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Introducción Al revelar los numerosos métodos mediante los cuales las células procesan, añaden, eliminan y transfi eren informa- ción genética, los biólogos moleculares abrieron el camino para el desarrollo de sus propias manipulaciones genéticas. En los últimos años, se han desarrollado técnicas que han permitido abordar el análisis y la manipulación del ADN de una forma antes inimaginada. La tecnología del ADN recombinante ha hecho posible investigar más a fondo la estructura y la función de los genes, en especial de los genes eucarióticos, inaccesibles por otros métodos. Cuando los investigadores se enfrentaron por primera vez con el gran tamaño y la complejidad del ADN, incluso el del virus más simple, la posibilidad de descifrar la información genética codifi cada parecía estar más allá de toda esperanza. Se hizo evidente que para estudiar un gen individual, se lo debía aislar del resto del genoma ya que, cada gen representa una pequeña sección dentro de un cromosoma y, en ese contex- to, no puede individualizarse. Para el aislamiento de un gen o de fragmentos más pequeños, el ADN debe fragmentarse. Si bien la rotura del ADN puede realizarse mecánicamente, por este medio la fragmentación se produce al azar. La obtención de fragmentos específi cos de ADN fue posible mediante un método desarrollado a partir de herramientas propias de ciertos organismos. Para avanzar hacia un estu- dio más detallado del ADN fue necesaria una metodología que permitiera obtener grandes cantidades de fragmentos específi cos de ADN. Estos fragmentos podían ser ADN genómico, ADN complementario (ADNc) o ADN obteni- dos a partir de oligonucleótidos sintéticos. A menudo, antes de que un determinado fragmento de ADN o de ARN men- sajero (ARNm) pueda manipularse de cualquier modo, pri- mero debe localizarse. Los cromosomas, incluso los de las células eucarióticas más simples, contienen una enorme cantidad de ADN, por lo que localizar un segmento especí- fi co es como tratar de encontrar la proverbial aguja en el pajar. Para localizar fragmentos específi cos se utiliza la téc- nica de hibridación de ácidos nucleicos. Entre las técnicas de hibridación más comunes se encuentran Southern blot, Northern blot, Slot blot, Dot blot e hibridación in situ. Antes de abordar cada metodología es importante mencio- nar algunos aspectos básicos que facilitarán el entendi- miento técnico de estas herramientas de la biología mo- lecular, como son la electroforesis de ácidos nucleicos y la defi nición de sondas. Electroforesis de ácidos nucleicos La electroforesis es una técnica analítica de separación de macromoléculas. La separación tiene lugar debido a la dife- rente movilidad que presentan las macromoléculas cargadas cuando se someten a la infl uencia de un campo eléctrico como consecuencia de su relación carga/masa. Los ácidos nucleicos son moléculas cargadas negativamente, debido a la presencia de grupos fosfato en su estructura. La naturaleza del enlace fosfodiéster de las cadenas polinucleotídicas con- diciona la carga de un ácido nucleico, que es aproximada- mente igual al número de grupos fosfato. La electroforesis en geles de agarosa se lleva a cabo en aparatos apropiados, cámaras generalmente horizontales, y requiere de dos ele- mentos indispensables: la fase móvil y la fase estacionaria. La fase móvil es el medio amortiguado que permite la movilidad de las moléculas cargadas hacia los electrodos correspon- dientes cuando se genera un campo eléctrico. La fase estacio- naria, o soporte, es un polímero de naturaleza gelatinosa conocida como agarosa (originalmente obtenido de algas, como el agar-agar, pero de composición más homogénea). Dependiendo de su concentración genera poros de cierto tamaño a través de los cuales migran los fragmentos de ADN o ARN. Normalmente la concentración es de 0.5 a 2%. La agarosa posee la propiedad de permanecer líquida a más de Técnicas de hibridación 140 PARTE II • Metodología del ADN recombinante 50 °C y de formar un gel al enfriarse. Los fragmentos de áci- dos nucleicos separados por electroforesis se visualizan mediante su tinción con bromuro de etidio, un colorante que se intercala entre las bases del ADN y que emite fl uorescen- cia cuando se irradia con luz ultravioleta. Sondas Las sondas son segmentos de ADN o ARN de cadena sen- cilla marcados con moléculas reporteras, como enzimas o radioisótopos, que permiten su fácil detección. El diseño de la sonda, es decir, su secuencia nucleotídica, es lo que le permitirá, entre miles de fragmentos que forman parte del genoma de un ser humano, identifi car “un solo gen” o “el fragmento de un gen”. Gran parte del éxito de este tipo de estrategias moleculares depende de la especifi cidad de la sonda. La longitud de las sondas puede ir de 15 a 30 bases, conocidas también como oligonucleótidos, hasta miles de bases de nucleótidos. Pueden sintetizarse y purifi carse con relativa facilidad por instrumentos comerciales disponibles en la actualidad. En términos generales las sondas se obtie- nen a partir de síntesis química o de plásmidos, que se clo- nan con la sonda de interés. La especifi cidad de la síntesis de la sonda dependerá del objetivo de estudio (por ejemplo, el diagnóstico de mutaciones en enfermedades genéticas o la identifi cación de un polimorfi smo). Southern blot Fundamento La técnica de Southern blot la desarrolló, en 1975, Edwin Southern y es una estrategia estándar para analizar ADN previamente digerido con enzimas de restricción. Esta técnica se utiliza para determinar la presencia de un gen o fragmentos del ADN específi cos en una mezcla de ácidos nucleicos previamente extraídos. Se basa en la aplicación de dos procesos fundamentales: la desnaturalización o separación de las cadenas comple- mentarias del ADN y la hibridación o unión de dos cadenas complementarias. Este fundamento es compartido por todas las técnicas de hibridación. Procedimiento técnico En este procedimiento, primero se aísla el ADN de cual- quier célula del organismo excepto de glóbulos rojos, ya que carecen de núcleo. Para el análisis molecular de un pacien- Corte con enzimas de restricción Fragmentos de ADN Membrana Electroforesis Papel absorbente Hibridación con la sonda marcada Detección de la secuencia de interés Fragmentos separados Amortiguador Membrana Gel Película ADN genómico Autorradiografía Figura 15-1. Esquema representativo de cada uno de los pasos involucrados en la técnica de Southern blot. Obtención del ADN genómico y digestión con enzimas de restricción, electroforesis, transferencia, hibridación específi ca con una sonda y detección de la secuencia de interés. CAPÍTULO 15 • Técnicas de hibridación 141 te, el ADN puede obtenerse de linfocitos. Sin embargo, la extracción puede hacerse también de otras fuentes: cultivos celulares, células de líquido amniótico, vellosidades corióni- cas o cualquier órgano biopsiado. Una vez extraído el ADN, se digiere con enzimas de restricción y los fragmentos se separan por electroforesis en geles de agarosa, de acuerdo con su carga/masa. En algunas ocasiones se utilizan geles de acrilamida cuando los fragmentos que se van a separar son muy pequeños. En este procedimiento electroforético, como ya se mencionó, las muestras se someten a un campo eléctrico; como los fragmentos de ADN tienen carga nega- tiva (por sus grupos fosfato) todos se mueven en la misma dirección hacia el electrodo positivo, y los fragmentos más pequeños migran más rápidamente. Las moléculas de ADN separadas pueden visualizarse mediante su tinción con bromuro de etidio. En este momen- to el procedimiento no es informativo, debido a que el frag- mento de interés se encuentra inmerso en millones de fragmentos creados por las enzimas de restricción. Poste- riormente, el ADN se desnaturaliza para obtener cadenas sencillas, mediante un proceso químico, generalmente por tratamiento con álcalis. A continuación, los fragmentos se transfieren del gel a un soporte sólido, como membranas de nitrocelulosa o de nailon. Existen diferentes métodos para la transferencia, como la capilaridad, el vacío o la electro- transferencia. Es importante señalar que la fi nalidad de la transferencia es crear una réplica de lo que se tenía en el gel, ahora en un soporte mucho más sólido, como es una membrana. Por último, para identifi car uno o más frag- mentos entre millones de fragmentos, se utiliza una sonda específi ca marcada con alguna molécula reportera (por ejemplo, “radiactividad”, 32P-dCTP). La sonda se pone en contacto con la membrana de nitrocelulosa y en aquellos lugares en donde la sonda encuentre su secuencia comple- mentaria se pegará, proceso conocido como hibridación. La sonda emitirá radiactividad, la cual se detectará mediante un proceso de revelado con placas de rayos X. La emisión de la sonda corresponderá únicamente al fragmento de interés. En la fi gura 15-1 se observa un esquema de cada uno de los pasos involucrados en la técnica de Southern blot. Marcaje de las sondas Las sondas pueden marcarse radiactivamente (en general con 32P) o enzimáticamente (biotina, digoxigenina, etc.). Una ventaja de los sistemas enzimáticos es que, una vez marcada la sonda, su vida media es muy larga (meses), mien- tras que el marcaje radiactivo es más corto (para 32P, de 15 días). Sin embargo, la sensibilidad varía: las radiactivas detectan hasta 0.1 pg de ácido nucleico y las enzimáticas, entre 1 y 10 pg. Las sondas pueden marcarse en un extremo o a lo largo de toda la cadena. Para marcar en un extre- mo puede utilizarse la enzima polinucleótido cinasa (que introduce un único nucleótido marcado en el extremo 5’ de la sonda) o la enzima transferasa terminal (que introduce varios nucleótidos marcados en el extremo 3’ de la sonda). El marcaje en toda la sonda se realiza por el procedi- miento de nick traslation (fi gura 15-2). En este método se combinan dos actividades enzimáticas: 1. Actividad ADNsa 1, que suprime un nucleótido al azar de una de las dos cadenas de la sonda. 2. Actividad de ADN polimerasa, que, a partir del hueco dejado en la cadena deADN por la ADNsa 1, va incor- porando nuevos nucleótidos por complementariedad (entre los que están marcados), tomando como molde la otra cadena de ADN intacta. A AG G GT T T TC Actividad ADN sal Actividad ADNp C CG G GA AA TC CC A GT TTC CC A G TTC CC G*A G T G*A G A G TT CC G* G*A AG T C* TT C*C* A G OH T TC C CG G GA AA T TC C CG G G C* G* T A A AA T TC C CG G GA AA T TC C CG G GA AA OH Figura 15-2. Marcaje de una sonda del ADN por nick trans- lation. En el primer paso de la reacción la enzima ADNsa 1 produce una pequeña rotura (nick) en una de las cadenas del ADN. A partir de ésta, la ADN polimerasa 1 añade nucleótidos al extremo 3’ OH generados. Dicha enzima tiene, además, ac- tividad de exonucleasa 5’-3’, que libera nucleótidos del 5’ del nick. La eliminación de nucleótidos del extremo 5’ y la adición de nuevos nucleótidos al extremo 3’ provoca el movimiento del nick a lo largo del ADN (nick translation). La sustitución de uno o más de los nucleótidos que van a ser incorporados de nuevo por nucleótidos marcados radiactivamente origina la formación de moléculas marcadas (sondas). 142 PARTE II • Metodología del ADN recombinante Otro método para marcar sondas es el de random pri- mers (secuencias cortas de oligonucleótidos, normalmente hexámeros, que por su pequeño tamaño hibridan al azar a lo largo de toda la cadena). Al añadir la enzima ADN poli- merasa 1 desde el lugar donde se unen los primers, van incorporándose nucleótidos en donde algunos van marca- dos radiactivamente hasta que fi nalmente se completa la cadena. Aplicaciones La técnica de Southern blot ha sido de gran utilidad para identifi car genes asociados con enfermedades de transmi- sión genética, e identifi car mutaciones, como rearreglos, deleciones y dosis génica en caso de portadores (fi gura 15-3). También se utiliza para detectar polimorfi smos en los fragmentos de restricción de diversos genes. Northern blot Diferencias con Southern blot Es la contraparte del Southern blot y como ácido nucleico se utiliza ARN en lugar de ADN. A diferencia del Southern blot, con esta técnica no se utilizan enzimas de restricción, Gel de electroforesis teñido Membrana de hibridación Normal portador afectado Kb 20 9 6 4 2 1 ya que las moléculas de ARN son más pequeñas y para su análisis no requieren su fraccionamiento. Sin embargo, prácticamente comparten todos los demás pasos, como son la electroforesis, la desnaturalización (aunque el ARN es de cadena sencilla, puede formar estructuras secundarias), la transferencia y la hibridación con una sonda. Aplicaciones Es una herramienta muy útil para el estudio de los produc- tos de la transcripción génica (ARNm) y de su regulación, ya que se pueden estudiar las potenciales variaciones en la abundancia de especies del ARN en diferentes condiciones experimentales o comparar condiciones clínicas normales o patológicas. Dot/slot blot Tras el aislamiento y separación de los ácidos nucleicos, éstos se aplican directamente a la membrana sin separarlos, según su peso molecular; es decir, no se realiza electrofore- sis. La fi jación se hace generalmente con vacío y en un mol- de cuyo pocillo puede tener forma de punto (dot blot) o ser lineal (slot blot) (fi gura 15-4). Es posible realizar deteccio- nes no sólo cualitativas (positivo o negativo) sino también cuantitativas, utilizando como patrón diluciones seriadas Figura 15-3. Southern blot para el diagnóstico de anemia falciforme. El esquema de la izquierda representa el ADN digerido con enzimas de restricción, separado por electroforesis y teñido con bromuro de etidio. Al extremo del gel, se observa un marcador de peso molecular como referencia, expresado en kilobases (Kb). El esquema de la derecha muestra el resultado de la hibridación, donde se observan las bandas que son reconocidas por la sonda. En este caso el diagnóstico fue dirigido hacia una hemoglo- binopatía (anemia falciforme), una enfermedad autosómica recesiva. Por el método de Southern blot se observa claramente la dotación génica en caso de sujetos portadores y afectados por la enfermedad. CAPÍTULO 15 • Técnicas de hibridación 143 slotsdots B) Slot blotA) Dot blot CEP 17HER-2/neu Laboratorio de Genética - INEN de concentraciones conocidas del genoma que se está determinando. Hibridación in situ Es un método histoquímico que emplea a la biología mo- lecular de la misma manera que la inmunohistoquímica uti- liza los métodos de la inmunología. Los principios de ambos métodos son semejantes y el resultado fi nal es el mismo: la identifi cación de componentes tisulares que pueden obser- varse al microscopio. La especifi cidad de la inmunohisto- química se basa en la unión antígeno/anticuerpo, mientras que la especifi cidad de la hibridación in situ se basa en la unión de una sonda con una secuencia complementaria de ADN o ARN dentro de un tejido. A diferencia de Southern blot y Northern blot, la hibridación in situ no requiere de la extracción de ácidos nucleicos, sino que en el mismo tejido se lleva a cabo el procedimiento de detección e hibridación; de ahí el nombre de in situ (en el mismo lugar). Las sondas que se utilizan para la hibridación in situ pueden ser radiac- tivas y no radiactivas. En la actualidad, las más relevantes son las marcadas con fl uorescencia, modalidad conocida como hibridación in situ acoplada a un sistema de fl uoro- cromos (FISH) (fi gura 15-5), o con biotina, ya que el detalle morfológico no se pierde, a diferencia de lo que ocurre con las modalidades radiactivas. Aspectos técnicos El primer paso para la hibridación es la preparación y fi ja- ción del tejido, en el cual deben conservarse los ácidos nucleicos lo más íntegramente posibles, mantener la mor- fología del tejido y permitir una accesibilidad sufi ciente paraque la sonda penetre. La fi jación con formalina, segui- da de una inclusión con parafi na es el procedimiento más usado. Después de la fi jación las secciones de tejido deben adherirse al portaobjetos y no deben desprenderse durante el procedimiento de hibridación. Normalmente se utiliza gelatina crómica, polilisina o Vectabond® (producto comer- cial). Antes de la hibridación, los tejidos se pretratan con HCl (que extrae proteínas e hidroliza parcialmente las secuencias diana) y proteinasa K (que incrementa la penetra- ción y la accesibilidad de la sonda) y se someten a una pos- fi jación con paraformaldehído (incrementa la especifi cidad de la señal). El procedimiento es muy complejo, por lo que únicamente se han mencionado algunos de los aspectos más relevantes. Aplicaciones La hibridación in situ tiene un alto grado de resolución, que permite la localización de secuencias génicas a nivel cro- mosómico, con lo que se pueden detectar translocaciones y otras alteraciones cromosómicas, así como el estudio de expresión de genes (ARNm) a nivel celular y subcelular. Las principales aplicaciones son la identifi cación de infecciones virales en tejidos, así como el mapeo cromosómico. Figura 15-4. Esquema de la visualización del dot blot y slot blot. El tipo de soporte que se utiliza durante el proceso de fi jación de los ácidos nucleicos en una membrana o fi ltro es lo que determina la forma en que se visualiza esta técnica molecular. A) Soporte que se utiliza para realizar un dot blot, donde los orifi cios están en forma de puntos. B) Soporte que se utiliza para realizar un slot blot, donde los orifi cios se encuentran en forma de líneas. Figura 15-5. Técnica de FISH. Identifi cación del gen HER2/NEU en cáncer de mama por la técnica de FISH. El gen HER2/NEU se encuentra localizado en el cromosoma 17q, y su amplifi ca- ción está presente en 25 a 30% de las neoplasias de mama; se relaciona estrechamente con los estadios avanzados, metas- tásicos, que implican mal pronóstico. En la actualidad existe un tratamiento con anticuerpos monoclonales humanizados dirigidos específi camente contra el producto del gen HER2/ NEU que mejora el pronóstico y la sobrevida del paciente. 144 PARTE II • Metodología del ADN recombinante 1. Consulte la secuencia número del ARNm de NFkB (NM_001077494.1) del banco de genes (http://www. ncbi.nlm.nih.gov). Según la información allí reportada, responda lo siguiente: ¿En qué posición del ARNm se unen las siguientes son- das? a) 5’agctctgctggatcggcatggag3’ b) 5’acgcggacccgcgggcgtctaaaatt 3’ ¿En qué exón se localizan estas secuencias? ¿Cuál es la secuencia complementaria de cada sonda? Según lo mencionado en este capítulo, ¿cuál técnica de hibridación es la más adecuada para detectar el ARNm? 2. ¿Cuál de los siguientes enunciados es verdadero para la técnica Southern blot? a) Se extrae ARN celular, separado por electroforesis y transferido a una membrana, se hibrida con una son- da marcada específi ca para un gen. b) Se extrae ADN, se digiere con enzimas de restricción, los fragmentos generados son marcados con radiacti- vidad, se separan por electroforesis y se transfi eren a una membrana, donde hibridan con una sonda mar- cada específi ca para un gen. c) Se utilizan fragmentos de ADN cortados con enzimas de restricción, que se separan por electroforesis y se transfi eren a una membrana, donde se hibridan con una sonda marcada específi ca para un gen. 3. La siguiente fotografía muestra la hibridación de una son- da en el ADN digerido con enzimas de restricción de los miembros de una familia con alteraciones en el gen de distrofi na. ¿Puede identifi car cuáles individuos presentan el gen alterado? 4. La siguiente fotografía muestra la hibridación de una son- da en el ARNm del virus del papiloma humano en pa- cientes con sospecha de presentar la infección. ¿Puede identifi car cuáles individuos están infectados? 5. ¿Cuál frase es correcta para describir la hibridación in situ? a) La técnica permite localizar un segmento concreto de ADN en una posición determinada de un cromosoma eucariótico. b) Si el marcaje es de tipo quimioluminiscente la técnica se denomina FISH. c) Consiste en detectar determinados ARNm marcados con fl uorescencia, utilizando sondas de ADN marca- das procedentes del cromosoma deseado. Ejercicios de integración Aussubel F., Brent R.E., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A., et al., editores. Short protocols in molecular biology, 4ª ed. Nueva York: John Wiley and Sons, 2000. Carreño V., Castillo I. Principios de biología molecular, 1ª ed. Madrid: Springer, 2001. Peters PM. Biotechnology: A guide to genetic engineering, 1ª ed. Dubuque: William C. Brown Publishers, 1993. Ross J. Nucleic acid hybridization. Essential techniques. Londres: John Wiley & Sons, 1998. Sambrook J., Russell D. Th e condensed protocols. From molecular cloning: a laboratory manual. Nueva York: CSHL Press, 2006. Bibliografía 1 2 3 4 5 6 D 1 2 3 4 5
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