ENZIMAS

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Mayo-Agosto 2016
UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DEL VALLE DE TOLUCA
INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA
U1. Enzimas
Principios enzimáticos
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PROFESORA: M. en C. Gisela Inés Hernández Contreras
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Ciencia que estudia la química de los procesos vitales.
Funcionamiento de los seres vivos a nivel bioquímico.
Microbiología
Estudio de lo pequeño
Bioquímica
La bioquímica microbiana se centra fundamentalmente en el estudio de sistemas constituidos los seres microscópicos, su hábitat y las interacciones que puedan ocurrir entre ellos y el medio ambiente.
Bioquímica Microbiana
En biotecnología es de gran importancia la comprensión de los procesos metabólicos de los microorganismos ya sea en cultivos puros, en poblaciones mezcladas o junto a otros seres vivos; pues son estos las herramientas “in situ” para la obtención de alimentos, bebidas fermentadas, medicamentos, proteínas; para la degradación de residuos agroindustriales, para el saneamiento del medio ambiente, etc.
¿Por qué estudiar bioquímica como Ingeniero en Biotecnología?
Es la energía mínima necesaria para que se produzca una reacción química dada.
Algunos conceptos
En química
Catalizador
Reacciones químicas
Sustancia que aumenta la rapidez o velocidad de una reacción química sin verse alterada ella misma en el proceso.
El dióxido de magnesio o un pedazo de hierro cataliza la reacción del agua oxigenada.
Y con sangre
La catalasa
Función de un catalizador
(a) Esquema de una reacción química. (b) para el caso concreto de la hidrólisis de un éster. Se indica el mecanismo químico y una estructura posible para el estado de transición. (c) se da el mecanismo de esa misma reacción en presencia de una base, :X-, que actúa como catalizador
EXTRAORDINARIA RÁPIDEZ
ENZIMAS
Son proteínas especializadas que catalizan o permiten que las reacciones químicas que el cuerpo necesita se lleven acabo.
PROPIEDADES DE LAS ENZIMAS:
1.Participa en el proceso pero no es modificado por este.
2. Los catalizadores modifican la velocidad pero no afectan la posición de equilibrio de una reacción.
3) Catalizan reacciones muy específicas
4) Pueden acoplar reacciones 
5) Su actividad puede ser regulada
Como comenzó
Ejemplo:
Términos importantes
Fisher : Modelo de la cerradura y la llave
S + E ES E + P
Hidrólisis del enlace pepitídico por la quimiotripsina
En 1878 el fisiólogo Wilhelm Kühne (1837-1900) introdujo el término enzima, que viene del griego ενζυμον "en levadura ".
ANTECEDENTES
En 1897 Eduard Buchner comenzó a estudiar la capacidad de los extractos de levadura para fermentar azúcar a pesar de la ausencia de células vivientes de levadura. 
Le dio el nombre de “zimasa” En 1907 recibió el Premio Nobel de Química "por sus investigaciones bioquímicas y el haber descubierto la fermentación libre de células".
(Conversión de azucar – alcohol)
ANTECEDENTES
Emil Fisher (1894) demostró la especificidad de las enzimas para algunos sustratos.
Normalmente, el sufijo "-asa" es agregado al nombre del sustrato (p. ej., la lactasa es la enzima que degrada lactosa)
ANTECEDENTES
La Unión Internacional de Bioquímica Molecular (IUBMB), clasifica a las enzimas de aceurdo con la clase general de reacción química orgánica que es catalizada.
Oxidoreductasas
Tranferasas
Hidrolasas
Liasas
Isomerasas
Ligasas
CLASIFICACIÓN
La oxidorreductasas catalizan las reacciones de oxidación-reducción
Toda reacción química en la que uno o más electrones se transfieren entre los reactivos
La mayor parte de estas enzimas se llaman:
Deshidrogenasas
Oxidasas
Peroxidasas
Oxigenasas
Reductasas
1. Oxidoreductasas
Catalizan las reacciones de transferencia de un grupo y pueden necesitar la presencia de coenzimas
una parte de la molécula del sustrato se suele enlazar en forma covalente con la enzima o con su coenzima
2. Transferasas
Las coenzimas son pequeñas moléculas orgánicas no proteicas que transportan grupos químicos entre enzimas
(catalizan hidrólisis)Son una clase especial de transferasas donde el agua sirve como aceptor del grupo transferido
3. Hidrolasas
4. Liasas
Catalizan la lisis de un sustrato, al generar un enlace doble; son reacciones de eliminación 
Las Liasas catalizan la adición de un sustrato a un doble enlace de un segundo sustrato.
Catalizan cambios estructurales dentro de una misma molécula, estas reacciones sólo tienen un sustrato y un producto.
5. Isomerasas
6. Ligasas
Catalizan la ligadura o unión de dos sustratos (requiere suministro de energía) conocidas como sintetasas 
COENZIMAS
Moléculas o iones que ayudan a la las enzimas.
Al haber pero muchísimas variedades de reacciones que pueden ser catalizadas, no hay suficientes de aminoácidos como para ser cada catálisis específica para una de estas combinaciones, por tanto nuestras células utilizan las llamadas coenzimas. Las coenzimas acostumbran a ser complejas moléculas orgánicas, que sufren modificaciones durante la reacción enzimática para ayudar a la modificación final del sustrato. También pueden servir de donadoras o aceptoras de hidriones (H-) y electrones, o pueden transferir grupos funcionales. Tras la catálisis la coenzima vuelve a su estado original. Si la coenzima de queda unida de forma temporal a la enzima es llamada cosustrato, si está anclada a la enzima, la llamamos grupo prostético
Mecanismo de acción de las coenzimas
El mecanismo de acción básico de las coenzimas es el siguiente:
La coenzima se une a un enzima.
La enzima capta su sustrato específico.
La enzima ataca a dicho sustrato, arrancándole algunos de sus átomos. En realidad la unión de sustrato y enzima produce una nueva sustancia. Esta sustancia es inestable, lo que provoca su separación en diferentes partes: enzima, producto, y la forma gastada de la coenzima, que se quedo con algunos atomos por presentar mayor fuerza de atracción molecular.
La enzima cede a la coenzima dichos átomos provenientes del sustrato.
La coenzima acepta dichos átomos y se desprende de la enzima.
La coenzima transporta dichos átomos y acaba cediéndolos, recuperando así su capacidad para aceptar nuevos átomos.
Iones metálicos que se mantienen unidos mediante enlaces covalentes coordinados a las cadenas laterales de los aminoácidos, pueden actuar estabilizando cargas o como reactivo redox.
COFACTORES
El mecanismo completo de la catalasa no se conoce, aún así la reacción química se produce en dos etapas:
H2O2 + Fe(III)-E → H2O + O=Fe(IV)-E
H2O2 + O=Fe(IV)-E → H2O + Fe(III)-E + O2
El estudio de las propiedades de las enzimas :
Velocidades de reacciones catalizadas por la enzima.
Cinética enzimática:
Proporciona una información indirecta acerca de especificidad y mecanismos catalíticos de las enzimas.
Revelan si una enzima está regulada
Cinética enzimática: 
Los primeros estudios de cinética enzimática confirmaron que una enzima (E) se une a un sustrato para formar un complejo enzima-sustrato (ES)
E + S = ES = E + P
La velocidad total de una reacción enzimática depende de las concentraciones tanto del sustrato como del catalizador
Cuando la cantidad de enzima es mucho menor que la cantidad de sustrato, la reacción depende de la cantidad de enzima.
 condición se llama saturación de la E con el S
Ecuación de Michaelis-Menten
Las reacciones catalizadas por enzimas, se pueden describir en forma matemática como ecuaciones de velocidad
la relación entre la velocidad inicial de una
reacción y la concentración del sustrato
Cinética Enzimática
ENZIMAS
Fuente: Stainer, 2003.
Las enzimas son proteínas capaces de transformar químicamente una molécula
Sin embargo solo transforman a una molécula y a ninguna otra, es decir, degradan sólo un sustrato o grupo de sustratos. 
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¿De donde provienen estos conocimientos?
De los análisis detallados provenientes de la cinética enzimática.
Velocidad de reacción para una reacción simple catalizadapor una enzima.
CINETICA DE MICHAELIS - MENTEN
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Reacción simple de primer orden.
 VELOCIDAD
Esta determinada por la concentración de ES y el valor de K2 es decir:
V y [ES] no son medibles para obtener K2
Lo que si se puede medir es la concentración del sustrato (o producto)[S] y la concentración de la enzima total [Et] que debe ser la enzima libre + la enzima ocupada, es decir:
[Et] = [E] + [ES] 
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Puede pensarse por la forma en que se ha descrito la reacción que E y S deben estar en equilibrio con ES, es decir:
Sin embargo lo anterior es una suposición incorrecta y esto se describe como estado estacionario en la cinética enzimática.
Modelo de G.E. Briggs y J.B.S Haldane en 1925.
Cuanto más ES hay, más rápidamente se disociará el ES en los productos. En consecuencia cuando se inicia la reacción buscando enzimas y sustratos, la concentración de ES aumenta al principio, pero alcanza rápidamente un estado estacionario, en el que se mantiene casi constante.
Por lo anterior la reacción de equilibrio se determina valida y podemos entonces expresar lo siguiente:
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K1[E][S] = K-1[ES] + K2[ES]
En estado estacionario, las velocidades de formación y degradación de ES son iguales.
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Reordenar la ecuación de la forma siguiente:
[E][S]
Generalizando las constantes suponemos que:
Entonces: [E][S]
A esta ecuación le introducimos la de enzima total se tiene que:
[ES]
Sacando factor común:
Constante de Michaelis
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Reordenar la ecuación 
Recordando la ecuación de velocidad
Se sustituye [ES] en la ecuación anterior para tener V en función de la enzima total y el sustrato, quedando de la siguiente manera:
 
Ecuación de Michaelis-Menten
Velocidad máxima.
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A concentraciones de sustrato elevadas en que [S] es muy superior a KM la reacción se aproxima a una velocidad máxima puesto que las moléculas de las enzimas están saturadas es decir ocupadas con el sustrato realizando el proceso catalítico.
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Expresamos lo anterior con la siguiente ecuación:
Así pues podemos expresar [Et] en la ecuación como Vmax y se tiene la ecuación de Michaelis-Menten en la expresión más utilizada.
 
 [Et]
 
Ejercicios
1. Utilizando los siguientes datos obtén la cinética molecular (gráfica) e identifica la KM, así como la Vmax y determina la V0 a una [S] de 1.5 x 10-6 µMol/L
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	[S] (µMol/L)	V (µMol/min)
	2x10-1	60
	2x10-2	60
	2x10-3	60
	2x10-4	48
	2x10-4	45
	2x10-5	12
Determina la velocidad de reacción de una [S] de 1x10-6 y 1x10-7 si su V0 0.071 M/min a una concentración del [S] de 5x10-6 , considerando una velocidad constante de 0.25M/min con una concentración de [S] de 2x10-2 
Ecuación de Michaelis-Menten
Altas [S] = Vmax de la reacción y esta limitado la [E]
Se conoce como variable catalítica (Kcat)
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Ecuación de Michaelis-Menten
(Kcat)
Moles de sustrato convertidos en producto por segundo.
Cantidad máxima de Moles de sustrato convertidos en producto cada segundo 
ES →E + P kcat=k2
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Enzimas efectores sobre la actividad
La velocidad de las reacciones catalizadas por encimas se puede modificar en presencia de ciertos compuestos (efectores)
Activadores: Aumenta la rapidez de la reacción.
Inhibidores: Disminuye la rapidez de la reacción.
2.1 Competitiva
2.2 Incompetitiva
2.3 No-competitiva
¿Que bloquean?
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Enzimas efectores sobre la actividad
Los inhibidores pueden actuar evitando la formación del complejo ES o bloqueando la reacción química que lleva a la formación del producto
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Inhibidores enzimáticos
En general 
Los inhibidores son moléculas pequeñas que se unen en forma reversible con la enzima que inhiben 
Las células contienen muchos inhibidores enzimáticos naturales que juegan papeles importantes en la regulación del metabolismo.
¿Inhibidores artificiales?
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Inhibidores enzimáticos
Los inhibidores reversibles se diferencian de los irreversibles por su fácil eliminación de soluciones de enzima.
El equilibrio entre la enzima libre (E) más el inhibidor (I) y el complejo EI se caracteriza por una constante de disociación. 
En este caso, a la constante se le llama constante de inhibición, Ki.
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Inhibidores enzimáticos
Inhibición competitiva
En este caso el inhibidor es una sustancia con una estructura química y especial analogía a la del sustrato 
Bloque al sitio activo de la enzima
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Inhibidores enzimáticos
Inhibición incompetitiva o acompetitiva
Sólo se unen al ES y no a la enzima libre, por conversión de algunas moléculas de E en la forma inactiva ESI
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Inhibidores enzimáticos
Inhibición no competitiva
Se puede unir a la enzima libre E o al complejo ES para formar EI, EIS
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Inhibidores enzimáticos
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Ejercicio
1. Utilizando los siguientes datos obtén la cinética molecular (gráfica) e identifica la KM, así como la Vmax y determina la V0 a una [S] de 1.5 x 10-6 µMol/L
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	[S] (µMol/L)	V0 (µMol-1/min)	V0 (µMol-1/min)
Inhibidor [A]	V0 (µMol-1/min)
Inhibidor [B]	V0 (µMol-1/min)
Inhibidor [C]
	0.20	16.67	6.25	5.56	10
	0.25	20	7.69	6.67	11.11
	0.33	24.98	10.0	8.33	12.50
	0.50	33.33	14.29	11.11	14.29
	1.0	50	25.0	16.67	16.67
	2.0	66.07	40.0	22.22	18.18
Uso de Inhibidores enzimáticos
La inhibición enzimática reversible permite contar con un método poderoso para determinar la actividad enzimática y para alterarla en el tratamiento de enfermedades.
Permite conocer reactividad química del sitio activo de una enzima a partir de experimentos que impliquen una serie de inhibidores competitivos con estructuras alteradas en forma sistemática
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Uso de Inhibidores enzimáticos
Los inhibidores irreversibles son los que se combinan o destruyen un grupo de la enzima que es esencial para su actividad (unión covalente muy estable).
Inactivadores suicidas: poco reactivos hasta que se unen al sitio activo de una enzima impide la producción del producto normal.
	Inactivadores basados en el mecanismo
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Regulación de la actividad enzimática
Otra de las ventajas de las enzimas es que su actividad catalítica se puede regular de varias maneras.
La cantidad de una enzima se puede controlar regulando la velocidad de su síntesis o de su degradación (enzimas reguladoras)
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Regulación de la actividad enzimática
Enzimas reguladoras se definen como aquellas cuya actividad se puede modificar en una forma que afecte la velocidad de una reacción catalizada por la enzima. 
Controlan un paso clave en una ruta metabólica.
Se designarán como enzimas reguladoras a las enzimas que regulan el flujo de metabolitos en una ruta).
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Regulación de la actividad enzimática
Enzimas reguladoras se vuelven más activos cuando:
Aumenta la concentración de sus sustratos
Disminuyen las concentraciones de los productos.
Se vuelven menos activas cuando:
Disminuyen las concentraciones de sus sustratos
Cuando se acumulan los productos de sus rutas metabólicas.
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Regulación de la actividad enzimática
Las enzimas reguladoras se pueden clasificar por el método de su modulación:
modulación alostérica no covalente 
modificación covalente
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Propiedades generales de las enzimas alostéricas
Las actividades de las enzimas alostéricas cambian debido a inhibidores y activadores metabólicos
Los moduladores alostéricos se enlazan en forma no covalente a las enzimas que regulan
Con pocas excepciones, las enzimas reguladoras son proteínas de subunidades múltiples
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EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
Las enzimas tiene un pH optimo o un intervalo en el que su actividad es máxima
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EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA