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Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp TP 13: Control del Ciclo Celular y Apoptosis El ciclo celular es una serie ordenada de acontecimientos macromoleculares que le suceden a la célula, mediante la cual duplica el material genético y las organela preparándose para una futura división celular, mediante la cual genera dos células hijas que son idénticas genéticamente entre si e idéntica a las células que le dio origen y estas células hijas una vez formadas pueden entrar nuevamente al ciclo de una nueva reproducción o proliferación. Al ciclo celular lo vamos a dividir en dos fases bien delimitadas, una llamada Interfase y otra llamada fase M o de división celular, la cual se divide a su vez en 2 fases de la fase M: una de división nuclear o mitosis y otra de división citoplasmática o citocinesis. La interfase a su vez, se divide en 3 fases: Fase G1, S y G2, y es el periodo de preparación para la siguiente división celular, en el cual la célula crece y duplica el material genético, la duplicación se lleva a cabo en el periodo S de interfase y este es un concepto importante, ya que en la FASE S SE DUPLICA LA CARGA DE ADN NUCLEAR pero el NUMERO de CROMOSOMAS y la PLOIDIA de las células NO CAMBIA. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp ¿Qué es la carga de ADN? La carga de ADN es el contenido de ADN nuclear, el cual se mide en unidades de peso (picogramos 1 pg = 10 ^-12 gramos), también es sabido que los diferentes genomas de las diferentes especies pueden ser de distintos tamaños, hay genomas concisos y hay otros más extensos por lo cual los picogramos del núcleo de una especie pueden ser muy diferentes a los de otros, por eso se generó una expresión universal en donde nos independizamos del valor numérico de los picogramos y atribuimos un valor C a la cantidad de picogramos de ADN presente en el núcleo de las gametas de una especie determinada. ¿Porque elegimos a las gametas? Las gametas son las células nucleadas que tienen la menor cantidad de ADN ya que contiene un único juego de cromosomas, ósea son haploides, y esos cromosomas están constituidos por una única cromatide, ósea una única molécula de ADN. Vale decir que si una gameta masculina, que es haploide, que tiene un único juego de cromosomas, fecunda a una gameta femenina que también es haploide con un juego completo de cromosoma y cada una tiene una carga de 1C, la célula que surge de dicha fecundación ahora va a tener el material genético proveniente de ambas gametas, ósea que va a tener 2 juegos completos de cromosoma y va ser diploide y por tanto si yo peso el ADN de este núcleo ahora voy a darme cuenta que va a pesar el doble de lo que pesaba el ADN del núcleo del espermatozoide o el ADN del núcleo del ovulo. Vale decir que la carga de ADN de esta nueva célula ahora es de 2c. Esta célula 2c, está en condiciones de ingresar al ciclo celular, duplicar su material genético en la fase S, entrar a la fase G2 con el doble de material genético que la célula en el estadio previo (g1), por tanto, luego del periodo S, esta célula tiene una carga de 4C. Todo lo anterior se puede ver en la figura (verde), en un experimento de clasificación de células por densitometría de flujo, donde se encontraban 2 poblaciones diferentes de células, una población con una cantidad de ADN determinado y otra población pequeña que tenía una cantidad de ADN equivalente al doble de la anterior. Ahora con nuestros conocimientos podríamos decir que el primer pico correspondía a células que estaban en fase G1, cuya carga era 2c, el segundo pico correspondía a células que estaban en g2, o fase M, cuya carga era 4c y en el medio teníamos células que tenían una carga intermedia, que estaban transitando la fase S del ciclo celular Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Con todo esto, para verlo más gráfico, vamos a mostrar un ejemplo donde se va a evaluar la ploidía y la carga de distintas células de diferentes especies. En este caso le presento la gameta de 2 especies, una especie A donde su juego cromosómico presenta 40 cromosomas (39 cromosomas autosómicos y 1 cromosoma sexual), el valor de C vale 100 pg y una especie B, cuyo juego de cromosomas es de 15 (14 autosómas y 1 sexual) mientras que el valor de c es de 30 pg. Las gametas van a ser haploides (un único juego de cromosomas) y su carga unitaria de 1C. En el caso de las células somática en G1 de esta especie es diploide, por lo que tendría 2 juegos de cromosomas, representada por los 2 juegos de naipes y la carga es ahora de 2c, por tanto, si yo peso el ADN de esta célula va a pesar el doble que el ADN de la célula antes mencionada. Diploide: 2 juegos de cromosoma, cada uno de 40 cromosomas y 2 c que corresponde a 200 pg, el doble del ejemplo A y en el ejemplo B, 2n= 30 cromosomas y 2C= 60 pg. Por ultimo una célula somática en fase G2, habiendo ya pasado por la fase S, va a haber duplicado. Su carga genética pero no por haber aumentado el número de cromosomas, si no que por haber hecho que sus cromosomas pasasen de estar constituido por una única cromatide, a estar constituido por 2 cromatides. Vale decir que va a seguir teniendo los 2 cromosomas, pero van a estar más pesados, va a ser el doble de lo que pesaba el núcleo anterior, ósea 4c. Acá tenemos los valores numéricos, y SIEMPRE MANTENIENDO EL MISMO NUMERO DE CROMOSOMAS, porque ambas siguen siendo diploides. Por tanto: En FASE S se duplica EL MATERIAL GENETICO (Carga de ADN), pero NO CAMBIA EL NUMERO DE CROMOSOMAS NI LA PLOIDIA. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Teniendo claro los conceptos, ahora podemos analizar la evolución de la ploidia y la carga de ADN a lo largo del ciclo celular: Se tomara como ejemplo una célula somática humana, constituida por 46 cromosomas, 2 juegos completos de 23 cromosomas (22 autosomas y uno sexual c/u), es decir una célula diploide. Se va analizar la evolución de la cantidad de ADN o los picogramas, la carga de ADN, a lo largo de todo el tiempo que dura el ciclo celular. La curva de evolución es más o menos como se ve en la imagen: viendo que tenemos un primer periodo en donde la carga se mantiene constante en un nivel de 2c, que corresponde al periodo G1 donde los cromosomas de las células están constituidos todos por una única croamtide, luego la célula atraviesa el punto de restricción, comienza la síntesis de ADN, ósea la duplicación del material genético, y por eso comienza un periodo de aumento de la carga, que se estabiliza justo cuando se completa la síntesis de ADN y la carga alcanza su valor máximo de 4c, justo el doble de carga inicial. Esa carga se mantiene constante a lo largo de todo el periodo G2 y de la fase M, en donde este cromosoma que ahora están constituidos por 2 cromatidas hermanas unidas por cohesinas, al entrar en anafase se separan y van a formar parte de los núcleos de las células hijas. Por tanto, se van a formar 2 células hijas que van a estar nuevamente en G1, con un numero cromosómico que va a seguir siendo 46, por tanto, van a seguir siendo diploide, pero su carga bajo drásticamente a la mitad para volver a tener su carga inicial y paralelamente un nuevo ciclo. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Dependiendo de las propiedades proliferativas de las células la podemos clasificar en 3 tipos: Renovables, estables y estáticas. Renovables —> Aquellas Capaces de entrar en múltiples ciclos celulares, tener recambio permanente, gracias a que tienen un sistema de control del ciclo celular permanentemente activado. Estables —> Están en estado quiescente o G0, mediante el cual se retiran momentáneamente del cicloy pueden reingresar por factores extracelulares que estimulen la mitosis, por tanto, se rearmando el control del sistema de ciclo celular. Estáticas —> Las cuales están en un estado de diferenciación terminal, que no tiene capacidad proliferativa, se salen por completo del ciclo celular y desmantelan el sistema de control, por tanto, ante una demanda funcional la respuesta NO ES LA PROLIFERACION, si no el crecimiento individual de la célula a través de la hipertrofia Sistema de control del ciclo celular: El SCCC funciona como un reloj y cada uno de los procesos se inicia en el momento adecuado y dura un tiempo fijo. Y el tiempo que dura el ciclo celular completo, en los mamíferos, es muy constante a lo largo de toda la vida del organismo. Los procesos deben darse en el orden correcto y se desencadenan una única vez por ciclo y existen puntos de control que funcionan como interruptores binarios, en donde encienden la posibilidad de avanzar o lo apagan y el ciclo se detiene en ese punto hasta que las condiciones estén siendo las óptimas para poder avanzar. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Características más salientes del ciclo celular: - Robustez: ya que un ciclo funciona correctamente aun cuando algunas partes del sistema funcionen mal. - Adaptable: El ciclo tomara características diferentes según las necesidades de la célula y las condiciones ambientales en las que se encuentre. ¿Cuáles son los puntos de control o interruptores binarios que existen en el ciclo celular de los mamíferos? Son 3: 1. Situado antes del inicio de la duplicación del ADN, lo que se llama “punto de restricción R” o punto de control del inicio, donde la célula chequea que el entorno sea favorable y que el ADN que va a ser replicado no este dañado y si esto se da, entonces el ciclo prosigue, el ADN se duplica y se prepara a la célula para ingresar en la fase de división celular. Y allí, justo antes de entrar a la fase M, se va a encontrar con el segundo punto de control de la transición entre G2 y M; 2. Segundo punto de control entre la fase G2 y M, aquí es donde se va a chequear que el entorno sea favorable y sobre todo que el ADN se haya replicado por completo y que no se haya comenzado a re- replicar. Si esto es así entonces, la división celular continua y se va a frenar justo en el momento en el que los cromosomas van a separar sus cromatides hermanas (3) y van a formar los núcleos de las células hijas, ósea en esta transición entre la metafase y la anafase. Lo fundamental es que se va a chequear en este momento que todos los cromosomas están unidos al huso mitótico y que están preparados para poder separar sus cromatidas. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Componentes del sistema de control del ciclo celular (SCC). Lo primer es analizar los complejos proteicos, entre ellos tenemos: - Complejo Cdk/ciclina: constituido por una serina-treonina - kinasa, que tiene la capacidad de fosforilar multipples sustratos, siendo esta capacidad dependiente de su asociación con otras proteínas llamadas ciclinas. Los niveles proteicos de CdK a lo largo del ciclo celular son muy constates, sin embargo. Los niveles de ciclinas no lo son y presentan Picks a lo largo del ciclo celular, por lo cual las concentraciones de este complejo, van a tener momentos muy precisos a lo largo del ciclo y van a generar acciones muy completas. Asi el complejo Cdk/ciclina G1, es activo al inicio de la fase temprana del G1, gracias a la transcripción de la ciclina D, los niveles de ciclina-D se mantiene constante a lo largo del ciclo celular y decaen a mita de la fase M, sin embargo, la actividad de este complejo es importante. Solo los primeros momentos del ciclo, y la actividad kinasa de este complejo va a estar regulada por fosforilzacion y por unión de un inhibido llamad P16 o Think4. La segunda cíclina es la ciclina-E, que va a formar junto a su CDK correspondiente el complejo CDK/ G1S, que va a presentar un pico de actividad a mitad de la fase G1 y rápidamente va a decaer su concentración antes de comenzar la fase S. La tercer cíclina importate es la A, que comienza su síntesis a mitad de la fase G1, pero su asociación con CDK, formando un complejo activo, se ve a partir del inicio de la fase S y se mantiene activa a lo largo de toda la fase S y G2, decayendo su concentración también al promediar la fase M Por último, la cuarta cíclina es la cíclina B, que va formar junto con la CDK el complejo CDK-M que también va a aumentar la concentración de cíclina lo largo de la fase G2 pero su actividad va a estar circunscrita al inicio, en los primeros momento de la fase M. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Como dijimos anteriormente, el principal regulador de la actividad de los Cdks son los niveles de las cíclinas, que son capaces de asociarse con ellas. Sin embargo, existen niveles secundarios de regulación, y uno de ellos son las modificaciones covalentes (fosforilaciones /desfosforilacion). Asi vamos a tener una: 1. Fosforilacion activadora: que está mediada por las Quinasas activadoras de Cdk, que una vez que se formó el dimero entre Cdk y cíclina y sufrió la Cdk un cambio conformacional que expone un dominio en forma de lazo, puede ser fosforilada por la CAK y activarla completamente. 2. Tambien existes fosforilaciones inhibitorias mediadas por una quinasa llamada quinasaWee1 que fosforila en otro sitio. Por supuesto la desfosforilacion en este sitio, medida por una fosfatasa cdc25, activa al complejo Cdk-ciclina. Este mecanismo de regulación de la actividad por Fosforilación y desfoforilación mediadas por quinasas wee1 y fostasas cdc 25 es el principal regulador del complejo CdK-M. 3. Regulaciones por uniones a proteínas inhibitorias, las CKis, cuyo ejemplo más importante son las p27 y la p 21, estas proteínas se unen al complejo e inhiben su acción. Este mecanismo de regulación va a ser muy importante para los complejos Cdk G1/s y Cdks. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Resumen de composición de cada uno de los complejos de cdk cíclinas, se pude observar que el complejo CdkG1, que si bien actúa en la mayoría de las células (no en todas) y aquellas células que tienen altísimo recambio, carecen de este complejo. Cdk M —> antes era conocido como factor promotor de la mitosis. Para que la cíclica presente perfiles con picks de síntesis y degradación, además de sintetizarse deben ser degradas. En este caso van a ser degradadas o su degradación van a estar mediada por los complejos ubiquitin-ligasa que son reclutadores de ubiquitina que van a permitir su marcación para ser degradada proteolíticamente en los proteosomas. El complejo SCF va a ser el que regule negativamente los niveles de la cíclinas-E en el complejo G1/s y va a hacer que aumente los niveles de las cíclicas S(A) que forma parte del complejo CDK-S (ahora vamos a ver como media este mecanismo). Un segundo complejo de ubiquitin-ligasa, es el APC/C o complejo promotor de anafase o ciclosoma, el cual ubiquinisa a las ciclinas, que se encuentran presente en la célula a la altura de la transicón entre la metafase y de la anafase, ósea que es el regulador de esta transición y degrada entonces a la ciclinas B, como A. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Complejos ubiquitina-ligasas I. El compjeo SCF, es un complejo trimerico que está constituido por 3 proteínas SKP1- CUL1 y proteína de caja F (F-box). Esta última es la que tiene la capacidad de reconocer proteínas fosforiladas, las cuales marca por ubiquitinacion para posterior proteolisis en el proteosoma.El tarjet de esta ubiquitinacion son proteínas CKi que mantenían inhibidas al complejo Cdk-S, por tanto SCF, es el que activa al complejo Cdk-S pre formado, que estaba inhibido por unión a la CPKi o P21. Ademas habíamos dicho que también degradaba las ciclinas E, marcada por la union de cadenas de poliubiquitinas. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp II complejo: Es el APC/C o complejo promotor de la anafase o ciclosoma APC/ C. Es un importante e complejo que tiene dos subunidades activadoras Cdc20 y Cdh1, que pueden interactuar alternativamente. Una de sus funciones muy importantes es la que media la escisión de las cohesinas, que permiten la separación de las cromatides hermanas, que se mantenían unidas en metafase para su separación en la anafase y la formación de los núcleos hijos. Por tanto, como buen complejo ubiquitin- ligasa, lo que va a hacer es ubiquitinisar una proteína llamada segurina que estaba secuestrando a la enzima que digiere a las cohesinas. Esta enzima se llama separasa, vale decir que, el complejo APCC activo, ubiquitiniza ese complejo de segurina, libera la separasa que tiene el poder de degradar a las coesinas y por tanto permitir la transición entre metafase y anafase. Ademas cumple la función de ubiquitinizar a las ciclinas S(a) y M (B) e inactiva los complejos CDK S y M. También al final de la anafase se van activar ciertas fosfatasa que van a desfosforilar todos los sustratos que fueron fosforilados por el complejo CDK M, entonces permitiendo que se complete la mitosis y la citosinesis. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Interruptores binarios del SCC Dijimos que para que comience el ciclo celular era necesario la presencia de factores extracelulares mitogenicos, que permita la activación de Cdk G1, que va a llevar a la síntesis de las ciclinas G1 y E o de la cíclina S A. Estas son las ciclinas que van a formar parte del Cdk G1/S y del complejo Cdk-S, desde allí estaríamos en condiciones de pasar al punto de restricción siempre y cuando hubiéramos chequeado que el ADN que va a ser replicado no tenga daño. Si estuvise dañado, se resta el ciclo celular en este punto y hasta que no se repare el ADN no se avanza. Si las condiciones están dadas, la duplicación del ADN se va a llevar a cabo, vamos a ingresar a la fase G2, van a aumentar las concentraciones de cíclica D, se va a chequear que no comience una nueva ronda de replicaron de ADN, ósea se va evitar la doble replicaron del ADN y si podemos chequear que el ADN no este dañado y que no existe ninguna porción de ADN que no fuera replicado, vamos a poder proceder, pasando por el punto de control de la transición G2M a la división celular donde vamos a activar al complejo APC/C que era el encargado de permitir la transición entre la metafase y la anafase, y para ello vamos a tener que chequear que los cromosomas estén unidos perfectamente al huso mitótico en metafase para poder ser separados en la anafase y culminar con la división celular. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp FASE G1 Temprana Cuando las células vienen del ciclo anterior y el APC/c está activo, manteniendo activo el nivel de fosfatasa y manteniendo bajo el nivel de ciclinas, no hay actividad de ningún complejo cdk y si además si hubiese algún complejo CDK dando vuelta, las proteínas “CKI” p27 y p21 están activas por lo cual las secuestrarían. En este momento en el ADN se empiezan a formas los complejos de pre replicación con las proteínas desfosforiladas e inactivas, pero ya pre formadas. Y además la célula crece. Dijimos que para la que la célula progrese en el ciclo celular, era necesario la presencia de factores extracelulares mitogenicos que estimularan al complejo Cdk G1, eliminando los controles intracelulares negativos que bloqueaban la progresión del ciclo celular. Existen otros tipos de factores de crecimiento que pueden incidir sobre la vida celular como los factores de crecimiento que inducen la síntesis de proteínas y de otras macromoléculas, sin inducir la división celular. O factores de supervivencia (próximo video, apoptosis), que estimulan la supervivencia celular inhibiendo la apoptosis (muerte celular programada). Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Veamos entonces como hacen los mitogenos para promover la entrada al ciclo celular lo van a hacer mediante la inactivación de proteínas llamadas factores supresores de tumores. Entonces el mitógeno va a impactar sobre su receptor en la membrana de la célula, que va a emitir una señal que va a ser transducida a dentro de la célula a través de la activación de Mapk-quinasas que van a llevar al aumento de una proteína reguladora de la expresión genica que a su vez va a desencadenar la expresión de genes de regulación tardía. Todo está vía hace que se active el complejo CDK G1 y este va a fosforilar a una proteína diana por excelencia, la proteína “Rb”, un factor supresor de tumor muy importante. Rb lo que hacía es estar secuestrando a un factor de transcripción, el “E2F”, que cuando es fosforilada por CDK-G1 se libera y entonces E2F ahora puede transcribir, puede mediar la transcripción de numerosos genes que tiene que ver con proteínas de control del ciclo celular, entre ellas están las ciclinas E y A, las primeras ciclinas E, que son transcritas y forman complejo con su CDK correspondiente y pueden fosforilar en diversos puntos a Rb, aumentado la respuesta de manera positiva, mediante una retroalimentación positiva de la vía. Vale decir que por acción del mitogeno se activó el CdKG1, fosforilo a proteína Rd y permitió la síntesis de ciclinas de los complejos CdK G1/S y Cdk (S). Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Otro factor supresor de tumor muy importante es la proteína P53, que se estimula ante el daño del ADN. Le habíamos mencionado que el daño del ADN era una señal negativa hacia el progreso del ciclo celular, entonces cuando se daña el adn se activan ciertas quinasas como la ATM o ATR o las CHK, que terminan fosforilando a la proteína P53 que estimula la expresión del gen P21 y P21, el producto de su traducción es una CKi que puede secuestrar los complejos CDK s y CDK G1s con lo cual ante el daño del ADN se activa P53 que activa los inhibidores de los CDK y arresta al ciclo celular. Entonces P53 es otro factor supresor de tumor que se estimula ante la aparición de daño en el ADN y que puede promover la detención del ciclo celular como vamos a ver en el video siguiente puede promover la entrada de la apoptosis y por tanto puede despertar los mecanismos de reparación del ADN. Tambien P53 es estimulado cuando hay un exceso en la estimulación por mitogenos y hay una gran actividad de la vía de la proteína Myc y entonces también regulan negativamente esta actividad desmedida del ciclo celular. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Celulas Cancerosas Estas proteínas Rb y p53 que pueden arrestar al ciclo celular, son supresoras de tumores porque tiene mucho que ver con el cáncer y el comportamiento de las células cancerosas. Las células cancerosas se caracterizan por reproducirse eludiendo las restricciones del ciclo celular y además pueden poseer la capacidad de invadir y colonizar territorios reservados a otras células lo cual las hace o las carga de malignidad. En la imagen se ve un cáncer que ha generado metástasis en un montón de tejidos. Existen 2 tipos de genes críticos del cáncer: 1. Supresores de tumores, ya mencionados Rb y p53, que si sufren mutacionesque hacen que disminuya su producción, entonces esas células van a estar susceptibles a entrar a sucesivos ciclos celulares y entonces generar cáncer. 2. Pro- oncogenes: son genes normales que codifican por lo general algunos de los componentes para el control del ciclo celular, pero que cuando mutan y esta mutación llevan a un aumento del producto de su expresión, decimos que desencadenan el cáncer. Entonces, cuando un proto-oncogen muta, pasa a llamarse oncogén y un ejemplo de ello pueden ser los genes Ras, las ciclinas D o cualquier otro factor que promueva el ingreso al ciclo celular. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Además de los factores mitogénicos también mencionamos a los factores de crecimiento y dijimos que estos factores en vez de promover la proliferación celular lo que hacían era promover el crecimiento y la síntesis proteica a través de la actividad de diferentes cascadas de reacción como pueden ser la vía de M de TOR. El tercer tipo de factor extracelulares que podrían tener influencia sobre la vida celular eran los factores de supervivencia y si combinamos los distintos factores entonces podemos entender los distintos destinos de las células: Supóngase una célula que reciba la influencia de factores de supervivencia, entonces esa célula no va a entrar en el programa de muerte celular y va a sobrevivir, ahora si bien esta célula recibe los factores de supervivencia combinados con factores decrecimiento o factores mitogenicos, entonces la célula puede crecer y dividirse. Si recibe otros factores de crecimiento que le impliquen un cambio en el patrón de la expresión génica, va a permitir entonces su diferenciación o la generación de un nuevo tipo celular. Pero si tienen la carencia de los factores de supervivencia, entonces esta célula va a entrar en el programa de muerte programada y terminara suicidándose por apoptosis. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp G1 Medio y Tardio, transicion G1 y S Promediando la fase G1 y llegando a la transición entre G1 y S entonces vamos a tener altos niveles de complejo Cdk G1/S y CdkS, aunque estos no están activos, porque todavía están secuestrados por las proteínas CKi. En este momento, el CDK G1/S fosforilar ciertos componentes del complejo SCF que va a generar sus 2 acciones: Ubiquitinizar los CKi permitiendo la liberación del complejo CDkS y su activación y ademas va a ubiquitinizar a las ciclinas (E) para su degradación, entonces este complejo CdK-S ahora está activo y puede fosforilar a sus proteínas diana. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp El complejo Cdk S activo, va a permitir la transcripción de genes que codifiquen las enzimas responsables para biosíntesis de nucleótidos, va a permitir la síntesis de proteínas de la maquinaria de la replicación del ADN y proteínas propias del sistema de control del ciclo celular, cuyo mayor ejemplo es la cíclica M. Ademas se va a bloquear la re- replicacion, fíjense en los ejemplos de la imagen de fusiones nucleares, entre un núcleo en fase S con un núcleo en fase G1, la presencia de CDk-S activa, hace que rápidamente el núcleo de G1 entre en fase S, mientras que la fusión de un núcleo en fase S y núcleo G2, permite que no se re- reduplique el ADN ya replicado en fase G2 y el núcleo S continua su fase S hasta completar la duplicación del ADN. Ademas se inicia la duplicación del centrosoma y se activan los orígenes de replicacion del ADN. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp La activación del origen de replicacion se va a dar por sucesivas fosfarilaciones mediadas con CdK-S y otras quinazas de las DKK, en distintos componentes del complejo pro- replicativo como la helicasa y otras proteínas accesorias que van a permitir el reclutamiento del ADN polimerasa y el avance de la burbuja o de las horquillas de replicación. La formación del nuevo complejo de reconocimiento de origen fosforilado, va a impedir hasta que se complete la división celular, se vuelva a replicar el ADN a partir de estos orígenes. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp FASE G2 Habiendo culminado la fase S, el ADN está completamente duplicado y cada cromosoma está constituida por dos cromatidas hermanas unidas entre sí por moléculas de cohesinas, los centrosomas también están duplicados y durante la fase G2 se va generando el acumulo de cíclica D formado por los complejos Cdk-M que permanecen inactivos hasta que entremos en mitosis. ¿Cómo es que permanecen inactivos? Sucede que en este momento está activa la quinasa Wee1 que fosforila a la Cdk en el sitio de fosforilacion inhibitorio. FASE M Cuando estamos entrando en la transición entre G2 y M, entonces Cdk-S es capaz de fosforilar a la fosfatasa CDC-21 y esta a desfosforilar al complejo Cdk-M activándolo, generando tambien una retroalimentación positiva con una mayor fosforilacion sobre la fosfatasa y entonces ampliando esta respuesta, lo cual permite que el complejo Cdk-M fosforile diversos sustratos relacionados con la entrada a la fase M, donde se van a separar los centrosomas, se va a Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp formar el huso mitotico, se van a condensar los cromosomas y en este experimento de fusión nuclear vamos a ver como la fusión de un núcleo en fase M con un núcleo en fase G1 o G2, provoca la rapida condensación de los cromosomas en la fase de la interfase. Ademas se desorganizará y disgregara la envoltura nuclear y se generará la interacción entre los cromosomas y el huso mitotico. Si todos los cromosomas están unidos al huso mitotico entonces podremos pasar el último punto control y activar al APC/C. En la figura donde se muestra la actividad de distintos complejos, vemos que el APC/C comienza su actividad promediando la mitosis (a la mitad) en y permanece activo hasta el final de la misma y durante el periodo G1 del ciclo siguiente. Ya habíamos dicho que APC/C tenía dos funciones muy importantes, 1 era la de mediar la destrucción de las cohesinas para poder separar las cromatidas hermanas en la anafase, gracias a la acción de la segurina, que mantenía secuestrada a la separaza que era la enzima que degrada a las cohesinas. Esta acción esta mediada por la APC/C cuando tiene unida la unidad activadora CdC 20. Cuando está unida a la subunidad activadora Cdh1, media la ubiquitinacion de todas la ciclinas que estaban presentes en las celulas en ese momento, limpiando a la célula de la actividad Cdk hacia finales de la anafase, momento en el cual también se activan las fosfatasa, principalmente la Cdc14, que elimina los grupos fosfatos que intodujola cdk-M en los inicios de la fase M y permite el desmontaje de huso mitotico, la descondensacion de los cromosomas y el reensamblaje de la envoltura nuclear. Este complejo APC/C, va a permanecer activo durante la primera parte de la fase G1, impidiendo la fosforilaciones mediadas por Cdk, pero ante la activación del ciclo por la llegada de un mitogeno, la subunidad Cdh1 va a Ser fosforilada y se va a separar de este complejo, y se va a inhibir, permitiendo la entrada a un nuevo ciclo. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Vamos a tener aquí un resumen con las principales proteínas de regulación del ciclo celular, donde tenemos las quinasas, fosfatadas, proteínas activadoras e inhibitorias, ubiquitinas, y otras. Como cierre de la clase, podemos decir que en la etapa temprana de G1 los complejos replicativos del adn se ensamblan en el origen y permanecen inactivos,pero ante la llegada de mitogenos y activación del complejos Cdk G1, la fosforilacion de Rb y a posterior hidrolisis de las ciclinas E y A, permiten la activación del complejo CdK G1-S y que va a inactiva al complejo APC/C que permanecían activos desde el ciclo anterior y ademas va a fosforilar a las Cki que mantenían inhibidas al complejo Cd-S, ese fosfato va a ser a reconocido por la proteína SCF que va a ubiquinisar al Cki y lo va a degradar entonces el complejo Cdk-S va a estar activo y va a fosforilzar a sus tarjet, entre ellos las proteínas del complejo de pre-replicacion permitiendo la duplicación del ADN y la activación de las ciclinas de los complejos Cdk M, gracias a la activación de las fosfatasa Cdc 25 que disparan la fosforilzacion medida por el complejo Cdk- M, de un montan de proteínas que están relacionadas con la entrada de la célula a la fase M y Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp su llegada a la metafase. Cuando las células están en metafase y los cromosomas están perfectamente alineados en el huso, entonces se puede activar al complejo APC/C que degrada la segurina, permitiendo la separación de las cromatidas hermanas y la generación de las células hijas activando las fosfatasa que permitirán el desarrollo de la citocinesis y degradando las ciclinas remanentes. Antes de cerrar, me gustaría decir que el ciclo celular va a proseguir siempre y cuando las condiciones ambientales estén dadas, pero si el adn esta dañado, hay un estrés replicativo, o hay una porción del ADN que no se haya replicado, el ciclo se restara para poder arreglar lo que estaba mal, estos mecanismos son siempre los mismos: inactivación de las fosfatasas cdc25, activación de p53 y generación de proteínas cki que inhiben a los complejos preformados Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp APOPTOSIS Las células que componen los organismos pluricelulares en general, pueden esta expuesta a situaciones de estrés o sufrir daños. Tienen 2 caminos, uno es la corrección de sus errores genéticos o bien programar su muerte (apoptosis). Este programa se lleva a cabo a través de una secuencia ordenada de procesos moleculares que le permite su destrucción y su posterior desaparición por fagocitosis a través de sus células vecinas, este proceso es normal, se da más en la embriogensis y el desarrollo fetal, para mantener una homeostasis tisular como respuesta en defensa a las reacciones inmunitarias, lesiones, envejecimiento, como concecuencia del estrés del RE o como consecuencia de procesos autofagicos exacerbados. Es muy importante que entendamos que para el desarrollo de los organismos es fundamental el equilibrio entre la supervivencia y la muerte celular. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp ¿Cuál es la diferencia entre necrosis y apoptosis? En el siguiente esquema se puede apreciar las diferencias entre necrosis y apoptosis, se ve que en la necrosis la célula se hincha, se edematiza y las membranas cedan, liberando contenido intracelular al medio extracelular, generando la respuesta inflamatoria. Vale decir que una célula necrotica produce la generación de un tejido necrótico a su alrededor. En cambio, la apoptosis es una muerte individual programada dependiente de caspasas. Las células sufren cambios morfológicos muy caracteristicos: La cromatina se condensa, se foran agrupaciones cromatinicas en forma de media luna, sus membranas plasmáticas exponen hacia el medio extracelular fosfatidil serina (fosfolípido de la monocapa interna o citosolica), el citoplasma se contrae. Se generan protrusiones celulares formando cuerpos apoptoticos que son fagocitadas por las células vecinas sin que se desate una respuesta inflamatoria. (-Necrosis regulada: no abordada en esta clase) Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp En el siguiente cuadro se aprecian las diferencias entre ambas: Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Aca se ve una fotografia de diferentes tejidos en apoptosis, se puede ver un páncreas exocrino de ratón, donde se aprecian células apoptoticas, que han sido retraídas y con los núcleos muy coloreados y también con la cromatina muy condensada, sin rastros que haya habido una respuesta inflamatoria. Aqui se ve un miocardio de rata, que presentan células apoptoticas. Donde vemos al citoplasma condensado. Se aprecia la cromatina condensada y una hipercromía (muy coloredo) en los núcleos. Ademas se ve al lado derecho de la imagen que hay ciertos macrofagos que ya están comiendo algunos cuerpos apoptoticos. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp En esta imagen de un Microscopia Electronica, se puede ver células apoptoticas con el citoplasma bien condensado. Se aprecia la cromatina condensada formando estas estructuras en semi-luna. Un cuerpo apoptotico que no tiene material nuclear en su interior y aquí se ve un núcleo fragmentado, previo a la formación de cuerpos apoptoticos en la célula que va a presentar apoptosis. Por supuesto todas estas células con borde irregular, son característicos de las células que están generando apoptosis. Aqui se puede ver un cuerpo apoptotico brotando de un linfocito de rata, podemos ver la generación de las burbujas o vacuolas dentro de la célula. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Y Esta foto es de un macrofago que se está comiendo a diferentes cuerpos apoptoticos Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp La apoptosis es una Muerte celular programada, que esta mediada por proteínas llamadas caspasas. Este es el historial de Neishore, el cual publicaro una revisión sobre la acción de las caspasas. ¿Que son las Caspasas? Son enzimas proteoliticas, que son sintetizadas como cimogenos inactivos, conocidos como procaspasas y que están constituido por un prodominio, una subunidad pequeña de 10Kd (p10) y otra grande de p20. Al activarse por proteolisis forman un heterotetramero. (en la imagen se ve como tiene subunidades pequeñas p10 en color verde oscuro y 2 subunidades grandes p20, verdes claros). Entonces el cimógeno o procaspasa inactivo, va a ser procesado por acción de algunas protasas que puede ser otra caspasa, libera este peptido prodominios y entonces se tiene a la caspasa activa. Y la caspasa activa puede generar la proteolisis de otras caspasas y así amplificar la respuesta o directamente degradar proteínas diana como puede ser proteínas citosolicas o proteínas de citoesqueleto como lo son las de las láminas nucleares. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp La proteolisis llevada a cabo por las caspasas pueden ser de dos tipos, pueden hacer que las proteínas o el complejo proteico que degradan, pierda la función por la proteolisis o al contrario, una proteína inactiva que gracias a la proteolisis adquiere actividad, o un complejo proteico que gracias a la proteolisis libera su subunidad activa. Las caspasas son enzimas proteoliticas que son capaces de digerir distintos tipos de proteínas. Las respuestas ante una señal apoptotica, despierta la actividad de ciertas caspasas, que llamaremos caspasas iniciadoras que por lo general se activan por union a estas señales apoptoticas y van a generar la proteolisis donde un pequeño grupo de proteínas sustratos, entre la cuales se encuentran otras caspasas que son las que finalmente van a degradar las diferentes proteínas celularesy estas las vamos a llamar caspasas efectoras. Vale decir que la respuesta ante la señal apoptotica se da en una cascada de reacciones que se amplifica, iniciada por la caspasas iniciadoras, y ejecutadas por las caspasas efectoras. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Asi una caspasa efectora, se va activar gracias a la acción proteolitica de una casposa iniciadora que la digiere y permite la agregación de la subunidad, activándola, y puede llegar a generar la proteolisis de la actina, haciendo que las células pierdan su forma y puedan ser eliminadas de los tejidos o activar otras caspasas que van a mediar la fragmentación celular y el desmembramiento de organelas. Su acción sobre la estructura del ADN es indirecta, ya que lo que hace es la proteolisis de una proteína llamada ICad, que era una proteína que estaba secuestrando los endonucleasas, vale decir que cuando se dispara la respuesta apoptotica, se degradan las ICad y las enzimas endonucleasas nucleares pueden degradar al ADN, a nivel de los ADN espaciadores, generando fragmentos que tienen 1, 2 o más nucleosomas como se pueden ver en esta corridas electroforeticas. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp La apoptosis se va a activar gracias a 2 tipos de estímulos, los extracelulares que van a desencadenar la vía extrínseca de apoptosis o los intracelulares que desencadenaran la vía intrínseca de este proceso. Los estimulos van a ser variados: -(Activación de un receptor de muerte, daño en el adn no reparado, 3 y 4 de la imagen) Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp La vía extrínseca comienza cuando un ligando impacta sobre un receptor de muerte, que se asocia con ciertas proteínas adaptadoras y con las caspasas inciadoras formando el complejo DISC, esta caspasa iniciadora ahora se activa y es capaz de activar a las caspasas efectoras, que van a terminar degradando las distintas proteínas y promoviendo la formación de los cuerpos apoptoticos que serán luego fagocitados por macrofagos. En la Vía extrínseca los ligandos extracelulares de muerte, que impacta con sus receptores de muerte en la membrana de la célula que va a hacer la apoptosis y activan su dominio DD o dominios de muerte que son capaces de reclutar a las proteínas adaptadoras, que mediante este dominio efector de muerte DED, reclutan ahora a las caspasas iniciadoras. Por tanto, receptor, proteina adaptadora y caspasa iniciadora, forman el complejo DIS que es capaz de activar a estas caspasas iniciadoras, degenerando su acción proteoliticas sobre sus proteínas dianas, como lo son las caspasas efectoras, que son las llamadas capasas 3, 6 y 7. Las caspasas iniciadora de la vía extrínseca de la apoptosis es la procaspasa 8. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Aqui se ve otro esquema, donde se un linfocito citotoxico, que expone los ligadnos de muerte que se asocian con el receptor de muerte, las proteínas adaptadoras, las procaspasa 8, forma de complejo DISC que activa la procaspasa 8 y que desde allí, puede activar a las caspasas ejecutoras y mediar la muerte por apoptosis. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp A diferencia de lo que ocurre en la vía extrínseca, en la intrínseca los estimulos no se encuentran mediados por receptor si no por estímulos intrascelulares. Estos estímulos pueden ser positivos o negativos. También esta vía es llamada vía mitocondrial, porque sus mecanismos producen cambios en la membrana mitocondrial, generan poros, que permiten la liberación de contenido del espacio intermembrana, entre ellos un montón de proteínas, entre ellos el citocromo C. El citocromo C, es una de las proteinas que forman parte de la cadena transportadora de electrones en la membrana mitocondria interna. El citocromo C es una proteína movil que se encontraba en el espacio intermembrana, que conectaba los complejos 3 y 4. Si vemos en las fotografias de Microscopia de fluorescencia, se puede ver que las celulas controles normales (verde) es coincidente con la coloración mitocondrial, mientras que en las células apoptoticas, la coloración verde del citocormo, la estamos viendo en todo el citoplasma, evidenciando su liberación. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Se describe entonces la via intrínseca o mitocondrial, se aprecia que ( en el ejemplo de la animación), la vía se despierta por daño en el ADN, que activa a la proteína P53, que va a generar la activación de ciertas proteínas, entre ellas la de la familia de Bcl2, que permitirá la salida del citocromo C de las mitocondrias y que va a ser la señal para activar las caspasas iniciadoras de la vía intrínseca la caspasa 9, formando lo que se llama el apoptosoma, que luego va a terminar de activar a las caspasas efectoras y mediar la muerte. La liberación del citocromo C, se une a ciertas proteínas adaptadoras, como son las Apaf 2, para formar una estructura llamada apoptosoma que recluta a las caspasas iniciadoras de la vía intrínsecas, que son las procaspasas 9. Formando el protsoma activo que es capaz de activar a las caspasas efectoras como son la 3 y la 6. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp La vía intrínseca de la apoptosis va a estar regulada por 2 tipos de proteínas, una de ella es la de la familia de la Bcl2. Dentro de esta familia vamos a tener miembros que son antiapoptoticos y proapoptotico. Dentro de las antiapoptoticas vamos a ver que se distinguen en su estructuras dominios llamados BH. La proteina Bcl2 propiamente dicho y Bcl X forman parte de las proteínas antiapoptticas, y presentan 4 dominios Bh, 1, 2, 3 y 4. Dentro de las proapoptoticas, tenemos a las proteínas que llamamos Bh 1,2 3 porque carecen del dominio Bh 4, las más conocidas o la más importante es la Bax (también existe la bak), que son proteínas de la membrana mitocondria externa que ante un estimulo apoptotico se asocian para formar los poros a través de los cuales pueden salir las proteínas que habitan en el espacio intermmebrana de las mitocondrias. El otro tipo de proteina proapoptoticas son las proteínas llamadas “Solo Bh3”, que carecen de dominio BH1,2 y 4. Aquí tenemos unas cuantas: Bad, Bim, Bid, puma y Noxa. ¿Cómo trabajan estas proteínas? Las antiapopticas: La Bcl2 es una proteína que inhibe el agregado de proteína BAX para formar el poro, por tanto, impedirá la liberación de las proteínas mitocondriales. En tantos las proteínas BH3 por ejemplo, simplemente son proteínas que inactivan a Bcl2, entonces la presencia de proteínas BH3 secuestraran a las proteínas Bcl2 y entonces esas será la señal para que las proteínas Bax, formen el poro y liberen el contenido mitocondrial. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Aquí es donde entra en juego P53, el cual se activaba ante el daño del ADN, y es capaz de activar a las proteínas de dominio BH3, para inhibir la acción de Bcl2. (Ver P53, factor superior de tumor) Las otras proteínas reguladoras de la vía intrínseca, son proteínas inhibidoras de las caspasas (IAP), o son proteínas que regulan la actividad de las anti-IAP. Las IAP lo que hacen, son secuestradoras de las procaspasas y por tanto inhiben su actividad. En tanto las Anti-IAPs, son proteínas que secuestran a las IAPs, y les impiden su union a las procaspasas. Estas proteínas Anti-IAPs, son liberadas por la propia mitocondria, vale decir que smac/diablo, bloquea a los inhibidos de las caspasas para generarla respuesta apoptotica. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Resumiendo, mecanismo de la vía intrínseca: El estímulo, que podría ser el daño del ADN, va a activar a p53, que mediante su acción sobre las proteínas BH3 va a permitir que se forme el poro de BAX, que libera tanto al citocromo C, que se va a unir a Apaf-1 y con las procaspasas 9 para formar el apoptosoma y también va a liberar a las proteínas anti-IAPs, Smac/diablo que van a secuestrar a estos inhibidos de casposa, y entonces el apoptosoma va a estar activo, pudiendo activar a la procaspasa 3 pudiendo convertirla en caspasa 3 Es importante señalar, que cuando se activa la vía extrínseca, también se genera un nexo con la vía intrínseca, dado que una de las proteínas dianas de la acción de las caspasas iniciadoras de la vía extrínseca es la proteína Bid, vale decir que cuando se actíve la vía extrínseca también se ponen en juego componentes de la via intrínseca. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Ejemplos de reguladores negativos de la apoptosis: Factores de supervivencia. La presencia de los factores de supervivencia va a inhibir la apoptosis por 3 mecanismos diferentes, ya sea aumentando la producción de proteína antiapoptotica bcl2, inhibiendo la acción de proteína solo-BH3 que secuentraban a las proteínas antiapototicas bcl2. O inactivando las proteínas anti-IAP, y permitiendo que estos inhibidores de caspasas inhiban la acción de estas proteínas proteolíticas ¿Cómo promueven la apoptosis? Lo hacen por ausencia, cuando hay ausencia de factores troficos o falta de factores de supervivencia, entonces se lleva a cabo la apoptosis. Esto se ve en el desarrollo neuronal, con los primeros estadios embrionarios cuando hay una super población de neuronas que estimulan las células diana y estas por medio de la regulación del nivel de factores de supervivencia que puedan estimular, va generar la muerte de ciertas neuronas y entonces van a promover la homeostasis tisular. Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Sígueme en IG: medicina_antibochazo.unlp Volvamos a ver esta diapositiva, en donde las combinaciones de los distintos tipos de factores, tanto mito-génicos como de crecimiento o de supervivencia, van a permitir los diferentes destinos celulares. En tanto la falta de factores de supervivencia va a llevar a la muerte celular por apoptosis.
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