QUIMICA-ORGANICA

Química

•

Vicente Riva Palacio

Maribel

9/11/2023

¡Este material tiene más páginas!

Entonces, ¿te gustó este material?

Ayude a animar a otros estudiantes a mejorar el contenido

¿Te gustó este material? ¡Compartir! 🧡

Química

202.084 Materiales compartidos

Descarga la aplicación para disfrutar aún más

Lea materiales sin conexión, sin usar Internet. Además de muchas otras características!

Vista previa del material en texto

Departamento de Química Orgánica e Inorgánica
Programa de Doctorado de Química Organometálica

VITAMINA D: SÍNTESIS DE ANÁLOGOS
MODIFICADOS EN EL ANILLO A, ESTUDIOS
ESTRUCTURA-ACTIVIDAD Y BIOHIDROXILACIÓN DE
LA CETONA DE GRUNDMANN

Tesis Doctoral
Alba Hernández Martín

Departamento de Química Orgánica e Inorgánica
Programa de Doctorado de Química Organometálica

VITAMINA D: SÍNTESIS DE ANÁLOGOS
MODIFICADOS EN EL ANILLO A, ESTUDIOS
ESTRUCTURA-ACTIVIDAD Y BIOHIDROXILACIÓN DE
LA CETONA DE GRUNDMANN

Memoria presentada para optar
al grado de Doctor en Química
por Alba Hernández Martín

FO
R
-M
A
T-
V
O
A
-0
10
-B
IS

RESUMEN DEL CONTENIDO DE TESIS DOCTORAL

1.- Título de la Tesis
Español/Otro Idioma:
Vitamina D: síntesis de análogos modificados
en el anillo A, estudios estructura-actividad y
biohidroxilación de la cetona de Grundmann
Inglés:
Vitamin D: synthesis of A-ring modified
analogues, structure-activity studies and
biohydroxylation of Grundmann’s ketone

2.- Autor
Nombre: ALBA HERNÁNDEZ MARTÍN DNI/Pasaporte/NIE:
Programa de Doctorado: QUÍMICA ORGANOMETÁLICA (MENCIÓN DE CALIDAD)
Órgano responsable: QUÍMICA ORGÁNICA E INORGÁNICA

RESUMEN (en español)
Los numerosos avances médicos y tecnológicos desarrollados con la llegada del siglo XXI,
han tenido una gran influencia en la investigación científica y, por lo tanto, en la Vitamina D
como área de investigación multidisciplinar. Así, en la última década, el empleo de técnicas de
modelización molecular, la secuenciación del genoma humano y el creciente número de
estudios químicos, fisiológicos y epidemiológicos, han mejorado nuestro conocimiento acerca
de los modos de acción de la vitamina D en el organismo. Desde el descubrimiento de la 1α,25-
dihidroxivitamina D3, la forma hormonalmente activa, se ha demostrado que su actividad
biológica va mucho más allá de su clásica función en la regulación de la homeostasis del
calcio, incluyendo la regulación del sistema inmune y endocrino, así como el control del ciclo
celular, entre otros procesos.
Esta Tesis Doctoral está dividida en tres capítulos, cada uno de los cuales aborda diferentes
aspectos de la vitamina D3 desde una perspectiva sintética.
El primer capítulo describe la síntesis de nuevos análogos 19-nor de la 1α,25-
dihidroxiprevitamina D3 con la función 2-hidroxietilideno en distintas posiciones del anillo A. La
presencia de este grupo puede favorecer diferentes conformaciones del anillo A de estos
análogos bloqueados en la forma 6-s-cis, promoviendo diferentes conformaciones del receptor
hormonal y, por consiguiente, diferentes respuestas biológicas.
En el segundo capítulo, se aborda la preparación de análogos de la 25-hidroxivitamina D3
modificados en la posición C-3 y su uso como herramienta analítica para la determinación de
niveles de vitamina D en muestras biológicas. Dicha modificación consiste en la introducción de
una función carbamato que contiene un grupo hidrofílico, como por ejemplo un alcohol o una
amina, al final de una cadena alquílica. Los derivados biotinilados de estos análogos son
capaces de unirse a la proteína de unión de la vitamina D (DBP, Vitamin D Binding Protein),
dando lugar a un complejo que no es reconocido por anticuerpos específicos anti-DBP,
proporcionando un método para la eliminación de la DBP libre en una muestra y mejorando el
método de medida.
Los análogos descritos en los Capítulos 1 y 2 se sintetizan mediante estrategias convergentes
en las que la 25-hidroxicetona de Grundmann es un precursor clave de los anillos CD y la
cadena lateral. El Capítulo 3 describe una estrategia alternativa para la preparación de este
compuesto basada en la oxidación selectiva de la cetona de Grundmann mediante la acción de

una monooxigenasa del grupo de los citocromos P450. El proceso biocatalítico fue llevado a
cabo in vivo por células recombinantes de Escherichia coli, modificadas para la expresión del
CYP154E1 de Thermobifida fusca YX, junto con dos sistemas de transferencia electrónica
distintos. En las condiciones óptimas de reacción, se logró una concentración de producto de
1.1 mM en menos de 24 h.

RESUMEN (en Inglés)
The numerous medical and technological advances developed with the advent of the 21st
century, have had a vast influence on scientific research, and therefore on Vitamin D as a
multidisciplinary research area. Thus, in the last decade, molecular modelling techniques, the
sequencing of human genome and an increasing number of chemical, physiological and
epidemiological studies, have enhanced our understanding of Vitamin D mechanisms of action.
Since the discovery of 1α,25-dihydroxyvitamin D3, the hormonally active form, its biological
actions have been shown to extend well beyond its classical functions in calcium homeostasis
to include regulation of immune and endocrine systems, as well as cell cycle among other
processes.
This PhD Thesis comprises three chapters, in which different Vitamin D3 aspects have been
studied from a synthetic perspective.
The first chapter describes the synthesis of novel 19-nor-1α,25-dihydroxyprevitamin D3
analogues bearing a 2-hydroxyethylidene group in different positions of the A-ring. The
presence of this function might favour different conformations of the A-ring of these 6-s-cis-
locked analogues, thus promoting different conformations of the hormone receptor and
therefore, different biological actions.
In the second chapter, the synthesis of C-3 modified 25-hydroxyvitamin D3 analogues and
their use as an analytic tool in the determination of vitamin D levels in biological samples is
described. Substitution consists in the introduction of a carbamate function that contains
hydrophilic groups such as alcohol or amino at the end of an exogenous alkyl chain.
Biotinlytated derivatives of these analogues were able to bind Vitamin D Binding Protein (DBP),
leading to a complex which was not recognized by anti-DBP antibodies. This afforded a method
to remove free DBP from a sample, improving the assay method.
The analogues described in Chapters 1 and 2 are synthetized though convergent strategies in
which 25-hydroxy Grundmann’s ketone is a key precursor for CD-ring/side chain formation.
Chapter 3 describes an alternative biocatalytic approach for the preparation of this compound
via selective oxidation of Grundmann’s ketone catalysed by a cytochrome P450
monooxygenase. Biotransformation was performed in vivo by recombinant Escherichia coli cells
expressing CYP154E1 from Thermobifida fusca YX along with two different redox partner
systems. Under the optimal conditions, a concentration of 1.1 mM of product was achieved in
less than 24 h.

SR. DIRECTOR DE DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÁNICA E INORGÁNICA

Abreviaturas y acrónimos

Å Angstrom
A Absorbancia
Ab Anticuerpo
AcO Acetato
5-ala Aminolevulinic acid
APCI Ionización química a presión atmosférica
Apo-DBP DBP libre
Bu Butilo
Bq Becquerel
CCF Cromatografía en capa fina
c Conversión
COSY Correlated Spectroscopy
Ci Curio
cpm Cuentas por minuto
CSA Ácido canforsulfónico
CPR Cytochrome P450 reductase from Candida apicola
CYP Cytochrome P450 (Citocromo P450)
DBP Vitamin D Binding Protein (proteína de transporte de
la vitamina D)
DIBAL-H Hidruro de diisobutilaluminio
DMAP N,N-Dimetilaminopiridina
Abreviaturas y acrónimos

DMF N,N-Dimetilformamida
DMSO Dimetilsulfóxido
δ Desplazamiento químico
d Doblete
ε Molar extintion coffecient
EIA Inmunoensayo enzymático
ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay
EM Espectrometría de masas
EMAR Espectrometría de masas de alta resoluciónESI Ionización por electrospray
Et Etilo
g Gramos
Fabs Fragment antigen-binding (fragmento de aticuerpo)
FAD Flavin adenine dinucleotide
FdR Flavodoxin reductase from Escherichia coli
FMN Flavin mononucleotide
g Acceleration due to gravity
GC Gas chromatography
GK Cetona de Grundmann
h hora
HEPES Ácido N-(2-hidroxietil)piperazin-N’-etanosulfónico
HMBC Heteronuclear Multiple bond Correlation
Holo-DBP DBP unida a la 25-OH-D
HPLC Cromatografía líquida de alta eficacia
HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence
Spectroscopy
Hz Hertzio
IR Espectroscopía de infrarrojo
IPTG β-D-1-thiogalactopyranoside
Abreviaturas y acrónimos

ITSD Internal standard
J Constante de acoplamiento
KPi Potassium phosphate buffer
LB Lysogeny or Luria Bertani broth
LHMDS Bis(trimetilsilil)amiduro de litio
m Metro
Multiplete
M Molar (mol·L
-1
)
Me Metilo
m/z Relación masa-carga
MOPS 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid
NAD Nicotinamide adenine dinucleotide
NADP Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
NOESY Two-dimensional Nuclear Overhouser Spectroscopy
OD Optical density
PBS Tampón fosfato salino
PdR Putidaredoxin reductase from Pseudomonas putida
Pdx Putidaredoxi from P. putida
PEG Polietilenglicol
PF Punto de fusión
Ph Fenilo
PMPI N-(p-maleimidofenil)isocianato
ppm Partes por millón
Pr Propilo
Py Piridina
q Cuatriplete
Rf Factor de retención
RIA Radioinmunoensayo
RMN Resonancia magnética nuclear
Abreviaturas y acrónimos

rpm Revolutions per minute
RU Refractive units (unidades de índice de refracción)
RXR Receptor X retinoide
s Segundo
Singulete
sa Singulete ancho
sat Saturado
sp. Species
SPR Surface plasmon resonance (Resonancia de plasmones
de superficie)
t Tiempo
t Triplete
t.a. Temperatura ambiente
TB Terrific broth
TBAF Fluoruro de tetrabutilamonio
TBDMS tert-Butildimetilsililo
TBDMSCl Cloruro de tert-butildimetilsililo
TBS tert-Butildimetilsililo
Tf Triflato
THF Tetrahidrofurano
TLC Cromatografía en capa fina
TMS Trimetilsililo
TMSCl Cloruro de trimetilsililo
Ts Tosilo
p-TsOH Ácido p-toluensulfónico
TTN Total turnover number
UI Unidades internacionales
UV/Vis Ultravioleta/Visible
ν Frecuencia
Abreviaturas y acrónimos

v/v Volumen por volumen
VDR Vitamin D Receptor (Receptor de la vitamina D)
YkuN Flavodoxin from Bacillus subtilis

Índice

Resumen ....................................................................... 1
Summary ....................................................................... 7
Introducción ................................................................ 13
I.1. Perspectiva histórica y aspectos nutricionales .......................... 15
I.2. Metabolismo de la vitamina D3 ................................................. 21
I.3. Estructura conformacional de la 1α,25-(OH)2-D3 ..................... 24
I.4. Equilibrio vitamina-previtamina ............................................... 26
I.5.1. Respuestas genómicas ........................................................ 29
I.5.2. Respuestas no-genómicas ................................................... 31
I.6. Aplicaciones terapéuticas de la vitamina D y sus análogos ...... 33
I.7. Métodos de síntesis de la vitamina D3 y sus análogos .............. 36
Capítulo 1. Síntesis de análogos estables de la previtamina
D3 con la función 2-hidroxietilideno en el anillo A ........ 41
1. Antecedentes .................................................................................. 43
1.1. Análogos de la 1α,25-(OH)2-previtamina D3 ........................... 43
1.2. Análogos 2-hidroxialquilideno sustituidos ............................... 50
2. Objetivos ........................................................................................ 53
3. Resultados y discusión .................................................................. 55
3.1. Síntesis del fragmento anillos CD-cadena lateral ..................... 56
3.2. Síntesis de precursores del anillo A .......................................... 58
3.2.1. Precursor del análogo 2-(2’-hidroxietilideno): anillo A C-4
sustituido ...................................................................................... 58
Índice

3.2.2. Precursor del análogo 1-(2’-hidroxietilideno): anillo A C-3
sustituido ....................................................................................... 63
3.2.2.1. Síntesis a partir del enino 4,5-di-OTBDMS protegido ..........63
3.2.2.2. Síntesis mediante la protección del diol trans .......................65
3.2.3. Precursor del análogo 3-(2’-hidroxietilideno): anillo A C-5
sustituido ....................................................................................... 68
3.3. Reacción de acoplamiento: síntesis de los derivados
previtamina ...................................................................................... 70
3.3.1. Síntesis de los derivados C-2 sustituidos ............................ 71
3.3.2. Síntesis del derivado C-1 sustituido ................................... 73
3.3.3. Síntesis de los derivados C-3 sustituidos ............................ 75
4. Conclusiones ................................................................................... 77
5. Parte experimental ......................................................................... 79
5.1. Condiciones de trabajo, disolventes y reactivos........................ 79
5.2. Técnicas instrumentales ............................................................ 81
5.3. Procedimientos sintéticos y datos experimentales .................... 82
Capítulo 2. Herramienta para la medida de niveles de
vitamina D en muestras biológicas: síntesis de análogos
C-3 sustituidos de la 25-hidroxivitamina D3 ............... 141
1. Antecedentes ................................................................................. 143
1.1. Medida de los niveles de vitamina D ...................................... 143
1.2. Análogos C-3 sustituidos ........................................................ 148
2. Objetivos ....................................................................................... 153
3. Resultados y discusión ................................................................. 155
3.1. Síntesis de derivados C-3 sustituidos de la 25-OH-D3 ............ 155
Índice

3.1.1. Primera aproximación: modificación del precursor del
anillo A ....................................................................................... 155
3.1.1.1. Síntesis del fragmento anillos CD/cadena lateral ........ 156
3.1.1.2. Síntesis de los precursores del anillo A ........................ 156
3.1.1.3. Acoplamiento de los precursores ........................................ 158
3.1.2. Estrategia alternativa: modificación de la estructura del
esteroide ..................................................................................... 159
3.1.2.1. Síntesis del fragmento anillos CD/cadena lateral ............... 159
3.1.2.2. Reacción de acoplamiento y síntesis de los derivados
carbamato ........................................................................................ 160
3.2. Aplicación a la determinación de niveles de vitamina D ....... 162
3.2.1. Formación de derivados biotinilados .............................. 162
3.2.2. Estudios de unión competitiva a la DBP con moléculas de
reconocimiento ........................................................................... 164
3.2.3. Estudios de desplazamiento de la [
3
H]25-OH-D3 ........... 168
3.2.4. Aplicación para la medida de niveles de vitamina D ...... 171
4. Conclusiones ................................................................................ 175
5. Parte experimental ...................................................................... 177
5.1. Desarrollodel ensayo ELISA para la medida de niveles de
vitamina D ..................................................................................... 178
5.2. Procedimientos sintéticos y datos experimentales .................. 179
Chapter 3. Whole-cell biotransformation with recombinant
cytochrome P450 for the selective oxidation of
Grundmann’s Ketone ............................................... 207
1. Overview ...................................................................................... 209
1.1. Cytochrome P450 monooxygenases ....................................... 209
1.2. Whole-cell biocatalysis........................................................... 213
Índice

2. Background .................................................................................. 219
2.1. P450s and vitamin D3 .............................................................. 219
2.2. Synthesis of 25-hydroxy-Grundmann’s Ketone ...................... 220
3. Aims ............................................................................................... 225
4. Results and discussion ................................................................. 227
4.1. Screening of recombinant P450s ............................................. 227
4.1.1. CYP105A1 ........................................................................ 227
4.1.1.1. Bacterial transformation and expression system for enzyme
production ........................................................................................227
4.1.1.2. Protein quantification ..........................................................229
4.1.1.3. Enzymatic reaction ..............................................................230
4.1.2. CYP109B1 ........................................................................ 230
4.1.3. CYP102A .......................................................................... 231
4.2. Whole-cell biotransformation ................................................. 232
4.2.1. First experiments with resting E. coli cells ...................... 232
4.2.2. Product inhibition ............................................................. 234
4.2.3. Effect of cell amount and oxygen supply .......................... 236
4.2.4. Influence of redox partners .............................................. 239
5. Conclusions ................................................................................... 243
6. Experimental section ................................................................... 245
6.1. Materials .................................................................................. 245
6.1.1. Chemicals and strains ...................................................... 245
6.1.2. Plasmids and enzymes ...................................................... 245
6.1.3. Buffers and culture media................................................. 246
6.2. Instrumental equipment ........................................................... 248
6.3. Molecular Biotechnology methods ......................................... 249
6.3.1. Plasmid preparation ......................................................... 249
Índice

6.3.2. Bacterial transformation .................................................. 249
6.3.2.1. Competent cells .................................................................. 249
6.3.2.2. Transformation ................................................................... 249
6.3.3. Protein production ........................................................... 250
6.3.3.1. CYP105A1 ......................................................................... 250
6.3.3.2. CYP102A family ................................................................ 250
6.4. Biocatalytic reactions ............................................................. 251
6.4.1. Cell-free bioconversions .................................................. 251
6.4.2. Whole-cell biocatalysts .................................................... 252
6.5. Analytical methods ................................................................. 253
6.5.1. CO-difference spectroscopy ............................................. 253
6.5.2. NADPH-consumption assay............................................. 254
6.5.3. GC-MS analysis ............................................................... 255
Bibliografía ............................................................... 257

Resumen

Los numerosos avances médicos y tecnológicos desarrollados con la
llegada del siglo XXI, han tenido una gran influencia en la investigación
científica y, por lo tanto, en la Vitamina D como área de investigación
multidisciplinar. Así, en la última década, el empleo de técnicas de
modelización molecular, la secuenciación del genoma humano y el
creciente número de estudios químicos, fisiológicos y epidemiológicos,
han mejorado nuestro conocimiento acerca de los modos de acción de la
vitamina D en el organismo. Desde el descubrimiento de la
1α,25-dihidroxivitamina D3, la forma hormonalmente activa, se ha
demostrado que su actividad biológica va mucho más allá de su clásica
función en la regulación de la homeostasis del calcio, incluyendo la
regulación del sistema inmune y endocrino, así como el control del ciclo
celular, entre otros procesos.
Esta Tesis Doctoral está dividida en tres capítulos, cada uno de los
cuales aborda diferentes aspectos de la vitamina D3 desde una
perspectiva sintética.
Resumen

El primer capítulo describe la síntesis de nuevos análogos 19-nor de
la 1α,25-dihidroxiprevitamina D3 con la función 2-hidroxietilideno en
distintas posiciones del anillo A. La presencia de este grupo puede
favorecer diferentes conformaciones del anillo A de estos análogos
bloqueados en la forma 6-s-cis, promoviendo diferentes conformaciones
del receptor hormonal y, por consiguiente, diferentes respuestas
biológicas.
En el segundo capítulo, se aborda la preparación de análogos de la
25-hidroxivitamina D3 modificados en la posición C-3 y su uso como
herramienta analítica para la determinación de niveles de vitamina D en
muestras biológicas. Dicha modificación consiste en la introducción de
una función carbamato que contiene un grupo hidrofílico, como por
ejemplo un alcohol o una amina, al final de una cadena alquílica. Los
derivados biotinilados de estos análogos son capaces de unirse a la
proteína de unión de la vitamina D (DBP, Vitamin D Binding Protein),
dando lugar a un complejo que no es reconocido por anticuerpos
específicos anti-DBP, proporcionando un método para la eliminación de
la DBP libre en una muestra y mejorando el método de medida.
Los análogos descritos en los Capítulos 1 y 2 se sintetizan mediante
estrategias convergentes en las que la 25-hidroxicetona de Grundmann es
un precursor clave de los anillos CD y la cadena lateral. El Capítulo 3
describe una estrategia alternativa para la preparación de este compuesto
basada en la oxidación selectiva de la cetona de Grundmann mediante la
acción de una monooxigenasa del grupo de los citocromos P450. El
proceso biocatalítico fue llevado a cabo in vivo por células recombinantes
de Escherichia coli, modificadas para la expresión del CYP154E1 de
Thermobifida fusca YX, junto con dos sistemas de transferencia
Resumen

electrónica distintos. En las condiciones óptimas de reacción, se logró
una concentración de producto de 1.1 mM en menos de 24 h.
Parte de los resultados obtenidos a lo largo de esta Tesis Doctoral
han sido publicados en los siguientes artículos:
“Synthesis of vitamin D3 analogues with A-ring modifications to
directly measure vitamin D levels in biological samples”. A. Hernández-
Martín, T. González-García, M. Lawlor, L. Preston, V. Gotor,
S. Fernández y M. Ferrero, Bioorg. Med. Chem. 2013,21, 7779-7789.
“Whole-cell biotransformation with recombinant cytochrome P450
for the selective oxidation of Grundmann’s ketone”. A. Hernández-
Martín, C. J. von Bühler, F. Tieves, S. Fernández, M. Ferrero y V. B.
Urlacher, Bioorg. Med. Chem. 2014, doi: 10.1016/j.bmc.2014.06.005
“Synthesis of 6-s-cis and 6-s-trans A-Ring Modified Vitamin D
Analogues”. S. Fernández, A. Hernández-Martín, T. González-García y
M. Ferrero, Curr. Top. Med. Chem. 2014, doi:

Summary

The numerous medical and technological advances developed with
the advent of the 21
st
century, have had a vast influence on scientific
research, and therefore on Vitamin D as a multidisciplinary research area.
Thus, in the last decade, molecular modelling techniques, the sequencing
of human genome and an increasing number of chemical, physiological
and epidemiological studies, have enhanced our understanding of
Vitamin D mechanisms of action. Since the discovery of
1α,25-dihydroxyvitamin D3, the hormonally active form, its biological
actions have been shown to extend well beyond its classical functions in
calcium homeostasis to include regulation of immune and endocrine
systems as well as cell cycle, among other processes.
This PhD Thesis comprises three chapters, in which different
Vitamin D3 aspects have been studied from a synthetic perspective.
The first chapter describes the synthesis of novel 19-nor-1α,25-
dihydroxyprevitamin D3 analogues bearing a 2-hydroxyethylidene group
in different positions of the A-ring. The presence of this function might
Summary

favour different conformations of the A-ring chair of these 6-s-cis-locked
analogues, thus promoting different conformations of the hormone
receptor and therefore, different biological actions.
In the second chapter, the synthesis of C-3 modified
25-hydroxyvitamin D3 analogues and their use as an analytic tool in the
determination of vitamin D levels in biological samples is described.
Substitution consists in the introduction of a carbamate function that
contains hydrophilic groups such as alcohol or amino at the end of an
exogenous alkyl chain. Biotinlytated derivatives of these analogues were
able to bind the Vitamin D Binding Protein (DBP), leading to a complex
which was not recognized by anti-DBP antibodies. This afforded a
method to remove free DBP from a sample, improving therefore the
assay method.
The analogues described in Chapters 1 and 2 are synthetized though
convergent strategies in which 25-hydroxy Grundmann’s ketone is a key
precursor for CD-ring/side chain formation. Chapter 3 describes an
alternative biocatalytic approach for the preparation of this compound via
selective oxidation of Grundmann’s ketone catalysed by a cytochrome
P450 monooxygenase. Biotransformation was performed in vivo by
recombinant Escherichia coli cells expressing CYP154E1 from
Thermobifida fusca YX along with two different redox partner systems.
Under the optimal conditions, a concentration of 1.1 mM of product was
achieved in less than 24 h.

Summary

Part of the results obtained along this PhD Thesis have been
published in:
“Synthesis of vitamin D3 analogues with A-ring modifications to
directly measure vitamin D levels in biological samples”. A. Hernández-
Martín, T. González-García, M. Lawlor, L. Preston, V. Gotor,
S. Fernández and M. Ferrero, Bioorg. Med. Chem. 2013, 21, 7779-7789.
“Whole-cell biotransformation with recombinant cytochrome P450
for the selective oxidation of Grundmann’s ketone”. A. Hernández-
Martín, C. J. von Bühler, F. Tieves, S. Fernández, M. Ferrero and V. B.
Urlacher, Bioorg. Med. Chem. 2014, doi: 10.1016/j.bmc.2014.06.005
“Synthesis of 6-s-cis and 6-s-trans A-Ring Modified Vitamin D
Analogues”. S. Fernández, A. Hernández-Martín, T. González-García
and M. Ferrero, Curr. Top. Med. Chem. 2014, doi:

Introducción

I.1. Perspectiva histórica y aspectos nutricionales
El término vitamina, según lo define la Real Academia Española,
hace referencia a “cada una de las sustancias orgánicas que existen en
los alimentos y que, en cantidades pequeñísimas, son necesarias para el
perfecto equilibrio de las diferentes funciones vitales”.
Etimológicamente proviene de la expresión “amina vital”, acuñada a
principios del s. XX para referirse a una serie de micronutrientes que, a
parte de las proteínas, grasas, carbohidratos y minerales esenciales, eran
fundamentales para la prevención y cura de ciertas enfermedades y que
en un principio se creyó, erróneamente, que eran aminas. Así, a la
sustancia encontrada en el salvado de arroz capaz de curar el beriberi
(enfermedad caracterizada por una intensa fatiga) se le dio el nombre de
vitamina B. Por analogía, al factor liposoluble encontrado en la
mantequilla capaz de prevenir enfermedades oculares, se le denominó
vitamina A. En la misma época se identificó en la fruta la vitamina C,
Introducción

base para la prevención del escorbuto. En estas circunstancias, el
descubrimiento de un factor liposoluble presente en el hígado de bacalao
capaz de prevenir y curar el raquitismo, dio lugar a la calificación de
vitamina D para dicho factor.
[1]

De hecho, la historia del descubrimiento de la vitamina D
(o calciferol) está íntimamente relacionada con el estudio de esta
enfermedad. El raquitismo es una enfermedad infantil caracterizada por
dolor y deformaciones en los huesos y un crecimiento deficiente, y que
recibe el nombre de osteomalacia cuando se da en adultos. Con escasa
incidencia en la antigüedad, esta enfermedad se tornó prácticamente
endémica en el s. XIX. El éxodo rural y el aumento de la contaminación
atmosférica ocasionados por la Revolución Industrial, dieron lugar a una
disminución drástica de la exposición de la población al sol, convirtiendo
el raquitismo en un grave problema de salud, siendo más acentuado en
países con baja incidencia de los rayos solares, como Inglaterra, llegando
a conocerse la enfermedad como el “mal inglés”. Sin embargo, y pese a
las observaciones que habían hecho Sniadecki y Palm al respecto ya en
1822 y 1890 respectivamente, la relación directa entre una exposición al
sol deficiente y la incidencia del raquitismo fue pasada por alto.
[2]

Así, la cura de esta enfermedad se centró en el remedio introducido
por Bretonneau y su alumno Trousseau en 1827: el empleo de aceite de
hígado de bacalao y de otros pescados grasos; aunque realmente, no se
sabía cuál era el principio activo que trataba la enfermedad.
[3]
Con el
descubrimiento de las vitaminas, Mellanby pensó, en 1919, que podría
ser uno de estos micronutrientes el que, presente en el hígado de bacalao,
le confiriera sus propiedades antirraquíticas. Para probar su hipótesis,
llevó a cabo diversos experimentos administrando dietas controladas a
perros con raquitismo, los cuales, criados en interiores, mejoraban
Introducción

notablemente tras el tratamiento con aceite de hígado de bacalao.
[4]
Sin
embargo, Mellanby no pudo confirmar si tal mejora era causada por la
vitamina A, la cual se sabía estaba presente en dicho aceite, o era debida
a otra sustancia aún desconocida. Fue McCollum
[5]
quien demostró que,
pese a la destrucción de la vitamina A por aireación y calentamiento del
aceite de hígado de bacalao, su efecto antirraquítico persistía,
confirmando que se trataba de otra sustancia, a la que llamó vitamina D
por ser la cuarta vitamina identificada.
Paralelamente, al tiempo que la vitamina D era descubierta en el
aceite de hígado de bacalao, Huldschinsky
[6]
demostró por primera vez,
sometiendo a niños con raquitismo a la radiación de una lámpara de
mercurio, que la exposicióna la luz ultravioleta era la responsable del
factor antirraquítico de la luz solar postulado por Sniadecki. Inspirado
por este experimento, Steenbock realizó diversos estudios en el campo,
llegando a la conclusión de que por irradiación solar de los animales o de
sus alimentos, se inducía la activación de una sustancia que pasaba de ser
inactiva a tener actividad de vitamina D.
[7]
Los estudios de Steenbock
sentaron la base para la preparación de alimentos fortificados con
vitamina D, centrándose en los de mayor consumo entre los niños: la
leche y los cereales. Esta medida resultó en la práctica erradicación del
raquitismo en Norteamérica y Europa.
[8]
Fueron también estos estudios
los que inspiraron a Windaus y sus colaboradores, cuyo trabajo condujo a
la identificación de las dos formas principales de la vitamina D: la
vitamina D2 (ergocalciferol, 1, Figura 1), presente en las plantas; y la
vitamina D3 (colecalciferol, 2), sintetizada por los animales a partir del
7-deshidrocolesterol por acción de la luz solar sobre la piel. Además, el
desarrollo de rutas sintéticas para la preparación química de estos
metabolitos, acabó con la era del aislamiento a partir de fuentes naturales,
Introducción

haciéndolos mucho más accesibles para la industria alimentaria y
farmacéutica y valiéndole a Windaus la concesión del Premio Nobel de
Química en 1928.
[9]

Figura 1. Formas nutricionales y hormonalmente activas de la vitamina D.
La constatación de que la vitamina D3 puede ser sintetizada por el
organismo a partir de la acción de la luz solar sobre la piel, le ha valido el
apelativo de la “vitamina del sol”, si bien este mismo hecho, hace que
este metabolito no sea estrictamente una vitamina. El estudio del
metabolismo de este compuesto, que se verá más adelante, dio lugar al
descubrimiento de que en realidad, la vitamina D (tanto D2 como D3
cuando se escriba sin subíndice) no es el compuesto activo en el
organismo, sino su metabolito dihidroxilado, la 1α,25-dihidroxivitamina
D [3 y 4, 1α,25-(OH)2-D, Figura 1], cuya función en el organismo es
puramente hormonal. Por lo tanto, la vitamina D es considerada en la
actualidad una pro-hormona.
Una vez establecido inequívocamente el papel esencial de esta
hormona en el mantenimiento del esqueleto a través de la regulación de
la homeostasis del calcio y el fósforo, se creyó durante décadas que éstas
eran las únicas funciones de la vitamina D en el organismo. Sin embargo,
hoy en día, hay claros indicios para afirmar que la regulación del sistema
Introducción

óseo es sólo la punta del iceberg de los múltiples procesos regulados por
la 1α,25-(OH)2-D. Como hormona, la vitamina D transmite señales a los
diferentes tejidos a través de su unión con un receptor específico (VDR,
Vitamin D Receptor). Pues bien, este receptor ha sido encontrado en la
mayoría de los tejidos y células del organismo, sugiriendo un espectro de
acción para esta hormona esteroidea mucho más amplio de lo que se
pensó en un principio. Diversos estudios han ligado la incidencia de
enfermedades crónicas en países de latitudes más altas con un déficit de
vitamina D, concretamente diversos cánceres, enfermedades
autoinmunes, diabetes, enfermedades infecciosas, desórdenes
cardiovasculares o enfermedades mentales.
[10]

La principal fuente de la que los humanos obtenemos la vitamina D
sigue siendo la luz solar. Por supuesto, la exposición al sol debe
realizarse siempre de forma controlada: de la primavera al otoño, unos
5-10 min al sol con los brazos y las piernas descubiertos proporcionan
una media de 3000 unidades internacionales (UI)
*
de vitamina D3 sin
suponer un riesgo para el desarrollo de cáncer de piel y otras
enfermedades asociadas. Sin embargo, en función de la edad, el tono de
piel, los hábitos culturales y personales o la situación geográfica, esta
fuente puede no ser suficiente para alcanzar unos niveles adecuados. Por
ejemplo, en países con una latitud por encima o por debajo de 35º,
†
la
síntesis de vitamina D3 durante el invierno es prácticamente nula. El
ángulo de incidencia de los rayos solares en esta estación es mucho más
oblicuo, siendo los rayos UVB, responsables de la activación del
7-deshidrocolesterol para la formación de vitamina D3, filtrados
prácticamente en su totalidad por la capa de ozono.
[11]

*
40 UI = 1 μg vitamina D
†
Latitud en la Península Ibérica: 36-43º N. Europa: 35-70º N.
Introducción

¿De qué otras fuentes puede obtenerse entonces la tan necesaria
vitamina D? En la dieta, la mayor fuente la constituye el pescado azul,
destacando el salmón (600-1000 UI por 100 g) y las sardinas (~300 UI
por 100 g). También, por supuesto, está presente en los alimentos
fortificados: un vaso de leche aporta unas 100 UI, la misma cantidad que
un yogur o una ración de cereales. Basándose en estos datos, la siguiente
pregunta que se plantea es: ¿cuántas unidades internacionales son
necesarias para mantener unos niveles de vitamina D correctos? Según el
último informe del Instituto Estadounidense de Medicina (IOM,
2011),
[12]
las cantidades diarias recomendadas de vitamina D para
mantener una correcta salud ósea y considerando una mínima exposición
solar, son las reflejadas en la Tabla 1.
Tabla 1. Cantidades dietéticas recomendadas de vitamina D con una mínima exposición
solar según el informe del Instituto Estadounidense de Medicina de 2011.
[12]

Grupo de edad CDR
a
(UI
b
) Máximo diario
c
(UI
b
)
0-6 meses
400
1000
6-12 meses 1500
1-3 años
600
2500
4-8 años 3000
9-50 años
d

4000 51-70 años
>70 años 800
a
Cantidad diaria recomendada.
b
Unidades internacionales (40 UI = 1 μg vitamina D).
c
Máxima ingesta diaria en la dieta o en forma de suplemento dietético por encima de la
cual, de forma continuada, podrían presentarse efectos adversos. No existe ningún
riesgo de intoxicación por síntesis cutánea (exposición al sol).
d
Embarazo/lactancia
(14-50 años): mismos niveles de vitamina D pero con mayores aportes de calcio.
Introducción

Estas recomendaciones coinciden con las dictadas por el Comité
Permanente de Médicos Europeos (CPME) en su informe del año
2009,
[13]
en el que se dictaminó que aproximadamente el 50% de la
población europea presentaba un déficit de vitamina D. En este informe,
se hace también hincapié en la dificultad para alcanzar unos niveles
adecuados a partir de fuentes naturales con los hábitos de vida actuales,
ratificando la incorporación de alimentos fortificados y suplementos
dietéticos como las opciones más viables para mejorar la situación
generalizada de déficit.

I.2. Metabolismo de la vitamina D3
La formación de vitamina D3 en la piel de los animales se
desencadena cuando los rayos ultravioleta B (λ = 290 – 315 nm) penetran
la epidermis e inciden sobre el 7-deshidrocolesterol (5, Esquema 1), el
cual, mediante una apertura electrocíclica fotoquímica, se transforma en
la previtamina D3 (6).
[14]
Este producto es inestable a la temperatura
fisiológica, dando lugar a través de una transposición sigmatrópica [1,7]
de hidrógeno a la vitamina D3 en su confórmero 6-s-cis (2’), el cual se
isomeriza espontáneamente a la forma termodinámicamente más estable
6-s-trans (2). Alternativamente a este proceso, cuando la exposición solar
ha sido prolongada, la previtamina D3, en lugar de isomerizarse a la
forma vitamina, sufre un nuevo proceso de isomerización fotoquímica
dando lugar a los metabolitos inactivos lumisterol y taquisterol (8 y 9
respectivamente, Figura 2), lo cual descarta la posibilidad de intoxicación
por hipervitaminosis mediante esta vía.
[15]

Introducción

Esquema 1. Biosíntesis de la 1α,25-(OH)2-D3 y sus metabolitos.

Introducción

La vitaminaD3 (2) sintetizada en la piel, o incorporada en la dieta
(el proceso metabólico es equivalente para la vitamina D2), puede ser
almacenada en los adipocitos para su posterior liberación o puede pasar
directamente al torrente sanguíneo, donde, dada su alta lipofilia, se une
inmediatamente a su proteína de transporte, la DBP (Vitamin D Binding
Protein), una proteína polimórfica multifuncional cuya principal función
es transportar los distintos metabolitos de la vitamina D. La vitamina D3
también puede encontrarse unida en menor medida a albúmina o
quilomicrones, estos últimos principalmente tras su absorción en el
intestino delgado.
[16]

Figura 2. Productos de inactivación fotoquímica de la previtamina D3.
Una vez en el torrente sanguíneo, la mayoría de la vitamina D3 es
hidroxilada rápidamente en el hígado en la posición C-25 de la cadena
lateral. Esta reacción es catalizada enzimáticamente por una hidroxilasa
de la familia de los citocromos P450 (CYPs), siendo el de mayor
actividad el CYP2R1, aunque se conocen tres más: CYP27A1, CYP2J2 y
CYP3A4. El producto de esta reacción, la 25-hidroxivitamina D3
(7, 25-OH-D3), es el metabolito mayoritario de la vitamina D3 en la
sangre y el usado como indicador en la medida del estatus corporal de
vitamina D3.
Introducción

En la siguiente etapa, la 25-OH-D3 es transportada hasta el riñón
donde, en función de las necesidades del organismo, puede sufrir dos
tipos de transformaciones. Si los parámetros fisiológicos regulados por la
vitamina D son los correctos, se procede a la degradación de la misma a
través de un proceso catalizado por el CYP24A1 que, a través de la
hidroxilación de la posición C-24, desencadena un proceso de
degradación en cascada que conduce a la excreción de la vitamina D. Por
el contrario, si alguno de estos parámetros se encuentra fuera de su rango
óptimo, el CYP27B1 cataliza la hidroxilación totalmente
diastereoselectiva de la posición C-1, originando la
1α,25-dihidroxivitamina D3 [4, 1α,25-(OH)2-D3, calcitriol], compuesto en
el que reside la actividad hormonal de la vitamina D. La 1α,25-(OH)2-D3
así sintetizada, es transportada por la DBP hasta los distintos tejidos,
desencadenando las correspondientes respuestas biológicas a través de su
unión al VDR, localizado principalmente en el núcleo de las células
diana, donde regula la expresión de distintos genes, como por ejemplo los
de las proteínas de transporte implicadas en la absorción de calcio en el
intestino o los que regulan la absorción y liberación de calcio en los
osteoblastos.
[17]

I.3. Estructura conformacional de la 1α,25-(OH)2-D3
Desde el punto de vista estructural, la 1α,25-(OH)2-D3 es un seco-B
esteroide cuya estructura dinámica resulta crucial para determinar su
papel biológico ligado a la unión selectiva al receptor (VDR), proteínas
transportadoras (DBP) y los diversos enzimas que pertenecen a su ruta
metabólica (CYPs).
Introducción

La estructura de la 1α,25-dihidroxivitamina D3 se puede dividir en
cuatro partes: el anillo A, la parte triénica, los anillos CD y la cadena
lateral (Figura 3).

Figura 3. Estructura de la 1α,25-(OH)2-D3.
En comparación con otras hormonas esteroideas, la 1α,25-(OH)2-D3
presenta una estructura conformacional inusualmente flexible.
[18]
Esta
flexibilidad reside en tres regiones de la molécula:
a) El anillo A, donde en disolución hay un equilibrio dinámico entre
las dos posibles conformaciones de silla, α y β (Esquema 2), de modo
que los hidroxilos en las posiciones 1α y 3β intercambian las posiciones
axiales y ecuatoriales, lo que las hace energéticamente similares y por
tanto, se encuentran presentes en proporciones equimoleculares.
[19]
La
conformación de bote intermedia apenas existe en el equilibrio, siendo
únicamente una conformación de paso entre las otras dos mucho más
estables.

Esquema 2. Confórmeros de silla del anillo A.
Introducción

b) El sistema triénico, caracterizado por tener una disposición que,
según los estudios electrónicos, presenta sólo dos de los tres dobles
enlaces conjugados. La conjugación se daría entre los que se encuentran
haciendo de puente entre el anillo A y el resto de la molécula, quedando
en un plano diferente el que afecta al metileno exocíclico del anillo A
(C-19). El enlace sencillo entre los carbonos C-6 y C-7 puede girar
libremente 360°. Esta característica, fruto de la apertura del anillo B,
marca una diferencia muy significativa con respecto a otros esteroides y
es además causante de que haya dos posibles conformaciones, 6-s-cis y
6-s-trans, que se analizarán más adelante.
c) La cadena lateral, que está constituida por ocho carbonos y un
hidroxilo en la posición C-25. Se trata de la unidad estructural más
flexible de la hormona. Posee seis enlaces sencillos que pueden rotar
libremente y generar un número muy elevado de conformaciones
posibles. Estudios de mecánica molecular indican que el confórmero de
menor energía es aquel en el que la cadena lateral adopta una posición
más alejada de los anillos CD, evitando así repulsiones.
[20]

Toda esta flexibilidad choca con la relativa rigidez de los anillos
CD, que tienen una conformación de silla fusionada y pueden ser
considerados el vínculo de unión de las otras partes de la molécula
mucho más flexibles.

I.4. Equilibrio vitamina-previtamina
A la temperatura fisiológica de 37 ºC, todos los metabolitos de la
vitamina D con estructura secoesteroidal se encuentran en equilibrio
entre tres formas diferentes (Esquema 3).
Introducción

Por una parte, la libertad de giro entorno al enlace sencillo C6C7
da lugar a dos posibles conformaciones: la forma 6-s-cis (4’), que
presenta estructura esteroidea, y la 6-s-trans (4), confórmero mayoritario
en el equilibrio que presenta una estructura extendida y cuya formación
está impulsada por su mayor descongestión estérica.
Por otro lado, los confórmeros 6-s-cis y 6-s-trans están a su vez en
equilibrio con la correspondiente forma previtamina (10). Esto es debido
a la reversibilidad térmica de la reacción de transposición sigmatrópica
[1,7] implicada en la transformación intramolecular en la piel de la
previtamina D3 en la vitamina D3. En el caso del metabolito
hormonalmente activo, la 1α,25-(OH)2-D3, la proporción a 37 ºC de la
forma previtamina en el equilibrio es de un 5-10%, isomerizándose a la
forma vitamina con una vida media de tan solo 13.4 horas.
[21]

Esquema 3. Equilibrio entre las formas previtamina y vitamina de la 1α,25-(OH)2-D3.
Introducción

La presencia de este equilibrio hace posible que, en función de las
características del centro activo del receptor a través del cual la hormona
emite su señal, haya un desplazamiento del mismo hacia el confórmero
más favorecido para la unión a dicho centro activo. De esta manera,
desde el punto de vista de la relación estructura-actividad, diferentes
confórmeros pueden desencadenar distintas respuestas biológicas.
Estudios biológicos con distintos compuestos bloqueados en las
estructuras cisoide o transoide sugieren que la forma 6-s-trans es la
responsable de las respuestas biológicas de tipo genómico y la forma
6-s-cis o de previtamina de aquellas de tipo no-genómico, también
llamadas respuestas rápidas.
[18,22,23]

La 1α,25-(OH)2-D3 pertenece al grupo de las hormonas esteroideas.
Como tal, actúa en el organismo como mensajero químico, transmitiendo
señales que regulan la expresión genética a través de su unión a un
receptor de la superfamilia de los receptores nucleares.
[24]
En el caso de
la 1α,25-(OH)2-D3 dicho receptor se conoce como receptor de la
vitamina D (VDR) y fue inicialmente identificado como una proteína
asociada a la cromatina capaz de unirse a la 1α,25-(OH)2-D3 en 1969.
[25]

Para estas hormonas, además del control genéticoefectuado en el
núcleo, en los últimos años se han encontrado indicios de la presencia de
variedad de receptores asociados a la membrana plasmática, sobre los
cuales la unión del ligando desencadenaría otro tipo de respuestas de
naturaleza no-genómica.
[26]

El principal elemento que diferencia las respuestas genómicas de las
no-genómicas es el tiempo que tardan en hacerse efectivas tras la
administración de 1α,25-(OH)2-D3. De esta manera, las respuestas a nivel
genómico transcurren en horas o incluso días y pueden ser bloqueadas
Introducción

por inhibidores a nivel transcripcional o translacional. Sin embargo, las
respuestas de tipo no-genómico tienen lugar en cuestión de varios
minutos, por lo que reciben comúnmente el nombre de respuestas rápidas
(RR).
[27]

I.5.1. Respuestas genómicas
Las respuestas genómicas son desencadenadas por la unión de la
1α,25-(OH)2-D3 al VDR presente en el núcleo celular en su modo de
acción más clásico.
En el núcleo, el VDR se encuentra asociado al receptor X retinoide
(RXR), receptor específico del ácido retinoico. La unión de la
1α,25-(OH)2-D3 al VDR provoca la unión de éste a una molécula del
RXR libre, formando un heterodímero que constituye el complejo activo
para la transducción de la señal hormonal.
Una vez formado, el complejo hormona-VDR-RXR se une a
secuencias específicas del ADN llamadas elementos de respuesta
(VDREs) y que están presentes en los genes regulados por la vitamina D.
Esta unión está favorecida por un cambio conformacional en la estructura
de la proteína en el VDR. Dicho cambio en la estructura desencadena a
su vez la unión de distintos comoduladores (coactivadores o
correpresores) al complejo hormona-VDR-RXR-ADN, regulando así la
transcripción genética (Figura 4).
Así como el VDR se encuentra distribuido en la práctica totalidad de
los tejidos humanos, también los elementos de respuesta están presentes
en multitud de genes. De esta manera, la 1α,25-(OH)2-D3 regula la
expresión de genes relacionados con el sistema óseo, el sistema inmune,
el ciclo celular (proliferación, diferenciación, migración y muerte), los
Introducción

procesos de eliminación de xenobióticos y el metabolismo de
aminoácidos, lípidos y carbohidratos.
[28]

Figura 4. Modos de acción de la 1α,25-(OH)2-D3.
Introducción

I.5.2. Respuestas no-genómicas
Además de las respuestas relacionadas con la transcripción genética,
la 1α,25-(OH)2-D3 desencadena en el organismo una serie de respuestas
que se hacen efectivas de manera demasiado rápida como para ser
explicadas por el mecanismo de regulación genética descrito
anteriormente. Algunos ejemplos de este tipo de respuestas son la
apertura de canales de Cl
-
y Ca
2+
en los osteoblastos, la secreción de
insulina en el páncreas o la contracción de las células del miocardio.
[29]

En estos estudios, el 1α,25-(OH)2-lumisterol3 (11, Figura 5), análogo de
la vitamina D bloqueado en configuración esteroidea o cisoide, mostró
ser agonista de estas respuestas, mientras que el análogo 1β,25-(OH)2-D3
(12), de configuración trans, mostró propiedades opuestas. Estos
resultados confirman la teoría de que las respuestas genómicas y no-
genómicas son desencadenadas por distintos confórmeros de la
1α,25-(OH)2-D3.
[30]

Figura 5
Este tipo de respuestas tiene lugar fuera del núcleo celular,
principalmente en la membrana plasmática (Figura 4). Esto llevó a pensar
durante años que existía un VDR alternativo, responsable de estas
respuestas. Sin embargo, hoy en día parece haber evidencias claras de la
existencia de un único VDR.
[31]

Introducción

El hecho de que, por un lado, conformaciones distintas de la
hormona originen distintos tipos de respuestas y que, por otro, se haya
identificado un único receptor, parece contradictorio. De acuerdo con la
estructura de rayos X del VDR unido a la 1α,25-(OH)2-D3, éste posee un
único hueco de unión al que se une estrictamente la forma
6-s-trans.
[32]
Sin embargo, estudios de modelización molecular utilizando
el 1α,25-(OH)2-lumisterol3 han demostrado la existencia de un hueco de
unión alternativo al que pueden unirse la hormona natural o distintos
análogos bloqueados en conformación 6-s-cis. Según estos estudios,
ambos huecos, el denominado hueco genómico (VDR-GP) y el hueco
alternativo (VDR-AP), estarían parcialmente solapados, utilizando en los
dos casos los mismos puntos de unión para acomodar el anillo A
(Figura 6).
[33]

Figura 6. Representación esquemática del modelo molecular del VDR con los
dos huecos de unión. En amarillo está representado el hueco genómico (VDR-
GP), en azul el hueco alternativo (VDR-AP) y en rosa la zona de unión común
del anillo A para ambos huecos. Imagen extraída de Haussler et al.
[28]

Introducción

I.6. Aplicaciones terapéuticas de la vitamina D y sus análogos
A pesar de la eficacia probada de la 1α,25-(OH)2-D3 en el
tratamiento de desórdenes hiperproliferativos (cáncer o psoriasis),
endocrinos (hiperparatiroidismo) o de inmunodeficiencia, los efectos
calcémicos inducidos a su vez limitan su uso como fármaco.
Para solventar este problema, la química médica ha realizado en las
últimas décadas un gran esfuerzo sintético con el objetivo de desarrollar
derivados de la vitamina D con aplicación clínica. En la síntesis de estos
análogos se busca como objetivo principal la disociación de los efectos
beneficiosos, como por ejemplo la actividad antiproliferativa, de los
efectos perjudiciales, como son la hipercalcemia y la hiperfosfatemia. De
los más de tres mil análogos de la vitamina D sintetizados y evaluados
biológicamente, varios han mostrado cumplir este requisito y han pasado
a ser probados en ensayos clínicos. Como resultado de estos ensayos,
más de una decena de ellos han sido aprobados para su uso como
fármacos en el tratamiento de la osteoporosis, la psoriasis y el
hiperparatiroidismo secundario, entre otros. Asimismo, otros, aun no
comercializados, han demostrado cierta eficacia en ensayos clínicos
relacionados con el tratamiento del cáncer de próstata, colon, mama o
leucemia.
[34]

Además de la vitamina D2, la vitamina D3 y la 25-OH-D3, los
principales análogos actualmente comercializados como medicamentos o
en estudios clínicos avanzados se muestran en la Figura 7.
Cabe destacar, que tanto los metabolitos naturales como algunos de
los análogos ya aprobados para determinadas enfermedades, están
igualmente en ensayos clínicos para el tratamiento de otras
enfermedades, principalmente como anticancerígenos.
Introducción

Figura 7. Análogos de la vitamina D comercializados como fármacos o en fases
avanzadas de ensayos clínicos.

Introducción

Figura 7 (cont.). Análogos de la vitamina D comercializados como fármacos o
en fases avanzadas de ensayos clínicos.

Introducción

I.7. Métodos de síntesis de la vitamina D3 y sus análogos
El elevado potencial terapéutico de la 1α,25-(OH)2-D3 y sus
análogos, ha dado lugar al desarrollo de un gran número de estrategias
sintéticas para su preparación.
[35,36]
Éstas pueden ser clasificadas en dos
grandes grupos: las que realizan modificaciones directas sobre la propia
vitamina, sus derivados, o sus precursores esteroideos, y las síntesis
convergentes.
El primer grupo se encuentra esquematizado en la Figura 8. Entre
los distintos procedimientos, la ruta A representa el método clásico de
síntesis de la vitamina D3. Basado en la biosíntesis de la misma, consiste
en la apertura fotoquímica del 7-deshidrocolesterol u otras provitaminas
y constituye el procedimiento industrial para su preparación.
[37]
Otros
métodos consisten en la modificación directa de la vitamina D2 o D3, o de
alguno de sus metabolitos y/o análogos (rutas B y C).

Figura 8. Rutasde acceso a la vitamina D y sus análogos por modificación
directa de la estructura.
Introducción

Las rutas convergentes son las más numerosas y utilizadas.
Esencialmente, consisten en la síntesis por separado del anillo A y del
fragmento que comprende los anillos CD y la cadena lateral, generándose
la parte triénica a partir del acoplamiento de ambos precursores.

Figura 9. Síntesis convergentes de la vitamina D y sus análogos (I).
Una de las primeras aproximaciones, desarrollada por Lythgoe
[38–40]

(ruta D, Figura 9), consiste en la formación de la parte triénica mediante
una reacción de olefinación de tipo Horner-Wittig entre una cetona
precursora de los anillos CD/cadena lateral 28 y el correspondiente óxido
de fosfina del anillo A 27. El principal inconveniente de esta ruta ha sido
durante años la laboriosa síntesis del precursor 27, en un proceso largo y
con bajos rendimientos globales. Sin embargo, hoy en día, gracias a la
aportación de diversos grupos,
[41,42]
este método ha sido mejorado
sustancialmente, gozando de alta popularidad.
Una alternativa a este procedimiento consiste en la formación de la
parte triénica mediante el acoplamiento de una cetona precursora del
anillo A (30) con una sulfona derivada de los anillos CD/cadena lateral
Introducción

(29), a través de una olefinación de tipo Julia (ruta E, Figura 9).
[43]
Su
aplicación en la preparación de la parte triénica fue descrita por primera
vez por Kittaka et al.,
[44]
suponiendo una reducción en las etapas de
reacción con respecto al acoplamiento de Lythgoe y unos rendimientos
globales mejorados.
El método F (Figura 9) implica el acoplamiento cruzado, catalizado
por paladio, de un precursor acíclico del anillo A 32 con el bromuro
vinílico del fragmento anillos CD-cadena lateral 31, formándose
directamente el esqueleto de la vitamina D.
[45]

Otra de las aproximaciones pioneras fue la desarrollada por
Mazur
[46]
(ruta G, Figura 9), que se basa en la interconversión entre la
vitamina D y la 3,5-ciclovitamina D 33, la cual puede ser modificada
fácilmente en posición C-1. Esta ruta ha sido posteriormente ampliada
gracias a la preparación por separado de distintos derivados del
biciclo[3.1.0]hexano 34 como precursores del anillo A para la síntesis
convergente de 33.
[47]

El método de los vinilalenos (ruta H, Figura 10) fue desarrollado en
el grupo de Okamura
[48]
y consiste en la formación del compuesto 36 a
partir del enino del anillo A 35, el cual puede presentar distintas
modificaciones. Una ventaja de este método es la posibilidad de sintetizar
análogos con modificaciones en la parte triénica, difícilmente accesibles
mediante otras metodologías.
[49]

Introducción

Figura 10. Síntesis convergentes de la vitamina D y sus análogos (II).
Una de las estrategias sintéticas más utilizadas es la ruta I
(Figura 10). En ella, a partir del mismo enino 35 precursor del anillo A se
llega, mediante su acoplamiento con el correspondiente triflato de los
anillos CD/cadena lateral, al dienino 37. La posterior semi-hidrogenación
del dienino da acceso a la previtamina, que se isomeriza térmicamente
para dar lugar a la vitamina. Introducido inicialmente por Lythgoe,
[50]
el
extenso desarrollo de este método en distintos grupos de investigación ha
permitido el acceso a una gran variedad de anillos A con notables
mejoras en el rendimiento del proceso.
[51]

Capítulo 1
Síntesis de análogos estables de la previtamina D3 con
la función 2-hidroxietilideno en el anillo A

Antecedentes

1. Antecedentes
1.1. Análogos de la 1α,25-(OH)2-previtamina D3
Como se ha explicado en la introducción, la 1α,25-(OH)2-D3 se
encuentra en el organismo en un equilibrio conformacional entre la forma
mayoritaria 6-s-trans y la minoritaria 6-s-cis, estando éstas a su vez en
equilibrio con la 1α,25-(OH)2-pre-D3, que presenta conformación cisoide
y cuya proporción es del 5-10%. Ambas formas presentan diferentes
modos de acción en el organismo, siendo difícil la evaluación de las
funciones asociadas a la forma 6-s-cis debido a su isomerización
espontánea a la forma trans a la temperatura fisiológica.
El estudio de las funciones promovidas por el confórmero 6-s-cis o
previtamina ha sido posible gracias a la síntesis de análogos estables de
ésta. Puesto que los ejemplos publicados de este tipo de derivados son
escasos, se describen a continuación de forma cronológica.
Antecedentes

El primer análogo 6-s-cis fue descrito por Moriarty et al.
[52]
en 1974
y se trata de un derivado acetilado de la previtamina D3 (38, Figura 11).
El grupo acetilo en la posición C-19 confiere estabilidad a esta
previtamina; sin embargo, Sialom y Mazur demostraron posteriormente
que un aumento de la temperatura daba lugar a la transposición [1,7] de
hidrógeno y formación de la correspondiente forma 6-s-trans.
[53]
En el
mismo trabajo, estos autores describieron la preparación de un derivado
difluorado de la previtamina D3 sustituido también en C-19 (39). En este
caso, el fuerte efecto inductivo producido por la introducción de dos
átomos de flúor en esta posición impide la migración del átomo de
hidrógeno, evitando la formación del derivado 6-s-trans.

Figura 11. Primeros derivados previtamina.
Los siguientes análogos datan de la década de los noventa. Así,
Curtin y Okamura,
[22]
sintetizaron el derivado pentadeuterado 40 en el
que, debido al efecto isotópico, el tiempo de vida media es de 81 h, en
comparación con las 13.4 h de la previtamina natural (Esquema 4).
Estudios biológicos con este análogo pentadeuterado, reflejan una
actividad similar en la mediación de respuestas de tipo no-genómico para
la 1α,25-(OH)2-d5-pre-D3 y la 1α,25-(OH)2-D3. Sin embargo, en las
respuestas genómicas la 1α,25-(OH)2-D3 mostró ser significativamente
más activa.
[21]

Antecedentes

Esquema 4
El primer ejemplo de un derivado bloqueado en la forma
previtamina fue descrito por Mouriño et al.
[54]
Dicho derivado, la 1α,25-
(OH)2-19-nor-previtamina D3 (42, Figura 12), carece del grupo metilo en
posición C-19, lo que hace imposible la reacción de transposición
sigmatrópica [1,7] de hidrógeno. Este compuesto no mostró sin embargo
una actividad biológica destacada en ninguno de los ensayos
realizados.
[55]

Figura 12
Antecedentes

Posteriormente, se realizaron numerosas pruebas acerca de la
actividad biológica que poseen diversos compuestos con estructura
cisoide pertenecientes a la familia de los lumisteroles, como el
1α,25-dihidroxilumisterol3 (11, Figura 12) y el 1α,25-dihidroxi-7-
deshidrocolesterol (43).
[23,56]
Estos compuestos se originan de forma
fotoquímica por exposición prolongada de la previtamina D3 a la luz
ultravioleta. El 1α,25-(OH)2-lumisterol3 mostró tener actividad biológica
a nivel no-genómico, es decir, provocaba el mismo tipo de efectos que la
1α,25-(OH)2-pre-D3, si bien con una capacidad ligeramente inferior. Sin
embargo, este compuesto apenas era capaz de desencadenar respuestas
genómicas, lo cual sirvió de apoyo a la idea de que la forma cisoide o de
previtamina tenía asociadas respuestas biológicas concretas.
Una de las respuestas de tipo no genómico estudiadas fue la
transcaltaquia o transporte rápido de calcio, que involucra la apertura de
los canales de calcio regulados por diferenciales de voltaje en la
membrana celular. En este aspecto, el 1α,25-(OH)2-7-deshidrocolesterol
(43) mostró ser menos activo que el 1α,25-(OH)2-lumisterol3 (11). Este
hecho pone de manifiesto la influencia de la configuración de los centros
estereogénicos en la mediación de las respuestas biológicas.
Basándose en estos estudios, se propuso que la 6-s-cis-1α,25-(OH)2-
D3 es el confórmeroactivo para promover los efectos no-genómicos,
siendo la 1α,25-(OH)2-pre-D3 simplemente un excelente análogo de este
confórmero.
[57]

Con el fin de ampliar el conocimiento acerca del modo de acción de
este metabolito y dada la influencia de la estereoquímica de los centros
estereogénicos en la actividad biológica, en nuestro grupo de
Antecedentes

investigación se prepararon los distintos diastereoisómeros en el anillo A
de la 1α,25-(OH)2-19-nor-previtamina D3 (Figura 13).
[58]

Figura 13
Una alternativa a la ausencia del grupo metilo C-19 para bloquear la
forma previtamina se presentó con el análogo 47 (Figura 14), que a través
de un puente 9,19-metano origina un nuevo esteroide con los anillos
ABC linealmente fusionados.
[59]

Figura 14
Posteriormente, se describió el primer derivado con estructura de
previtamina que presenta una actividad genómica comparable a la
Antecedentes

1α,25-(OH)2-D3.
[60]
Este análogo (48, Figura 14), que posee un ciclo de
seis miembros como anillo D (TD=trans-decalina), es sorprendentemente
igual de efectivo que la hormona natural en su interacción con el VDR y
utiliza los mismos puntos de contacto con el receptor.
Más recientemente, en nuestro grupo de investigación se ha
preparado una familia de derivados previtamina que se centra en la
introducción de distintos sustituyentes en posición C-2. Una primera
serie la componen los derivados trihidroxilados en el anillo A con distinta
estereoquímica en las posiciones C-1, C-2 y C-3 (Figura 15).
[61]
De ellos,
el análogo 1α,2β,25-trihidroxi-19-nor-previtamina D3 (51) es el que
muestra una mayor actividad en la inhibición de la proliferación celular,
aunque se requieren concentraciones más altas que con la hormona
natural.

Figura 15
Dentro de esta familia, se ha descrito también la síntesis y
evaluación de un derivado 2β-(3-hidroxipropoxi) sustituido (53, Figura
16),
[62]
que se corresponde con la forma previtamina del análogo ED-71
Antecedentes

(20, Figura 7), compuesto de elevado potencial farmacéutico desarrollado
por la empresa japonesa Chugai Pharmaceutical Co. y aprobado
actualmente para el tratamiento de la osteoporosis en este país.
[63]
Tanto
el análogo 53 como la previtamina 54 (Figura 16), en la que se introdujo
la función epóxido en el anillo A, mostraron escasa afinidad por el VDR
y la DBP y no presentaron capacidad antiproliferativa.
[62]

Figura 16
Por otra parte, en el grupo de Kittaka se han desarrollado en los
últimos años una serie de derivados previtamina cuya estabilidad radica
en la alteración de la estereoquímica de la posición C-14. La
configuración de esta posición es clave en el equilibrio vitamina-
previtamina: mientras que la vitamina D3 es más estable que la
previtamina D3, la estabilidad de la 14-epi-previtamina D3 es mayor que
la de la 14-epi-vitamina D3 y en este caso, el equilibrio se encuentra
desplazado hacia la forma previtamina, presente en un 90-95%.
[64]
Así,
describen la preparación de una serie de análogos de la 1α,25-(OH)2-14-
epi-pre-D3 con distintos sustituyentes en C-2 (55, Figura 17)
[65]
y sus
correspondientes análogos 14-epi-19-nor 56.
[66]
En estudios de afinidad
al VDR tanto estos compuestos como sus derivados en conformación
trans han mostrado ser menos activos que la hormona natural, aunque
según los autores esto no sería un condicionante para que presentaran
actividad a nivel genómico, pendiente de evaluación.
Antecedentes

Figura 17

1.2. Análogos 2-hidroxialquilideno sustituidos
La introducción de sustituyentes de tipo alquilideno o
hidroxialquilideno en la posición C-2 de la 1α,25-(OH)2-19-nor-D3 ha
dado lugar a análogos caracterizados por una fuerte afinidad por el VDR
y un elevado potencial biológico comparados con la 1α,25-(OH)2-D3.
Estas características se han asociado con un cambio conformacional en el
anillo A, mostrando mayor actividad los análogos con geometría E en el
doble enlace, en los cuales la conformación de silla-β está más
favorecida.
Desde la descripción por Sicinski et al.
[67]
de la síntesis y
propiedades biológicas del 2MD, un derivado 19-nor que posee un grupo
metileno en C-2 (23, Figura 18), varios análogos preparados por estos
autores y en el grupo de Yamada han demostrado sustentar esta
afirmación (estructura general 57).
[68–70]

Antecedentes

Figura 18
Entre los análogos descritos, cabe destacar aquellos que incorporan
la función hidroxialquilideno en posición C-2 y cuya síntesis ha sido
desarrollada en paralelo por estos dos grupos en los últimos años. Así, se
han preparado distintos derivados (Z)- y (E)-2-(3’-hidroxipropilideno)
con distintas modificaciones en la cadena lateral (58a-g y 59a-g, Figura
19).
[70,71]

Figura 19
Por otro lado, los dos isómeros Z/E de los derivados 2-(2’-
hidroxietilideno) también se han conjugado con variedad de cadenas
laterales diferentes (60a-h y 61a-h, Figura 20).
[69,72,73]
Estos análogos
mostraron, por lo general, mayor actividad transcripcional que la
Antecedentes

hormona natural, destacando el compuesto 60a, cuya afinidad por el
VDR y actividad transcripcional son dos veces la de la 1α,25-(OH)2-D3.

Figura 20
Hasta la fecha, no se conocen derivados en los que la función
hidroxialquilideno haya sido introducida en otra posición de la molécula.
Objetivos

2. Objetivos
Con el fin de profundizar en el papel que desempeña la forma
previtamina en las funciones biológicas asociadas a la 1α,25-
dihidroxivitamina D3, y puesto que la función 2-hidroxietilideno
introduce cambios notables en la actividad de los análogos 6-s-trans-19-
nor, es el objetivo de este capítulo sintetizar los correspondientes
derivados estables 6-s-cis 2-hidroxietilideno sustituidos, que carecen del
grupo metilo en C-19 y por lo tanto son incapaces de isomerizarse a la
forma vitamina.
Por otra parte, puesto que sustituyentes con insaturaciones
directamente unidas al anillo A influyen en la conformación de silla de
éste, con el consiguiente efecto sobre la actividad biológica, se pretende
introducir dicha función 2-hidroxietilideno en las posiciones C-1, C-2 o
C-3 de la 1α,25-(OH)2-19-nor-pre-D3, manteniendo en cada caso las
otras dos posiciones hidroxiladas.
Antecedentes

Se espera que cada análogo induzca diferentes formas de la proteína
(DBP, VDR), obteniéndose conformaciones diferentes del complejo
análogo-proteína, lo que resultará en respuestas biológicas distintas. Por
ello, se evaluará la actividad biológica de los derivados sintetizados y se
comparará con la de los análogos 6-s-trans.

Resultados y discusión

3. Resultados y discusión
La síntesis de los análogos de la 1α,25-(OH)2-pre-D3 se llevó a cabo
mediante una estrategia convergente basada en el acoplamiento, a través
de una reacción de tipo Sonogashira, del fragmento que comprende los
anillos CD y la cadena lateral, en forma de triflato de vinilo, y el enino
del correspondiente anillo A (Esquema 5).

Esquema 5
Resultados y discusión

3.1. Síntesis del fragmento anillos CD-cadena lateral
El sintón que comprende los anillos CD junto con la cadena lateral
se sintetizó directamente a partir de la vitamina D3 natural (Esquema 6).

Esquema 6
En primer lugar, el tratamiento de la vitamina D3 con ozono dio
lugar a la cetona de Grundmann (65, GK, Grundmann’s Ketone)
[74–76]

(Esquema 7).

Esquema 7
Posteriormente, la oxidación de la posición C-25 se llevó a cabo
mediante una reacción catalítica con tetróxido de rutenio, generado
in situ por reacción de tricloruro de rutenio con metaperyodato sódico
(Esquema 8).
[77,78]
Esta reacción, según la metodología descrita por
Maynard et al.
[64]
tiene lugaren una mezcla de tres disolventes: agua,
acetonitrilo y tetracloruro de carbono. El medio acuoso consiste en una
disolución tampón de fosfato potásico (50 mM, pH 7), que además de
Resultados y discusión

servir para solubilizar el RuCl3 y el NaIO4, regula el pH del medio
estabilizando así la especie oxidante (RuO4). Esta reacción transcurre con
bajo rendimiento debido a la formación de otros productos de oxidación,
así como a la recuperación de una pequeña parte de producto de partida.

Esquema 8
Una vez aislado el producto hidroxilado en C-25 (66,
25-hidroxicetona de Grundmann, 25-OH-GK), se procedió a la
protección del alcohol como éter de sililo, con trimetilsililimidazol,
obteniéndose en 16 h y a temperatura ambiente el producto 67 con
elevado rendimiento. La protección del alcohol es necesaria para que no
interfiera en el posterior proceso de acoplamiento con los anillos A. Se
seleccionó un grupo protector de silicio tanto en esta etapa como
posteriormente en los anillos A para permitir una desprotección conjunta.
El producto 67 se purificó por cromatografía HPLC semipreparativa para
aislarlo de las trazas de su isómero 14-epi formadas en las etapas
anteriores.
Para la reacción de acoplamiento es necesario transformar la cetona
en un triflato de vinilo. Para ello, se generó primero el enolato, utilizando
Resultados y discusión

como base bis(trimetilsilil)amiduro de litio (LHMDS), y se atrapó a
continuación como triflato utilizando N-fenil-bis(trifluorometano)-
sulfonamida.
[59]
De esta manera se obtuvo el producto 63 con un
rendimiento del 94%.

3.2. Síntesis de precursores del anillo A
Para la síntesis de los anillos A se partió en todos los casos del ácido
siquímico, producto natural comercial de alta versatilidad y que posee la
funcionalidad y la estereoquímica adecuada en sus centros estereogénicos
para ser utilizado como sustrato de partida.
3.2.1. Precursor del análogo 2-(2’-hidroxietilideno): anillo A
C-4 sustituido
Por analogía con los análogos 6-s-trans-19-nor descritos en los
antecedentes, se decidió preparar, en primer lugar, el correspondiente
análogo previtamina C-2 sustituido. El análisis retrosintético propuesto
para la preparación del anillo A es el siguiente:

Esquema 9
Así, a partir del ácido siquímico (70, Esquema 9), se sintetizó el
correspondiente derivado acetilénico necesario para el acoplamiento.
Resultados y discusión

Este proceso se desarrolló en 5 etapas según la metodología previamente
descrita en nuestro grupo de investigación.
[62]
Siguiendo este
procedimiento, se formó el siquimato de metilo (71, Esquema 10) por
tratamiento del ácido siquímico con ácido clorhídrico en metanol. A
continuación, la protección selectiva de los grupos hidroxilo en C-3 y
C-5 con cloruro de tert-butildimetilsilano (TBDMSCl, abreviatura TBS-
usada en los esquemas para este grupo protector) dio lugar al compuesto
72. La transformación del éster en aldehído se realizó en dos estapas. En
la primera, la reducción del éster con hidruro de diisobultilaluminio
(DIBAL-H) dio lugar al alcohol 73, que por oxidación selectiva del
alcohol alílico con óxido de manganeso proporcionó el aldehído 74.

Esquema 10
La conversión de la función aldehído en el triple enlace se llevó a
cabo mediante la reacción de Colvin.
[79]
En esta reacción, la adición de
una base fuerte como n-butillitio sobre trimetilsilildiazometano
(TMSCHN2) proporciona el correspondiente compuesto organolítico, que
ataca al carbonilo generando el consiguiente α-diazoalcóxido. Éste
Resultados y discusión

evoluciona hacia el alquino a través de la eliminación de TMSOLi, dando
lugar al α-diazoalqueno que, mediante el reagrupamiento de Wolff, libera
nitrógeno gas y el alquino final 75 (Esquema 10).
La preparación de este compuesto en cantidades mayores que las
utilizadas previamente en el grupo, permitió observar un fenómeno de
migración del grupo protector de silicio del hidroxilo en posición C-3 a
C-4 (76, Esquema 11). La migración del grupo TBDMS suele ocurrir en
medio básico y transcurre intramolecularmente a través de un intermedio
pentacoordinado de silicio.
[80]
Así, se observó que con la utilización de
determinados lotes comerciales de
n
BuLi con mayor concentración de
productos de descomposición de éste, principalmente hidróxido de litio,
la migración de este grupo estaba altamente favorecida.

Esquema 11
Con el fin de evitar la formación del producto 76, se planteó realizar
la transformación del aldehído en alquino mediante la reacción de
homologación de Corey-Fuchs.
[81]

Esquema 12
Resultados y discusión

El proceso consta de dos etapas: inicialmente, el aldehído se
transforma en un dibromuro vinílico (77, Esquema 12) y posteriormente,
la reacción de éste con
n
BuLi da lugar a un intercambio halógeno-litio
que, con un segundo equivalente de base, evoluciona al alquino por un
proceso de eliminación seguido de hidrólisis. El rendimiento global de
las dos etapas resultó ser similar al obtenido utilizando la reacción de
Colvin, observándose igualmente trazas del compuesto 76. Esto, unido a
la inestabilidad mostrada por el producto dibromado 77, hizo que se
desechara esta alternativa, optándose por el empleo de la reacción de
Colvin. Un cuidado especial en el uso del
n
BuLi, así como una mayor
dilución en la extracción de la reacción, evitando concentrar el crudo en
presencia de la base, sorteó en gran medida la aparición del producto de
migración del TBDMS. En los casos en los que se observaron trazas de
este compuesto, hubo de separarse del producto deseado 75 mediante
cromatografía HPLC semipreparativa.
Una vez se dispuso del alquino, se procedió a la modificación de la
posición C-4 para introducir el grupo 2-hidroxietilideno.
En primer lugar, la oxidación con el reactivo de Dess-Martin originó
la cetona 78 en condiciones suaves y con alto rendimiento (Esquema 13).
Este compuesto resultó ser inestable en la purificación por cromatografía
de columna, observándose una pérdida de rendimiento; sin embargo, ésta
es necesaria, ya que la utilización del crudo sin purificar mostró interferir
en la siguiente etapa de reacción.
Resultados y discusión

Esquema 13
La transformación de la cetona en alqueno se llevó a cabo mediante
la reacción de Horner-Wittig, por tratamiento de 78 con un iluro de
fósforo generado por la adición de
n
BuLi sobre el correspondiente
fosfonato. Esta reacción dio lugar al compuesto 79 como mezcla de
diastereoisómeros Z/E en una relación 40:60. La posterior reducción del
nitrilo a aldehído con DIBAL-H proporcionó el producto 80 (Z/E) el
cual, por tratamiento con borohidruro de sodio en etanol dio lugar a los
derivados (Z)- y (E)-4-(2’-hidroxietilideno) 81 en un proceso rápido y
con alto rendimiento.
Finalmente, para evitar posibles interacciones en el acoplamiento
debidas a la presencia de un grupo hidroxilo libre, se llevó a cabo la
protección de 81 como éter de sililo. Los productos protegidos 82a
(isómero Z) y 82b (isómero E), podrían utilizarse como mezcla de
diastereoisómeros en la reacción de acoplamiento y realizar la separación
Resultados y discusión

de ambos en la última etapa de reacción; sin embargo, para reducir el
número de componentes en las posteriores reacciones y facilitar la
purificación de los distintos productos obtenidos, la separación de los
isómeros se realizó en esta etapa mediante cromatografía HPLC
semipreparativa.
3.2.2. Precursor del análogo 1-(2’-hidroxietilideno): anillo A
C-3 sustituido
Basándose en el análisis retrosintético expuesto en el Esquema 14,
se plantearon dos posibles estrategias para la síntesis de este precursor.

Esquema 14
Por un lado, se propuso realizar las pertinentes modificaciones sobre
el