Aminoácidos y proteínas

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Aminoácidos y proteínas
RyojioNagaioyo Naoyukio Taniguchi
OBJETIVOS DE APRENDIZAJE
INTRODUCCIÓN
Las proteínas son los principales polímeros estructurales 
y funcionales en los seres vivos
Las proteínas desempeñan una amplia gama de funciones, como 
la catálisis de reacciones metabólicas y el transporte de vitaminas, 
minerales, oxígeno y combustibles. Algunas proteínas constituyen 
la estructura de los tejidos, mientras que otras actúan en la trans­
misión nerviosa, la contracción muscular y la motilidad celular, 
otras lo hacen en la coagulación de la sangre y las defensas in- 
munitarias, y otras como hormonas y moléculas reguladoras. Las 
proteínas son sintetizadas como una secuencia de aminoácidos 
unidos formando una estructura poliamida (polipéptido) lineal, 
pero adoptan estructuras tridimensionales complejas al realizar 
sus funciones. Hay alrededor de 300 aminoácidos en los sistemas 
animales, vegetales y microbianos, pero solamente 2 0 aminoá­
cidos están codificados por el ADN para aparecer en las 
proteínas. Muchas proteínas también contienen aminoácidos 
modificados y componentes accesorios, denominados grupos 
prostéticos. Se utilizan diversas técnicas químicas para aislar y 
caracterizar proteínas en función de diferentes criterios, como 
masa, carga y estructura tridimensional. La proteómica es un 
campo emergente que estudia la expresión de las proteínas en 
una célula u organismo y los cambios en la expresión de una 
proteína en respuesta al crecimiento, a las hormonas, al estrés y 
al envejecimiento.
AMINOÁCIDOS
Los aminoácidos son los bloques de construcción 
de las proteínas
Estereoquímica: configuración 
en el carbono a, isómeros d - y l-
Cada aminoácido tiene un carbono central, denominado carbo­
no a, al cual se unen cuatro grupos diferentes (fig. 2 .1 ):
■ Un grupo amino básico (-NH2).
■ Un grupo carboxilo ácido (-COOH).
■ Un átomo de hidrógeno (-H).
■ Una cadena lateral característica (-R).
Uno de los 20 aminoácidos, la prolina, no es un a-aminoácido sino 
un a-iminoácido (v. más adelante). Exceptuando la glicina, todos 
los aminoácidos contienen al menos un átomo de carbono asimé­
trico (el átomo de carbono a), dando lugar a dos isómeros que 
son ópticamente activos, es decir, que pueden desviar el plano 
de la luz polarizada. Se dice que estos isómeros, denominados es- 
tereoisómeros o enantiómeros, son quirales, una palabra derivada 
del término griego para mano. Dichos isómeros son imágenes es­
peculares no superponibles, de forma análoga a lo que ocurre con 
la mano derecha y la izquierda, como se muestra en la figura 2 .2 . 
Las dos configuraciones de los aminoácidos se denominan D (para 
la dextro o derecha) y l (para la levo o izquierda). Todos los ami­
noácidos en las proteínas son de configuración L, ya que las 
proteínas son biosintetizadas por enzimas que insertan solamente 
L-aminoácidos en las cadenas peptídicas.
Átomo de hidrógeno
T
H
GT T ° h2n - c - c o o h
R
t
Cadena lateral
Fig.1. Estructura de un aminoácido. Excepto para la glicina, cuatro 
grupos diferentes se unen al carbono a de un aminoácido. En la tabla 2.1 
se enumeran las estructuras de los grupos R.
CAPÍTULO 2 Aminoácidos y proteínas
Clasificación de los aminoácidos según 
la estructura química de sus cadenas laterales
Las propiedades de cada aminoácido dependen de su cadena lateral 
(-R); las cadenas laterales son los grupos funcionales que determi­
nan la estructura y la función de las proteínas, así como la carga 
eléctrica de la molécula. Para comprender los métodos de análisis, 
purificación e identificación de las proteínas es importante conocer 
las propiedades de estas cadenas laterales. Los aminoácidos con 
cadenas laterales cargadas, polares o hidrofilicas normalmente 
se encuentran expuestos en la superficie de las proteínas. Los 
residuos hidrofóbicos apolares normalmente se encuentran ente­
rrados en el interior hidrofóbico o núcleo de una proteína y no 
están en contacto con el agua. Los 20 aminoácidos que forman 
parte de las proteínas y están codificados en el ADN se enumeran 
en la tabla 2 .1 y se clasifican según los grupos funcionales de su 
cadena lateral.
Aminoácidos alifáticos
Los aminoácidos alifáticos (alanina, valina, leucina e isoleucina) 
tienen hidrocarbonos saturados como cadenas laterales. La gli­
cina, que solamente tiene un hidrógeno como cadena lateral, se 
incluye también en este grupo. La alanina tiene una estructura 
relativamente simple, un grupo metilo como cadena lateral, mien­
tras que la leucina y la isoleucina tienen grupos see- e iso-butilo. 
Todos estos aminoácidos son hidrofóbicos.
Aminoácidos aromáticos
La fenilalanina, la tirosina y el triptófano tienen cadenas 
laterales aromáticas
Los aminoácidos apolares alifáticos y aromáticos suelen encon­
trarse enterrados en el interior de la proteína y están involucrados 
en interacciones hidrofóbicas entre ellos. La tirosina tiene un gru­
po hidroxilo débilmente ácido y puede localizarse en la superficie
D-serina L-serina
Fig. 2 Enantiómeros. Par de imágenes especulares de los ami­
noácidos. Cada aminoácido representa una imagen especular no 
superponible. Las imágenes especulares de los estereoisómeros se 
denominan enantiómeros. En las proteínas solamente se encuentran 
los L-enantiómeros.
Tabla 2.1 Los 20 aminoácidos encontrados en proteínas*
Aminoácidos Estructura de la porción R
Aminoácidos alifáticos
Glicina (Gly, G) —H
Alanina (Ala, A) —ch3
Valina (Val, V) /CH3
— ch
\
ch 3
Leucina (Leu, L) /CH3
Isoleucina (lie, I) ch 3
I
-C H — CH2— CH3
Aminoácidos que contienen azufre
Cisterna (Cys, C)
Metionina (Met, M)
Aminoácidos aromáticos
Fenilalanina (Phe, F)
Tirosina (Tyr, Y)
Triptófano (Trp, W)
Iminoácido
Prolina (Pro, P)
- ch2— SH
■CH?— CH,— S— CH,
Aminoácidos neutros
Serina (Ser, S)
Treonina (Thr, T)
Asparagina (Asn, N) 
Glutamina (Gin, Q)
- ch 2- c h 2- c
Aminoácidos ácidos
Ácido aspártico (Asp, D) 
Ácido glutámico (Glu, E)
Aminoácidos básicos
Histidina (His, H)
Lisina (Lys, K) 
Arginina (Arg, R)
— CH2-C H j— c o o h
K
nV nh
—CHj—CHj—CH2—CHj—NHj 
— CHj— CH2— CH2— NH— c — NH2
NH
* Entre paréntesis se muestran las abreviaturas de tres letras 
y de una letra de uso corriente.
CAPÍTULO 2 Aminoácidos y proteínas 7
de las proteínas. La fosforilación reversible del grupo hidroxilo de 
la tirosina en algunas enzimas es importante en la regulación 
de las vías metabólicas. Los aminoácidos arom áticos son res­
ponsables de la absorción ultravioleta de la mayoría de 
las proteínas, que presentan un m áximo de absorción a 
unos 2 8 0 nm. El triptófano tiene una absorción mayor en esta 
región que los otros dos aminoácidos aromáticos. El coeficiente de 
absorción molar de una proteína es útil para determinar la concen­
tración de una proteína en disolución mediante espectrometría. 
En la figura 2.3 se muestra el espectro de absorción típico de los 
aminoácidos aromáticos y de una proteína.
Aminoácidos polares neutros
Los aminoácidos polares neutros contienen grupos hidroxilo o 
amida en su cadena lateral. La serina y la treonina contienen 
grupos hidroxilo. Estos aminoácidos se encuentran a veces en 
los centros activos de proteínas catalíticas, las enzimas (cap. 6). 
La fosforilación reversible de los residuos de serina y treonina 
periféricos en la molécula enzimática también está involucrada en 
la regulación del metabolismo energético y del almacenamiento 
de combustible en el organismo (cap. 13). La asparagina y la 
glutam ina tienen cadenas laterales con grupos amida. 
Éstas son polares, pero en condiciones fisiológicas carecen 
de carga. La serina, la treonina y la asparagina son los principales 
lugares de unión de azúcares a proteínas, formando las gluco- 
proteínas (cap. 26).
Aminoácidos ácidos
Los ácidos aspártico y glutámico contienen ácidos carboxílicos 
en sus cadenas laterales y están ionizados a un pH de 7,0 y, como 
resultado, transportan cargas negativas en sus grupos carboxi- 
lo (3 y 7 , respectivamente. En el estado ionizado,estos aminoácidos 
se denominan aspartato y glutamato, respectivamente.
Aminoácidos básicos
Las cadenas laterales de la lisina y la arginina están completa­
mente protonadas a pH neutro y, por tanto, están cargadas positi­
vamente. La lisina contiene un grupo amino primario (NH2) uni­
do al carbono terminal e de la cadena lateral. El grupo e-amino 
de la lisina tiene un pKa de aproximadamente 11. La arginina
CONCEPTOS AVANZADOS
AMINOÁCIDOS QUE NO FORMAN 
PARTE DE PROTEÍNAS
Algunos aminoácidos aparecen en estado libre o combinado, pero 
no en proteínas. La cuantificación de aminoácidos anormales en 
orina (aminoaciduria) es útil para el diagnóstico clínico (v. cap. 19). 
En el plasma, los aminoácidos libres normalmente se encuentran 
a concentraciones de 10-100 mmol/l, incluidos muchos que no se 
encuentran en proteínas. La citrulina, por ejemplo, es un metabolito 
importante de la L-arginina y un producto de la óxido nítrico sintasa, 
una enzima que produce óxido nítrico, una importante molécula de 
señalización vasoactiva. La concentración urinaria de un aminoácido 
se expresa normalmente en p,mol/g de creatinina. La creatinina es un 
aminoácido que proviene del músculo y que se excreta en cantidades 
relativamente constantes por unidad de masa corporal por día. De 
este modo, la concentración de creatinina en orina, que normalmente 
es de alrededor de 1 mg/ml, puede utilizarse para corregir la dilución 
de la orina. El aminoácido más abundante en la orina es la glicina, 
que está presente en cantidades de 400-2.000 mg/g de creatinina.
1,0 1
0,8 -
.2 0,6 -
1
I 0,4 -
0,2 -
0,0
Triptófano
260 280 
Longitud de onda (nm) Longitud de onda (nm)
Fig. 3 Espectros de absorción ultravioleta de los aminoácidos aromáticos y de la albúmina sérica bovina. (A) Aminoácidos aromá­ticos 
como el triptófano, la tirosina y la fenilalanina tienen un máximo de absorbancia a aproximadamente 280 nm. Cada proteína purificada tiene un 
coeficiente de absorción distinto de alrededor de 280 nm dependiendo de su contenido en aminoácidos aromáticos. (B) Una disolución de 
albúmina sérica bovina (1 mg disuelto en 1ml de agua) tiene una absorbancia de 0,67 a 280 nm utilizando una cubeta de 1cm. El coeficiente 
de absorción de las proteínas se expresa con frecuencia como E,% (10 mg/ml de solución). Para la albúmina, E1%280nm = 6,7. Aunque las 
proteínas varían en su contenido de Trp, Tyr y Phe, las mediciones de absorbancia a 280 nm son útiles para la estimación de la concentración 
de proteínas en las disoluciones.
CAPÍTULO 2 Aminoácidos y proteínas
es el aminoácido más básico (píCa de aproximadamente 13) y 
su grupo guanidina existe como ion guanidinio protonado a un 
pH de 7,0.
La histidina (pKa de aproximadamente 6) tiene un anillo imida- 
zólico como cadena lateral y actúa como catalizador ácido-básico 
general en numerosas enzimas. La forma protonada del imidazol 
se denomina ion imidazolio.
Aminoácidos que contienen azufre
La cisteína y su forma oxidada, la cistina, son aminoácidos que 
contienen azufre y que se caracterizan por su baja polaridad. 
La cisteína desempeña un papel importante en la estabilización 
de la estructura de las proteínas, dado que puede participar en 
la formación de puentes disulfuro con otros residuos de cis­
teína para formar residuos de cistina, con lo que las cadenas de 
proteínas quedan entrelazadas y así se estabiliza la estructura 
de la proteína. Dos regiones de una sola cadena polipeptídica, 
alejadas una de otra en la secuencia, pueden estar unidas co- 
valentemente a través de un puente disulfuro (puente disulfu­
ro intracatenario). Los puentes disulfuro también pueden 
formarse entre dos cadenas polipeptídicas (puente disulfuro 
intercatenario), formando dímeros proteicos covalentes. Estos 
puentes pueden reducirse mediante enzimas o mediante agentes 
reductores como el 2 -mercaptoetanol o el ditiotreitol para for­
mar residuos de cisteína. La metionina es el tercer aminoácido 
que contiene azufre y tiene un grupo metil tioéter apolar en su 
cadena lateral.
Prolina, un iminoácido cíclico
La prolina se diferencia del resto de aminoácidos en que el anillo 
de pirrolidina de su cadena lateral incluye el grupo a-amino y 
el carbono a. Este iminoácido fuerza un «ángulo» en la cadena 
polipeptídica, lo que causa algunas veces cambios abruptos en la 
dirección de la cadena.
Clasificación de los aminoácidos 
según la polaridad de las cadenas 
laterales del aminoácido
La tabla 2.2 muestra los grupos funcionales de los aminoácidos 
y su polaridad (hidrofilia). Las cadenas laterales polares pueden 
intervenir en la unión del hidrógeno al agua y a otros grupos po­
lares y normalmente se encuentran en la superficie de la proteína. 
Las cadenas laterales hidrofóbicas contribuyen al plegamiento de 
la proteína mediante interacciones hidrofóbicas y se encuentran 
principalmente en el interior de la proteína o en superficies que 
intervienen en interacciones con otras proteínas.
Estado de ionización de un aminoácido
Los aminoácidos son moléculas anfóteras, es decir, tienen 
tanto grupos básicos como ácidos
Los ácidos monoamino y monocarboxílico en disolución presentan 
varias formas de ionización según el pH de la solución. A un pH 
de 7, el «zwitterion» +H3N-CH2-COCT es la especie predominante 
de la glicina en disolución, y la molécula global es, por tanto, eléc­
tricamente neutra. En la titulación a pH ácido, el grupo a-amino 
resulta protonado y cargado positivamente, lo que da lugar al 
catión +H3N-CH2-COOH, mientras que la titulación con álcalis 
da lugar a la especie amónica H2N-CH2-COCT.
+h 3n c h 2 c o o h f J ^ t I j N c h , c o c r < oh~ >h 2n c h 2 c o c r
En la tabla 2 .3 se muestran los valores de pKa para los gru­
pos a-amino y a-carboxilo y de las cadenas laterales de aminoáci­
dos ácidos y básicos. La carga neta global de una proteína depende 
de la contribución de los aminoácidos básicos (carga positiva) y 
ácidos (carga negativa), pero la carga real en la proteína varía con 
el pH de la disolución. Para entender cómo influyen las cadenas 
laterales en la carga de las proteínas, es imprescindible recordar 
la ecuación de Henderson-Hasselbalch.
Tabla 2.2 Resumen de los grupos funcionales de aminoácidos y su polaridad
Aminoácidos Grupo funcional Hidrofílico (polar) o hidrofóbico (apolar) Ejemplos
Ácido Carboxilo, -C00H Polar Asp, Glu
Básico Amino, -NH2 Polar Lys
Imidazol Polar His
Guanidina Polar Arg
Neutro Glicina, -H Apolar Gly
Amidas, -C0NH2 Polar Asn, Gln
Hidroxilo, -OH Polar Ser, Thr,
Sulfhidrilo-SH Apolar Cys
Alifático Hidrocarburo Apolar Ala, Val, Leu, lie, Met, Pro
Aromático Anillos C Apolar Phe, Trp, Tyr
CAPÍTULO 2 Aminoácidos y proteínas 9
Tabla 3 Valores de pKa de los grupos ionizables en las proteínas
Ácido (forma protonada) H+ + base (forma no protonada)
Grupo (ácido conjugado) (base conjugada) pKa
Residuo carboxilo terminal (a-carboxilo) -COOH (ácido carboxílico) -C00" + H+ (carboxilato) 3,0-5,5
Ácido aspártico ((3-carboxilo) -COOH -C00" + H+ 3,9
Ácido glutámico (-y-carboxilo) -COOH -C00- + H+ 4,3
Histidina (imidazol)
V \
6,0
N^/NH + H+
(imidazolio) (imidazol)
Amino terminal (a-amino) -NH3+ (amonio) -NH2 + H+ (amina) 8,0
Cisterna (sulfhidrilo) -SH (tiol) -S" + H+ (tiolato) 8,3
Tirosina (hidroxilo fenólico)
—^ ^ — OH —^ CT + H+
10,1
(fenol) (fenolato)
Lisina (e-amino) - nh3+ -NH2 + H+ 10,5
Arginina (guanidina) ,.n h 2 12,5
—NH—C ' ffi —NH—C ( + H
v nh2 x NH2
(guanidino) (guanidino)
Los valores reales de pKa pueden variar hasta tres unidades de pH en función de la temperatura, el amortiguador (o tampón), la fijación de ligando
y especialmente los grupos funcionales próximos en la proteína.
Ecuación de Henderson-Hasselbalch y pKa La ecuación (3) puede expresarse en términos de un logaritmo 
negativo:
La ecuación de Henderson-Hasselbach describe la 
titulación de un aminoácido y puede usarse para predecir 
la carga neta y el punto isoeléctrico de una proteína
La disociación general de un ácido débil, como elácido carboxílico, 
viene dada por la ecuación:
(1) HAí=tH++A"
(2)
_ [H*][A-]
[HA]
(3) [H+] = Kax
[HA]
[A ']
(4) - lo g [H * ]= - lo g K ,- lo g í^
[A ]
donde HA es la forma protonada (ácido conjugado o forma asociada) 
y A- es la forma no protonada (base conjugada o forma disociada).
La constante de disociación (Ka) de un ácido débil se define como 
la constante de equilibrio de la reacción de disociación (1 ) del ácido:
Dado que el pH es el logaritmo negativo de [H+], es decir, -log[H+], 
y el pKa es igual al logaritmo negativo de la constante de di­
sociación para un ácido débil, es decir, -log2Ca, la ecuación de 
Henderson-Hasselbalch (5) puede desarrollarse y utilizarse para 
el análisis de los sistemas de equilibrio ácido-base:
(5) pH=pKa+log
[A ']
[HA]
La concentración de iones hidrógeno [H+] de una disolución de un 
ácido débil puede calcularse como sigue. La ecuación (2) puede 
reordenarse para dar:
Para una base débil, como una amina, la reacción de disociación 
puede escribirse como sigue:
(6) RNH3+^ H ++RNH2
Y la ecuación de Henderson-Hasselbalch se convierte en:
(7) pH=pKa+log
[rn h 2;
[r n h ;
10 CAPÍTULO 2 Aminoácidos y proteínas
pH < 2,4 2,4 < pH < 9,8 pH>9,8
+OH- r 5 + OH- ^
H C -O H . , * H C -C H 3 , * H C -C H ,
+ H* I + H*
COOH 000- 000-
PH Catión Zwitterion Anión
12-
10-
íC = 9 ,8
8 -
6 - 0 pl = 6,1
4-
2 -
------------1------------1------------
Equivalentes de OH"
A partir de las ecuaciones (5) y (7) está claro que el grado de 
protonación de los grupos funcionales ácidos y básicos y, por tanto, 
la carga neta variarán con el pKa del grupo funcional y el pH de la 
disolución. Para la alanina, que tiene dos grupos funcionales con 
pKa = 2 ,4 y 9,8, respectivamente (fig. 2.4), la carga neta varía 
con el pH, de +1 a -1 . En un punto intermedio entre p2Cal y pJCa2, la 
alanina tiene una carga neta de cero. Este pH se denomina su 
punto isoeléctrico, pl (fig. 2.4).
AMORTIGUADORES O TAMPONES
Los aminoácidos y las proteínas son amortiguadores 
excelentes en condiciones fisiológicas
Los amortiguadores son soluciones que minimizan un cambio 
en la [H+], es decir, en el pH, al añadir un ácido o una base. Una 
disolución amortiguadora que contenga un ácido débil o una 
base débil y un ion de carga contraria tiene una capacidad de 
amortiguación máxima a su pKa, es decir, cuando las formas ácidas 
y básicas están presentes a la misma concentración. La forma 
ácida protonada reacciona con la base añadida y la forma básica 
no protonada neutraliza el ácido añadido, como se muestra a 
continuación para un compuesto amino:
Fig. 4 Titulación de un aminoácido. La curva muestra el número de 
equivalentes de NaOH consumidos por la alanina cuando se titula la 
solución desde pH 0 a pH 12. La alanina contiene dos grupos ionizables: 
un grupo a-carboxilo y un grupo a-amino. A medida que se añade 
NaOH, se titulan estos dos grupos. El pKa del grupo a-COOH es 2,4, 
mientras que el del grupo a-NH3+ es 9,8. A un pH muy bajo, la especie 
iónica predominante de la alanina es la forma catiónica completamente 
protonada:
Í H3
En el punto medio del primer estadio de la titulación (pH 2,4), hay 
concentraciones equimolares de las especies donadora y aceptora de 
protones, lo que proporciona un buen poder de tamponamiento.
[ ch3 | í CH3
|+h 3n — c h — c o o h | |h 2n — CH— C00"
En el punto medio de la titulación global (pH 6,1), el zwitterion es la 
forma predominante del aminoácido en disolución. El aminoácido tiene 
una carga neta de cero a este pH, ya que la carga negativa del ion car- 
boxilado está siendo neutralizada por la carga positiva del grupo amonio.
íH’
+H;N— CH— C00"
Zwitterion
El segundo estadio de la titulación corresponde a la pérdida de un 
protón por el grupo -NH3+ de la alanina. El pH en el punto medio de este 
estadio es 9,8, igual al pKa del grupo -NH3+. La titulación es completa a 
un pH de alrededor de 12, punto en el que la forma predominante de 
la alanina es la forma aniónica no protonada:
Í H3 I
H2N— CH— COO'j
El pH en el que una molécula no tiene carga neta se conoce como punto 
isoeléctrico. Para la alanina, se calcula así:
pKa1+pKa2 _ (2,4 + 9,8) _ 6 1
2 2
RNH3++OH" r n h 2 + h 2o 
r n h 2+ h +^ r n h 3+
Una disolución de alanina (fig. 2.4) tiene una capacidad de amor­
tiguación máxima a pH 2 ,4 y 9,8, es decir, al pKa de los grupos 
carboxilo y amino, respectivamente. Cuando se disuelve en agua, 
la alanina existe como un ion dipolar, o zwitterion, en el que el 
grupo carboxilo no está protonado (-COO“) y el grupo amino está 
protonado (-NH3+). El pH de la solución es 6,1 y el punto isoeléctrico, 
pl, el valor medio entre el pKa de los grupos amino y carboxilo. La 
curva de titulación de la alanina por NaOH (fig. 2.4) ilustra que la 
alanina tiene una capacidad de amortiguación mínima a su pl y una 
capacidad de amortiguación máxima a un pH igual al pKax o al pKa2.
PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS
Estructura primaria de las proteínas
La estructura prim aria de las proteínas es la secuencia 
lineal de sus aminoácidos
En las proteínas, el grupo carboxilo de un aminoácido se une 
al grupo amino del aminoácido siguiente, formando un enlace 
amida (péptido): durante la reacción se elimina agua (fig. 2.5).
Ri R2 Ri 0 2̂
i i 1 ii i
H2N - CH - COOH + H2N - CH - COOH H2N - CH - C - NH - CH - COOH 
H20
Aminoácidos Dipéptido
Fig. 5 Estructura de un enlace peptídico.
CAPÍTULO 2 Aminoácidos y proteínas 11
NH2 H o 
HOOC C N COOH
n ' i
0 | 2 H 
SH
Fig..6 Estructura del glutatión.
CONCEPTOS AVANZADOS
GLUTATIÓN
El glutatión (GSH) es un tripéptido con la secuencia 7-glutamil-cisteinil- 
gliclna (fig. 2.6). Si el grupo tiol de la cisteína está oxidado, se forma el 
disulfuro GSSG. El GSH es el principal péptido presente en la célula. En 
el hígado, la concentración de GSH es de aproximadamente 5 mmol/l. 
El GSH desempeña un papel fundamental en el mantenimiento de 
los residuos de cisteína de las proteínas en su forma reducida (sulfhi- 
drilo) y en las defensas antioxidantes (cap. 37). La enzima 7-glutamü 
transpeptidasa participa en el metabolismo del glutatión y es un 
biomarcador plasmático de algunas enfermedades del hígado, como 
el carcinoma hepatocelular y la hepatopatía alcohólica.
Las unidades de aminoácidos de una cadena peptídica se deno­
minan residuos aminoácidos. Una cadena peptídica formada por 
tres residuos aminoácidos se denomina tripéptido; un ejemplo es el 
glutatión (fig. 2.6). Por convención, el amino terminal (N-terminal) 
se considera el primer residuo y la secuencia de aminoácidos se 
escribe de izquierda a derecha. Cuando se escribe la secuencia 
peptídica se utilizan las abreviaciones de los aminoácidos con tres 
letras o con una, como Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu o 
D-R-V-Y-I-H-P-F-H-L (v. tabla 2.1). Este péptido es la angiotensina, 
una hormona peptídica que influye sobre la presión arterial. El 
residuo aminoácido que tiene un grupo amino libre en uno de los 
extremos del péptido (Asp) se denomina aminoácido N-terminal 
(amino terminal), mientras que el residuo que tiene un grupo 
carboxilo libre en el otro extremo (Leu) se denomina aminoácido 
C-terminal (carboxilo terminal). Las proteínas contienen entre 50 
y 2 .000 residuos aminoácidos. La masa molecular media de un
residuo aminoácido es de alrededor de 110 unidades dalton (Da). 
Por tanto, la masa molecular de la mayoría de las proteínas oscila 
entre 5 .500 y 220.000 Da. La anhidrasa carbónica humanal, una 
enzima que desempeña un cometido fundamental en el equilibrio 
acidobásico en la sangre (v. cap. 24), es una proteína con una masa 
molecular de 29 .000 Da (29 kDa).
Las cadenas laterales de los aminoácidos contribuyen 
tanto a la carga como a la hidrofobicidad de las proteínas
La composición de aminoácidos de una cadena peptídica tiene un 
efecto notorio en sus propiedades físicas y químicas. Las proteínas 
ricas en grupos amino alifáticos o aromáticos son relativamente 
insolubles en agua y se encuentran frecuentementeen las mem­
branas celulares. Las proteínas ricas en aminoácidos polares son 
más hidrosolubles. Las amidas son componentes neutros, de 
manera que el esqueleto amida de una proteína, que incluye los 
grupos a-amino y a-carboxilo que lo forman, no contribuye a la
carga de la proteína. Más bien, la carga de la proteína depende de 
los grupos funcionales de la cadena lateral de los aminoácidos. Los 
grupos de aminoácidos con cadena lateral ácida (Glu, Asp) o bási­
ca (Lys, His, Arg) conferirán carga y capacidad de amortiguación a 
la proteína. El balance entre cadenas laterales ácidas y básicas en 
una proteína determina su punto isoeléctrico (pl) y la carga neta 
en disolución. Las proteínas ricas en lisina y arginina son básicas en 
disolución y tienen carga positiva a pH neutro, mientras que las 
proteínas ácidas, ricas en aspartato y glutamato, son ácidas y tie­
nen carga negativa. Debido a los grupos funcionales de su cadena 
lateral, todas las proteínas están más cargadas positivamente a pH 
ácido y más cargadas negativamente a pH básico. Las proteínas 
son una parte importante de la capacidad de tamponamiento de 
las células y de los líquidos biológicos, incluida la sangre.
Estructura secundaria de las proteínas
La estructura secundaria de las proteínas está 
determinada por las interacciones mediante puentes 
de hidrógeno entre los grupos funcionales de las cadenas 
laterales de los aminoácidos
La estructura secundaria de una proteína hace referencia a la 
estructura local de la cadena polipeptídica. Esta estructura está 
determinada por las interacciones mediante puentes de hidrógeno 
entre el oxígeno del grupo carbonilo de una cadena peptídica y 
el hidrógeno de amida de otro puente peptídico cercano. Existen 
dos tipos de estructura secundaria: la hélice a y la hoja plegada (3.
Hélice a
La hélice a es una estructura en forma de varilla con la cadena 
peptídica fuertemente enrollada y con las cadenas laterales de 
los residuos aminoácidos extendiéndose hacia fuera del eje de la 
espiral. Cada grupo carbonilo amídico está unido mediante un 
puente de hidrógeno al hidrógeno del grupo amida de un enlace 
peptídico que está a una distancia de cuatro residuos a lo largo de 
la misma cadena. Hay un promedio de 3,6 residuos aminoácidos 
por cada vuelta de la hélice y, en la mayoría de las proteínas na­
turales, la hélice gira hacia la derecha (en el sentido de las agujas 
del reloj) (fig. 2.7A).
Hoja plegada f$
Si los enlaces de hidrógeno se forman lateralmente entre enlaces 
peptídicos, las secuencias polipeptídicas se ordenan de forma pa­
ralela o antiparalela entre sí en una disposición que se denomina 
hoja plegada (3. La hoja plegada (3 es una estructura extendida, a 
diferencia de la hélice a, que está enrollada. Está plegada porque 
los enlaces carbono-carbono (C-C) son tetraédricos y no pueden 
existir en una configuración plana. Si la cadena polipeptídica dis­
curre en la misma dirección, forma una hoja p paralela (fig. 2 .7B), 
pero, si sigue la dirección opuesta, forma una estructura antipa­
ralela. El giro o ángulo (3 hace referencia al segmento en el que el 
polipéptido gira y cambia abruptamente de dirección. Los residuos 
de glicina (Gly) y de prolina (Pro) aparecen con frecuencia en 
giros (3 en la superficie de las proteínas globulares.
Fig. 7 Motivos de la estructura secundaria de las proteínas. (A) Una estructura secundaria a helicoidal. Los puentes de hidrógeno entre el 
«esqueleto» de los grupos amida NH y C = O estabilizan la hélice a. Los átomos de hidrógeno de los grupos OH, NH o SH (donadores de 
hidrógeno) interaccionan con los electrones libres de los átomos aceptares como el O, N o S. Aunque la energía de los enlaces es menor que la de 
las uniones covalentes, los enlaces o puentes de hidrógeno desempeñan un cometido fundamental en la estabilización de las moléculas proteicas. 
La cadena lateral R de los aminoácidos se extiende hacia fuera de la hélice. Se muestran también el modelo de bolas y varillas y el modelo 
compacto. (B) La estructura secundaria de hoja plegada (3 paralela. En la configuración de hoja plegada 0, el esqueleto de la cadena polipeptídica se 
extiende en una estructura en zigzag. Cuando las cadenas polipeptídicas en zigzag están dispuestas lado a lado forman una estructura que se 
parece a una serie de pliegues. Se muestran también el modelo de bolas y varillas y el modelo compacto.
CONCEPTOS AVANZADOS
COLÁGENO
Los defectos genéticos que afectan al colágeno ilustran la estrecha 
relación entre la secuencia de aminoácidos y la estructura tridimen­
sional. Los colágenos son la familia de proteínas más abundante 
en los mamíferos, llegando a representar cerca de un tercio de las 
proteínas corporales. Son un componente fundamental del tejido 
conjuntivo, como el cartílago, los tendones, la matriz orgánica de 
los huesos y la córnea del ojo.
Comentario. El colágeno contiene un 35% de Gly, un 11 % de Ala 
y un 21 % de Pro e Hyp (hidroxiprolina). La secuencia de aminoáci­
dos en el colágeno generalmente es una unidad tripeptídica repe­
tida (Gly-Xaa-Pro o Gly-Xaa-Hyp), donde Xaa puede ser cualquier 
aminoácido e Hyp = hidroxiprolina. Esta secuencia repetida adopta 
una estructura helicoidal levógira con tres residuos por vuelta. Tres 
de estas hélices se enrollan una alrededor de la otra formando una 
triple hélice dextrógira. La molécula de tres filamentos resultante 
se denomina tropocolágeno. Las moléculas de tropocolágeno se 
autoagrupan formando fibrillas de colágeno y se empaquetan para 
formar fibras de colágeno. Existen trastornos metabólicos y genéti­
cos que son resultado de anomalías del colágeno. El escorbuto, la 
osteogénesis imperfecta (cap. 28) y el síndrome de Ehlers-Danlos 
son resultado de defectos en la síntesis y/o el entrecruzamiento 
del colágeno.
Estructura terciaria de las proteínas
La estructura terciaria de una proteína está determinada 
por las interacciones entre los grupos funcionales 
de la cadena lateral, incluyendo además a los puentes 
disulfuro, los puentes de hidrógeno, los puentes salinos 
y las interacciones hidrofóbicas
Se denomina estructura terciaria de una proteína a su conformación 
tridimensional, plegada y biológicamente activa. Esta estructura refleja 
la forma global de la molécula y por lo general consta de varias unidades 
pequeñas de menor tamaño también plegadas denominadas domi­
nios. La estructura terciaria de las proteínas se determina mediante 
cristalografía de rayos X y espectroscopia de resonancia magnética.
La estructura terciaria tridimensional de una proteína está es­
tabilizada por interacciones entre grupos funcionales de las cade­
nas laterales: puentes disulfuro covalentes, enlaces de hidrógeno, 
puentes salinos e interacciones hidrofóbicas (fig. 2.8). Las cadenas 
laterales de triptófano y arginina sirven como donadores de hi­
drógeno, mientras que la asparagina, la glutamina, la serina y la 
treonina pueden servir tanto de donadores como de aceptares de hi­
drógeno. La lisina, el ácido aspártico, el ácido glutámico, la tirosina 
y la histidina también pueden servir de donadores y de aceptares en 
la formación de pares iónicos (puentes salinos). Dos aminoácidos 
de carga opuesta, como el glutamato con un grupo carboxilo 7 y 
la lisina con un grupo amino e, pueden formar un puente salino, 
principalmente en la superficie de las proteínas (v. fig. 2 .8).
CAPÍTULO 2 Aminoácidos y proteínas 13
1. Puentes disulfuro Cysí-S-S-)Cys
CONCEPTOS AVANZADOS
LUXACIÓN DEL CRISTALINO 
EN LA HOMOCISTINURIA 
(INCIDENCIA: 1:200.000)
La manifestación ocular más frecuente de la homocistinuria (cap. 19), 
un defecto en el metabolismo de los aminoácidos que contienen azufre, 
es la luxación del cristalino, que tiene lugar alrededor de los 10 años. 
La fibrilina, que se encuentra en las fibras que sustentan el cristalino, es 
rica en residuos de cisteína. Se necesitan puentes disulfuro entre estos 
residuos para el entrecruzamiento y estabilización de la proteína y de la 
estructura delcristalino. La homocisteína, un intermediario metabólico 
homólogo de la cisteína, puede alterar estos puentes mediante un 
intercambio de disulfuro que depende de la homocisteína.
Otra alteración igualmente infrecuente causada por alteraciones de 
aminoácidos que contienen azufre es el déficit de sulfito oxidasa, que 
también se asocia a luxación del cristalino por un mecanismo similar 
(normalmente se presenta al nacer, con convulsiones precoces resistentes 
al tratamiento). El síndrome de Marfan, asociado también a luxación del 
cristalino, guarda relación con mutaciones en el gen de la fibrilina (cap. 29).
Fig. 8 Elementos de la estructura terciaria de las proteínas. Ejem­
plos de las interacciones de las cadenas laterales de los aminoácidos que 
contribuyen a la estructura terciaria.
Compuestos como la urea y el clorhidrato de guanidina provo­
can con frecuencia la desnaturalización o pérdida de la estructura 
secundaria y terciaria cuando se encuentran a concentraciones 
elevadas como, por ejemplo, 8 mol/1 de urea. Estos reactivos se 
denominan desnaturalizantes o agentes caotrópicos.
La estructura cuaternaria de las proteínas 
está formada por interacciones 
entre cadenas peptídicas
La estructura cuaternaria de proteínas con múltiples 
subunidades está determinada por interacciones covalentes 
y no covalentes entre las superficies de las subunidades
La estructura cuaternaria hace referencia a un complejo o un en­
samblaje de dos o más cadenas peptídicas que se mantienen unidas
Fig. 2.9 Estructura tridimensional de una proteína dimérica. Es­
tructura cuaternaria de la Cu,Zn-superóxido dismutasa de espinaca. 
La Cu,Zn-superóxido dismutasa tiene una estructura dimérica, con un 
monómero con una masa molecular de 16.000 Da. Cada subunidad 
consta de ocho hojas p antiparalelas denominadas estructura en barril 0 , 
por su similitud con motivos geométricos encontrados en tejidos y alfa­
rería griega y de los indígenas americanos. El arco rojo indica un puente 
disulfuro. Cortesía del Dr. Y. Kitagawa.
por interacciones no covalentes o, en algunos casos, covalentes. En 
general, la mayoría de las proteínas mayores de 50 kDa constan 
de más de una cadena y se conocen como proteínas diméricas, 
triméricas o multiméricas. Muchas proteínas que contienen varias 
subunidades están compuestas por diferentes tipos de subunida­
des funcionales, como las subunidades reguladoras y las 
catalíticas. La hemoglobina es una proteína tetramérica (cap. 5) 
y la ATPasa mitocondrial del corazón de vaca tiene 10 protómeros 
(cap. 9). La unidad más pequeña se denomina monómero o sub­
unidad. La figura 2.9 ilustra la estructura de la proteína dimérica 
cobre-zinc superóxido dismutasa. La figura 2 .10 muestra una 
visión general de las estructuras primaria, secundaria, terciaria 
y cuaternaria de una proteína tetramérica.
PURIFICACION Y CARACTERIZACION 
DE LAS PROTEÍNAS
La purificación proteica es un proceso de múltiples 
pasos basado en el tamaño, la carga, la solubilidad 
y la capacidad de unión de ligandos
Los procedimientos de purificación proteica permiten la separación 
de las proteínas basándose en la carga, el tamaño, las propieda­
des de unión y la solubilidad. La caracterización completa de la 
proteína requiere conocer su composición de aminoácidos y sus 
estructuras primaria, secundaria y terciaria completas, y, en las 
proteínas multiméricas, su estructura cuaternaria.
Para caracterizar una proteína, primero es necesario purificar la 
proteína separándola de otros componentes en mezclas biológicas 
complejas. La fuente de las proteínas normalmente es la sangre
o los tejidos, o células microbianas como bacterias y levaduras. 
Primero, las células o tejidos se rompen mediante troceado u homo- 
geneización en disoluciones isotónicas tamponadas, normalmente 
a pH fisiológico y a 4 °C para minimizar la desnaturalización de la 
proteína durante la purificación. El «extracto crudo» que contiene 
orgánulos, como el núcleo, mitocondrias, lisosomas, microsomas y 
fracciones citosólicas, puede fraccionarse posteriormente mediante 
centrifugación a alta velocidad o mediante ultracentrifugación.
14 CAPÍTULO 2 Aminoácidos y proteínas
H H 0 H H 
I I II I I II 
— N - C - C - N - C - C
I I
R R
0 H 
II I 
N-
Fig.o 10 Estructuras primaria, secundaria, ter­
ciaria y cuaternaria. (A) La estructura primaria 
está compuesta por una secuencia lineal de resi­
duos aminoácidos de proteínas. (B) La estructura 
secundaria indica la disposición espacial local del es­
queleto polipeptídico dando una hélice a extendida 
o la estructura de hoja plegada p como representa 
la cinta. Los puentes de hidrógeno entre los grupos 
amida NH y C = O del esqueleto estabilizan la hélice. 
(C) La estructura terciaria ilustra la conformación 
tridimensional de una subunidad de la proteína, 
mientras que la estructura cuaternaria (D) indica el 
ensamblaje de múltiples cadenas de polipéptidos en 
una proteína tetramérica intacta.
CONCEPTOS AVANZADOS
MODIFICACIONES 
POSTRADUCCION ALES 
DE LAS PROTEÍNAS
La mayoría de las proteínas sufren alguna forma de modificación enzi- 
mática después de la síntesis de la cadena peptídica. Las modificaciones 
«postraduccionales» se realizan mediante enzimas procesadoras en el 
retículo endoplasmático, el aparato de Golgi, los gránulos secretores y 
el espacio extracelular. Las modificaciones consisten en fragmentación 
proteolítica, glucosilación, lipidación y fosforilación. La espectrometría 
de masas es una herramienta potente para detectar dichas modifica­
ciones y se basa en las diferencias en la masa molecular (v. cap. 35).
Las proteínas fuertemente unidas a otras biomoléculas o membranas 
pueden solubilizarse utilizando disolventes orgánicos o detergentes.
Precipitación mediante desalinización 
(«salting out» o fraccionamiento mediante 
sulfato de amonio) y ajuste del pH
La solubilidad de una proteína depende de la concentración 
de sales disueltas
La solubilidad de una proteína puede incrementarse añadiendo sal 
a baja concentración (salinización, «salting in») o disminuirse aña­
diendo una concentración elevada de sal (precipitación mediante 
desalinización, «salting out»). Cuando se añade sulfato de amonio, una 
de las sales más solubles, a una disolución de una proteína, algunas 
proteínas precipitan a una concentración concreta de sal, mientras que 
otras no precipitan. Las inmunoglobulinas séricas humanas pueden
precipitar al añadir (NH^SC^ saturado al 33-40%, mientras que la 
albúmina permanece soluble. La concentración saturante de sulfato de 
amonio es de aproximadamente 4,1 mol/1. La mayoría de las proteínas 
precipitarán en una disolución de (NH4)2S04 saturado al 80%.
Las proteínas también pueden precipitar en una disolución 
ajustando el pH. Por lo general, las proteínas son menos solubles 
en su punto isoeléctrico (pl). A este valor de pH, la proteína carece 
de carga neta o de repulsión de cargas entre las subunidades. Las 
interacciones hidrofóbicas entre las superficies proteicas pueden 
conllevar agregación y precipitación de la proteína.
Separación basada en el tamaño
Diálisis y ultrafiltración
Las moléculas pequeñas, como las sales, pueden separarse 
de las disoluciones de proteínas mediante diálisis 
o ultrafiltración
La diálisis se realiza añadiendo la disolución de proteína y sal a un 
tubo de membrana semipermeable (normalmente una membrana 
de nitrocelulosa o colodión). Cuando el tubo se sumerge en una 
disolución tamponada diluida, las moléculas pequeñas pasarán a 
través de la membrana y las moléculas proteicas quedarán reteni­
das en el tubo, dependiendo del tamaño del poro de la membrana 
de diálisis. Este procedimiento es particularmente útil para separar 
el (NH4)2S04 u otras sales durante la purificación de la proteína, 
dado que las sales interferirán en la purificación de las proteínas 
mediante cromatografía de intercambio iónico (v. más adelante). 
La figura 2.11 ilustra la diálisis de proteínas.
La ultrafiltración ha reemplazado en gran medidaa la diálisis para 
la purificación de proteínas. Esta técnica utiliza presión para forzar el 
paso de una disolución a través de una membrana semipermeable
CAPÍTULO 2 Aminoácidos y proteínas 15
con un tamaño de poros definido y homogéneo. Seleccionando 
el valor adecuado de discriminación del peso molecular (tamaño 
del poro del filtro), las membranas permitirán que el disolvente y 
los solutos de peso molecular más bajo atraviesen la membrana, 
formando el filtrado, mientras que las proteínas de mayor peso mole­
cular quedarán retenidas en la solución que no puede pasar el filtro. 
La ultrafiltración puede utilizarse para concentrar disoluciones de 
proteínas o para llevar a cabo la diálisis mediante un continuo reem­
plazo del tampón en el compartimento de retención.
Fig. 11 Diálisis de proteínas. Las proteínas y los compuestos de masa 
molecular baja son separados por diálisis según su tamaño. (A) Una 
disolu­ción de proteínas con sales se coloca en un tubo de diálisis en 
un recipiente y se dializa agitándola en un tampón apropiado. (B) La 
proteína queda retenida en el tubo de diálisis, mientras que las sales se 
intercambiarán a través de la membrana. Si se utiliza un gran volumen 
de tampón externo y se va reemplazando ocasionalmente el tampón, la 
proteína también será intercambiada hacia la solución amortiguadora 
externa.
Filtración en gel (tamizado molecular)
La cromatografía de filtración en gel separa las proteínas 
según el tamaño
La cromatografía de filtración en gel usa una columna de polímeros 
insolubles pero altamente hidratados, como los dextranos, la agaro- 
sa o la poliacrilamida. La cromatografía de filtración en gel depende 
de la diferente migración de solutos disueltos a través de geles 
que tienen poros de tamaños definidos. Esta técnica se utiliza con 
frecuencia para la purificación de proteínas y para la desalinización 
de disoluciones de proteínas. La figura 2.12 describe el principio de 
la filtración en gel. Existen en el mercado geles elaborados con 
perlas de polímeros de carbohidratos como dextranos, (series 
de Sephadex), poliacrilamida (series de BioGel P) y agarosa (series de 
Sepharose), respectivamente. Los geles varían en el tamaño del poro 
y se pueden escoger los materiales de filtración en gel de acuerdo 
con el intervalo de peso molecular deseado en el fraccionamiento.
Cromatografía de intercambio iónico
Las proteínas se unen a matrices de intercambio iónico 
en función de las interacciones entre cargas
Cuando un ion o una molécula cargada con una o más cargas 
positivas se intercambia con otro compuesto cargado positiva­
mente unido a una fase inmovilizada cargada negativamente, el 
proceso se denomina intercambio catiónico. El proceso inverso se 
denomina intercambio amónico. El intercambiador de cationes car- 
boximetilcelulosa (-0-CH 2-C 00“) y el intercambiador de aniones
Número de fracción
Fig. 12 Fraccionamiento de las proteí­
nas por el tamaño: cromatografía de las 
proteínas mediante filtración en gel. 
Las proteínas con diferentes tamaños mole­
culares son separadas mediante filtración en 
gel según su tamaño relativo. La proteína más 
pequeña entra más fácilmente en las bolas de 
polímeros, mientras que las proteínas más 
grandes pueden ser completamente ex­
cluidas. Las moléculas más grandes fluyen 
más rápidamente a través de esta columna, 
consiguiéndose un fraccionamiento según 
el tamaño molecular. El cromatograma de la 
derecha muestra un fraccionamiento teórico 
de tres proteínas, Pr,-Pr3, de peso molecular 
decreciente.
CAPÍTULO 2 Aminoácidos y proteínas
Mezcla de proteínas
© ® % ®
© © 0 
© © ©
© (+) © ®
Las proteínas cargadas 
positivamente fluyen a través — © © (j> 
de la columna
Fig. 13 Fraccionamiento de proteínas por la carga: cromatografía 
de intercambio iónico. Las mezclas de proteínas pueden separarse 
mediante cromatografía de intercambio iónico según sus cargas netas. 
Las bolas que tienen enlazados grupos con carga positiva se denominan 
intercambiadores de aniones, mientras que las que tienen grupos con 
carga negativa son intercambiadores de cationes. Esta figura muestra 
una columna de intercambio de aniones. Las proteínas cargadas nega­
tivamente se unen a las bolas cargadas positivamente y las proteínas 
cargadas positivamente fluyen a través de la columna.
dietilaminoetil (DEAE) celulosa [-O ^ H ^ N E P ̂ H ^ ] se utilizan 
con frecuencia para la purificación de proteínas. Considérese la 
purificación de una mezcla de proteínas que contiene albúmina e 
inmunoglobulina. A un pH de 7,5, la albúmina (con un pl de 4,8) 
está cargada negativamente; la inmunoglobulina con un pl de 
aproximadamente 8 está cargada positivamente. Si la mezcla se 
aplica a una columna de DEAE a un pH de 7, la albúmina se une 
a la columna de DEAE cargada positivamente, mientras que la 
inmunoglobulina pasa a través de la columna. La figura 2.13 ilus­
tra el principio de la cromatografía de intercambio iónico. Al igual 
que en la cromatografía de filtración en gel, las proteínas pueden 
separarse según las pequeñas diferencias en su pl. Normalmente 
las proteínas adsorbidas son eluidas con un gradiente for­
mado a partir de dos o más disoluciones con distinto pH y/o 
distintas concentraciones de sal. De esta forma, las proteínas 
son eluidas gradualmente de la columna y se resuelven según su pl.
Cromatografía de afinidad
La cromatografía de afinidad purifica las proteínas 
basándose en las interacciones con ligandos
La cromatografía de afinidad es un método conveniente y específico 
para la purificación de proteínas. Una columna de cromatografía 
con una matriz porosa es derivatizada con un ligando que se une a 
una proteína específica que se encuentra en una mezcla compleja. 
La pro teína de interés se unirá de forma selectiva y específica al 
ligando, y las otras pasarán a través de la columna. La proteína 
unida se puede eluir posteriormente mediante alta concentración 
de sal, mediante desnaturalización suave o mediante una forma 
soluble del ligando o de análogos del ligando (v. cap. 6).
Determinación de la pureza y del peso 
molecular de las proteínas
La electroforesis en gel de poliacrilamida en dodecil sulfato 
sódico puede usarse para separar proteínas basándose 
en la carga
La electroforesis puede utilizarse para separar una amplia variedad 
de moléculas cargadas, como aminoácidos, polipéptidos, proteínas 
y ADN. Cuando se aplica una corriente a moléculas disueltas en 
amortiguadores diluidos, las moléculas con una carga neta nega­
tiva al pH seleccionado migran hacia el ánodo y las que tienen una 
carga neta positiva, hacia el cátodo. Para minimizar la difusión y 
convección se utiliza normalmente un soporte poroso, como papel, 
acetato de celulosa o un gel polimérico.
Al igual que la cromatografía, la electroforesis puede utilizarse para 
el fraccionamiento preparativo de proteínas a pH fisiológico. Las distin­
tas proteínas de la disolución se moverán a diferentes velocidades en el 
campo eléctrico, dependiendo del valor del cociente carga/masa para 
cada molécula. El dodecil sulfato de sodio (SDS), un detergente des­
naturalizante, se suele utilizar en un sistema de electroforesis en gel de 
poliacrilamida (PAGE) para separar y resolver subunidades proteicas 
según su peso molecular. El preparado proteico suele tratarse con SDS 
y un reactivo tiol, como el P-mercaptoetanol, para reducir los puentes 
disulfuro. Debido a que la unión del SDS es proporcional a la longitud 
de la cadena peptídica, cada molécula proteica tiene el mismo cociente 
masa/carga y la movilidad relativa de la proteína es proporcional a 
la masa molecular de la cadena polipeptídica. La variación del estado 
de entrecruzamiento del gel de poliacrilamida proporciona selectividad 
para proteínas de pesos moleculares diferentes. Un preparado proteico 
purificado puede analizarse fácilmente para determinar su homoge­
neidad en SDS-PAGE mediante tinción con colorantes sensibles y es­
pecíficos, como el azul de Coomassie,o mediante la técnica de tinción 
con plata, como se muestra en la figura 2.14.
Isoelectroenfoque (IEF)
El isoelectroenfoque se utiliza para separar proteínas 
según su punto isoeléctrico
El isoelectroenfoque (IEF) se realiza en un microcanal o un gel que 
contiene un gradiente de pH estabilizado. Una proteína aplicada al
CONCEPTOS AVANZADOS
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA 
DE ALTO RENDIMIENTO (HPLC)
La HPLC (del inglés high-performance liquid chromatography) es 
una técnica cromatográfica útil para la separación de alta resolución 
de proteínas, péptidos y aminoácidos. El principio de separación 
puede estar basado en la carga, el tamaño o la hidrofobicidad de las 
proteínas. Las columnas son muy estrechas y son empaquetadas con 
una matriz no comprimible de bolitas de sílice rodeada por una fina 
capa de una fase estacionaria. Se aplica una mezcla de proteínas a 
la columna y a continuación los componentes son eluidos mediante 
cromatografía ¡socrática o de gradiente. Los eluidos se monitorizan 
mediante absorción ultravioleta, índice de refracción o fluorescencia. 
Esta técnica proporciona una separación de alta resolución.
CAPÍTULO 2 Aminoácidos y proteínas 17
A B C D E
kDa
94 —
67 —
43 —
30----
Fig. 14 SDS-PAGE. La electroforesis en gel de poliacrilamida en 
presencia de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) se usa para separar 
proteínas según sus pesos moleculares. Las moléculas más grandes se 
retrasan en la matriz del gel, mientras que las más pequeñas se mueven 
más rápidamente. El carril A contiene proteínas estándar con masas 
moleculares conocidas (indicadas en kDa a la izquierda). Los carriles B, C, 
D y E muestran los resultados del análisis por SDS-PAGE de una proteína 
en varios estadios de purificación: B, proteína total aislada; C, precipitado 
de sulfato de amonio; D, fracción de la cromatografía de filtración en 
gel; E, proteína purificada de una cromatografía de intercambio iónico.
sistema se cargará positiva o negativamente, según su composición 
de aminoácidos y el pH del ambiente. Al aplicar una corriente, la 
proteína se moverá hacia el ánodo o hacia el cátodo hasta encon­
trar la parte del sistema que corresponde a su pl, donde la proteína 
no tiene carga y dejará de migrar. El IEF se usa junto con el SDS- 
PAGE para la electroforesis en gel bidimensional (fig. 2.15). 
Esta técnica es particularmente útil para el fraccionamiento de 
mezclas complejas de proteínas para el análisis proteómico.
ANÁLISIS DE LA ESTRUCTURA 
PROTEICA
En la figura 2.16 se resumen los pasos característicos en la purifi­
cación de una proteína. Una vez purificada, para la determinación 
de su composición de aminoácidos, la proteína es sometida a hi­
drólisis, normalmente en HC16 mol/1 a 110 °C en un tubo sellado 
y al vacío durante 24-48 horas. En estas condiciones, el triptófano, 
la cisterna y la mayor parte de la cistina son destruidos, y la glu­
tamina y la asparagina son desaminadas cuantitativamente para 
dar glutamato y aspartato, respectivamente. La recuperación de la 
serina y la treonina es incompleta y disminuye con el incremento 
del tiempo de hidrólisis.
Para la determinación del triptófano, pueden utilizarse pro­
cedimientos de hidrólisis alternativos, mientras que la cisterna y 
la cistina pueden convertirse en ácido cisteico estable antes de la 
hidrólisis. Tras la hidrólisis, los aminoácidos libres se separan en 
un analizador automático de aminoácidos utilizando una columna 
de intercambio iónico o, después de la derivatización previa a la
m m
_ _
pH=4 pH=7 
< -------------------------- IEF ------------------------ ►
Fig. 15 Electroforesis en gel bidimensional. (parte superior) Paso 1: 
a la muestra que contiene las proteínas se le aplica un gel de isoelec- 
troenfoque dentro del gradiente de pH. Paso 2: cada proteína migra 
hacia la posición en el gel correspondiente a su punto isoeléctrico (pl). 
Paso 3: el gel de IEF se coloca horizontalmente en lo alto de una capa 
de gel. Paso 4: las proteínas se separan mediante SDS-PAGE según su 
peso molecular (PM). (parte inferior) Ejemplo típico de 2D-PAGE. Un 
homogenado de hígado de rata se fraccionó mediante 2D-PAGE y las 
proteínas se detectaron mediante tinción con plata.
columna con reactivos coloreados o fluorescentes, mediante HPLC 
de fase reversa. Los aminoácidos libres fraccionados mediante la 
cromatografía de intercambio iónico son detectados por la reac­
ción con un reactivo cromógeno o fluorógeno, como la ninhidrina 
o el cloruro de dansilo, el reactivo de Edman (v. más adelante) o 
el o-ftalaldehído. Estas técnicas permiten medir cada aminoácido 
en cantidades tan pequeñas como 1 pmol. En la figura 2 .17 se 
muestra un patrón de elución típico de los aminoácidos en una 
proteína purificada.
CAPÍTULO 2 Aminoácidos y proteínas
Homogeneización/extracción
Desalinización/diálisis y concentración
Intercambio iónico y cromatografía de filtración en gel
CONCEPTOS AVANZADOS
EL PROTEOMA
El proteoma se define como el conjunto completo de proteínas 
producidas por un genoma particular. Los cambios en los proteo- 
mas hísticos y celulares se producen en respuesta a señales hormona­
les durante el desarrollo y al estrés ambiental. La proteómica se define 
como la comparación cualitativa y cuantitativa de los proteomas bajo 
diferentes condiciones. Para analizar el proteoma de una célula, las 
proteínas son extraídas y se someten a electroforesis bidimensional en 
gel de poliacrilamida (2D-PAGE). Las manchas proteicas individuales 
se identifican mediante tinción, y posteriormente se extraen y se 
digieren con proteasas. Los péptidos pequeños obtenidos en el gel 
se secuencian mediante espectrometría de masas, lo que permite 
la identificación de la proteína. En la figura 2.15 se muestra el análisis 
característico de un extracto de hígado de rata. En la electrofo­
resis bidimensional diferencial en gel (DIGE) pueden compararse 
dos proteomas marcando sus proteínas con diferentes tinciones 
fluorescentes (p. ej., rojo y verde). Las proteínas marcadas se mezclan 
y se fraccionan mediante 2D-PAGE. Las proteínas presentes en los 
dos proteomas aparecerán como manchas amarillas, mientras que 
las proteínas presentes en un solo proteoma serán rojas o verdes, 
respectivamente (v. cap. 36).
Determinación de la estructura primaria 
de las proteínas
Históricamente, el análisis de la secuencia de las proteínas 
se llevaba a cabo mediante métodos químicos; 
en la actualidad, tanto el análisis secuencia1
Degradación proteolítica
Purificación y secuenciación de péptidos
Fig. 2.16 Estrategia para la purificación de proteínas. La purificación 
de una proteína supone una secuencia de pasos en los que las proteínas 
contaminantes se eliminan a partir de la diferencia de tamaño, carga 
e hidrofobicidad. La purificación se monitoriza mediante SDS-PAGE 
(v. fig. 2.14). La secuencia primaria de la proteína puede determinarse me­
diante la degradación de péptidos de Edman automatizada (v. fig. 2.18). 
La estructura tridimensional de la proteína puede determinarse mediante 
cristalografía de rayos X.
Tiempo de retención (min)
Fig. 17 Cromatograma característico a partir de un análisis de 
aminoácidos mediante cromatografía de intercambio catióni-
co. Una proteína hidrolizada se aplica a la columna de intercambio de 
cationes en un tampón diluido a un pH ácido (=3,0), al cual todos los 
aminoácidos están cargados positivamente. Los aminoácidos son eluidos 
mediante un gradiente de pH y de concentración de sales creciente. 
Los aminoácidos aniónicos (ácidos) eluyen primero, seguidos por los ami­
noácidos neutros y básicos. Los aminoácidos son derivatizados mediante 
una reacción posterior de la columna con un componente fluorógeno, 
como el o-ftalaldehído.
como la identificación de las proteínas se realiza 
mediante espectrometría de masas
La información sobre la secuencia primaria de una proteína es esen­
cial para comprender sus propiedades funcionales, la identificación 
de la familia a la que pertenece y la caracterizaciónde las proteínas 
imitantes que causan enfermedad. Una proteína puede escindirse 
primero mediante digestión por endoproteasas específicas, como la 
tripsina (cap. 6), la proteasa V8 o la lisil endopeptidasa, para obtener 
fragmentos peptídicos. La tripsina escinde enlaces peptídicos en que el 
C es aportado por arginina y lisina, y siempre que el próximo residuo 
no sea prolina. La lisil endopeptidasa también se utiliza con frecuen­
cia para escindir el fragmento cuando el C es aportado por la lisina. La 
escisión mediante reactivos químicos, como bromuro de cianógeno, 
también resulta útil. El bromuro de cianógeno escinde cuando el C 
es aportado por metionina. Antes de la escisión, las proteínas con 
residuos de cisterna y cistina son reducidas con 2 -mercaptoetanol y 
posteriormente se tratan con yodoacetato para formar residuos de 
carboximetilcisteína. Esto evita la formación espontánea de enlaces 
disulfuro intermoleculares o intramoleculares durante el análisis.
Posteriormente, los péptidos escindidos son sometidos a HPLC 
de fase reversa para purificar los fragmentos peptídicos y después 
son secuenciados en un secuenciador automático de proteínas, 
utilizando la técn ica de degradación de Edman (fig. 2.18). 
La secuencia de péptidos superpuestos se utiliza entonces 
para obtener la estructura primaria de la proteína. La técnica 
de degradación de Edman tiene un interés meramente histórico. 
Actualmente se usa más la espectrometría de masas para obtener 
simultáneamente la masa molecular y la secuencia de polipéptidos 
(cap. 36). Estas técnicas pueden aplicarse directamente a proteínas 
y péptidos recuperados de la electroforesis SDS-PAGE o de la elec­
troforesis bidimensional (IEF más SDS-PAGE).
La secuenciación e identificación de proteínas puede hacerse 
también mediante espectrometría de masas combinada con cromato­
grafía líquida de ionización mediante electropulverización (HPLC- 
ESI-MS/MS) (cap. 36). Esta técnica es suficientemente sensible 
para que las proteínas aisladas por 2D-PAGE (v. fig. 2.15) puedan
CAPÍTULO 2 Aminoácidos y proteínas 19
Fig. 18 Pasos de la degradación de Edman. El método de de­
gradación de Edman extrae secuencialmente un residuo cada vez desde 
el extremo amino de un péptido. El fenilisotiocianato (PITC) convierte el 
grupo amino AMerminal del péptido inmovilizado en un derivado del 
feniltiocarbamil (aminoácido PTC) en disolución alcalina. El tratamiento 
con ácido extrae el primer aminoácido en forma de derivado de la fenil- 
tiohidantoína (PTH), que se identifica mediante HPLC.
recuperarse del gel para el análisis. La tripsina puede digerir in situ 
menos de 1 |xg de proteína por mancha; a continuación puede ex­
traerse del gel e identificarse según su secuencia de aminoácidos. Esta 
técnica, así como una técnica complementaria llamada MALDI-TOF 
MS/MS (del inglés, Matrix-assisted Laser Desorption Ionization-time of 
flight) (cap. 36), puede aplicarse para determinar el peso molecular 
de las proteínas intactas, así como para el análisis de la secuencia de 
péptidos, obteniendo una identificación inequívoca de una proteína.
Determinación de la estructura 
tridimensional de las proteínas
La cristalografía de rayos X y la espectroscopia 
de RM suelen usarse para determ inar la estructura 
tridimensional de las proteínas
La cristalografía de rayos X se basa en la difracción de los rayos 
X por los electrones de los átomos que forman la molécula. Sin 
embargo, dado que la difracción de los rayos X causada por una 
molécula individual es débil, la proteína debe encontrarse en forma 
de cristal bien ordenado, en el que cada molécula tiene la misma 
conformación en una posición y orientación específicas en una 
matriz tridimensional. A partir de la difracción de un haz colimado 
de electrones, puede calcularse la distribución de la densidad de 
electrones y, por tanto, la localización de los átomos en el cristal 
con el fin de determinar la estructura de la proteína. Para la cris­
talización de las proteínas, el método más usado es el de la gota 
colgante, para el que se necesita un aparato simple que permite 
a una pequeña porción de una disolución de proteína (general­
mente, una gota de 10|xl con un contenido de 0,5-1 mg/proteína) 
evaporarse gradualmente para alcanzar el punto de satura­
ción en el que la proteína empieza a cristalizar. La espectroscopia
CONCEPTOS AVANZADOS
PLEGAMIENTO DE PROTEÍNAS
Para que las proteínas funcionen correctamente deben plegarse 
en la forma correcta. Las proteínas han evolucionado, de manera 
que un plegado es más favorable que todos los demás, recibiendo 
la denominación de estado nativo. Numerosas proteínas ayudan 
a otras en el proceso de plegamiento. Estas proteínas, llamadas 
chaperonas, incluyen las proteínas de «choque térmico», como 
la HSP 60 y la HSP 70, y las proteínas disulfuro isomerasas. Una 
enfermedad del plegamiento de las proteínas es una enfermedad 
que se asocia con una conformación anómala de una proteína. Esto 
ocurre en enfermedades crónicas asociadas con el envejecimiento, 
como la enfermedad de Alzheimer, la esclerosis lateral amiotrófica y 
la enfermedad de Parkinson.
CONCEPTOS CLÍNICOS
ENFERMEDAD DE CREUTZFELDT-JAKOB
Un vaquero de 56 años presentó crisis epilépticas y demencia, y se le 
diagnosticó enfermedad de Creutzfeldt-Jakob, una enfermedad de los 
seres humanos causada por priones. Las enfermedades producidas 
por priones se conocen también con el nombre de encefalopatías 
espongiformes transmisibles. Son enfermedades neurodegenerativas 
que afectan tanto a seres humanos como a animales. En las ovejas y 
las cabras recibe el nombre de encefalopatía espongiforme ovina y en 
las vacas se denomina encefalopatía espongiforme bovina (enfermedad 
de las vacas locas). Estas patologías se caracterizan por la acumulación 
en el cerebro de una isoforma anormal de una proteína codificada por 
el huésped, una forma celular de una proteína priónica (PrPC).
Comentario. Los priones parecen estar compuestos solamente 
de moléculas de PrPSc (forma ovina), que son moléculas con una 
conformación anormal de la proteína normal codificada por el 
huésped. La PrPC tiene un alto contenido de hélice a y está desprovis­
ta de hojas plegadas 0, mientras que la PrPSc tiene un alto contenido 
de hoja plegada (3. La conversión de PrPC en PrPSc representa un 
profundo cambio conformacional. La progresión de las enfermedades 
infecciosas por priones parece conllevar una interacción entre PrPC y 
PrPSc, que induce un cambio conformacional de la PrPC rica en héli­
ce a a la forma PrPSc rica en hojas plegadas (3. La enfermedad 
priónica derivada de PrPSc puede ser genética o infecciosa. Las 
secuencias de aminoácidos de PrPC de diferentes mamíferos son 
similares y la conformación de la proteína es virtualmente la misma 
en todas las especies de mamíferos.
de RM se suele emplear para el análisis estructural de compuestos 
orgánicos pequeños, pero la RM de alto campo también es útil para 
determinar la estructura de una proteína en una disolución y com­
plementa la información obtenida por cristalografía de rayos X.
RESUMEN
■ Los elementos fundamentales de las proteínas son 
20 alfa-aminoácidos. Sus cadenas laterales contribuyen 
a la carga, la polaridad y la hidrofobicidad de cada proteína.
Las proteínas son macromoléculas formadas 
por la polimerización de L-a-aminoácidos mediante 
enlaces peptídicos. La secuencia lineal de los aminoácidos 
constituye la estructura primaria de la proteína.
■ Las proteínas son macromoléculas formadas por la 
polimerización de L-a-aminoácidos. Hay 20 aminoácidos 
diferentes en las proteínas, unidos mediante enlaces 
peptídicos. La secuencia lineal de los aminoácidos
es la estructura primaria de la proteína.
La estructura de orden superior de una proteína 
es el producto de sus estructuras secundaria, terciaria 
y cuaternaria.
■ Estas estructuras de orden superior están formadas por 
puentes de hidrógeno, interacciones hidrofóbicas, puentes 
salinos y enlaces covalentesentre las cadenas laterales
de los aminoácidos.
La purificación y la caracterización de las proteínas son 
procesos cruciales para dilucidar su estructura y su función. 
Las proteínas pueden purificarse hasta la homogeneidad 
mediante diferentes técnicas cromatográficas y 
electroforéticas, aprovechando las diferencias en su tamaño,
solubilidad, carga y capacidad de unión. La masa molecular
APRENDIZAJE ACTIVO
1. El análisis de sangre, orina y tejidos mediante espectrometría de 
masas se aplica actualmente para el diagnóstico clínico. Comentar 
las ventajas de esta técnica con respecto a la especificidad, sensi­
bilidad, rendimiento e intervalo de análisis, incluyendo el análisis 
proteómico con fines diagnósticos.
2. Revisar la importancia del plegamiento defectuoso de las proteínas 
y su depósito en los tejidos en las enfermedades crónicas relacio­
nadas con el envejecimiento.
y la pureza de una proteína, así como su composición de 
subunidades, pueden determinarse mediante SDS-PAGE.
■ El descifrado de las estructuras primaria y tridimensional de 
una proteína mediante métodos químicos, espectrometría 
de masas, análisis de rayos X y espectroscopia de 
resonancia magnética permite conocer la relación 
estructura-función de las proteínas.