistente a golpes y variaciones térmicas, y no sufrir desvitrificación al ser sometido a llama. Los materiales de vidrio más utilizados en laboratorios de Microbiología e Inmunología son: Láminas Porta-objeto: Láminas de vidrio, rectangulares y de tamaño variable. Usados para colocar preparaciones que van a ser observadas. Limpios y desgrasados. Láminas Cubre-objeto: Laminillas de vidrio cuadradas, redondas o rectangulares, tamaño variable. Para Examen microscópico al fresco. Evitan desecación y contaminación del lente. 2 Láminas de Koch: Semejante a una lámina portaobjeto pero presenta una excavación central o hendidura. Gota pendiente para observar motilidad bacteriana. Tubos de ensayo: Recipientes de vidrio de paredes gruesas, de diferentes dimensiones (150X16 mm; 175x22 mm; 100x22 mm). Sirve como envase de medios de cultivo. Se esterilizan con tapa de algodón. Tubos de fermentación Durham: Tubos pequeños, de dimensiones variables (más común 50x6 mm). Se colocan invertidos en medio de cultivo líquido en un tubo mayor. Recolecta el gas producido por la fermentación. Tubos de Roux: Son tubos de 200X25 mm., que presentan una estrangulación en el extremo inferior. Se usa para cultivo en papa. Tubos con tapa de baquelita: Tubos de ensayo que presentan en su extremo superior una tapa de baquelita resistente al autoclave. 3 Tubos de centrifuga: Tubos cónicos graduados o no, con diversas capacidades. Uso en aerología. Placas de Petri: Recipientes de vidrio o de plástico, redondos y planos. Se emplean como recipientes de medios de cultivo sólido. Superficie extensa permite siembra de bacterias. Es esencial para el aislamiento. Balones: Envases de vidrio o plástico en forma de balón con un cuello alargado, pueden presentar fondo plano. Balones aforados: Envases de vidrio en forma de balón con cuello alargado y graduación. Empleados para la preparación de soluciones con volúmenes exactos. Fiolas de Erlenmeyer: Recipientes de vidrio de forma cónica, para diferentes volúmenes (de 125 a 2.000 ml) Se emplean para mezclar y calentar soluciones, preparar y almacenar de medios de cultivo. Fiolas de Kitasato: Recipientes de vidrio con la misma forma que los Erlenmeyer. Pero con mayor espesor y una prolongación tubular lateral ya sea superior o inferior. Empleado para realizar filtraciones al vacío (líquido ascítico, suero) que el calor puede dañar. 4 Frasco o botella de Roux: Envases achatados que se emplean para cultivos confluentes en agar y en grandes cantidades. Se emplean en la preparación de antígenos, bacterinas, etc. Beaker o vaso de precipitado: Recipiente de cristal o de material plástico de capacidad variable y boca ancha. Se emplea en la mezcla y preparación de medios y reactivos. Frasco de dilución: Frasco de vidrio con tapa de baquelita que se emplea en la realización de diluciones, sobre todo en microbiología de alimentos. Embudos: Recipientes de plástico o vidrio, con pico terminado en bisel, de diferentes diámetros. Se utiliza para repartir medios de cultivo en tubos de ensayo y otros recipientes. Permite filtrar sustancias. Cilindros graduados o probetas: Son recipientes cilíndricos con una base ancha que le confiere estabilidad, de capacidad variable indicada por una escala graduada en su parte externa. Se emplea en la determinación volumétrica de líquidos. 5 Viales: Recipientes de vidrio con tapa de diferentes tamaños, empleados en la toma de muestras o en la conservación mediante congelación de material o líquidos. Varilla de vidrio: Se utilizan para agitar o mover sustancias, es decir, facilitan la homogenización. De dimensiones, formas y espesor variables: simple, acodada, espátula de Drigalski. Espátula de Drigalski. Varilla de vidrio que se usa para siembra sobre superficies de medios sólidos y para cosechas de cultivos. Pipeta de Bang: Pipeta con graduación externa especial. Se emplea para medir volúmenes muy específicos (0,08; 0,04; 0,02; 0,01; 0,005 ml). Se emplea en la prueba de Brucelosis. Pipeta volumétrica: No están graduadas y sólo permiten medir un volumen único Recipientes para coloraciones (inmersión total): Frasco de vidrio de paredes gruesas y boca ancha, con tapa. Se emplea para la inmersión de láminas portaobjetos con extendidos en soluciones colorantes. 6 Goteros: Frascos de vidrio con dispositivo dosificador gota a gota en su tapa. Puede ser de color ámbar o transparente, dependiendo de la estabilidad a la luz que presente el reactivo contenido en su interior. Permite contener sustancias que se necesitan agregar en pequeñas cantidades. Frascos dosificadores de colorantes: Frasco de vidrio de paredes gruesas con tapa de diseño especial que permite la salida de solución colorante de manera controlada. Se emplea para colorear láminas con extendidos fijados por calor. Pipetas graduadas: Tubos delgados que presentan un extremo agudo y otro romo empleados para medir trasvasar o medir volúmenes fijos de soluciones. Existen pipetas graduadas hasta la punta (pipetas terminales) y de doble enrase (graduación termina por arriba de la punta). En la punta roma se coloca un algodón que tiene como función: Proteger al operador de posible contaminación accidental e impedir la contaminación del material al soplar. Pipetas Pasteur: Pipetas sin graduación, con punta inferior de diámetro capilar. Se emplea para colocar gotas en láminas, cuando sembramos o se precisa tomar un volumen inexacto de líquidos. 7 APARATOS E INSTRUMENTOS: Mango de Kolle con alambre o Asa de Platino: Constituido por un mango de material diverso con una extremidad recubierta de abonita que actúa como aislante térmico; en la otra tiene una aguja o asa de alambre de platino (niquel- cromo). Sembrar o repicar en medios de cultivo. Asas y agujas de inoculación desechables: Asas y agujas de plástico calibradas y estériles. Se emplean para sembrar o repicar bacterias en medios de cultivo. Mechero Bunsen: Instrumento formado por un tubo metálico vertical sujeto a un pie de conveniente peso, la entrada de gas se efectúa por un tubo lateral. En la parte inferior del tubo vertical existe un orificio que permite la entrada de aire, cuya apertura se regula por un tornillo. Se utiliza para producir la llama de gas. Balanza de un solo plato: Aparato que permite determinar el peso de medios de cultivo, colorantes u otras sustancias. Es una aparato que permite pesar sustancias su sensibilidad es de 1 décima de gramo. Balanza Analítica: Balanza que permite determinar cantidades muy pequeñas y precisas (0,1 mg o menos). 8 Campana de microaerofilia: Recipientes de vidrio, en los cuales se coloca una vela encendida con el objeto de producir CO2 y crear una atmósfera libre de O2 y con una concentraciónde CO2 en el orden del 5 al 8%. Se emplea en el cultivo de M.O. tales como: Brucella abortus, Neisseria, Haemophyllus, entre otros. Jarra de Gas-pak: Recipiente que permite obtener ambientes libres de oxígeno empleando reactivos equipos catalizan la eliminación del oxígeno mediante una reacción en frío. El oxígeno es reducido a agua. Agitador vortex: Equipo que se utiliza para mezclar diluciones, o resuspender partículas, entre ellas gérmenes que se encuentran en suspensión en los líquidos. Estufa: Equipo parecido a un horno eléctrico que se emplea para someter los medios de cultivo a incubaciones con diferentes rangos de temperatura, generalmente 37 ºC. Esta controlado por un termostato. Horno Pasteur: Equipo parecido a la estufa, pero alcanza valores de temperatura superiores. Se utiliza en la esterilización de la cristalería mediante la aplicación de calor seco (180 ºC x 30´). 9 Autoclave: Equipo que se emplea para esterilizar todo material que puede dañarse por calor seco, tales como medios de cultivo, materiales de superficie de goma,etc). Esteriliza mediante calor húmedo a una temperatura de 121 ºC a 15 libras de presión durante 15´. Pipetero: Recipientes de acero inoxidable que se utilizan para guardar pipetas previamente preparadas (esterilizadas). Espátulas: Instrumentos empleados para tomar material de un recipiente con el objeto de pesarlo o mezclarlo. Generalmente esta compuesto de un mango de madera y una laminilla de acero inoxidable. Mortero y mazo: Son utensilios hechos de diferentes materiales como: porcelana, vidrio o ágata, los morteros de vidrio y de porcelana se utilizan para triturar materiales de poca dureza y los de ágata para materiales que tienen mayor dureza. Aglutinómetro: Caja de madera con características especiales (placa de vidrio cuadriculada y fuente de luz en el fondo), que se emplea para leer pruebas de aglutinación, Ej.: Pruebas de brucelosis. 10 Pisetas: Recipientes plásticos de contextura suave con una punta por la cual se puede expeler su contenido al comprimirlos. Se usa para rociar agua, desinfectante, etc. Baño María: Recipiente de acero inoxidable en el cual se coloca agua para calentarla. Incluye un termostato regulador de temperatura y un termómetro que indica la temperatura alcanzada. Dentro del agua se colocan tubos, frascos u otros envases conteniendo diversos líquidos. La temperatura puede variar desde 20 ºC hasta 80 ºC. El uso más frecuente es a 37 ºC o a 55 ºC. Centrifugas: Es un aparato que aplica una fuerza centrífuga sostenida (esto es, una fuerza producida por rotación) para impeler la materia hacia afuera del centro de rotación. Este principio se utiliza para separar partículas en un medio líquido por sedimentación. La parte funcional está constituida por un eje vertical accionado por un motor eléctrico que hace girar el soporte o cabezal que lleva los tubos a diferentes velocidades, gracias a un regulador de revoluciones. Algunas centrifugas llevan un reloj de tiempo para controlar la duración de la centrifugación, también puede llevar un tacómetro que indica las revoluciones que da el aparato. Se emplea para separar en base a pesos moleculares. 11 Microcentrifuga: Igual al anterior, pero para volúmenes pequeños. Emplea tubos capilares o eppendorf. Camisas de centrifugas: Contenedores de metal en los que se introducen los tubos de centrífuga, estas camisas se colocan en ejes vasculantes dentro de las centrifugas. Campana de flujo laminar: Equipo de laboratorio que provee un ambiente seguro de trabajo al proteger manos, cara y todo el cuerpo del operario. Posee fuente de gas, aire comprimido, electricidad. Igualmente ofrece como ventaja un flujo de aire dirigido hacía filtros que permiten la captura de todo el material microbiológico infectante. Reloj cronómetro para turnos: Cronómetro con alarma acústica que advierte la culminación del tiempo de una incubación. Termómetro: Instrumento que permite determinar la temperatura del medio ambiente o los medios. Se utilizan para determinar la temperatura a la que ocurre una reacción. Parafilm: Película plástica que permite la mezcla de soluciones al colocarse sobre la boca de los frascos sin tapa. 12 Contador de colonias: Equipo conformado por una lámina de vidrio cuadriculada, una fuente de luz, una lupa y electrodo, que permite el contaje de colonias en placas de Petri con medio de cultivo. Empleada en Microbiología de alimentos y agua. Microscopio: Equipo de laboratorio conformado por oculares, objetivos y lentes de aumento que permite observar preparaciones con especimenes microbiológicos. pHmetro: Equipo conformado por un electrodo y un monitor. Se emplea para la determinación del pH. Micropipetas graduables o fijas: Pipetas mecánicas que emplean puntas desechables plásticas para volúmenes pequeños de líquido (< 1ml). Propipetas: Instrumento empleado para facilitar la toma de líquidos que se coloca sobre el extremo superior de las pipetas y que permite la manipulación de líquidos potencialmente peligrosos sin riesgo para el operario. 13 Medios de cultivo: Sustrato empleado para el cultivo y aislamiento de cultivos puros bacterianos. Carro de transporte para materiales de laboratorio: Carro de acero inoxidable para el transporte de reactivos y equipos de uso en el laboratorio. Reactivos coloración de Gram: Reactivos empleados para colorear microorganismos obtenidos a partir de medios de cultivo o de muestras clínicas. Agujas vacutainer: Agujas de doble punta que son empleadas en la toma de muestras sanguíneas estériles. Tubos vacutainer estériles con vacío: Tubos de ensayo con tapones de goma, estériles y con vacío, empleados en las tomas de muestras sanguíneas. 14 Medios de transporte: Sistemas para recolección, preservación y transporte de especimenes microbiológicos. Gradillas para tubos: Rejillas que permiten el sostén de tubos de ensayo de diversos calibres. Pueden ser de metal o de plástico. Nevera: Equipo empleado para preservar los reactivos y medios a bajas temperaturas. Base para agitador magnético: Permite la mezcla de reactivos y solubilización de los mismos. Agitadores magnéticos: Piezas imantadas recubiertas de plástico que permiten la mezcla de reactivos y solubilización de los mismos mediante agitación por rotación. Batas de laboratorio: Blancas, manga larga, debidamente abotonadas. 15 Cinta indicadora para Autoclave: Cinta con propiedades adherentes empleada como indicadora del correcto funcionamiento del autoclave. Cuando la cinta es sometida a la temperatura, presión y tiempo de incubación adecuado aparece una señal visual sobre la misma. Cepillos para lavado de cristalería: Cepillos con asa de alambre o plástico, útiles para la limpieza de una amplia variedad de cristalería Escobillas o limpia tubos: Permite lavar tubos de ensayo. Yesqueros: Instrumentos empleado para encender los mecheros, pueden ser de pedernal, de gas o eléctrico. Rotores orbitales: Equipo que permite la mezcla de medios líquidos o suspensiones que no pueden se agitadas violentamente. Consta de una plataforma y un rotor que permite el movimiento circular de la primera. Bomba de vacío: Motor que permite la creación de vacío. Se emplea para filtrar soluciones o líquidos al hacerlos pasar a través de membranas porosas. También se emplean para purificar líquidos. 16 Cestas de alambre: Recipiente que permite contener material para esterilizar en autoclave Porta placas u porta pipetas: Recipienteelaborado en acero inoxidable que se utiliza para contener placas de Petri y/o pipetas estériles. Rejilla de amianto o asbesto: Es una tela de alambre de forma cuadrangular con la parte central recubierta de amianto o asbesto, con el objeto de lograr una mejor distribución del calor. Se utiliza para sostener utensilios que se van a someter a un calentamiento y con ayuda de este utensilio el calentamiento se hace uniforme. Bandejas de coloración: 17 Soportes para embudos: Pieza del equipamiento de laboratorio que sirve para sujetar embudos de filtración, embudos de decantación, etc. Trípodes: Es un aparato de tres patas y parte superior circular o triangular, que permite estabilizar un objeto y evitar el movimiento propio de este. La palabra se deriva de tripous, palabra griega que significa ‘tres pies’. Sobre la plataforma del trípode se coloca una tela de amianto para que la llama no dé directamente sobre el vidrio y se difunda mejor el calor. Soportes universales: Es una pieza del equipamiento de laboratorio donde se sujetan las pinzas de laboratorio, mediante dobles nueces. Sirve para sujetar tubos de ensayo, buretas, embudos de filtración, criba de decantación o embudos de decantación, etc. También se emplea para montar aparatos de destilación y otros equipos similares más complejos. Aro metálico: Instrumento metálico de laboratorio, que se emplea como soporte de otros materiales anexado al soporte universal. 18 Espátulas, tijeras, pinzas, bisturís, etc.: Instrumentos empleados para tomar, separar, sujetar, cortar o diseccionar material biológico y no biológico. Marcadores: Se utiliza en la rotulación e identificación de vidriería empleada en la preparación de los medios de cultivo en los cuales se siembran las cepas bacterianas Lámpara de Luz Ultravioleta: Lámpara que emite radiación electromagnética en el intervalo entre 4 y 400 nm, o más allá del espectro violeta de la luz visible. El cual es empleado para el control y muerte de microorganismo sobre la superficie de áreas e instrumentos de trabajo. 19 Soportes para filtros o membranas filtrantes: Instrumento empleado como un método físico- mecánico para la separación de bacterias que se encuentran en un suspensión en mezclas de sustancias compuestas de diferentes fases (fase = componente homogéneo en un determinado estado de agregación). Un medio filtrante poroso es atravesado por un líquido quedando retenidas las bacterias en la superficie o en el interior del medio filtrante Mangueras: Es un instrumento de caucho que se utiliza para traspasar líquidos o gases de un instrumento a otro. Gafas de seguridad: Este instrumento sirve para proteger los ojos y parte de la cara, de cualquier partícula que pueda afectarla. Papel filtro: Se utiliza para filtrar disoluciones, reteniendo los precipitados o impurezas. 20 ELIMINACIÓN Y LIMPIEZA DEL MATERIAL CONTAMINADO. ESTERILIZACION. ESTERILIZACIÓN: En Microbiología se define esterilización, como la destrucción o eliminación total de todos los microorganismos vivos en un objeto o material, incluidas las endosporas bacterianas. En otras palabras, la esterilización implica la destrucción o eliminación de cualquier forma de vida. Se considera que un objeto está estéril cuando se encuentra libre de todo organismo viable. Un organismo viable o vivo es aquel que puede reproducirse. La esterilidad por lo tanto es un estado absoluto, no hay grados de esterilidad. La comprensión de los principios básicos de esterilización y desinfección es fundamental para la práctica razonable de la medicina y, en general, de las carreras correspondientes al área de la salud. En Microbiología es importante recordar la necesidad de una pulcra y esmerada limpieza del material, así mismo, es muy importante la recuperación del material reciclable y la eliminación del material desechable. Continuamente se introducen nuevas técnicas de esterilización y nuevos productos desinfectantes; sin embargo, la mayoría de los procedimientos y agentes utilizados en la actualidad son los mismos que han venido empleándose desde hace cientos de años. Al aplicar algunos procedimientos de esterilización (esterilización por calor, por ejemplo), es posible destruir o matar a los microorganismos, pero no los eliminamos físicamente. En ocasiones especiales, especialmente tratándose de líquidos, pueden permanecer organismos muertos o restos de los mismos, aun cuando el líquido es estéril, estos productos remanentes pueden interferir con la finalidad a la que se destina el líquido. Obviamente en ocasiones no basta con esterilizar un objeto, material o sustancias; Es necesario también escoger adecuadamente el procedimiento de esterilización apropiado a la situación específica. Hay varios métodos de esterilización posibles, que pueden clasificarse de la siguiente manera: 1. METODOS FISICOS: Permiten la destrucción de los microorganismos mediante aplicación de calor o radiaciones, o bien, su eliminación mediante filtración o centrifugación. 2. METODOS QUIMICOS: Los microorganismos son destruidos mediante la aplicación de agente químico. 21 La descripción de los métodos empleados para el control y muerte de microorganismos se discutirán, con bastante detalle más adelante, en la práctica correspondiente. Por los momentos solo mencionaremos la dinámica de la esterilización que sustenta las técnicas empleadas para la preparación del material de cristalería requerido en el trabajo microbiológico. Igualmente consideramos que es pertinente aclarar algunos de los términos de uso frecuente en Microbiología: ESTERILIZACIÓN: Termino absoluto que implica la inactivación de toda forma de vida microbiana, en términos de la capacidad de organismos para reproducirse. SEPSIS: Estado de infección. SÉPTICO: Calificativo dado a materiales infecciosos. ASEPSIA, ASÉPTICO: Estado no infeccioso o ausencia de material infeccioso respectivamente. ANTISÉPTICO: Sustancias químicas que tienen la propiedad de oponerse a la sepsis o putrefacción ya sea, matando los microorganismos o inhibiendo su capacidad de crecer y multiplicarse. Este termino se utiliza comúnmente para referirse a agentes químicos que se aplican tópicamente sobre: tejidos vivos o se incorporan a materiales destinados a inoculación (vacunas, por ejemplo), o que interesa conservar libres de contaminación (sueros). DESINFECTANTE: Agente capaz de destruir microorganismos capaces de producir infecciones. El término comúnmente se adjudica a los agentes que se aplican sobre objetos inanimados: utensilios, pisos, paredes, etc. SUFIJOS -CIDA y -STASIS: Se añaden cuando la acción final del agente comporta la muerte del microorganismo o la inhibición de su capacidad de crecer y multiplicarse, respectivamente. BACTERICIDA: Agente capaz de destruir bacterias. GERMICIDA: destruye gérmenes o microorganismos. BACTERIOSTÁTICO: agente capaz de inhibir la multiplicación bacteriana. DINAMICA DE LA ESTERILIZACIÓN. Para la comprensión de las bases de la esterilización por agentes letales, es imprescindible tener una información acerca de la cinética de la muerte en poblaciones bacterianas. Tratándose de microorganismos, el único criterio válido de muerte es la incapacidad para multiplicarse. Eso se determina mediante siembra en medios de cultivo adecuados; usualmente aplicamos métodos de recuento o contaje bacteriano viable. Cuando una población bacteriana se expone a un agente letal, ocurre una disminución, progresiva en el tiempo, en el número de microorganismos sobrevivientes. La cinética de la muerte de una población bacteriana es, usualmente, exponencial, si elaboramos un gráfico representando el logaritmo del número de microorganismos sobrevivientes, como una función del tiempo de22 exposición, obtenemos una línea recta, cuya pendiente negativa define la rata o tasa de muerte. La tasa de muerte no dice sólo que fracción de la población inicial sobrevive a un determinado período de exposición al agente. Para determinar el número real de sobrevivientes es necesario conocer el tamaño, en términos de número de individuos, de la población inicial. La curva logarítmica es matemáticamente conveniente y aproximadamente correcta cuando se usan concentraciones relativamente altas de desinfectantes pero, cuando la concentración es baja la curva de desinfección es sigmoidal; la tasa de muerte es lenta en las etapas iniciales de contacto, procede luego procede luego en forma rápida y se hace lenta hacia el final. Esto debe tomarse e cuenta cuando la carga microbiana inicial es alta, pues en ésta circunstancias aumenta la probabilidad de que se encuentran presentes individuos resistentes, o formas de resistencia bacteriana como las esporas. La experiencia indica que mientras mayor es el número inicial de microorganismos presentes, debe considerarse además el tipo de microorganismos presentes. No todos los microorganismos son igualmente susceptibles; por ejemplo, los esporulados son más resistentes a una serie de agentes físicos y químicos que aquellos que no lo son. De hecho, hay mucha variación en la sensibilidad de las distintas especies microbianas a los diferentes agentes microbianos y, aún más, es posible encontrar variaciones dentro de una misma especie. Preparación del Material para la Esterilización Limpieza de la Cristalería: Toda la cristalería utilizada en Microbiología debe estar escrupulosamente limpia y estéril Para el lavado y limpieza de la cristalería se debe considerar si es nueva o no, pues amerita tratamientos diferentes según el caso. Cristalería nueva: La cristalería nueva generalmente contiene álcalis libres, por lo que es necesario introducir1a en un recipiente que contenga una solución al 2% de HCI, durante algunas horas, para lograr la neutralización. Posteriormente, se enjuaga con agua comente y se procede a lavarla. Lavado de la Cristalería: 1.- Cristalería Nueva: La cristalería nueva (ya neutralizada) o la usada pero no contaminada con materiales infecciosos, se coloca en agua, preferiblemente tibia, con suficiente jabón para que se forme abundante espuma y luego se limpia con cepillos y esponjas especiales. Se enjuaga con agua comente varias veces y posteriormente se enjuaga al menos tres veces con agua destilada. Se deja escurrir hasta secar y se procede al taponamiento y envoltura para la esterilización. 2.- Cristalería Sucia con Material infeccioso: Se procede a la decontaminación o esterilización de la cristalería con el fin de destruir todo agente vivo. Este proceso de esterilización se lleva a cabo en el autoclave. Después de la 23 esterilización, se desecha el contenido de los recipientes y se procede al lavado como se describió anteriormente. 3.- Lavado de Pipetas, Láminas, laminillas y varillas de vidrio usados: Este material contaminado con agentes infecciosos, se coloca de inmediato en recipientes con desinfectante (solución de fenol al 0.5%), que siempre debe estar ubicado en el mesón de trabajo. Después del tiempo de acción necesario este material se considera descontaminado y se procede al lavado en la forma ya descrita. 4.- Cristalería Turbia: La cristalería, después de ser usada por mucho tiempo, en general se enturbia. Lo que impide una buena visualización de los medios y materiales contenidos en ella. Para eliminar el enturbiamiento se utiliza una solución llamada mezcla sulfocrómica, que se prepara de la siguiente manera: MEZCLA SULFOCRÓMICA Bicromato de potasio 65 g. Agua destilada 400 mI. Acido Sulfúrico concentrado hasta completar 1000 mI. El Bicromato se disuelve en el agua con ayuda del calor; se deja enfriar y se añade lentamente el ácido sulfúrico, agitando constantemente. La cristalería turbia se sumerge en esta mezcla durante varias horas (12 - 24 horas). Luego se retira, la enjuaga con agua comente y después con agua destilada. Posteriormente se procede al secado y preparación para la esterilización. Para manipular la mezcla sulfocrómica es imprescindible el uso de guantes de goma. Preparación de la cristalería para la esterilización Después del lavado y secado, se procede a preparar la cristalería para la esterilización. La cristalería se tapona y se envuelve de manera diferente según la forma del recipiente. PREPARACIÓN Y PROCESAMIENTO DEL MATERIAL DE LABORATORIO: El material que se va a esterilizar debe prepararse de tal manera que se conserve sin contaminar una vez esterilizado: Todos los objetos sucios o contaminados deben recogerse en recipientes adecuados, provistos de tapa. El material de vidrio, tubos, matraces y pipetas, se separa del resto del material recogiéndose en un contenedor vertical u horizontal lleno de una solución desinfectante, como por ejemplo una solución diluida de lejía, en la que permanecerá antes de su lavado durante 24 horas. 24 Como los objetos contaminados contienen, con frecuencia, cantidades importantes de materia orgánica (procedente de los medios de cultivo) que protegen a los microorganismos de los agentes físicos o químicos utilizados en la descontaminación de los mismos, no puede asegurarse la total destrucción de las formas vegetativas y mucho menos de las esporas. Por ello, se recomienda utilizar mayores concentraciones de desinfectante y tiempos más largos de tratamiento que para la desinfección o la esterilización de material limpio. Generalmente se utiliza el autoclave para la descontaminación de instrumentos, equipos y material que sean estables al calor, así como de material desechable. A tal objeto se coloca este material en recipientes adecuados y se introducen en el autoclave sometiéndolos a la acción del vapor de agua a 1 atmósfera de sobrepresión (121º C) en ciclos más prolongados de lo habitual (1 hora en lugar de hacerlo durante 30 minutos). Una vez efectuado este tratamiento, se procede a su lavado para eliminar toda materia extraña, sumergiendo el material en agua caliente jabonosa o utilizando detergentes, mezcla crómica o cualquier otro procedimiento enérgico, tanto mecánico como químico. Se aclara bien con abundante agua y se deja escurrir y secar a temperatura ambiente. En el caso de las pipetas, y antes de ser lavadas, debe extraerse con ayuda de un alambre o pinzas especiales, el trozo de algodón que tienen en la boquilla. Algunos de los objetos sucios y contaminados (portas, pipetas, etc), después de lavados, se sumergen en una mezcla sulfocrómica donde se dejan 24 horas al cabo de las cuales se lavan con agua y se dejan escurrir. Los portas se secan con un paño de hilo limpio, procurando que no queden hilazas sobre la superficie. El material que contiene colorantes se trata, según las condiciones del material, durante un tiempo variable con una solución que puede ser de ácido clorhídrico, nítrico o mezcla sulfocrómica. El resto del material (tubos de plástico, jeringas, etc) se trata con distintas soluciones desinfectantes como hipoclorito sódico, formol, etc, pero debe recordarse que se utilizan a concentraciones superiores a las utilizadas con otros fines. El material de vidrio, como tubos, matraces, frascos, etc, se cierran con algodón graso o tapones metálicos para evitar la entrada o salida de los microorganismos. Además, cuando se usa algodón, a de cubrirse éste con un papel impermeabilizado. En el caso de las pipetas, se les coloca en la boquilla un trocito de algodón que actuará como filtro, evitando la contaminación del operario con los microorganismos de la muestra y que éste a su vez contamine la muestra. Una vez preparadas, se introducen en estuches o cajas metálicas, o bien se envuelvenindividualmente en papel satinado para ser posteriormente esterilizadas. Todo el material de vidrio se esteriliza con calor seco, generalmente en un horno Pasteur. El material de plástico desechable ya se suministra estéril y listo para su uso. Por ejemplo, las placas de Petri se introducen en bolsas de plástico selladas y se esterilizan con óxido de etileno o radiaciones. 25 Las soluciones y medios de cultivo líquidos se envasan en matraces o tubos y se esterilizan, generalmente, en autoclave. Existen varios métodos para llevar a cabo el proceso de esterilización y la selección de un determinado método se encuentra condicionado por el tipo de material que se quiere esterilizar. PRESTE A TENCION A LAS INDICACIONES ACERCA DE LA PREPARACION DE CADA MATERIAL.
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