TECNICAS DE ESTUDIO Y DIAGNOSTICO VIROLOGICO

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TECNICAS DE ESTUDIO Y DIAGNOSTICO 
VIROLOGICO 
JNTRODUCCJON 
El diagnóstico virológico se realiza por una variedad de ra­
zones, desde aquel l.as destinadas ai diagnóstico etiológico de una 
enfermedad hasta los de estudios retrospectivos serológicos. La 
virol.ogi.a ha sido hasta hace poco tiempo considerada una rama 
de la microbiología ''dífk: i l de estudiaí'\ los vims, al ser pará­
sitos intracelulares obli gados, imponen la necesidad del cultivo 
previo de células o la inoculación de animales de laboratorio, 
lo que conducía a tediosas técnicas y costoso instrumental que 
desalentaban a muchos laboratoristas. 
Para el estudio de. los virns pueden aplicarse distintos métodos 
diagnósticos que inc luyen: a) el aislamiento viral que indica la 
presencia de virus como agente. infeccioso, b) la detección directa 
de los anti genos virales o su genoma, c) la detección de anticuerpos 
que ellos producen, o bien d) la observación directa de partículas 
con el microscopio electrónico. Para el. aislamiento viral es ne­
cesario c.onta.r con cultivos celulares o animales de laboratorio, 
lo cual implica una gran disponibilidad de recursos y personal 
entrenado; las pruebas de detección directa de antígenos virales o 
su genoma en tejidos u otras muestr.is por distintos procedimientos 
(por c_j . , inmunofluorescencia, inmunoperoxidasa., prueba de ELI­
SA, hibridación, reacción en cadena de la polimerasa, etc.) se han 
desarrollado como métodos alternativos de similar sensibilidad 
al uso de cultivos celulares al igual que los estudios serológicos, 
como métodos diab'!lósticos indirectos para detectar la presencia 
o desarrollo (aumento en el título) de anticuerpos, prácticamente 
los más difundidos en los faborarorios de virología.
Tabla 1 7-l . Métodos de diagnóstico vi.rológico 
Por diagnóstico virniógico rápido (DVR) se entiende una 
%'1Íe de técnicas qt1c son compartidas también con los métodns 
de identificación vu-al en e-1 cultivo celular.. Estas comprenden 
la detec.c:ión directa, los e·st.udios serológicos para detectar la 
presencia o desarrollo (aumento en el tirulo) de anticue-rpos y 
pruebas de detección de virus o ant.lgenos virnles en tejidos ti 
otras muestras (independiente del cul t.ivo de virns) por distintos 
procedimientos (por ej. , inmun.ofluorescenc.ia., EUSA, hemaglu­
tinac1ón, inhíbicíón de la hemaglutinación, etc .) . Mue.has de estas 
pruebas se realizan mediante kits comerciales que facilitan una 
pronta respuesta diagnóstica. 
Es esencial, en el laboratorio virológico, el mantenirniento 
de un estrecho contacto entre el laboratorista y el profesional que 
envía la muestra, ya que de otra manera es imposible encaminar 
el proceso de estudio del ma.terial virológico. A dife.renc.ia del 
diagnóstico bacteriológico, no existe una "marcha virológica" 
básica, que pueda tomarse como guía para el estudio de w1 
vims; esta marcha va a depender del virus que 5e sospeche y de 
las posibilidades del laboratorio de diag11óstico. Los métodos de 
diagnóstico vírológico se resumen en la tabla [ 7- i . 
EL CULTIVO VIRAL 
El cultivo viral es una técnica que va perdiendo adepros, debido 
a Ia facilidad que presentan otros métodos diagnósticos como alter­
nativa para la rápida respuesta requerida. Sin embargo, posee varias 
ventajas: n,-presenta la confinnación de un diagnóstÍCú tentativ() basa­
do en aiguna omi técnica, cuando la enfermedad no ha sido descrita 
1 AISLAMIENTO VIRAL DETECClON DIRECTA 1 DETECCION DE 
ANTICUERPOS 
OBSERVAClON
DIRECTA 
/ 
Cultivos 
cela lares 
\ 
Huevos 
embrionados. 
Animales de 
lab<;ratorio 
Muerte o 
enfermedad 
Pme.bas compkmen1arias de identificación 
I \ 
Genoma viral 
l 
PCR 
H ibridac. ión 
Pruebas 
serológicas 
fF-IP 
ELISA 
F de C
!HA
ID
m
VN
Microscopia 
electrónica 
IME: inmunomkrnscopia electrónica: ECP: efedo ciu.lpático: NECP: sin efecto citopático; PCR: re.acción en cadena de la polimerasa: IF: innrnnofiuo­
resccncia; fP: inmunoperoxidasa; F de C: fijación de complemento; !HA: inhibición. de la hemaglutinación; ID: inmunodifusión: IB: inmunoblot: 
VN : virus neutraii7.,ación. 
aún en una zona derem1inada., cuando el diagnóstico seroló¡pc:o no 
revela una verdadera re lacíún etíológic.a con e:!. agente sospechoso o 
cuando la sintomatología puede coincidir con varios age-nres Yirales 
s.emejante.s y la real ización de serülogía puede ser imprac.ticabie 
para todos ellos. Finalmente. si es de importancia para la vígilancia 
1;..,-pidemiológica que debe realizar el Estado para el control sanitario 
de la población tanto animal como humana. El aislamiento vira!. es 
el metodo cl1tsi.co convencional de día.gnóstico, cuyo Cxíto depende 
de la vi.abil.idad del ví.ms en !.a muestra problema 
Elección y toma de muestra 
Para el éxito del aislamiento. es de fundame.nt1:1.I importancia 
la elección de hi muestra a procesar. Esto va a depender d� la 
simomatologia que prtsente el anlma! (por ej .. hisopado faringeo 
en cnfenne-dad respiratoria. materia fecal en diarreas. etc.), pero !a 
reg!a fundamental es la toma de. muestra temprana: esto es, teniendo 
en cuenta que. la mayor parte de los vinis son mucho mii:: fadles de 
aislar y cultivar en la etapa aguda de la enfermedad (se encuentran 
y diminan gene�raimente en mayor concentración}, es necesario que 
s:e envíe al laboratorio la muestra de i nmediato ant.e- la sospecha. de 
una etiología viral y preservarla para su traslado. 
Las muestras deben extraerse en forma estéril y enviarse. en 
medios especiales para cultivo de virus. No son adecuados los 
conservadores utili7.ados para muestras bacterianas, y se emplean 
por lo general me.dios como e1 2-SP que contienen soluciones 
tamponadas con el agregado de antibióticos como penicilina-estrep­
tomicina, y un antifi'mgic.o como la nistaüna.. Corno alternativa pue­
de emplearse solución fisiológica estéri l . La soluC-ión de transporte 
elegida debe mantenerse congelada (-20 ºC) hasta el momento de 
uso y enviarse al laboratorio en condiciones refrígeradas (4 ºC). 
También puede remitirse. material en medios protectores como el 
caldo tripmsa, gelatina (0,5ºAi) o glicerina (50�'i,). 
La mayor parte de la-; muestras corresponden a excredones y 
exudados, tales como heces, orina, saliva, líquidos vesiculares .. a,<:.1Ji­
rados na..-;ofaríngeos, líqi1ido cefaloffaquídeo, etc . ; tejidos de necropsia 
o biopsia. o hisopados (rectal, faríngeo, ocular o vesicular) y sangre.
1:--:S muy importante acompall.ar la muestra con un breve resumen de
la histmia clinica, destacando fecha de inicio de íos síntomas .
Animales de laboratorio 
Los animales de laboratorio más utíiizados en virología son: 
ratones, hl!msters, cobayos y conejos. Tienen el inconveniente 
de que, además de la compl.ejidad de las instalaciones necesarias 
para su mantenimiento, muchos de ellos poseen ya sus propios 
virus; que pueden ac.tívarse en la manipulación de laboratorio . 
Cuentan con l a ventaja de brindar (especialmente cuando es 
desconocido el agente. causal ) t.odos los órganos para todos los 
lropismos posibles. La inoculación del material sospechoso se 
realiza e.n varios· animales (1.nan1.eniendo algunos sin inocular 
como controles testigos), por distintas vías. seglln el lmpismo 
viral. y se observan por l o 2 semanas. Algunos animales pueden 
morir o presentar signos cl ínicos, y se sacrifican a intervalos 
re.guiares para evidenciar cambios patoiógicos, para subculti � 
varios o para realizar técnicas complementarias. Aquellos que 
mueren dentro de las primeras 48 horas de su inoculación son 
descartados porque sus muertes se consideran incspecíficas. 
Los ratones lactantes se uti liz.an para virus rábico; los cobayos, 
para enfennedades vesiculares y neurotrópicas ; los conejos. para 
herpesvirus, y los hámsters, para enfermedades neurotíópicas. El 
uso de animales de laboratorio es:tá siendo su.:;tituido por culti vos 
ce lulares por razones humanitarias. 
Huevos embrionados 
Los huevos fértiles de galhna l emhrión de poHo j sepueden 
uti.iizar en lugar de !os animales de !aborawrio, debido a que 
suelen ser más económicos. Son empleados para e-1 ai slamiento de 
virus influenz,a y son también muy importantes como sum.i.ni.stro 
de tejidos para la real.izac. ión de cultivos celulares. Suelen ser 
también útíles para el estucho de Ri.ckett.sias. 
Para ser inoculados debe-n reunir cíe-rtas condiciones .. como edad, 
(tiempo de incubación ) para que et embrión. las cavidades e-x.traem�·­
hrionarias y membranas adquieran el larna1i-o necesario de acuerdo , 
con la vía de inoculación elegida. y provenir de animales en hue.nas · 
condiciones sanitaria...-;. Actualmente el cultivo viral en embrión de. 1 
pollo se realíza para la preparación de ciertas vacunas. Las récnit::.as o ' 
ví.as de ínoculación están someramente esque.ma.tiz�1das en la figura 
1 7-- l . En la cavidad alantoídea se inoculan virus de. Las famihas 
Pa.rami.xovirídae y Orthomixoviridae, Poxviridae y Herpesviridae 
en la membrana corioaiantoidea., y Togavirus y Rhabdovirus en el , 
saco vitelino. El éxito de la infección puede manifestarse como 
muerte del embrión. alteraciones macro y mícroscópicas, cuerpos 
d.C'. inclusión, hemorragias .. retraso del crecimiento, etc 
Cultivo de células 
El: cultivo de células constttuye el método de e-lección para la 
replicación de la mayoría de los virus. Los cultivos se mantienen 
en botellas, tubos o placas, de vidrio o plástíco, en condiciones de 
esterilidad. y con medios nutritivos, Existe una suerte de confusión • 
en cuanto a la tem,Jnologia que emplean distintas fuentes biblio­
gráficas. Tétminos como cultivo primario, secundario, explante:s, 
lineas celulares, etc.., parecen mezclarse, no dejando claro el con­
cepto de cada tennino. Antes de acercar la definición de ca.da uno 
de los ténninos., se describirá el procedimiento básico para el cultivo 
celular primario, para luego señalar las diferencias entre ellos. 
Cultivo primarío 
Consiste en obtener material de un donante, generalmente 
a pa11 ir de la necropsia de un anirnaL eligiéndose un órgano de 
acuerdo con los requerimientos celulares (por ej . , riñón). Este ór­
gano debe provenir de un animal clínicamente. sano. La extracción 
del material se realiza previa higiene minuciosa y desinfección 
de la piel (técnicas asépticas), trabajando siempre con materiales 
estériles y en flujo laminar; Una vez obtenído el órgano. los pasos 
a seguir se resumen a continuación: 
a) Se coloca el órgano en un rec.ipiente estéril, se l ava varias
veces con una solución salina isotúnka, se descapsula si
correspondiera y se. procede. a su trituracíón con tijeras
hasta re.ducirlo a pequeños trozos de 3 o 4 mm.
b) Por medio de enzimas (tripsina) se: real i.1..2 la desintegración
del tejido disolviendo el cemcmo inte.rceh.i lar y separando
las células unas de otras .
e} Se filtra por gasa, se centrifuga y se tira el sobren.ad.ante
(que contiene tripsina).
d) Se realiza un conteo de células vivas. en una cámara cuenta
glóbulos (a efectos de estandarizar el número de células),
1 Existen animales SPF (libres de patógenos espe.cíficos) o GFA (lil,res de génnenes) que, si bien serian de utilidad, su costo es mucho mayor y el 1• 
rnantenimiento más caro. 
1 
r .·---
1 Cámara de 
Membrana de la clise.ara 
Membrana corioaltmtoid(".a 
Oio del embrión 
•--- _ ..\lbú.mina 
· ·<�:.:::::::::::::>·
figura A.natomía de un bu evo embrionado ( i zquierda) e inoculacíón de la membrana corioalantoidea después de formar una 
cámara de aire an.iflcial ( derecha). 
con azul de tripán que colorea la.,;; células muertas. o con 
un colorante vital corno e:l rojo neutro que colorea sólo 
la.-; células vívas. 
el El medio de cultivo (medio esencial rninimo, MEM) para 
ei crecimiento de células es altamente complejo, y t'.stá 
suplementado con nutrientes esenciales que. ínc.luyen los 
elementos necesarios para la biosíntesis de nuevas células 
y los sustratos para d metabolismo energéticú. Púse:e sales 
minerales (iones inorga.Dícos para func.ione.s catalítica.-:;. y 
fisiológic.as como e! balance osmótico y el mantenimiento 
del potencial de membrana), trazas de elementos como 
hierro y cobre: . vitaminas (principalmente del grupo 
B). indicador de pH, azúcares c-.omo glucosa o galactosa 
para el metabolismo energético. bicarbonato de sodio, 
a1ninoácidos esenciales y no esenciales para la biosíntesis 
de diversos constituyentes celulares. y suero fe.tal bovino 
(SFB} al 10% para el crecímiento celular' . E1 uso de este 
tipo de suero se debe a que no posee anticuerpos y contiene 
cienos factores necesarios para el crecímiento que no 
pose.en los sueros de animales adultos. Este. medio debe 
estar l ibre de cualquier efecto tóxico o inhibitorio. Todos 
los nutrientes deben estar cuantitativamente ajustados para 
producir una relación balanceada entre. los componentes 
del medio . En general se utilizan medios deshidratados 
de origen comercial. En la tabla 1 7-2 pueden apreciarse 
!üs componentes elementales del medio MEM.
f) La.<:: células con su medio de cultivo se colocan en botellas
de ,idrio o plást.ico (fig. 1 7-2) donde decantarán y se mul­
tipl icarán adhiriéndose a la superficie del vidrio, fonnando
una sola capa de células (cultivo "en monocapa"), la que
podrá visualizarse- con la ayuda de un microscopio con b.3:.jo 
aumento. Otro sistema utilizado es la suspensión. e.n la cual
J.a.,;; células están mantenidas en ag.itaci.ón pennanente.
g) Una vez multiplicadas, se retira el med io de crecimiento y
se lo remplaza por el de mantenimiento, que es MEM, pero
e-on el agregado de suero fetal bovino al 2%) {dependiendo
del tipo celular).
En este. caso. el cultivo celular se ha desarroIJado a panir 
de un órgano, pero este cultivo no mantiene la arquitecrura 
del órgano <-1ue le. dio origen. Las cClulas en monocapa pue­
den tener aspecto de células poliédricas o eíongad.as-. 
Cultivo secundario 
Cuando se ha.e.e actuar una enzima (tripsina) sobre una mo­
nocapa de un cultivo primarío, las células que estaban adhe,rida� 
al vidrio se desprenden y pueden ser subcultivada.s, se generan de. 
esta manera nuevas botellas y aumenta el número de células. A 
partir de este momento, a estas células se las denomina secunda­
rias, y a este proceso. s:ubcultivo. pasaje o repique. Normalmente 
este proceso pu.e.de repetirse un número limitado de vece.s ya que 
por factores desconocidos, luego de sucesivos pasajes .. las células 
tienden a no multiplicarse y morir. 
Tabla 1 7-2. Composición del medio MEM 
Sales inorgánicas 
CaCl,(anhidro) 
Fe(NOJ,.9H,O 
Kél 
KNO, 
MgSO� 
NaCI 
NaHCO, 
NaH,PO'. 
Otros c.omponente.s. 
O-Glucosa
Rojo fenol
HEPES-Buffer 
Piruvato sodio 
Aminoácidos 
L-arginina HCI
L-cistina
L-glutamina
Glicina
L-histidina HCl
L-tsoleue-ina
L-leucina
L-metionina
L-fenilalanina
L-serina
L-treonina
L-triptofano
L-tirosina
L-vahna
Vitamina!:
D-Ca pantotemto
Colina
Acido fólico
i-inüsitol 
Nicotinamida 
Piridoxal 
Ribofla.vin;;, 
Tiamina-HCI 
' fato:-; elementos estaban históricamente presentes en los medios corno "contamlnantes" de los componentes que. se usaban en la ¡)reparn{:.ión de aquéllos. 
Actudmc-nte son agregados a los medios dt. manera intencional en coocc.ntradones definida.'> (otros ejemplos: vanadio, molibdeno. cinc y selenio). 
' En la actualidad ex.is.ten meilios sinteticos sin necesidad del agregado de SFB. 
Línea celular 
Cuando puede replicar indefinidamente. un culti\JC> celular. se 
puede decir que se ha establecido una línea ce!ular. El nll.mero 
de veces que es necesario subcultivar las células para considerar 
a un cultivo como línea celular varia. según los autores. entre 30 
y 70 pasajes. Actualmente existen numerosas lineas ce lu lares 
establecidas que se comerc ia!i7_an por d.isi intüs laboratorios o 
por instituciones. Ejemplos de ell.as son las: HeLa . Hep-2. BHK, 
Vero, RK 1 3 , MDBK y MDCK. entre otras' . 
Se l lama linea celular diploide cuando la mayor parre de 
las células que. íntegran la línea poseen el númeronom1al de 
cromosomas de la especie de la cual provienen; mi.entras q_µe se 
denomina hereroploidc cuando la mayor parte de e.l ías pose�-1; un 
número distinto de cromosomas. 
Explante 
Tambié:n l lamado cultivo en sobrevida, desi gna a un frag­
me-nto de órgano o tej ido, que será rnant.enído con su arquitectura 
e.n condiciones que posihüiten su esrudio n infección viraL Es de 
uso poco frecuente en la práctica virológica. 
SIEMBRA DEL MATERIAL PARA ESTUDIO 
VIROLOGICO: INOCULACION 
En general, el. aislamiento de un virus es el método de diag­
nóstico más preciso y es aun considerado como "pruebí.l de oro'" 
en la mayoría de los casos. 
L.as muestras se procesan convenientemente e inoculan en cé-
1 uia.s elegid.as por su suscepribilídad, siempre intcni.ando abarcar 
la mayor cantidad. posible de tropismos virales. Nonnalmente se 
inoculan de 3 a 4 tipos celulares que. son observados diariamente 
duran.te 1 o 2 semanas incubados a 3 7 ºC en búsqueda de efecto 
víra.1 sobre el cultivo celular. Esta acción. llamada efecto cito­
pático (ECP), puede producirse sobre grupos celulares o sobre 
la total idad de la monocapa, dependiendo siempre del tipo y la 
cantidad de vírus, y de la célula afectada. La replicación viral 
en cultivo suele presentar problemas de adaptadón, lo que se 
soluciona efectuando una serie de pasajes sucesivos de.nominados. 
•·pasajes ciegos", hasta que aparezca el ECP característico.
Los tipos de ECP se pueden sintetizar en los siguientes 
(siempre comparándolos con una monocapa de células control 
sin inocular}: a) cambios celulares que pueden ser progresivos, 
de redondeamiento celular o, por e-1 contrario, ckmgación, b) 
picnosis, e) pérdida de unión e.ntre células, d) levantamiento 
de. la monocapa (efecto lítico), e) cambio de refringencia de 
las células, f) fragmentación de la monocapa, g) vacuolízadón 
celular, h) formación de sincic.ios (células multinudeadas), e i) 
agregación celular. 
También pueden observarse cambios en el medio de cultivo 
que consisten generalmente en variación de pH; de neutro (co­
lor rosado si el indícador de pH es rojo de. fenol) puede pasar a 
alcalino (rosa fuerte) o acidificarse (amarillo); sin embargo, el 
metabolismo nonnaJ de las células conduce a la acidificación del 
medio de. cultivo . Si se encuentra el pH del medio neutro luego 
Fragmentación del l'(�i idc, 
--� Tripsinac1ón
Centrifugar y femover 
la tripsina 
1/1,/z/ Re.cuenro c.e!1Jlar 
Resus:pender en el medio de cultivo y 
sembrar los frascos 
Figura 1 7-2. Procedimiento para el cultivo celular primario. 
de la incubación , puede significar la presencia de virus, ya que 
éste pue-de acruar frenando el metabolismo ce lular y. por ende, -
la acidificación nom1al . 
Los. cambios mencionados pueden observarse con facil idad: , _ 
hay otros que necesitan la ayuda de técnicas especiales de colo- f 
ración, como aqueUas que ponen en evidencia a l os cuerpos de -
incluslón5 , Para ésto se. realii..an técnicas especiales de tinción, ""' 
que necesitan previamente "levantar"& la> células que han sido 
cultivada� en los tubos. 
• Actualmente existe la tendencia a unificar los terminos llamando, tanto a la célula como al cultivo secundario, !inca celul.ar.
f Los cuerpos de inclusión son producidos por ciertos virus, y pue<len c.onsistír en cúmulos de virus (menos frecuente) o productos del metabolismo
celular alterndo (ma.E frec.uen1e). Estos cuerpos de inclusión pueden localízarse en el núcleo (}N) o e.n d citoplasma ce!ular (kit). lN "" Hen,e,svirus.
Adenoviridae, Parvoviridae. kit = Reoviridae, Rabdoviridae.
" A menos que se emplee ta técnica de culti.vo en ''viales•·, que consiste en el cultivo sobre un cubreobjetos que se de.posita e-n e.l fondo de un 1ubo,
sobre e.l c.ua! crecerin las células. Luego que el vírns ha producido el e.fecto citopático, puede obse:r.-·arsc direc.tamente el cubreobjetos sin necesidad
de levantar las células.
El desarrol lo de ECP en un cult.ivo ce!uíar penn ite reconocer 
que se ha aislado un virns, y de acuerdo con el material del cual 
proviene la muestra, el tipa de células en el que se desarrol la. el 
tipo de efecto que causa sobre el cultivo celular y el tiempo de 
desarrollo. puede realizarse una identificación presuntiva.. Sin 
embargo. e:F. casi impo!;ible poder afim·iar de qué \Ji.rus se trata ,
ya que muchos vinis pueden desarrollar e! mismo ECP. Además, 
algunos virus no producen ECP visible con el microscopio óptico 
luego de. la replicación en cultivos ce-l ularcs, por lo que la identi � 
ficación debe efectuarse por pruebas c.ompiement.arias. La identi­
ficación de.finitíva se realiza utilizando un antícl1erpü específico 
que detecta antigcnü5 vi.m ies o para inhibir el ECP inducido por , 
el vims .:-:n las célu las. De acuerdo con la sospecha viraL podrán 
incluir:-.e distin.tQS tipos de pruebas co111plementaria.s � : algunas. de 
estas pruebas están estrechamente relacionadas con los maodos 
de. diag.nóstico. y por In tanto _ se tratarán en conjunto_ 
Pruebas complementarias para la 
identifkación viral 
Entre las pruebas complementaria.s pueden mencionarse la 
hemadsorclón, la inhibición de la hemadsorción, la hemaglutínación 
e inhibición de l.a hemag!utinación, la virusneutraliz.ación� la inlcrfe� 
rencia viral, la inmunofluorescencia y ia inmunoperoxidasa� El 
dia¡,móstico presuntivo puede realizarse sobre la base de los resultados 
obienidos t�n las. pruebas de hernadsordón, hemaglutinadón o interfe­
rencia viral, rniemraS que el diagnóstico definítivo debe realizarse por 
identificación del virns mediante las pruebas de virus neutralización, 
inmunofluorescencia, inmunoperoxidasa._ fijación del complemento. 
ELISA o inhiblción de ia hemaglutinación, entre otras. 
Hemadsorción 
Algunos virus0 como los Orthomixoviridae. y Paramixovllidae. 
confieren al cultivo ce.lular infectado antígenos de membrana 
(hemaglutíninas), que adsorben glóbulos. rojos de ciertas especies 
bajo condiclone.s específicas, causando agregación. Muchos de 
\'os virus que integran estas familias producen escaso ECP. La 
prueba consiste en agregar al tubo o frasco infectado y al control 
una suspensión de. hematíes de pollo o cobayo conveniente.mente 
lavados en solué. ión fislOlógie-a. Se dejan horizontalmente por a 1� 
gunos minutos a 4 ºC o a 3í ºC, la mon.ocapa se lava y se examina 
con el microscopio en búsqueda de glóbulos rojos adsorbidos a 
las 1nembranas celulares; en las células control no debe haber 
he.madsmción. Debido a que muchos vinis poseen hemaglutininas, 
esta técnica sólo pennite realizar un diagnóstico presunti vo. 
Inhibición de la hemadsorción 
Una vez realízada la prueba anterior y confümada la presencia 
de un virus hemadsorbente. e.s posible identificarlo mediante i.a 
prueba de inhibición de la hemadsorc.ión, que consiste en hacer 
sobre un cultivo celular infectado, un suero con anticucrpos. especí­
ficos- (antívi.rus detenninado) que se deja actuar sobre la superfiCie 
celuiar por 15 minutos. Luego se agregan los glóbulos rojos de 
acuerdo con la técnica anterior, Los am.icUt'TpOS bloquearán los 
ant ígenos de superficie que posee la membrana celular y nú permi­
tirán. por tanto, la adsorción de íos glóbulos rojos, De esta manera, 
conociendo e! anticuerpo (suero anti) empleado, y al inhibirse la 
hemadsorción, se puede ldentificar el virus actuante . 
La imerferencia viral 
Como ya ha sido mencionado. en al gunos vi.rus la rt�pE­
cac.ión ocurre sin producción de ECP, pero sin emhargo, esr.a
replicación es capaz de inhibir la replicación de un virus se-­
ctmdario inoculado en el mismo cultivo celular. El mecanismo 
de la interferencia no es completamente conocido: se posrnlan 
alterac iones en la superficie e.dular. enzimas imcia;es produci­
das por el virus o la producción de interferón8 . Esta 1écnica se 
us�i. principalmente e11 el vin1s de rubéola humaw- que interfiere 
con el desarrollo de otros virus que producen efecto c.i topfrri-co. 
Si un cultivo celular está infectado con el virus de larubéola. 
ante b inoculación de un virus productor de efecto citopático en 
eí m ismo cuhivo, este Ultimo no se. desarrolla y, por lo t.anrn, no 
se l)bservará efecto alguno. Et uso de. esta técnica sól o perm ite 
un diagnóstico presumlvo _ 
Virus neutralizt1citin 
Lr_ prueba de virus ne-utral iz.ac-ión consist.c. cütno su nombre 
!o indica. en neutralizar ía acción de un virus pm medio de ,t\c
específicos dirigidos contra Ag superfidales. Luego que un vln1s
ha sido aislado. se lo cose..>cha obteniendo el mattrial :;,obren.adame
del cultivo celul.ar, se divide en alícuotas y una de e.Uas se pone en
contacto con suern antivirus especifico_ Luego de un período de
incubación, se infecta un nue.vo cultivo celular. Por otro iado, y a
efectos de tener un testigo •. se infecta- otro cultivo celular con nna
alícuota víral sin neutral.i1.ar. Si el suero era especifico comra e.se
vims, lo neutralizará y no producirá ECP. Es una de la.s 1ec:nicas
más confiables para la tipificación viral,. sin embargo. cuenta c.on 
el inconvenieme de :-;cr d.e lenta y CQStosa rcal17...ac ión. 
Hemaglutinació11 
El principio de. ia reacción es el mismo que el de la hemad­
sorción. La diferencia consiste en que en ésta se demuestra la 
presencia de hemagluti.ni!,'las en las membranas celulares, mientras 
que en la hemaglutinación, el fenómeno ocurre en el liquido de 
cultivo sobrenadante (fig. 1 7-3 ) . Consiste en extraer }uego que. el 
virus se ha multip1icado en la monocapa o en embriún de polio, el 
l iquido sobrenadante del cultivo (rico en vírus ), enfren1ándolo en 
un tubo o poiicubeta con una suspensión de glóbulos rojos prepa­
radas como para la hemadsorc.ión. Si la reacción es positiva, los 
glóbulos rojos forman una malla fina , que- se deposita lentamente 
en el fondo del tubo y se visualiza como un balo grande. Po: el 
contrario, si es negativa, se decantan al fondo del tubo formando­
un botón. Al igual que la hemadsorción, el uso de e!:ta técnica 
sólo permite arribar a un diagnóstico presuntivo . 
Inhibición de la hemaglutinación 
Semejante al concepto de inhibición de la. he.rnad.sorción. si 
se hace. reaccionar un virus con capacidad hemag!.utínant.c con su 
anticue)l)o espedfico, éste anulará su capacidad de hema.glutina­
ción por bloqueo de las hemaglutininas. El antisuero neutralizarú 
esta actividad viral y luego, ai agregarse los glóbu! (.l'S ro,ios. éstos 
no ser.in aglutinados. 
Si se desea investigar la. presencia de Ac en animales sos� 
pechosos de padecer una enfermedad causada por un virus 
hemaglutinante, éstos pueden ponerse en evidencia enfrentando 
7 A\gunru; de las denominadas "pruehas c.ompkmentarias" pueden incluirse dentro de las 11amadas prueba..-; inmuno!.ógicas que serán descri tas más 
adelante (por ej., Inmunodifusión). 
'· El lnrerferón (IFN) es una sustancia antivira.1 (generalmcme glucoproteína de: hajo pe.<.ü molecular) no e-.spe.citka, muy importante. producid;¡ por 
células en respuesta a la infe-.cción de un virus (u otras sustancias ;nductoras ). Se produce un mismo tipo de 1nterferón para dístintas ripos de virus., 
pero es específico de la especie (el interferón bovino no tiene actividad en el humano). 
.Ag A
o¡hJc10n.::s d.c l amig_cno v1rai 
l ' l O 1 .'20 1 !40 l i80 j . J 60 1 .1320
Amigenc1 
tC!stÍfW 
Hcmai:k:-
1e�rigos 
• • 
• • 
Figura Tecnic.:1 Je hemag:lutin�ic ión . 
e.l $Uern de! animal afectado con ¡¡na suspensión vírjc:;; convc-­
nienrement.e estandarizada. As imismo_ por esta técn,ica . pue.den tímlarse lof> Ac presentes. Es una técnica sensible y específica que 
requiere equipamiento mlnimo y es de lecru.ra v i sual. 
Inmunofiuores('.encia 
La técnica de inmunofluorescencia (If) (fig. 1 7-4) es arn­
pliamente usaOO en el diagnóstíco virológ_ico debido a su alta 
específü.:idad y muy buena sensibilidad. Su mayor ínconveniente 
es ia necesidad de poseer en el l aboratorio un buen microscopio 
de fluorescencia, por su precio elevado. Es útil no sólo para el 
diagnóstico e identificación de un virus que ha sldo ais lad.o en el 
laboratorio. en muestras clínicas tales e.orno hisopados faríngeos, 
líquido a hisopados de úlceras , vesículas, o incluso cortes o im� 
prontas de tejidos. sino también como técnica de diagnóstico. 
La técnica de IF requiere de Ac purificados antivirns deter­
minados {suero anti). "marcados'' o conjugados9 con fl.uoresceína 
(fiuorocromo que tiene la. propiedad de excitarse con los rayos UV 
y emitir luz verde brillante) generalmente comerciales, 
En un portaobjetos se colocan las céluJas infectadas con el 
vi. rus, se fijan con alcohol metíJico o acetona, se dejan secar y
se hace actuar el suero anticonjuga.do. Luego de un lavad.o con
solución fisiológica, y si hubo unión Ag-Ac, el Ac queda unido
y no será arrastrado . Se deja secar y se observa, en microscopio
de fluorescencia, un color verde bri llante en aquellas c.élu.las
infectad.as por el virus.
Para evaluar la presencia de Ac en sueros de animales sospe­
chosos. es necesario tener un Ag conocido (gencraJmen t.e célu las 
infectadas por el vims a estudiar,_ adbcrídas a un portaobjetos ); 
en una primera etapa se colocan diluc iones del suero que reac� 
c.íonan sobre el Ag uniéndose a él . Para poner en evidencia esta 
reacción, se agrega fina lmente un suero antiespecie )u conjugado 
cnn fluoreseelna. La reacción se visual iza de igual modo bajo 
microscopia fl.uoresccme. 
ln.mu.noperoxidasa 
Es similar a la anterior, sólo que el anticuerpo está c-0njugado 
a la enzima perox.ídasa. Como ventajas respect.0 de la lF se pued 
destacar que la lectura se real íza. en un microscopio común y q_ue 
la reacción desarrollada como granujos de. color es pennartente. 
ELISA 
Con el nombre de ELISA (del ingles "'frL}-'IJW Un.ked lmmu-_· 
n.osorhent As.>·t�_i.:' _\ o ensayo de inmunoabsorc.ión iiga<lo a enzimas; 
se desi.gnan una serie de pruebas de altísima sensibi lidad (dere:ctan
1 
canl"ldades iguales a nanogramo [ng]) y aceptable especifi cidad,··, 
c.arac.teri.zad.as por la acción de un A.e conjugmfo c.on una enzima 
e e ¡ ¡ · �-'l {peroxidasa o iostatasa a ca ma l.Omo las más comunes ) ��'-1 
Exi:.ten numerosas \'ariante:, o comhinac.ioncs de pruebas, una ,·:! 
de las más usuales c(msis1e en fijar, en policubet:-i::; de plástico, E 
un Ac específico anrivírus (la fijación se rea! i z.J por cargas e.léc- 1 
rricas ). La búsqueda de.! Ag se realizanl a panir de lo:-: cultivos il 
celulares_ qu
.
e reng:
.
an o !
.
)◊ efocw cit.opático i dc a.cuerdo .c..on el fjtipo de \'ffU::: sospechado ¡ . Si el virus se encuentrn presente en d f 
l íquido sobrenadame del cultivo celular y existe Cúrrespondencia 1-:· 
Ag-Ac_ se unirá al Ac fijado a la po!icubeta y no :.e
. 
eliminará ante '
un lavado (todo or.ro Ac no fijado se irá con él). ·
1
· 
Luego se agrega nuevamente el mi.smo Ac antivirus que fue __ ,t 
usado en primera instancia pero con_
.
jugado
. 
con una enzima (por ej ., 
,
.'"1 
.
.
.
.
. 
·
·
.
·
. 
peroxidasa) (Ac* ). Si elAg quedfrunido al Ac en ei prí.merpaso de · , 
la. reacción. este. Ac.* quedará unido al Ag y no sed arra�t.rado en Lm t )! 
l avado posterior (queda a manera de sándwich Ac-Ag-Ac*·¡ _ ·1 , 
Para revelar la presencia de este Ac*, es necesario brindar un -'.: 
sustrato que, para la peroxidasa, e-s el a.gua ox.igenada_ A.1 enoon- 11 
trarse esta enzima con su sustrato. l iberad oxígeno que prnducirá -� 
u�1. c.ambi� de color (por oxidación-redti_c,ción } d': un re.acüvo-.(por l.l,-:
e}. OPD 1 ' ), De esta manera, una reac:c1on positiva (presencia de 1 
virus) se verá como cambio de color en los pocillos de 1.a policubeta, 1
.
'�:i 
mientras que su ausenc
.
ia dejará los pocillos in
. 
e.oteros. 
¡.,··\. En el caso de ser necesario detectar la presencia de A.e , la -1 
prueba varía en que en lugar de pegar un Ac a la policubera. $C- ,;
pega un Ag conocido. Se hace reaccionar el suero p.rnblerna (que f: si tiene Ac específicos quedarán unidos al Ag) y fina lmente se -1:{,
hace reaccionar un suero antiespecieconjugado con un2 enzima 1-:f(Ac* ). E! revelado_ de la_ �e..'l�!ón se rea_l!za del mismo modo que li para el e.aso de la mvesugacwn de Ag. ' � Wl 
Fijación del complemento 
En esta prueba se detectan Ac. dirigidos contra Ag internos 
del virn.s. Fue una de las primeras técnicas emplead
.
as en el 
d.iagnóst:íco de infecc iones virales, pero en la actualidad ha sido 
remplazada por técnica<; más sensibles. 
hrmunoblot 
Esta técnica combina la resolución en el fraccionamiento 
de protefoas que posee la electroforesis en geles de pül iacri•• 
lamída con la especificidad de la detección inmunoquírnica. 
Como primer paso &e efectúa la separación e!ectroforétic.a de 
.{;'! 
:Sú 
1>:, 
wi 
ll 
�p. 
�\ 
if 
"1;" 
·i-i
El. proc.edimiento consiste en pegar !a ftuorescdna a 1os ant icuerpos, que seguirá con sus sitios de reconocimiento antigénicli ,: cti \--<J, De tsl.a Jfüt· 
riera . al producfr,¡;e la unión Ag-Ac, la fiuoresc-eina quedará también unid:: a! Ag, La fiuoresceína puede ser remplazada por otros compuestos. que. 
serán úliles en otn;_,; reacciones de idemificación de, antígeno. tales como en:llmas (peroxidasa. fosfarn.sa. alcalina, urc..::Lsa, cte. /. ptm.l las t&cnicas 
inmunoenzimática (EUSA) o mmunohistüquimica, 
w Ante la inoculación de un suero o Ac de una especie anímal en otra (p0r ej., suero de bovino inoculado a un coneJO), esta última (la receptora),
ai no reconocer estas proteínas como propias, e. labora inmunoglobulina¡.,: que reaccionarán con los Ac inoculados. El suero obtenido se denomina 
antiespccie <1 antiglobu!ina 
1 1 OPD "" Oithodifenilendiamína, 
S iempre es necesario entre un paso y otro de la prueba el lavado parn eliminar todo elemento no reaccionante. 
Antíg'C'.no 
+ 
:'\e antiespccie 
conjugado con 
íluoresceína 
Anticuerpos. 
e-specific<is 
+ 
Figura Técnica de innmnofluorescencia. 
ia.s proteínas virales en geles de po\iacrilamida. Luego se rea� 
liza la transferencia de. esas bandas a papeles de nitrocelulosa 
mediante corriente eléct rica. Se incuban esas tiras de pape! 
con sueros problema y controles positivos, y posteriormente. 
se- lncuban con anti suero anüespee-i.e conjugado con enzimas 
y se revelan con su sistema detector. La positividad de una 
mue.stra. se e>.'lde1Kia por bandas coloreadas. 
DETECCION DIREC
T
A 
Detección de antígenos virales 
Puede llevan;e a cabo en tej idos u otras muestras por distintos 
procedímientos ya rnencionados (por ej ., ínmunofluorescencia, 
inmunoperoxidasa, prueba de ELISA, hemaglutinación, inhibi­
ción de la hemaglutinación, etc .).
Para el examen microscópico de tej idos , deberfa envtarse 
un trozo de órgano afectado, de no mas de 5 mm de espesor, 
embehido en formol al )<�,;, (pH 7 ,(J ) . Para ia dete.ccion de .t� g 
viral.es, pueden em•iarse improntas realizadas con tejidos $übre 
un portaobjetos. secadas a l aire y fijadas CQn metano l. o acetona 
por 5� 1 O minutos, En todos los casos dehen rem írirst; refrigerad.as 
y deben arribar al iaboratorio dentro de las 24 horas. 
Detecciém de genoma viral 
PCR (reacción en cadena de la potimerasaJ 
La amplificación enzimática sele.ctiva de secuencias de DNA o 
R.NA._ flanqueada p()r dos oligos cebad.ores o ·•primcrs·, que hibridan
con las cadenas opuestas de la secuencia de intcres. provee infOr­
mación adicional que no puede ser obteni.da por proce-dimienios de 
nitina. El ácido nucleico presente en wia muestra se desnaturaliza a 
ahas 1empenm1ras: posteríormente. los cebadores se hibridan a la� 
cadenas en fonna complementa.tia y luego �e produce ia síntesis: d.e­
n-uevas: c-ad�as complementarías al DNA por la acción de la tntima 
polirnerasa. La prueba requiere tres etapas de inc.ubac.ió-n ld�sna" 
tural izacíón, hibrldación y extensión) a distíntas temperarnra.;:; lUn 
cklo ) . Cada ciclo sucesi.vo dupl ica la cantidad de DNA sintetizado 
en el ciclo previo. Durante varios ciclos programados, cada cadena 
de. DNA sirve óe molde para el ciclo siguiente, de manera de- obtener 
grandes cantidades de DNA que. se visualizan en geies. S i el \'Í.rus 
es RNA, debe realizarse una etapa de transcripción reversa pre'l-'ia 
a la amplificación por La polimerasa. 
Hibridación 
El empleo de sondas de DNA o RNA para detecciór, de 
secuencias de genomas se fundamenta en la tendencia de dos 
cadenas de ácido nucle.ico a aparearse por sm secuencias com­
pleme.ntarías (hibridación) . I.,.,uego del aislamiento viral . el ácido 
m1deico a investigar se fija en membranas de nitroceiul(1s.a o 
nailon. se de.snatural iza (separación de !a doble cadena _) y �e
incuba con una. sonda marc.ada (secuenc.ía conocida y conjugada 
con enzimas o isótopos radiactivos) . Si hubo hibridación. los 
híbridos se evidencian por precipita.dos coloreados (enzimas) o 
mediante auton:ad.iograíla (isótopos ) _ 
DETECCION DE ANTICUERPOS 
La toma y la remisión de muestra 
Para el caso del estudio serológic.o, es necesario remitir a! 
laboratorio suero ic del animal enfermo o. en su defecto. de a.ni� 
males que hayan e:;.tado en contacto con él . En !a mayoría de las 
enfennedades infec.cíosas, es de Ítnporrancia b seroconversión._ 
es decir. es imperioso tener dos muestras de suero obre.núias dei 
mismo animal con intervalo no inferior a 1 0 dias. 2 -efe.etas de 
detectar variación en el tí111l.o i"' . La conversión serológ.ica se define 
como la aparición o el aumem.o de 4 o más veces del título- de A.c. 
entre dos rnuestras pareadas de suero. la primera. obtenida en el 
período agudo. y la. segunda, 14-2 ] días después dl.'.'-1 comienzo 
de los slnromas. La detección de la conversión serológica per­
mite. realizar el diagnóstico de i nfección Te.ciente. Cuando no �e 
encuentra un aumento importante o el titulo es bajo, significa 
que hubo una infección previa. Si no hay Ac} ne hubo contacto 
con el virus. Si la técnica de detección de anticuerpos es la virus 
i.\ El suero se obtiene por extracción de sangre al anímal, dejándolo coagular espontáneamente y centrifugando. Se envía sólo el suero sin el coágulo 
y un protocolo o)mpleto . 
1
� Variación en la cantidad detectable de Ac (en más o en menos) mayor de 2-4 diluciones y según la técnica empleada . 
neutralización. las muestras de suero a remir.i¡ dehen conservarse 
en forma est6riL 
Los anticuerpos en el diagnóstko de la infección viral 
La valoración de anticuerpos puede ser un método ideal para 
1a evaluación de la infecóón v}ral cuandü eJ cu!rivo no pued.2 ser 
practicado en el laboratorio. Es úül ademas para dernrminar el 
estado inmune del anima! o de la poblac.ión. Sin embargo, la sola 
presencia de. Ac. e.n un animal no significa protección o enforn1e­
dad, sino contacto previo con el virus estudiado. 
Existen numerosas pruebas complementarias. aparte de las men.­
tionada�. que se u.tíbz.an en el diagnóstico de las infec.cione� vi.r-d.�. 
Mucha.'> de eHa-; son usadas tambtén para el diagnóstico de enferme­
dades producidas por mros microorganismos {bacterias. hongosi e 
incluso son Uüie..-; para el diagnóstico deenfem.1edades auroinmune.s. 
determinación de preñe?� investigación de. hom1oms, etc.. Ei tema 
se encuentra ampiiado en el capüu!o referido a prnebas st..>-rológicas. 
que abarca un número mayor de l'écnic.as diagnósticas, 
OBSERVAClON DIRECTA DE PARTICULA.S 
Microscopia electrónica 
Para esta técnica es necesario una alta concentrac.i.ón de partic.ul.ac; 
en la muestr.t, la cuai puede observarse et1 fonna directa (morfología 
de las partículas virales) o me-.dianre el empleo de Ac antivinL'> qu 
permite conglutinar las partícula� (inmtmomicros.cüpia i. 
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