Premio_Yeyati_Diciembre2016

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Autores:
Trimarchi H., Canzonieri R., Schiel A., 
Costales-Collaguazo C., Politei J., Stern A., 
Paulero M., Rengel T., Andrews J., Forrester 
M., Lombi M., Pomeranz V., Iriarte R., Muryan 
A., Zotta E., Sanchez-Niño MD., Ortiz A.
Podocituria y aumento de la excreción 
urinaria de CD80 y la en la enfermedad 
de Fabry
Podocituria y aumento de la excreción urinaria 
de CD80 y la en la enfermedad de Fabry
Trimarchi H1, Canzonieri R2, Schiel A2, Costales-Collaguazo 
C3, Politei J4, Stern A2, Paulero M1, Rengel T1, Andrews J1, 
Forrester M1, Lombi M1, Pomeranz V1, Iriarte R1, Muryan A2, 
Zotta E3, Sanchez-Niño MD5,6*, Ortiz A5,6*
1 Servicio de Nefrologia, Hospital Británico de Buenos Aires, 
Argentina
2 Laboratorio Central, Hospital Británico de Buenos Aires, Ar-
gentina
3 IFIBIO Houssay, CONICET, Fisiopatología, Facultad de Far-
macia y Bioquimica, Universidad de Buenos Aires, Argentina
4 Departamento de Neurologia, Laboratorio Neuroquímica Dr 
Néstor Chamoles, Buenos Aires, Argentina
5 IIS- Fundación Jimenez Diaz, Escuela de Medicina, UAM, 
Madrid, España. 
6 REDINREN, Madrid, España
Resumen
Introducción 
Algunas glomerulopatías se encuentran asociadas a niveles elevados de CD80. Medimos la excreción 
urinaria de CD80, la podocituria y la proteinuria en un grupo control y en pacientes con enfermedad de 
Fabry sin o con terapia de reemplazo enzimático (TRE).
Métodos Estudio transversal de 65 pacientes: controles (n = 20) y pacientes con Fabry (n = 45; 23 de ellos 
sin TRE y 22 con TRE. Variables incluidas: Edad, sexo, índice proteinuria/creatininuria (UPCR), filtrado 
glomerular estimado (eGFR), índice uCD80/creatininuria y podocituria. Se estudió la expresión de CD80 
RNAm en podocitos humanos cultivados en respuesta a liso- globotriasosilceramida (liso-Gb3).
Resultados
Fabry vs control: No se encontraron diferencias significativas en relación a edad, eGFR y género. UPCR, 
uCD80 y la podocituria fueron significativamente mayores en pacientes Fabry. Los pacientes con 
enfermedad de Fabry sin TRE fueron más jóvenes y en mayor medida mujeres. Aquellos con enfermedad 
de Fabry sin TRE tenían enfermedad renal más avanzada: el UPCR fue menor en relación a un eGFR 
más alto, pero el uCD80 y la podocituria no difirió entre los pacientes con Fabry. Las concentraciones 
circulantes de Liso-Gb3 aumentó la expresión de uCD80 en los podocitos cultivados de pacientes con 
Fabry.
Conclusiones
La enfermedad de Fabry se caracteriza por la aparición temprana y el aumento en la excreción uCD80 
como consecuencia a la acumulación de glicolípidos. 
El potencial diagnostico de la excreción uCD80 para reflejar el compromiso precoz y subclínico de la 
alteración renal en la Enfermedad de Fabry debería ser más estudiada.
 Introducción
 La enfermedad de Fabry es una enfermedad genética ligada al cromosoma X. Se debe a mutaciones en el 
gen GLA que codifica la α-galactosidasa A, llevando a la acumulación lisosomal de sustratos enzimáticos 
como la globotriaosilceramida (Gb3), liso-globotriaosilceramida (liso-Gb3) y la galabiosilceramida1. La 
sobrecarga intracelular patológica de estos glicoesfingolípidos altera la morfología celular y conduce a 
la disfunción celular2,4. Sin embargo, los mecanismos exactos por los que estos metabolitos conducen a 
la disfunción celular siguen sin conocerse. Se ha planteado como posible mecanismo la interacción de 
los glicoesfingolípidos con transportadores o canales iónicos, localizados principalmente en el retículo 
endoplasmíco, o la activación de vías inflamatorias celulares con el consiguiente daño tisular5,7. De 
manera similar a la nefropatía diabética, la nefropatía de Fabry es una patología proteinúrica, progresiva, 
de origen metabólico con una historia natural que se expande a través de las décadas. En este sentido, 
los glicolípidos que se acumulan en la enfermedad de Fabry, tales como liso-Gb3, pueden activar vías 
de inflamación en las células renales8. Tanto el factor de crecimiento tisular-β1 (TGF-β1) como el factor 
de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y el factor de crecimiento fibroblástico-2 (FGF-2) -entre otros- 
están elevados en la nefropatía de Fabry. Como también la vía de señalización Notch-1, la apoptosis 
y las vías inflamatorias que se encuentran relacionadas con la autofagia9,12. Específicamente, las 
concentraciones circulantes de liso-G3 en pacientes con Fabry promueven por vía autocrina al TGF-β1 y 
a la vía Notch-1 señalizados en los podocitos, repitiendo lo que sucedeen la respuesta de los podocitos 
a altas concentraciones de glucosa.10,13 Asimismo, los niveles elevados de glucosa también aumentan 
la expresión del CD80 en podocitos humanos cultivados14. El antígeno CD80 se encuentra normalmente 
en las células presentadoras de antígeno como los neutrófilos, macrófagos y células dendríticas 
modulando la actividad de las células T CD8 + y CD4 + al interactuar con el ligando co-estimulador CD28, 
una glicoproteína localizada en las células T, o bien con los co-inhibidores de la proteína de los linfocitos 
T citotóxicos tipo 4 (CTLA-4)15. Sin embargo, en condiciones normales, los podocitos no expresan 
CD80. No obstante, en ciertas glomerulopatías, incluyendo la nefropatía diabética, el CD80 se expresa 
en los podocitos y en las células tubulares, así como también se encuentra aumentada su excreción 
renal.14,16 El aumento del CD80 en los podocitos y células tubulares en condiciones anormales sugiere 
que estas células pueden comportarse como células presentadoras de antígeno y participar en las vías 
inflamatorias17. Por último, el CD80 también se ha relacionado con la migración y desprendimiento de 
los podocitos a través de su interacción con las integrinas. De hecho, se ha observado podocituria en 
las glomerulopatías activas18,19. Recientemente hemos demostrado la existencia de podocituria en la 
enfermedad de Fabry, incluso en ausencia de nefropatía clínica20. En este estudio hemos explorado 
la excreción urinaria de CD80 en pacientes con enfermedad de Fabry y los potenciales efectos de la 
sobreexpresión de CD80.
Materiales y Métodos
 Se trata de un estudio observacional tipo transversal, que incluyó a 65 pacientes. Un grupo de 20 
pacientes sanos sin comorbilidades clínicas conocidas o tratamiento farmacológico fue reclutado de 
un grupo de potenciales donantes de riñón con historia clínica y resultados de laboratorio normales. 
Además, se estudiaron 45 pacientes con enfermedad de Fabry. De éstos, 23 no fueron tratados con 
terapia de reemplazo enzimático (TRE), mientras que 22 habían recibido TRE con Agalsidasa Beta 1 
mg / kg administrada cada dos semanas (Fabrazyme, Genzyme Corp., Cambridge, MA, EE.UU.) durante 
al menos 12 meses. La enfermedad de Fabry se diagnosticó en todos los casos por una deficiencia 
enzimática de la actividad de alfa-galactosidasa A en muestras de sangre seca , leucocitos de sangre 
periférica y confirmado por la identificación de la mutación del gen GLA. Las características de los 
pacientes se resumen en la Tabla 1. Se estudiaron las siguientes variables: edad, sexo, índice de filtración 
glomerular (eGFR) estimada por la ecuación de Colaboración Epidemiológica para Enfermedad Renal 
Crónica (CKD-EPI), índice proteinuria-creatinuria (UPCR), podocituria ajustada a gramo de creatininuria 
y relación CD80/creatininuria (uCD80).
Podocituria
 Hemos descripto en otra publicación en forma detallada la metodología de estudio de la podocituria 
20. Brevemente, se recogió la muestra de orina recién emitida después de un mínimo de 3 horas de 
retención; se centrifugaron 20 ml de orina a 700g durante 5 min usando una centrífuga; se descartó 
el sobrenadante y el sedimento obtenido se almacenó en compartimientos de 100 μl a temperatura 
ambiente mezclados con 1,5 ml de solución de formaldehído al 40% diluido en solución de fosfato 
con base de sodio (PBS) (pH 7.2 a 7.4) alcanzando una concentración finalal 10%. Los núcleos de los 
podocitos se tiñeron con 40,6-diamino-2-fenilindol (DAPI). Los podocitos se identificaron mediante 
inmunofluorescencia utilizando anti-sinaptopodina como anticuerpo primario (1: 100, Abcam, 
Cambridge, MA, EE.UU.) y IgG anti-conejo de Alexa Fluor® 488 (1: 100, Abcam, Cambridge, MA, EE.UU.) 
como el anticuerpo secundario. Las muestras se analizaron empleando un microscopio epifluorescente. 
Siguiendo nuestra técnica estandarizada, los podocitos se contaron en 10 campos elegidos al azar a 20x 
y el promedio de los podocitos contados en los campos microscópicos se consideraron como el conteo 
final para cada paciente. Los resultados fueron corregidos en función a los niveles de creatinina basales 
en orina que se encontraron en cada muestra 20,21. Para ello, el valor de creatinina urinaria se calculó 
para el volumen de orina inicial de 20 ml empleadas para el recuento de podocitos.
CD80 y otras determinaciones.
 Los valores de creatinina en suero se obtuvieron en la misma semana en que se recolectó la muestra 
de orina para el recuento podocitario. UPCR se midió de la muestra empleada para la evaluación de 
podocitos. La concentración urinaria de CD80 se determinó empleando un CD80 Humano instantáneo 
por ELISA (ELISA® instantánea, Affymetrix eBioscience, San Diego, CA, EE.UU.).
Ética
 El presente protocolo fue aprobado por el Comité de Revisión Institucional del Hospital Británico de 
Buenos Aires, Buenos Aires, Argentina. Se Obtuvo el consentimiento informado de cada participante en 
el estudio.
 En España, las muestras de riñón se obtuvieron a partir de tejido de muestras de nefrectomías de riñones 
donados al banco biológico del IIS-Fundación Jiménez Díaz. luego de haberse realizado una evaluación 
diagnóstica. El Comité de Ética local aprobó el protocolo del estudio y se obtuvo el consentimiento 
informado.
Cultivo de células y reactivos
 Los podocitos humanos son una línea celular inmortalizada transfectada a un gen SV40 termosensible 
y un gen que codifica el dominio catalítico de la telomerasa humana10, 13. A una temperatura permisiva 
de 33ºC, las células se mantienen en un estado proliferativo indiferenciado y de división. Elevando la 
temperatura a 37 ° C dio como resultado un detenimiento en el crecimiento y diferenciación fenotípica 
de los podocitos. Los cultivos de podocitos indiferenciados se mantuvieron a 33ºC en medio RPMI 1640 
con penicilina, estreptomicina, ITS (insulina, transferrina, selenita), y 10% de FCS. Una vez que las células 
alcanzaron el 70 a 80% de confluencia, fueron completamente diferenciadas en un cultivo a 37 ° C durante 
al menos 14 días10,13. Las células fueron cultivadas en medio libre de suero 24 horas antes del estímulo 
y durante todo el experimento. Liso-Gb3 (Sigma, St. Louis, MO) se utilizó a una concentración de 100 
nM con testeo negativo para lipopolisacáridos. Esta concentración es clínicamente relevante, ya que 
desde la circulación de liso-Gb3 ha sido reportado como presente en un rango de 10-50 nM para mujeres 
heterocigóticas y por encima de 100 nM en los hombres 22. Por otra parte, esta concentración ya se había 
demostrado en estudios de respuesta a la dosis de bioactividad en podocitos humanos cultivados. 10,13 
Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real 
 El ARN se aisló utilizando el reactivo Trizol (Invitrogen, Paisley, UK). Un μg de ARN fue transcrito de 
forma inversa con el Kit cDNA de alta capacidad (Applied Biosystems, Foster City, CA). Las reacciones de 
PCR a tiempo real se realizaron con el sistema de detección de secuencia PCR ABI Prism 7500 (Applied 
Biosystems) de acuerdo con el protocolo de la marca fabricante usando el método DeltaDelta Ct 10,13 . 
Los niveles de expresión se dan como relaciones al GAPDH. Los primers pre-desarrolados y pruebas de 
ensayo fueron de Applied Biosystems.
La inmunohistoquímica
 Las muestras de riñón se obtuvieron a partir de tejido de muestras de nefrectomías de riñones 
donados al banco biológico del IIS-Fundación Jiménez Díaz. Se tomaron muestras humanas de riñón 
de controles a partir de porciones de tejidos renales normales de pacientes que se sometieron a cirugía 
debido a tumores renales localizados. Se estudió una biopsia renal de un paciente sexo masculino de 
69 años de edad con enfermedad de Fabry, con creatinina sérica de 4.2 mg / dl, proteinuria de 0.7 g / 
24 h. La inmunohistoquímica se llevó a cabo en secciones de tejido de 5 µm de espesor incluidas en 
parafina. El anticuerpo primario era un anti-CD80 monoclonal de ratón (1: 100, Abcam). Las secciones 
fueron contrastadas con hematoxilina de Carazzi. Los controles negativos incluyeron la incubación con 
una inmunoglobulina no específica del mismo isotipo que el anticuerpo primario.
Análisis estadístico
 Los resultados se expresan como mediana y rangos. Las variables se analizaron mediante el test 
de Wilcoxon Mann-Whitney. Las correlaciones entre las variables se obtuvieron con el coeficiente de 
correlación de Spearman. Los resultados se consideraron significativos con una p <0.05. El programa 
estadístico empleado fue InfoStat 2016, Córdoba, Argentina.
Resultados
Estudios de pacientes con Fabry
 El grupo control y aquellos con enfermedad de Fabry no fueron diferentes en cuanto a edad, eGFR y 
género. Sin embargo, el UPCR, uCD80 y la podocituria fueron significativamente mayores en pacientes 
con Fabry (Tabla 1). Los pacientes con Fabry sin TRE eran más jóvenes y había una mayor proporción de 
mujeres. Esto podría ser debido a que tanto los pacientes más jóvenes y las mujeres suelen tener una 
enfermedad más leve y esto puede llevar a la decisión de no iniciar TRE todavía. En este sentido, el eGFR 
fue mayor y el UPCR menor en los pacientes que no están recibiendo TRE, probablemente reflejando 
una enfermedad renal mucho más leve. Sin embargo, no hubo diferencias en la excreción uCD80 o la 
podocituria en los pacientes con enfermedad de Fabry con o sin TRE (Tabla 2). Hubo una correlación 
significativa entre uCD80 y UPCR en toda la población (r 0,44, p 0,0005) y en pacientes con Fabry (r 0,42, 
p 0,0046). Sin embargo, no hubo correlación entre el uCD80 y la podocituria.
Desde que el uCD80 aumentó en la orina de pacientes con Fabry, nosotros exploramos a continuación 
la expresión de CD80 en tejido humano con enfermedad de Fabry. No se observó ninguna expresión de 
CD80 en los riñones de control. Sin embargo, la inmunohistoquímica confirmó la expresión de CD80 en 
los podocitos en una biopsia de riñón de un paciente con enfermedad de Fabry (Figura 1).
Liso-Gb-3 aumenta la expresión de CD80 en los podocitos cultivadas
 A partir que el uCD80 aumentó de forma temprana en la nefropatía de Fabry, incluso en el grupo de 
pacientes con un mejor eGFR y una menor albuminuria, hemos explorado si los glicolípidos acumulados 
en la enfermedad de Fabry pueden aumentar la expresión de CD80 en células de riñón. Habíamos 
demostrado anteriormente que liso-Gb3, en concentraciones que se encuentran circulantes en pacientes 
con enfermedad de Fabry, aumenta la expresión de diversos mediadores de la lesión renal en un tiempo 
y manera dependiente de la dosis, con una respuesta pico observada a 100 nM en 24 h 10; 13. El Liso-Gb3 
en concentración de 100 nM indujo un aumento en la expresión de ARNm del CD80 que alcanzó su punto 
máximo a las 24 horas en los podocitos (Figura 2).
Discusión
 En el presente estudio hemos confirmado que en la enfermedad de Fabry los podocitos se pierden a 
través de la orina en cantidades mayores en comparación al grupo control y que ésta es una característica 
temprana presente en los pacientes con enfermedad renal subclínica. Si ésto se mantiene en el tiempo 
puede conducir a una pérdida de podocitos y a la lesión glomerular clásica de la nefropatía de Fabry: 
glomeruloesclerosis focal y segmentaria. Un nuevo hallazgo es que la excreción de uCD80también se 
incrementa de manera temprana en la nefropatía de Fabry. Si bien hubo una correlación entre uCD80 y la 
proteinuria, la falta de correlación entre uCD80 y podocituria sugiere que la podocituria no parece estar 
ligada a la activación de vías de señalización del CD80 y que el uCD80 y la podocituria reflejan diferentes 
aspectos de la lesión renal en la nefropatía de Fabry. Por otra parte, hemos identificado a la liso-Gb3 
como un posible promotor de la expresión de CD80 en los podocitos. Se ha demostrado previamente 
que liso-Gb3 aumenta la expresión o la secreción de TGFß1, CD74, Notch1 y MCP-1 en los podocitos 
10,13. Por otro lado, el liso-Gb-3 parece promover una reacción generalizada de stress celular. Nosotros 
hemos demostrado que esta incluye al CD80 evocando una respuesta de los podocitos a los altos valores 
de glucosa suscitados 14,23,24. Con respecto a esto, otros glicolipidos, lipopolisacáridos bacterianos, 
también aumentan la expresión de CD80 en los podocitos 25.
 La enfermedad de Fabry silente y con podocituria severa se presentó en individuos más jóvenes 
cuando el promedio de eGFR y proteinuria todavía era normal. Más aún, el uCD80 ya estaba elevado en 
los pacientes más jóvenes y en mujeres que no estaban con TRE, sugiriendo que puede ser un marcador 
precoz de lesión renal. Además, el CD80 se mantuvo elevado en los pacientes con TRE. Al tratarse de un 
estudio transversal, se desconoce si el uCD80 había sido mayor al inicio de la TRE y había disminuido, 
pero no normalizado con TRE. Se requiere de más estudios para poder afirmar si las intervenciones 
terapéuticas tempranas llegaran a normalizar los niveles de uCD80. La literatura actual señala que el 
inicio temprano de TRE en la enfermedad de Fabry se asocia a mejores resultados a largo plazo 26,27. 
Sin embargo, nuestros datos de cultivos de células son consistentes con la observación obtenida de la 
excreción urnaria del CD80, ya que el liso-Gb3 disminuye, pero usualmente no se normaliza, con la TRE. 
22.
 La nefropatía por enfermedad de Fabry es una glomerulopatía. Por lo tanto, no es sorprendente que 
el defecto metabólico llegue a desencadenar la expresión de moléculas inflamatorias y fibróticas así 
como factores de crecimiento y citocinas , como es el caso de otras glomerulopatías 28,29. Además, una 
característica de la nefropatía de Fabry es la acumulación de glicolípidos entre los podocitos, células 
endoteliales y tubulares. Estas células son todas, fuentes potenciales de mediadores inflamatorios. Sin 
embargo, no fuimos capaces de medir simultáneamente CD80 en la sangre y en la orina y, por lo tanto, 
no se puede determinar si uCD80 es de origen renal. A pesar de estas observaciones, nuestro hallazgo 
hace énfasis en el concepto de que las moléculas inflamatorias de la nefropatía de Fabry son excretadas 
en la orina y esto no parece ser normalizado con la TRE. El CD80 no es exclusivo de los linfocitos, como 
en biopsias humanas, podocitos en glomeruloesclerosis focal y segmentaria primaria30 y diabetes14 y 
los podocitos y células tubulares en la nefropatía por IgA expresan CD8016. Aunque algunos autores 
han señalado el potencial papel del CD80 en ciertas glomerulopatías, tales como la nefropatía por IgA, 
la glomerulonefritis focal y segmentaria primaria y las glomerulopatías con semilunas16,17,30,31, otros 
han cuestionado seriamente estos hallazgos, particularmente en la enfermedad de cambios mínimos 
y la glomeruloesclerosis focal y segmentaria primaria32. Recientes datos señalan a la glucógeno sintasa 
quinasa (GSK) 3 como un actor clave en la patogénesis de podocitopatía y la proteinuria. En ratones 
knockout GSK3 la expresión de novo en los podocitos de mediadores de lesión podocitaria dependientes 
de factor nuclear kappa B (NFKB), incluyendo al CD80, la catepsina L, y la MCP-1, se redujo33. Estas 
moléculas podrían contribuir a la fisiopatología de la enfermedad de Fabry10,11,34. En la enfermedad 
de Fabry, la expresión de CD80 de células de riñón puede ser impulsado por glicolípidos acumulados, 
como se muestra en nuestros experimentos de cultivos celulares, y por lo tanto, puede proporcionar 
información sobre la persistencia de la lesión renal por glicolípidos a pesar de TRE. Citoquinas adicionales 
en el microambiente local también pueden contribuir al daño renal.
 Aún no se sabe si la expresión de los CD80 en los podocitos contribuye a la patogénesis de la 
nefropatía de Fabry mediante la alteración de la forma, la reorganización de la actina y la alteración de 
la permeabilidad glomerular promoviendo así la proteinuria17,31. De hecho, el CD80 ha sido implicado 
en la contracción podocitaria, la migración y la eventual pérdida de podocitos17,31. Sin embargo, no 
hemos encontrado una correlación entre el uCD80 y la podocituria. Esto podría estar relacionado con 
el reducido tamaño de la muestra. Alternativamente, el uCD80 y la podocituria pueden representar 
diferentes aspectos de la nefropatía de Fabry. Un aumento anormal del CD80 en los podocitos se ha 
relacionado con anomalías en la subunidad de la integrina beta117,31,35. En este sentido, se reportó un 
aumento de la excreción urinaria de integrina β3 en los pacientes con Fabry35.
 Existen varias limitaciones en nuestro estudio: En términos absolutos, el número de pacientes es 
pequeño y el estudio es transversal. Sin embargo, pocos estudios en enfermedades renales raras son 
capaces de reclutar un mayor número de pacientes, y un estudio prospectivo requeriría de varios años 
de seguimiento, dada la historia natural de 40 años de la nefropatía de Fabry. No hemos abordado 
directamente la fuente celular de CD80 in vivo en los pacientes estudiados. Si el uCD80 se origina a partir 
de linfocitos, neutrófilos y/o células dendríticas, o de la expresión anormal de CD80 en los podocitos, a 
nivel tubular o de las células endoteliales es desconocido. Nuestros resultados se basan en un estudio 
de ELISA humano altamente sensible y específico, pero se limitan a la orina, y no podemos discernir si 
existen diferencias en el comportamiento de los niveles circulantes y urinarios de CD80. Sin embargo, 
datos relacionados a biopsias renales con Fabry y cultivos celulares sugieren que los podocitos podría 
ser una de las fuentes de uCD80.
 En resumen, hemos confirmado el desarrollo temprano de podocituria en pacientes con enfermedad 
de Fabry. Por otra parte, se observó un aumento temprano en uCD80. El hecho de que la expresión de 
CD80 se incremente por la liso-Gb-3 en los podocitos sugiere que uCD80 puede ser un marcador precoz de 
lesión renal en la enfermedad de Fabry y además un marcador de lesión renal continua por glicolípidos 
. Futuros estudios acerca de la potencial participación de uCD80 para reflejar de forma temprana, el 
compromiso renal subclínico en la enfermedad de Fabry están justificados.
Palabras clave: Terapia de reemplazo enzimático, enfermedad de Fabry, liso-Gb3, podocituria, CD80, 
proteinuria.
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Tablas
Tabla 1. Características generales del grupo control y pacientes Fabry
Tabla 2. Comparación intragrupal de pacientes Fabry
FIGURA 1
FIGURA 2
Leyenda de las figuras
Figura 1. Expresión de CD80 en la enfermedad de Fabry. La inmunohistoquímica de una muestra de 
biopsia humana con nefropatía de Fabry mostro aumentó de la expresión de CD80 en los podocitos. La 
tinción no se encontró en las biopsias control. Aumento original a 20X y 40X.
Figura 2. liso-Gb3 aumenta la expresión de ARNm de CD80 en los podocitos. Podocitos humanos 
cultivados se estimularon con 100 nM liso-Gb3. Curso de tiempo de la inducción de CD80 mRNA. * P 
<0,004 vs control. La expresión de ARNm se evaluó por el tiempo real de RT-PCR. La media ± SEM de tres 
experimentos independientes.