Biologia de los microorganismos (259)

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162 L O S F U N D A M E N T O S D E L A M I C R O B I O L O G Í A
Para obtener el número de colonias adecuado, casi siempre 
hay que diluir la muestra que se va a contar. Como normal-
mente no se conoce el número aproximado de viables antes de 
hacer el recuento, suele ser necesario hacer más de una dilución. 
Generalmente se hacen diluciones decimales de la muestra 
(Figura 5.17). Para hacer una dilución decimal (10−1) se mezclan 
0,5 ml de muestra con 4,5 ml de diluyente, o 1,0 ml de mues-
tra con 9,0 ml de diluyente. Si la dilución necesaria es centesi-
mal (10−2), se mezclan 0,05 ml con 4,95 ml de diluyente, o 0,1 ml 
con 9,9 ml de diluyente. También se puede obtener una dilución 
10−2 haciendo dos diluciones decimales sucesivas. Con los culti-
vos densos, estas diluciones en serie son necesarias para conse-
guir una dilución adecuada para sembrar y conseguir colonias 
que puedan contarse. Así, se puede obtener una dilución 10−6 
(1/106) haciendo tres diluciones 10−2 (1/102) sucesivas o seis 
diluciones 10−1 sucesivas (Figura 5.17).
Fuentes de error en el recuento en placa
El número de colonias obtenidas en un experimento de recuento 
de viables depende no solo del tamaño del inóculo y la viabilidad 
del cultivo, sino también del medio de cultivo y las condiciones 
de incubación. También puede cambiar con la duración de la 
incubación. Por ejemplo, si se cuenta un cultivo mixto, no todas 
las células depositadas en la placa formarán colonias a la misma 
velocidad; si se usa un tiempo de incubación corto se obtendrán 
menos colonias de las posibles. Además, el tamaño de las colo-
nias puede variar. Si se desarrollan colonias muy pequeñas, pue-
den pasar desapercibidas durante el recuento. Con los cultivos 
puros, el desarrollo de las colonias es un proceso más sincrónico 
y la morfología uniforme de las colonias es la norma.
El recuento de viables puede estar sujeto a errores bastante con-
siderables por varias razones, como la falta de homogeneidad 
5.9 Recuento de células viables
Una célula viable es la que es capaz de dividirse y formar des-
cendencia, y en la mayoría de las situaciones de recuento de 
células, son esas las que más interesan. Por eso se ha desa-
rrollado el método de recuento de viables, llamado también 
recuento en placa, porque son necesarias placas de agar. En un 
recuento de viables se supone que cada célula viable crecerá y 
se dividirá para formar una colonia, de manera que el número 
de colonias refleja el número de células.
Métodos de recuento de células viables
Existen al menos dos métodos para llevar a cabo un recuento 
en placa: el método de siembra por extensión en placa y el 
método de siembra por vertido en placa (Figura  5.16). En el 
método de extensión en placa, sobre la superficie de una placa 
de agar se extiende, con ayuda de un asa de vidrio estéril, un 
volumen (normalmente 0,1 ml o menos) de un cultivo diluido 
adecuadamente. En el método de vertido en placa se pipetea 
un volumen conocido (normalmente 0,1-1,0 ml) de cultivo en 
una placa de Petri estéril; a continuación se añade medio de 
agar fundido, justo a la temperatura por encima de la de soli-
dificación, y se mezcla con cuidado moviendo suavemente la 
placa encima de la poyata. Con ambos métodos es importante 
que el número de colonias que se desarrollen en el medio no 
sea ni demasiado alto ni demasiado bajo. En las placas dema-
siado llenas es posible que no todas las células formen colonias; 
además, algunas colonias podrían fusionarse, lo que provocaría 
mediciones erróneas. Si el número de colonias es demasiado 
pequeño, la significación estadística del recuento será baja. La 
práctica habitual, que es la más válida a efectos estadísticos, es 
contar colonias solamente en placas que tengan entre 30 y 300 
colonias.
Figura 5.16 Dos métodos para la determinación de viables. En el método de vertido en placa, las colonias se forman tanto en la superficie como en el
interior del agar. Las fotos de la derecha corresponden a colonias de Escherichia coli formadas a partir de células sembradas por extensión (arriba) y por vertido en 
placa (abajo).
La muestra (0,1 ml o menos)
se pipetea en la superficie
de una placa de agar
Se extiende la muestra de
manera regular en la
superficie de agar usando
un asa de virio estéril
Resultado típico de la
siembra por extensión
Colonias
superficiales
Colonias
superficiales
La muestra se pipetea
en una placa estéril
Se añade medio estéril
y se mezcla bien con el inóculo
Resultado típico de la
siembra por vertido en placa
Colonias en
el interior
del medio
Método de siembra por vertido en placa
Método de siembra por extensión
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Solidificación
e incubación
Incubación
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