Serología - Test Elisa

Vista previa del material en texto

TEÓRICO PRÁCTICO Nº 10
DIAGNÓSTICO DE VIRUS POR MEDIO DE TÉCNICAS SEROLÓGICAS
La serología en el diagnóstico de virus 
-La reacción antígeno – anticuerpo
-Aplicaciones en el campo de la virología vegetal 
-Importancia como Herramienta para el diagnóstico de virus y otros patógenos
 
-Diferentes pruebas serológicas: 
 difusión en gel de agar (simple y doble) 
 precipitación entre porta y cubreobjetos
 látex
+La prueba ELISA
Esquema de un anticuerpo: Fab (sitio de combinación, Fc (fracción sin capacidad de combinación), CH (cadenas
polipeptídicas pesadas), CL (cadenas polipeptídicas livianas)
VH y VL (regiones hipervariables de las cadenas pesadas y livianas respectivamente) 
La respuesta inmunológica
Teoría de las cadenas laterales
La reacción Antígeno - Anticuerpo
 Complejo soluble
Complejo insoluble
 La relación de concentración de antígeno y anticuerpos debe ser la adecuada
LA PRUEBA ELISA
CLARK Y ADAMS (1979)
ENZIME LINKED SORBENT INMUNO ASSAY
VARIANTES DE ELISA
 La prueba inmuno enzimática ELISA puede ser realizada utilizando diferentes protocolos que se definen de acuerdo a las conveniencias técnicas que ofrezcan.
 A continuación se explican tres, entre las cuales se encuentra la que será utilizada en este trabajo práctico. 
 ELISA DIRECTO 
 ELISA INDIRECTO
 DAS ELISA
ELISA Directo
ELISA Indirecto
DAS-ELISA (Sand. de doble anticuerpo)
DESARROLLO DE LA PRUEBA
ELEMENTOS QUE SE DEBEN UTILIZAR:
Placas Elisa
Buffers específicos
Muestras, bolsitas de polietileno 
Controles positivos y negativos
IGG, Conjugado, Sustrato
Micropipetas, estufa, cámara fría lector (o no), planillas, etc.
Una vez que se han sembrado las celdillas de la placa con las muestra y los respectivos controles ( buffer, controles positivos y enfermos respectivamente ), las placas deben ser incubadas a 2 – 4 º C durante 16-18 horas o a 30 ºC durante 4 a 6 horas. 
Transcurrido este lapso se sacan de la cámara (al día siguiente generalmente)
y se procede a lavar cada placa cuidando la no contaminación entre celdillas dando tres o cuatro lavados. 
Luego del lavado se debe proceder a colocar el conjugado llevando a incubar las placas durante 4-6 horas a 30º C.
Posteriormente se deben repetir nuevamente los lavados
Colocación del sustrato
 Transcurrido el tiempo de incubación del conjugado se procede a descartarlo y lavar nuevamente previo a la colocación del sustrato. 
LOS PASOS DEL TEST ELISA EN RESUMEN
VENTAJAS
Alta sensibilidad (mil veces mayor que otras pruebas serológicas)
Es rápida (dos días o un día)
Es muy específica
Altamente confiable (eficiencia entre 95 y 99%)
No requiere uso de lupas o microscopios para observar
Utiliza pequeñas cantidades de antisuero
Permite analizar muchas muestras simultáneamente