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1 BOLILLA N° 11 BOLILLA 11. Técnicas inmunológicas. Fundamento y aplicación. Las técnicas inmunológicas y las moleculares son herramientas que pueden utilizarse para estudiar una gran variedad de entidades nosológicas de importancia medica. Las técnicas inmunológicas sirven para medir la respuesta inmune de un individuo frente a un agente infeccioso o bien para detectar antígenos microbianos en particular. Por eso son clave para DX, evolución, control del tratamiento y epidemiologia de las enfermedades causadas por bacterias, virus, parasitos y hongos. Además sirven para estudiar enfermedades del sistema inmune, tales como inmunodeficiencias, alergias, etc. Pueden usarse también con otros fines: determinación de grupos sanguíneos, pruebas de histocompatibilidad en transplantes o en estudios de filiación, DX de embarazo, de enfermedades endocrinas, entre otras. Las técnicas moleculares permiten identificar acidos nucleicos (ADN o ARN) de un agente infeccioso presente en una muestra clínica a fin de identificarlo. La principal ventaja de estas técnicas frente a las anteriores radica en su sensibilidad(permiten detectar minimas cantidades de acidos nucleicos microbianos en una muestra, aunque el agente no se este replicando ni haya manifestaciones clínicas). Como las distintas técnicas aportan información diferente, en realidad las distintas metodologías son complementarias. TECNICAS INMUNOLIGICAS. Se basan en la interaccion Ag-Ac. La especificidad de la interaccion Ag-Ac y la sensibilidad de muchas de las técnicas inmunológicas las convierten en poderosas herramientas de laboratorio aplicables entre otras cosas, al DX etiológico de enfermedades infecciosas. Antígenos: el termino Ag se usa en dos sentidos: Para designar una molecula que genera una respueta inmune (inmunogeno). Para referirse a una molecula que reacciona con Ac o LT programados, independientemente de su capacidad para generarlos. Los haptenos son pequeñas agrupaciones químicas bien definidas, que no son inmunogenos por si mismos pero que son capaces de reaccionar con Ac preformados inducidos por la inyección del hapteno unido a una molecula transportadora o “carrier” que si es inmunogena. La parte de las regiones hipervariables del Ac que interacciona con el Ag se denomina paratope y la parte del Ag que entra en contacto con el paratope se llama epitope. Los Ag naturales mas importantes son los de células y tejidos, los bacterianos, los virales, los parasitarios y los micoticos. ¿un Ag puede tener epitopes diferentes?: todo Ag suele tener varios determinantes antigénicos en su superficie, que pueden ser estructuralmente distintos unos de otros. Los Ac formados en respuesta a la inmunización con una proteína globular nativa tienden a no reaccionar bien con preparaciones desnaturalizadas ya que la mayoría reconoce estructuras superficiales topográficas, es decir, epitopes que dependen de la conformación de la molecula nativa. Hablamos en esta caso de epitopes conformacionales. Los residuos de aa que los forman están muy separados unos de otros en la secuencia primaria de la proteína pero se acercan por el plegamiento de las cadenas peptidicas en la proteína nativa. Por ello, los Ac contra 2 BOLILLA N° 11 proteínas nativas no suelen reaccionar con tanta intensidad ante péptidos con la misma secuencia primaria. En las proteínas fibrilares o en algunos carbohidratos, los determiantes se denominan epitopes secuenciales o lineales. ¿la respuesta inmune normal es monoclonal?:debido a que cada Ag esta formado por varios epitopes, generalmente distintos, la respuesta inmune normal es siempre policlonal y heterogenea. El sistema inmune va a reaccionar frente a muchos determinantes antigénicos simultáneamente y el resultado será un antisuero formado por una población heterogenea de moléculas de Ac. Algunos grupos atomicos que integran un epitope, reaccionan de distinta manera con el paratope especifico de ellos. Los radicales que intervienen mas que otros en la unión contra el Ac se denominan radicales inmunodominantes. Se denomina valencia a la capacidad de un Ag de unirse a mas de un Ac. Es decir, no indica la cantidad de grupos determinantes de un Ag sino la cantidad de Ac que el Ag puede fijar. Los Ag naturales son siempre polivalentes. Inmunovalencia: cantidad de Ags que puede pegar un Ac. ¿Qué son y para que sirven los Ac monoclonales?: además de ser bastante competentes para proteger a nuestro organismo de los agentes infecciosos perjudiciales, los Ac también so n reactivos de suma utilidad y muy específicos para detectar y cuantificar otras sustancias. Al inyectar un Ag en un animal de experimentación se obtendrá un antisuero policlonal que contendrá una mezcla de Ac que en forma predominante pero no exclusiva se dirigen contra el inmunogeno para el cual se formaron. Milstein ideo una técnica para producir clones inmortales de células plasmáticas productoras de Ac específicos individuales mediante la fusión de células productoras de Ac con una línea adecuada de células B tumorales. Estos “hibridomas” se seleccionan en un medio de cultivo que no puede sostener la proliferación de los tipos celulares progenitores y los clones individuales se pueden establecer por diluciones sucesivas o por extensión en placas. Estos clones pueden propagarse en cultivos a gran escala. Todas las moléculas producidas por un hibridoma son idénticas, es decir, tienen la misma clase y el mismo alotipo de Ig, asi como la misma región variable y una estructura, idiotipo y afinidad y especificidad idénticos para un epitope dado. La principal ventaja de los Ac monoclonales como reactivos esque proporcionan un único material estándar para todos los laboratorios en el mundo, en un aporte ilimitado si se mantiene la inmortalidad y la pureza de la línea celular. Sus usos incluyen: inmunoensayos, DX de cáncer, tipificación de tejidos, serotipificacion de microorganismos, separación de tipos celulares individuales con marcadores de superficie específicos, neutralización terapéutica de citoquinas inflamatorias, etc. Uno de los problemas del uso de Ac monoclonales en medicina es que al ser en su mayoría de origen murino, cuando son administrados a individuos, estos producen Ac frente a los mismos que disminuyen su eficacia o bien pueden tener problemas alérgicos cuando se usan reiteradamente. Para evitar este problema se están obteniendo Ac humanizados de tipo quimerico. Estos Ac se preparan mediante la creación de una molecula hibrida en la que se mantienen las partes del Ac monoclonal de raton que le dan especificidad(regiones V, D y J) y la sustitución de la región constante del Ac del raton por una región igualmente constante del mismo isotipo pero de procedencia humana. Interaccion Ag-Ac. Interaccion primaria: la unión del Ag con el Ac especifico, formando asi el complejo Ag-Ac, se denomina interaccion primaria. Esta interaccion tiene lugar in vivo, al encontrarse un Ag con su correspondiente Ac. También se puede hacer en el laboratorio(in vitro) por medio de distintas técnicas que serán descritas mas adelante. La interaccion primaria se basa en la combinación del determinante antigénico con la región variable o paratopo del Ac. Esta combinación responde a las estructuras (radicales, grupos atomicos) tridimensionales complementarias del epitope y el paratope, y es responsable de la especificidad reacccional. Esta unión es de tipo no covalente(puentes de hidrogeno,enlaces electrostáticos, fuerzas de Van del Waals, etc). Este tipo 3 BOLILLA N° 11 de unión entre epitope y paratope va a responder a diferentes constantes cineticas que tornan la interaccion primaria en reversible. La afinidad del sistema esta determinada por las fuerzas de unión entre los dos reactivos y el equilibrio puede determinarse en distintas situaciones y tiene relavancia in vivo. Por ejemplo si un Ac recubreun virus,éste no puede ingresar en la celula blanco y si otro Ac se puede adherir a una celula bacteriana en una densidad bastante alta, entonces se puede activar el complemento y la celula se destruye. Interaccion secundaria: es consecuencia directa pero no obligada de la interaccion primaria. En un sistema in vitro de Ag-Ac, a la formación de complejos inmunes(interaccion primaria), le sigue una reacción inespecífica o interaccion secundaria, con la constitución espontanea de una red tridimensional macromolecular que se manifiesta por la aparición de agregados visibles. La aparición de la interaccion secundaria depende de multiples variables, las cuales están en relación con los Ags y Acs presentes y con las condiciones de la experiencia: Los Ags serán preferentemente multivalentes y poliespecificos. Los Acs serán bivalentes (IgG) y heterogéneos(mezcla de Acs específicos para los distintos epitopes del Ag). Presencia de electrolitos en el medio. pH neutro. T° adecuada: 37-45°C. Reunidas estas condiciones, la aparición de la interaccion secundaria depende de una adecuada relación en las concentraciones de Ag y Ac. Fenómeno de prozona: cuando en la solución hay una concentracion muy elevada de Acs con respecto a los Ags, no hay interaccion secundaria. Fenómeno de equivalencia inmunológica: cuando en la solución hay una concentracion adecuada o equivalente (no igual) de Ag y Ac, además de la interaccion primaria hay interaccion secundaria y formación de la red tridimensional. Fenómeno de poszona: cuando en la solución hay una concentracion relativa muy elevada de Ags con respecto de Acs, no hay interaccion secundaria. Entonces, reunidas las condiciones adecuadas, la aparición de la interaccion 2ria depende de una adecuada relación Ag y Ac (equivalencia inmunológica). La respuesta inmune puede ser evaluada mediante diferentes pruebas. Las técnicas que se realizan sobre el paciente se denominan in vivo, y las que se llevan a cabo en el laboratorio a partir de una muestra del paciente, se llaman in vitro. TECNICAS IN VIVO: Por lo tanto, la interaccion primaria es la unión especifica entre epitope (en Ag) y paratope(en Ac). La misma es de tipo no covalente y reversible, y el grado de afinidad de la interaccion va a estar determinado por las fuerzas de unión entre el grupo determinante del Ag y la región complementaria del Ac. No es observable a simple vista y ocurre in vivo. En resumen, es inespecífica, en ella se ve la formación visible de una maya entre todos los complejos Ag-Ac, se da in vitro, puede ser un poco mas laxa (débil) que la interaccion 1ria, no siempre se produce, un Ac monoclonal no puede hacer interaccion secundaria. 4 BOLILLA N° 11 INTRADERMOREACCION DE LECTURA RETARDADA: evalua la respuesta celular del paciente, ya que es una clásica reacción mediada por células T. Tambien se la conoce como reacción cutenea de hipersensibilidad tardia o retardada. La reacción aparece luego de la inyección intradérmica de un Ag contra el cual el individuo esta previamente sensibilizado. Su lectura re realiza a las 48-72hs post inoculación y macroscópicamente se observa eritema e induración en el lugar debido al infiltrado celular(linfocitos, monocitos y gran proporción de macrófagos) cuando la reacción es positiva. La aparición de una reacción de hipersensibilidad retardada, implica una presensibilizacion. Asi la inoculación de PPD(derivado proteico purificado de Mycobacterium tuberculosis)intradérmica, puede suscitar una reacción de hipersensibilidad tardia, denominada reacción de Mantoux. Si esto ocurre lo que podemos afirmar es que el paciente tiene LT sensibilizados contra esa bacteria, pero de ninguna forma podemos afirmar que esta enfermo con este único dato. Las intradermorreacciones también sirven, en el caso de micosis profundas endémicas, para evaluar micosis infección en una determinada población. Puede hacerse con Ags que normalmente producen reacciones en la mayoría de la población (por ejemplo candidina). La positividad de la reacción indica que el sistema T del individuo ha sido sensibilizado previamente con ese Ag y es capaz de reaccionar contra él. Esto es de suma utilidad en el estudio de las inmunodeficiencias. INTRADERMOREACCION DE LECTURA RAPIDA: son utilizadas para demostrar la respuesta alterada de algunos individuos, hipersensibilidad inmediata, a determinados Ags (alérgenos). Señalan una respuesta patológica mediada por Ac de tipo IgE. Estas técnicas no se utilizan generalmente en el campo de la microbiología. TECNICAS IN VITRO PARA MEDIR LA INMUNIDAD HUMORAL: estas técnicas se denominan habitualmente técnicas serológicas ya que son capaces de detectar la presencia de Ac en el suero del paciente. Estas técnicas permiten tanto estudiar a los Acs (suero del paciente) disponiendo de los Ags conocidos (reactivos de laboratorio) o a la inversa, estudiar los Ags (presentes en la muestra biológica correspondiente)contando con los Ac conocidos (reactivos de laboratorio). Las técnicas serológicas pueden ser cualitativas o cuantitativas. En el primer caso se busca demostrar la presencia o ausencia de un Ag o Ac determinado. Por lo tanto, su resultado será positivo o negativo. En el segundo caso, se busca establecer una cantidad o concentracion relativa de los Ags o Acs. Habitualmente se trata de determinar el titulo de Acs en el suero del paciente. Se denomina Titulo de un suero a la minima cantidad del mismo que reacciona en forma positiva frente a una técnica inmunológica dada. Para proceder a titular un suero, se realiza una serie de diluciones cada vez mayores del mismo. Se realiza la técnica con cada dilución del suero. El titulo puede definirse entonces como la mayor dilución de un suero en la que se demuestra la presencia de Acs, por medio de una prueba serológica. Cada técnica serológica se caracteriza por presentar una determinada sensibilidad y especificidad. La sensibilidad de una técnica inmunológica es su capacidad de poner de manifiesto determinada concentracion de Ags o Acs. Una técnica muy sensible detectara menor concentracion del Acs o Ags buscado, que una poco sensible. Las técnicas muy sensibles se utilizan habitualmente para screening o tamizaje serológico en el DX de enfermedades infecciosas, ya que el resultado negativo es confiable y solo deben confirmarse los positivos para poder diferenciar los falsos de los verdaderos positivos. La especificidad es su capacidad de identificar únicamente al Ag o al Ac para el que fue diseñada. Una técnica muy especifica, no dara reacciones cruzadas con otros Ags o Acs. Las técnicas muy especificas se utilizan habitualmente como pruebas confirmatorias en el DX serológico de las enfermedades infecciosas ya 5 BOLILLA N° 11 que es confiable su resultado positivo. Pueden presentar falsos negativos, por eso generalmente se usan a continuación de una prueba de screening. Hay técnicas que detectan anticuerpos totales y otras que detectan los Ac IgM específicos: esto es muy útil para decidir si el cuadro infeccioso es agudo o crónico. No siempre se cuenta con la posibilidad de realizar IgM especifica para el DX de una infección aguda. En este caso es posible diagnosticar una infección aguda mediante la comparación entre los títulos de los sueros obtenidos en diferentes periodos de la enfermedad. Si no se puede hacer el DX midiendo IgM se hace el par serológico de IgG. Par serológico es un termino que define la extracción de dos muestras de suero del mismo paciente en diferentes periodos de la misma enfermedad. Su utilidad es muy amplia y nos indica la dinámica que posee la respuesta humoral. El diagnostico de infección aguda se efectua siempre por aumento de cuatro o mas veces de los títulos en una segunda determinación efectuada después de una a dos semanas de la primera. Las técnicas serológicas se pueden clasificar en: Técnicas de lectura directa: son la precipitación( inmunodifusion radial, doble inmunodifusion, inmunoelectroforesis, contrainmunoelectroforesis) aglutinación, (aglutinación directa, aglutinación pasiva, aglutinación reversa pasiva, inhibición de la hemaglutinación). Técnicas de lectura indirecta: son la fijación del complemento, inmunofluorescencia,( directa, indirecta) enzimoinmunoensayo o ELISA(ELISA sándwich para detección de Ags; ELISA indirecto para detectar Acs, ELISA sándwich para detectar Acs), inmunocromatografia, radioinmunoensayo, electroquimioluminiscencia, Western Blot. A continuación se describirán cada una de las técnicas: A) TECNICAS DE LECTURA DIRECTA: Se trata de técnicas en la que los Ags reaccionan con los Acs correspondientes formando la red tridimensional (interaccion secundaria) que puede evidenciarse a simple vista. Son técnicas sencillas y de bajo costo, por lo que están al alcance de la mayoría de los laboratorios clínicos. A.1. PRECIPITACION: la formación de un precipitado visible se produce cuando se enfrentan Ags solubles con sus correspondientes Acs específicos. El precipitado es la forma en que se visualiza la interaccion secundaria. Las ventajas son: alta especificidad, bajo costo, posibilidad de cuantificación; su principal desventaja es la baja sensibilidad. Pueden realizarse en un medio liquido o en medio solido, la mayoría se hacen en medio solido porque es muy difícil observar la formación de precipitado en medio liquido. Para ello se incorporan los Ags y los Acs en un medio gelificado, en el cual las moléculas migran a través de los poros del gel. A medida que difunden desde el lugar de origen, se diluyen formándose un gradiente de concentracion. En el lugar donde se encuentran los Ags con los Acs, a concentraciones optimas (zona de equivalencia inmunológica) aparecerá una línea blanquecina de precipitación visible a simple vista (interaccion secundaria). A.1.1- INMUNODIFUSION RADIAL (IDR): en este caso se incorpora una solución de Acs al agar fundido,el cual se vuelca en placas. Una vez solidificado, se le hacen perforaciones para generar pocillos donde colocar la solución de Ags a investigar. Las moléculas del Ag difunden desde el pocillo en todas las direcciones a través del agar. Tras una incubación de 24-48hs se observara un circulo de precipitación alrededor del pocillo donde se sembro el Ag a investigar. El diámetro de dicho circulo será proporcional a la cantidad de Ag El resultado de una técnica serológica no es un ente aislado, sino que pertnece a un paciente con síntomas y/o signos clínicos que debe ser correctamente analizada por el medico. Tanto los factores laboratorio y clínica, deben ser evaluados critica y razonablemente para arribar a un DX correcto. 6 BOLILLA N° 11 presente en la muestra. Para determinar la concentracion de Ags presentes en la muestra, se realiza una curva de calibración con estándares de concentracion conocida. A partir de allí es posible extrapolar la concentracion de Ags entrando a la curva con el diámetro del halo de precipitación. Esta técnica se utiliza habitualmente para cuantificar en el suero del paciente inmunoglobulinas (IgG,IgM,IgA), fracciones de C3 yC4 del complemento y otras proteínas sericas. A.1.2 DOBLE INMUNODIFUSION(Ouchterlony): se siembran en dos pocillos diferentes Ags y Acs y ambos difundirán simultáneamente unos hacia otros. Luego de una incubación de horas se observara una línea de precipitación entre los pocillos, en el lugar de equivalencia inmunológica. Ya no se usa mucho en la clínica para hacer DX de enfermedades infecciosas por su baja sensibilidad. Diferentes preparaciones que contienen multiples Ags frente a un antisuero multiespecifco dara numerosas bandas de precipitado debido a que las distintas interacciones entre Ag-Ac tienen distintos puntos de equivalencia, de esta forma se puede analizar la complejidad de distintas mezclas antigénicas. Este patrón de bandas se puede clasificar de tres maneras: identidad parcial, total o no identidad. VER FIGURA EN PAGINA 21 MODULO 3. A.1.3 INMUNOELECTROFORESIS: es una técnica empleada para el estudio de las proteínas plasmáticas. Es útil para el estudio de las Igs, por ejemplo en los mielomas. No tiene mucha aplicación en el campo de la microbiología. Esta técnica combina la electroforesis con la precipitación en medio solido. Se lleva a cabo en 2 etapas: 1) se somete a electroforesis una mezcla de Ags proteicos (ej: suero humano) que se ha sembrando en un pocillo del agar. Las proteínas se separaran según su carga eléctrica en el buffer de corrida; 2) se coloca paralelamente a la línea de migración anterior un antisuero total. Se incuba para que Ags y Acs difundan y formen los correspondientes arcos de precipitación en la zona de equivalencia inmunológica. A.1.4 CONTRAINMUNOELECTROFORESIS: combina la inmunodifusion doble con una electroforesis. Se siembran enfrentados Ags y Acs y se aplica una corriente eléctrica continua de modo tal que los Ags migraran hacia el polo positivo (tendrán carga negativa) y los Acs (neutros) son arrastrados por el agua hacia el polo negativo. De este modo, los reactivos se mueven unos hacia otros, y al encontrarse en la zona de equivlencia, formaran una línea de precipitación. Es un método muy rápido y mas sensible que los anteriores por lo cual es utilizado en el DX de algunas patologías infecciosas tales como micosis profundas endémicas. A.2- AGLUTINACION: estas reacciones ocurren cuando se enfrentan Ags particulados (bacterias, globulos rojos) en suspensión con sus Acs específicos, se forman agregados que aumentan de tamaño y sedimentan en el medio de reacción (interaccion secundaria). Sus ventajas son su sensibilidad y bajo costo y su desventaja es su menor especificidad. Son métodos que no se prestan a estudios cuantitativos exactos. A.2.1 AGLUTINACION DIRECTA: se enfrenta un Ac, fabricado artificialmete, al Ag particulado directamente. Un ejemplo es la determinación del grupo sanguíneo. Para ello se hacen reaccionar los hematíes de la sangre del paciente con Ac anti A y anti B, en este caso se trata de una hemaglutinación. Busco Ag. Otro ejemplo es la detección de Ac en el suero de un paciente, usando Ags particulados de Salmonella tiphy t S. paratiphy (reacción de Widal), o de Brucella spp (Reaccion de Huddleson). En estos casos es posible titular el suero del paciente. A.2.1.2 AGLUTINACION PASIVA: en este caso, Ags solubles se transforman en praticulados por su fijación en partículas mas grandes, como partículas de latex, globulos rojos, etc y sirven para detectar Acs específicos en el suero problema. Se usa frecuentemente, tienen buena sensibilidad y son de bajo costo. Busco Ac. Entre ellas podemos citar la hemoaglutinación indircta (HAI) utilizada para hacer DXserologico de Chagas y Toxoplasmosis, determinación del factor reumatoideo por test de latex, entre otras. La HAI sirve para semicuantificar. 7 BOLILLA N° 11 A.2.1.3 AGLUTINACION REVERSA PASIVA: se parece mucho a la anterior, con la diferencia de que en este caso lo que se fija a la particula inerte es el Ac por su fragmento Fc, de modo tal que permite la detección de Ags específicos en la muestra biológica problema. Entre ellas podemos mencionar el latex para detectar Ag de Criptococcus neoformans o de patógenos bacterianos del SNC en el LCR. A.2.1.4INHIBICION DE LA HEMAGLUTINACION: ya no se usa habitualmente, era la metodología serológica de referencia en el DX de rubeola pero ha sido reemplazada por otras técnicas de lectura indirecta. Se findamenta en que algunos virus son capaces de algutinar hematíes de ciertas especies animales, por lo cual es posible detectar Acs específicos contra él en el suero del paciente. Si los Acs están presentes, el virus no podrá aglutinar los hematíes presentes en la muestra. O sea, una aglutinación visible indica que no hay Acs específicos enla muestra. Las reacciones que algutinan son negativas (no hay Ac), la aglutinación es porque los GR se unieron con los virus y forman la maya. Las reacciones que no aglutinan son positivas para la presencia de Ac. B) TECNICAS DE LECTURA INDIRECTA. Se basan en la interaccion primaria entre el Ag y Ac, es decir, en la formación de complejos inmunes. Esta interaccion no es visible a simple vista, como ocurre en las técnicas de lectura directa, por lo que para demostrarla se recurre a distintos artificios. De este modo se logra una mayor sensibilidad que las de lectura directa. B. 1 FIJACION DEL COMPLEMENTO: se fundamenta en que la activación (o”fijación”) del complemento por el Ac unido al Ag hace que se generen complejos de ataque de membranas. Si el Ac se une a los eritrocitos, éstos se destruyen y se genera hemolisis. Se hace en dos etapas: 1) se inactiva el suero problema para que el complemento propio no interfiera en la prueba, 2) luego se lo enfrenta con el Ag especifico, mas el agregado de complemento titulado. Entonces, si se observa hemolisis, la prueba es negativa (no contiene Ac) y si no hay hemolisis, la prueba es positiva (el suero contiene Acs). Esta técnica es metodológicamente compleja y difícil de estandarizar, por lo que ha sido totalmente reemplazada por las técnicas de inmunomarcacion, las cuales son de amplia utilidad para el DX de enfermedades infecciosas en los laboratorios clínicos. Las técnicas de inmunomarcacion son: B.2 INMUNOFLUORESCENCIA (IF): el fundamento de esta técnica radica en la capacidad que muestran algunos elementos o compuestos fluorescentes de fluorescer al iluminarlos con luz UV, denominados fluorocromos, de fijarse a los Ac mediante un enlace químico estable que no puede romperse durante el curso de la reacción inmunológica. Ejemplos de fluorocromos naturales son vitaminas,esteroides,porfirinas, etc. Otros compuestos que fluorescen(rodamina, auramina, fluoresceína) se usan en distintas técnicas de tinción. La inmunofluorescencia conjuga la observación de la morfología con la especificidad inmunológica, evidencia tanto germenes vivos como muertos y requiere solamente de pequeñas cantidades de Ag, lo que permite evidenciar cantidades minimas de Ag aun en un medio complejo de germenes no cultivables, asi como investigar Ac con Ag difíciles de preparar. Empleando la técnica se pueden revelar Ac llamados incompletos, que no precipitan, no algutinan y no fijan el complemento. La IF permite identificar un Ag con la ayuda de un inmunosuero conocido e investigar y titular un Ac con la ayuda de un Ag conocido. Hay dos tipos de IF, la directa y la indirecta. B.2.1 IF DIRECTA (IFD): se usa para la detección de Ags por medio de Acs específicos marcados. Para ello, se impronta el material biológico sobre un portaobjetos, se fija adecuadamente y se lo cubre con los Ac específicos marcados. Se incuba, se lava adecuadamente para eliminar los restos de fluorescencia inespecífica y se observa al microscopio de fluorescencia. De este modo, los Ac marcados, fijados asi sobre el Ag, lo tornan visible. Se usa en el DX etiológico de cuadros respiratorios virales, detección de Ags de 8 BOLILLA N° 11 Chlamydia trachomatis en el exudado uretral o endocervical, detección de Ags en el virus Hepes Simplex en ulceras genutales, entre otras aplicaciones. B.2.2 IF INDIRECTA (IFI): se usa para la detección de Acs en un suero problema. Para ellos se fijan sobre un portaobjetos los Ags conocidos(reactivos de laboratorio). Luego se cubren con el suero del pacient. Se incuban, se lava cuidadosamente para eliminar todo lo que no esta unido específicamente. A continuación se agregan Ac anti Ig humana (reactivo de laboratorio) marcados con un fluorocromo. Si el suero problema contenía Acs específicos, estos fueron fijados por el Ag y puesto de manifiesto por los Acs marcados. Se usa para hacer DX serológico de Chagas, Toxoplasmosis, Sifilis, etc. Tanto para IFD como para IFI hay imágenes en la pagina25 del modulo 3. B.3 ENZIMOINMUNOENSAYO (ELISA): el fundamento de esta metodología es similar al de la IF con la diferencia que en este caso se emplean Acs marcados con una enzima capaz de desarrollar una reacción coloreada para poner en evidencia la interaccion primaria. Una de las enzimas que mas se usan es la peroxidasa y el sustrato es el agua oxigenada mezclada con orthofenilendiamina. Se usa tanto para detectar Ags como Acs. B.3.1 ELISA sándwich para detección de Ags: se usa para detectar Ags en fluidos biológicos. El Ac especifico para el Ag de interés, se encuentra adsorbido en un soporte solido, sobre el cual se añadirá la muestra biológica. En el caso de que en dicha muestra se encuentre el Ag, quedara capturado en la placa y será puesto en evidencia tras la adicion de otro Ac especifico conjugado con la enzima. Por ultimo se añade el sustrato incoloro que por acción de la enzima, dara un producto coloreado, que producirá un color observable a simple vista y cuantificable mediante un espectrofotómetro. B.3.2 ELISA indirecto para detectar Acs: para la determinación de Acs específicos para un determinado Ag se usa esta técnica, donde el Ag de interés se encuentra adsorbido en la placa de ELISA. Se pueden usar como Ags proteínas virales o bacteianas e incluso virus completos, pero cada vez es mas frecuente que sean las proteínas de interés inmunológico. Es una de las técnicas de elección para buscar Acs contra proteínas de virus que hacen viremia, HIV, rubeola, sarampión y de hemoparasitos (enf. De Chagas, Toxoplasmosis, Trichinosis) en suero de pacientes. Ver figura 19 pagina 27 modulo 3. B.3.3 ELISA sándwich para detectar Acs: permite poner en evidencia la presencia de Ac específicos de isotipo IgM en el suero del paciente, lo cual es muy valioso para hacer DX de infecciones en estadio agudo o de infecciones congénitas en recién nacidos. El soporte posee adsorbido un Ac anti-IgM humana y se hace reaccionar con la muestra(suero del paciente). La IgM presente se va a unir a este Ac de captura a través de su fragmento Fc. Luego se lava y se agrega el Ag de mi interés. Se vuelve a lavar para arrastar lo que no se unió específicamente. Por ultimo se agrega otro Ac especifico marcado con la enzima. Si la muestra contenía IgM especifica, al agregar el sustrato de la enzima, se generara color en el pocillo de reacción. Ver figura 20 en pagina 27 del modulo 3. INMUNOCROMATOGRAFIA: sobre una membrana de nitrocelulosa o nylon se encuentran adsorbidos en la línea de reacción Ac contra el Ag que buscamos y sobre la línea control Ac anti-conjugado, de forma que cuando la muestra contiene Ag, este fluye por la membrana quedando retenido en la línea de reacción. El conjugado, que también es un Ac especifico frente al Ag que buscamos, esta marcado con una molecula de oro coloidal, que también fluye por la membrana, es retenido por el Ag en la línea de reacción y por el Ac en la línea de control. En el caso de muestras negativas que no contienen Ag, el conjugado es retenido únicamente en la línea de control. Estas técnicas son rapidas, obteniéndose resultados en 15-30 minutos. Se usa para detección de Ag de Streptococcus pyogenes en secreciones faríngeas, de Chlamydia trachomatis en secreciones genitales, de Rotavirus y Adenovirus en materia fecal, entre otras aplicaciones diagnosticas. 9 BOLILLA N° 11 RADIOINMUNOENSAYO (RIA): fue una de las primeras pruebas de inmunomarcacion. Su fundamento es similar al ELISA o a la IF con la diferencia que los Acs se marcan con radioisótopos. Han sido desplazadas en el DX clínico por la ELISA y la IF debido al riesgo a la salud que implica la manipulación de compuestos radiactivos. ELECTROQUIMIOLUMINISCENCIA: este tipo de ensayo, pese a no ser enzimático, es muy similar al ELISA. En el se generan (a partir de sustratos estables) productos capaces de emitir fotones al pasar de un estadointermedio inestable y energéticamente superior, a uno de energía inferior mas estable, aunque en este caso su origen es electroquímico y no una reacción enzimática. En este inmunoensayo no competitivo, el anticuerpo utilizado recubre unas microparticulas imantadas, que tras la formación del complejo Ag-Ac, se fijan a un electrodo por magnetismo. Dicho Ac esta conjugado con un marcador (derivado del rutenio) capaz de emitir fotones cuando se aplica una pequeña diferencia de potencial sobre el electrodo. En cualquier caso la energía lumínica se sigue detectando en un fotomultiplicador. Esta técnica sirve para detectar Acs anti HIV+ Ag p24; Acs anti hepatitis B, entre otros. WESTERN BLOT: es un enzimoinmunoensayo cualitativo para la detección in vitro de Ac contra las distintas proteínas de un agente infeccioso en suero o plasma humano. Es mas especifico que el ELISA ya que permite identificar contra que proteínas puntuales están dirijidos los Acs presentes en la muestra. Se usan equipos comerciales los que proveen una tira de nitrocelulosa que contiene las distintas proteínas inmunogenas del microorganismo separadas según su peso molecular (para ello el fabricante realiza una electroforesis y electrotransferencia de las proteínas del agente) y un control interno para reducir el riesgo de falso positivos. Se pone en contacto esta tira con el suero del paciente, luego se lava para eliminar todo aquello que no esta unido específicamente a los Ags de la tira. A continuación se agrega un Ac anti Ig humana conjugado con una enzima. Se vuelve a lavar y posteriormente se procede a agregar el sustrato de la enzima. En aquellos sitios donde hay Ac específicos únidos a los Ag se visualizara la banda correspondiente a ojo desnudo. Su resultado será positivo (si se cumple el criterio de positividad preestablecido), negativo (si no aparecen bandas), o indeterminado (aparecen algunas bandas pero no cumplen el criterio de positividad). TECNICAS IN VITRO PARA MEDIR LA INMUNIDAD CELULAR: Para la evaluación de las poblaciones linfocitarias, con el advenimiento de los Ac monoclonales marcados con fluorocromos y del clasificador electrónico de células activado por fluorescencia que se utilizan en el citrometro de flujo, se han dejado de lado otras metodologías para estudiar subpoblaciones de linfocitos( formación de rosetas, inmunofluorescencia). CITOMETRIA DE FLUJO: cuando una población celular es sujeta a inmunotincion para un marcador particular, por ej: CD4, un subgrupo de la población puede expresar este marcador en concentraciones elevadas, otro conjunto diferente puede expresar el mismo marcador en concentraciones bajas y el resto puede ser negativo. Para agregar complejidad, se puede desear el examen simultaneo de la expresión de un marcador diferente, por ejemplo CD8, para determinar si la expresión de estas proteínas es mutuamente excluyente. La evaluación del porcentaje de células en una población que expresa CD4 o CD8 o ambos, seria una tarea ardua mediante el empleo de microscopia de fluorescencia o confocal, ya que implicaría el recuento manual de varios cientos de células para obtener cifras confiables. Además de la tarea, estos análisis serian bastante subjetivos y muy variables de acuerdo con la pericia del operador. Afortunadamente, el citrometro de flujo realiza estas determinaciones en forma sencilla ya que este instrumento puede analizar el grado de fluorescencia asociado con miles de células por minuto de una manera sumamente reproducible y cuantitativa. En su forma mas básica, el citrometro de flujo es un instrumento equipado con un sistema de manejo del liquido capaz de mover miles de células en una sola fila a través de una cámara estrecha iluminada por un laser. El paso de una celula inmunomarcada a través de la cámara produce la exitacion del fluorocromo 10 BOLILLA N° 11 adherido a la celula por el laser. La emisión resultante del fluorocromo se evalua mediante un detector basado en un fotomultiplicador, que permite la cuantificación precisa de la fluorescencia asociada con la celula. Asi, es posible diferenciar con rapidez células negativas, ligeramente positivas o muy positivas para un marcador o un Ag dado. Los citrometros de flujo mas modernos cuentan con tres o cuatro laseres de longitudes de onda diferentes con detectores asociados, y cada combinación laser- detector puede recoger señales de los distintos fluorocromos diferentes. Entonces, es posible realizar la inmunotincion de una población calular para cuatro marcadores diferentes y recoger los datos que se relacionan con la expresión de la totalidad de los cuatro marcadores a medida que la celula pasa a través del citrometro de flujo. El citrometro de flujo también es capaz de proporcionar información relativa al tamaño y la granularidad de la celula por la manera en que la luz del laser se dispersa o se refleja a medida que atraviesa la celula. Esta información denominada dispersión frontal y lateral, también es muy útil ya que suele ser suficiente para permitir la discriminación entre tipos celulares distintos. Asi el citrometro de flujo registra datos cuantitativos referentes al contenido de Ag y la naturaleza física de cada celula, con parámetros multiples que se evalúan celula por celula para brindar un análisis fenotípico de cada una en lugar de un promedio de la población. Con el numero asombroso de Ac monoclonales y los fluorocromos disponibles, es posible procede al análisis con alto grado de detalle, lo cual ha contribuido notablemente, entre otras cosas, al DX de las laucemias. Estreptococos beta hemolíticos. Introduccion a todos los grupos de estreptococos: Los estreptococos son bacterias Gram positivas, de forma esférica u ovoide, que se presentan en pares o en cadenas de longitudes variadas. No forman esporas, son catalasa negativos, generalmente inmóviles y la mayoría de ellos son anaerobios facultativos. Sus requerimientos nutricionales son complejos y variables. Tienen amplia distribución en la naturaleza. Existen numerosas especies identificadas, que son patógenos para los seres humanos. Las mas importantes son: Streptococcus pyogenes y Streptococcus pneumoniae. Pueden causar diferentes enfermedades tales como piodermitis, faringitis, escarlatina,endocarditis, sepsis puerperal, caries dentales,afecciones periodonticas y secuelas no supurativas como fiebre reumática y glomrulonefritis aguda. Hay un grupo de estreptococos invasivos con capacidad de producir infecciones severas que conducen a shock general y meurte. Hábitat natural: son usualmente parasitos del hombre y otros animales. Mientras algunos estreptococos son patógenos virulentos, otros viven armoniosamente con su huésped como comensales avirulentos. Los estreptococos colonizan la piel y membranas mucosas, pueden ser aislados como parte de la flora normal del tracto gastrointestinal y respiratorio. Clasificación: la clasificación para diferenciar este grupo heterogéneo de microorganismos no es única. Depende de una combinación de características que incluyen los patrones de hemolisis observados en las placas de agar sangre, composición antigénica, características de las colonias, reacciones bioquímicas y mas recientemente análisis genéticos. Cuando se observan estreptococos en agar sangre se puede apreciar diferencias morfológicas. Las colonias en algunas cepas están rodeadas por zonas incoloras dentro de las cuales los globulos rojos han sido lisados en forma completa, este patrón se designa beta hemolisis y es de considerable importancia ya que lo presentan S. pyogenes y muchos otros estreptococos patógenos para el hombre. Un segundo grupo de microorganismos produce alfa hemolisis, o hemolisis parcial. La observación al microscopio revela una zona interna de células no hemolizadas y una zona externa de hemolisis. Estas colonias producen una coloración verdosa en el medio. Esta reacción,que varia con el tipo de sangre, da origen al termino estreptococos del grupo viridans, aplicado con frecuencia a las cepas alfa hemolíticas. 11 BOLILLA N° 11 Streptococcus pneumoniae es alfa hemolítico, asi también lo son otras cepas estreptococcicas que normalmente habitan en el tracto respiratorio superior y gastrointestinal de los seres humanos. Por ultimo, se ha utilizado el termino gamma hemolisis para designar aquellas cepas que no producen hemolisis, también se las designa como estreptococos no hemolíticos. Lancefield ha clasificado a los estreptococos beta hemolíticos mediante serología. Estos microorganismos poseen un antígeno grupo especifico, llamado sustancia C. cuando este componente es un polisacárido se los agrupa en A, B, C, F y G, y cuando es un acido teicoico en grupo D hasta N. esta clasificación en la actualidad aun puede ser usada como primer paso en la identificación. ESTREPTOCOCO LANCEFIELD HEMOLISIS. S. pyogenes A Beta. S. agalactiae( da meningitis, numonia y sepsis del neonato). B Beta.( aveces alfa o gamma) S. pneumoniae ----- Alfa. S. viridans ----- Alfa (aveces beta o gamma). Taxonomía: Los extensos cambios en la clasificación de los estreptococos resultan de los estudios taxonómicos moleculares del genero Streptococcus. Los enterococos( previamente considerados estreptococos grupo D), y los lactococos( como estreptococos grupo N, ahora residen en nuevos genero: Enterococcus y Lactococcus respectivamente. Aunque el criterio fenotípico tradicional( reacción hemolítica, grupo serológico de Lancefield) para la clasificación de Estreptococcus es aun útil en ciertas circunstancias, los viejos esquemas de clasificación deben ser reemplazados por la nueva taxonomía. Se conoce que entre los estreptococos beta hemolíticos, especies no relacionadas pueden producir antígenos de Lancefield idénticos, y especies genéticamente relacionadas, tener antígenos de Lancefield heterogéneos. No obstante estas excepciones, para los fines tradicionales de la taxonomía estreptococal, la reacción hemolítica y el test serológico de Lancefield, pueden aun ser usados para dividir los estreptococos dentro de categorías, como primer paso en la identificación de los aislamientos clínicos. Los estreptococos beta hemolíticos que poseen antígeno de Lancefield grupo A, C o G pueden ser subdivididos en dos grupos: los formadores de colonias grandes (mayor a 0.5mm de diámetro) y los que forman colonias pequeñas(menor a 0.5mm de diámetro). Los formadores de colonias grandes del grupo A (S. pyogenes) C y G son estreptococos “piogénicos”, que presentan una variedad de mecanismos de virulencia. Las cepas beta hemolíticas, formadoras de colonias pequeñas de los grupos A, C y G de Lancefield son genéticamente diferentes de las cepas piogénicas y están relacionadas a estreptococos del grupo anginosus. Aunque pueden participar en infecciones(abscesos importantes) se encuentran también como comensales, poseen menor capacidad patogénica que los estreptococos piogénicos. S. agalactiae es el único que puede ser identificado con certeza, por su producción de antígeno grupo B y otro rasgo fenotípico. Los aislamientos que presentan alfa hemolisis corresponden a las especies Streptococcus pneumoniae y estreptococos del grupo viridans, entre otros, los que pueden ser diferenciados con las pruebas de optoquina y solubilidad en bilis. En la actualidad, los organismos conocidos como estreptococos variante nutricional( que requieren piridoxal para crecer) no están estrechamente relacionados a estreptococos y por lo tanto no pueden ser incluidos en el genero streptococcus. Para ubicar a estas bacterias 12 BOLILLA N° 11 se ha propuesto un nuevo genero denominado Abiotrophia. Lo mismo ocurre con organismos que previamente fueron considerados como estreptococos anaerobios, no se los incluye en el genero por no guardar relación genética con ellos. Taxonómicamente la 9na edición del Manual de determinaciones bacteriológicas de Bergey los ubica en: Grupo 1: cocos Gram positivos. Genero: Streptococcus. Enterococcus. Abiotrophia. Pediococcus. Gemella. Lactococcus. Vagococcus. Aerococcus. Genero Streptococcus. Son cocos Gram +, catalasa negativos, anaerobios facutativos. Son esféricos u ovales con menos de 2 mm de diámetro. Aunque crecer en presencia de O2, no son capaces de sintetizar compuestos hemo y son incapaces de llevar a cabo un metabolismo respiratorio. Algunas especies (S. pneumoniae y ciertas especies de estreptococos del grupo viridans) requieren elevadas concentracion de CO2 para cercer. La atmosfera enrriquecida en CO2 estimula el crecimiento de muchas especies de estreptococos. Son microorganismos nutricionalmente fastidiosos, con requerimientos nutritivos variables. Crecen sobre medios comlejos enrriquecidos con sangre o suero, glucosa y otros carbohidratos. Son metabolizados fermentativamente, produciendo acido láctico como principal producto metabolico. No forman gas durante el metabolismo de la glucosa. Los estreptococos aislados producen la enzima leucina aminopeptidasa( también llamada leucina arylamidasa o LAP) la producción de pyrrolidonil arylamidasa(PYR) es rara entre los estreptococos( es positiva en S. pyogenes y algunas cepas de S. pneumoniae). Nota: hasta aca es como una “introducción” que da el libro tanto de los beta como los alfa hemolíticos, desde ahora es solo beta hemolíticos. Streptococcus pyogenes. Epidemiologia: Formadores de colonias grandes (piogénicos) Estreptococo grupo A(S. pyogenes). Estreptococo grupo B (S. agalactiae). Estreptococo grupo C y G.(S. disgalactiae spp equisimiles). Formadores de colonias pequeñas. Estreptococo grupo A, C y G (grupo anginosus). Estreptococos beta hemolíticos: 13 BOLILLA N° 11 S. pyogenes es el de mayor frecuencia en relación con enfermedades humanas. Se considera improbable que un niño supere la primera década de su vida sin haber presentado cuadros faríngeos o de vías respiratorias superiores producidos por estreptococos grupo A. la faringitis estreptocócica puede ocurrir a cualquier edad, pero prevalece entre los 5 y los 15 años de edad. En todas la edades, la transmisión de estas infecciones se ve favorecida por el hacinamiento y por las condiciones climaticas durante el otoño y el invierno, época en que aumentan los portadores nasofaríngeos. Las gotitas de las secreciones respiratorias pueden estar contaminadas con estreptococos y diseminarse ya sea en forma directa o a través de alimentos contaminados por individuos infectados, originando grotes epidémicos. La transmisión por leche y productos lacteos, que anteriormente constituían un severo problema, ha sido controlada con la pasteurización. Pioderma estreptocócica(impétigo) ocurre con mayor frecuencia en verano. Los microorganismos responsables del impétigo colonizan primero la piel y luego pueden invadir la faringe. El ambiente sucio, el hacinamiento, las picaduras y los microtraumas desempeñan un papel importante, favoreciendo las infecciones, ya que contribuyen a la proliferación de estos microorganismos. La escarlatina se observa en individuos en edad escolar. Su transmisión ocurre en los ambientes familiares o escolares, a través de las gotitas de saliva de portadores asintomáticos o pacientes con sintomatología por S. pyogenes capaces de elaborar toxinas eritrogenicas. Streptococcus pyogenes puede iniciar dos secuelas no supurativas: fiebre reumática aguda(FRA) y glomerulonefritis aguda postestreptococica (GNPE). La FRA se observa después de faringitis y la GNPE puede presentarse después de una infección cutánea o por cepas de piel que colonizaron faringe. Morfología- requerimientos nutricionales. Los estreptococos del grupo A (S. pyogenes) son microorganismos esféricos u ovoides, de 0.6 a 1mm de diámetro. La mayoríade las cepas forman colonias largas,especialmente en medios liquidos. Son Gram positivos, pero pueden convertirse en Gram negativos a medida que el cultivo envejece. Son catalasa negativos,anaerobios facultativos. Son nutricionalmente fastidiosos. Los medios complejos enriquecidos con sangre de oveja son adecuados ya que la reacción hemolítica puede ser determinada tempranamente. Los patrones hemolíticos pueden variar según la fuente de sangre animal usada o el tipo de medio basal usado. Los cultivos para aislamientos de estreptococos deben ser incubados a 35-37°C; pH optimo de 7-7.5. acrecienta la recuperación de este microorganismo la incubación en atmosfera que contenga 5% de CO2. Componentes superficiales de S. pyogenes: Pared celular: es fundamental para mantener la integridad de la celula. Es permeable a los compuestos nutritivos necesarios para se desarrollo. Tiene una relación directa con la capacidad de organismo para infectar e inducir estados patológicos. La pared de los estreptococos consta de peptidoglicano, polisacáridos, proteínas y acido teicoico. Los polisacáridos y proteínas antigénicas se encuentran en la superficie de las células. Al observarse un corte transversal de la pared, se ve una trama semejante a un retículo entrelazado, que va desde el peptidoglicano de la pared hacia la superficie y los acidos teicoicos y lipoteicoico que se dirigen a través de la pared hacia el exterior. Estructura antigénica: 14 BOLILLA N° 11 Carbohidratos: uno de los métodos para clasificar estreptococos es el realizado por Rebeca Lancefield en 1933, quien proporciono las bases para la clasificación serológica de estas bacterias. Los antígenos (ya sean polisacáridos o acidos teicoicos) pueden ser extraidos de células enteras por medio de acido clorhídrico diluido, autoclave, acido nitroso diluido o enzimas líticas. Los extractos asi obtenidos son probados contra antisueros grupo específicos, para determinar los diferentes grupos serológicos. El antígeno especifico de grupo, o polisacárido C, esta compuesto por un polímero de L-ramnosa y N-acetil-D-glucosamina, siendo éste ultimo el determinante antigénico. Este carbohidrato esta unido al glucopeptido y consiste en N-acetil-D-acido muramico, acido D-glutamico, L- lisina y D yL- alanina. Proteínas: los estreptococos del grupo A producen antígenos proteicos de superficie: M;T y R. mas del 90% de las cepas estreptocócicas pueden ser clasificadas en serotipos utilizando los antígenos M y T. La proteína M es el principal factor de virulencia de los estreptococos grupo A. se han descrito numerosos serotipos. Esta proteína esta asociada con el pili en la superficie externa de la pared celular, es termoestable, su extracción no altera la viabilidad celualar. La tipificación M se lleva a cabo por medio de pruebas de precipitación en tubos capilares, utilizando extractos de antisueros tipo- específicos y acido clorhídrico a ebullición. Actualmente también puede ser clasificada por PCR. Los antígenos T son termolábiles. No se asocian con el pili de superficie ni con la virulencia. Los anticuerpos contra Ag T no son protectores. Antígeno capsular: muchos estreptococos del grupo A producen una capsula de acido hialuronico con poco significado antigénico, pero que incrementa la virulencia del organismo. Ver figura 23.2 pag 298 Basualdo. Determinantes de patogenicidad. La proteína M y la capsula son los factores de virulencia que le confieren a S. pyogenes propiedades antifagociticas. Capsula de acido hialuronico: esta compuesta por un polímero de acido hialuronico que contiene unidades repetidas de acido glucoronico y N-acetilglucosamina. En la síntesis del polímero están involucrados tres genes has A, B y C. La expresión de estos genes es controlada transcripcionalmente. La capsula es requerida para resistir la fagocitosis. Actua como barrera física evitando el acceso de los fagocitos a las proteínas superficiales bacterianas y de este modo, inhibe la fagocitosis. Es también un importante factor de adhesión en la faringe. Epidemiológicamente se ha observado que las cepas altamente mucosas están relacionadas a fiebre reumática y enfermedad invasiva severa, lo que sugiere que la capsula podría jugar un papel importante en la infección invasiva humana. Los anticuerpos anticapsulares no son opsonicos y por los tanto no son protectores contra la infección. Proteína M: es la principal proteína de superficie y factor de virulencia de S. pyogenes. Se han identificado mas de 80 serotipos. La proteína M presenta dos regiones,una aminoterminal que se proyecta desde la superficie de la pared celular, y una región carboxil terminal que esta anclada en la membrana celular; esta ultima es altamente conservada y es compartida por la mayoría de los serotipos. La proteína M se proyecta como un dimero, espiral-enrollado a helicoidal, que aparece como fibrillas sobre la superficie del estreptococo. Estas proteínas han sido divididas en clase I y clase II. Las correspondientes a clase I contienen un epitopo expuesto en la superficie, que reacciona con los Ac contra la región repetida C y son un factor de opacidad del suero negativo. Los de clase II no reaccionan con dichos Ac, ya que carecen de epitopo superficial y poseen factor de opacidad positivo. Hay una fuerte correlacion entre serotipos que producen fiebre reumática y presencia de epitopo clase I. La inmunidad contra la proteína M es protectiva, pero solo contra reinfecciona ese particular serotipo. Los Ac contra la proteína M inhiben la fagocitosis por unión al factor H y al fibrinógeno: bloqueando la activación via clásica o via alternativa del complemento, respectivamente. 15 BOLILLA N° 11 La respuesta inmune contra la proteína M produce Ac contra componentes del microorganismo, pero que también pueden reaccionar con los tejidos del huésped. Los informes clínicos y estudios epidemiológicos indican que los tipos de proteína responsables de enfermedad invasiva y toxica son M1,3,11,12 y 28, siendo los mas frecuentes M1 y M3. Además de las propiedades antifagociticas de la proteína M, hay otras moléculas de la superficie que contribuyen a resistir la fagocitosis. Toxina eritrogenica: varios son los factores de virulencia de S. pyogenes involucrados en la patogénesis. Entre ellos se encuentran tres exotoxinas pirogénicas, llamadas toxinas eritrogenicas tipo A, B y C. La codificación de exotoxina B esta localizada en el cromosoma mientras que A y C son codificadas por un bacteiofago en estado lisogenico. Actualmente se conocen otras exotoxinas tales como: exotoxina F(factor mutagenico) y el superantigeno estreptococal (SSA), como asi también los nuevos superantigenos, con fuerte actividad mitogenica, que se los denomina con las siglas ApeC, SpeH, SpeS, SmeZ y SmeZ-2. Todas estas exotoxinas, que actúan como superantigenos, se caracterizan porque interactúan con el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase II, sin requerir procesamiento previo, activando un numero masivo de células T produciendo una liberación masiva de citocinas inflamatorias, que causan daño. Las exotoxinas pirogénicas son responsables de algunas de las manifestaciones el Sme toxico estreptococal, presentes en la fiebre escarlatina: rash, lengua en fresa y descamación de la piel. La exotoxina B es una proteasa que corta fibronectina, vitronectina, la matriz extracelular de las proteínas e IL-1 humana. Es muy importante en la inflamación, shock y destrucción de tejido. En todas las enfermedades invasivas se producen elevados títulos de Ac contra exotoxina B. La antitoxina inyectada en la piel de un paciente con escarlatina produce en la zona un emblanquecimiento localizado, debido a la neutralización de la toxina eritrogenica( reacción de Shultz y Charlton). Hemolisinas: la estreptolisina O (STO) es producida por la mayoría de las cepas de estreptococo grupoA, y también cepas de los grupos C y G. es toxica para eritocitos y leucocitos. Esta hemolisina es inactivada por oxigeno. Luego de infección faríngea o sistémica, se detectan títulos elevados de Ac antiestreptolisina O(ASTO). La respuesta inmune después de una infección cutánea es considerablemente menor, probablemente por inactivación local de estreptolisina O, por los lípidos de la piel. La estreptolisina S (STS) es una toxina no antigeica, oxigeno estable, inhibible por acidez. Ejerce acción lítica sobre los globulos rojos y blancos, y sobre formas L y protoplastos bacterianos. Ambas hemolisinas son responsables de la reacción beta hemolítica en agar sangre. DNasas A, B,C y D: estas enzimas extracelulares son producidas por muchos estreptocos del grupo A. Los Ac contra DNasa B tienen gran valor diagnostico, principalmente en la infección cutánea, ya que los Ac anti estreptolisina O están ausentes o son muy bajos. También se observan títulos elevados en farigitis. Otras enzimas: la estreptocinasa cataliza la conversión de plasminogeno en plasmina, llevando a la lisis de fibrina e hidrólisis de proteínas. La hialuronidasa estreptocócica es capaz de hidrolizar el acido hialuronico de los tejidos animales, como asi también el presente en la capsula que rodea a S. pyogenes. Ambas proteínas son antigénicas. La detección de sus anticuerpos son de gran valor en el serodiagnóstico de infección estreptocócica. Patogénesis: Adherencia y colonización: la adherencia de estreptococo grupo A a las células epiteliales de faringe o dermis es el paso inicial mas importante en la colonización del huésped. La adhesión especifica permite la competición entre la flora normal y estreptococo grupo A. el proceso de adhesión involucra multiples adhesina. La adherencia esta asociada a fimbria proteína M sobre la superficie del microorganismo. Shorhly y otros describieron el papel de la adhesina del acido lipoteicoico (LTA). Los anticuerpos contra LTA bloquean la 16 BOLILLA N° 11 adhesión a las células epiteliales, cuyo receptor es la fibronectina. LTA actua como una adhesina que le permite reaccionar a través de una estructura de poliglicerol fosfato, cargado negativamente y los residuos de las proteínas de superficie, cargadas positivamente. El lipido de la molecula de LTA se proyecta hacia fuera e interactua con sitios de unión acido graso sobre fribronectina y células epiteliales. Se han descripto por lo menos 11 adhesinas para estreptococo grupo A, de naturaleza proteica tales como M, LTA,proteína F/Sfb, dos proteínas que unen fibronectina, una deshidrogenasa gliceroaldehido 3 fosfato, una proteína que liga galactosaa, una proteína que liga vitromicina, proteína que liga colágeno, FBP54 y capsula de hialuronato. Cada una de estas proteínas tiene un receptor especifico en las células del huésped. De todas las adhesinas estudiadas, proteína M y LTA fueron las únicas capaces de prevenir la colonización en animales y proteger contra las infecciones letales por S. pyogenes. Se ha descrito el mecanismo de adhesión en dos tiempos, que son: uno relativamente débil, mediado por LTA, que es el primer paso en la adhesión, en el segundo paso hay una fuerte repulsión electrostática en el que esta involucrada la proteína M, FBP54, la proteína F, el factor de opacidad y todas las otras adhesinas arriba mencionadas. Las adhesinas pueden diferir según la localización de la infección en la garganta o piel, debido a la presencia o ausencia del receptor especifico. Las alteraciones en las células huésped por la presencia de citocinas proinflamatorias, pueden cambiar las condiciones para la adhesión a la celula huésped. Hay evidencia de que estreptococo grupo A no solo se adhiere a las células epiteliales sino que también invade. La Penta demostró que este germen tiene el potencial de invadir las células epiteliales tanto o mas que otros patógenos bacterianos extracelulares(Salmonella spp , Listeria spp). Manifestaciones clínicas. S. pyogenes puede colonizar el tracto respiratorio superior y ser responsable de faringitis aguda, desde allí diseminarse al tracto respiratorio superior e inferior produciendo infecciones tales como otitis, sinusitis y neumonía. Además es capaz de infectar meninges, ya sea por extensión desde otitis o sinusitis, o por invasión del torrente sanguíneo a partir del foco pulmonar. Desde sangre es capaz de infectar hueso y articulaciones( osteomielitis o artritis). Faringitis y escarlatina: la infección faríngea puede ser asintomática o asociarse con dolor de garganta, fiebre, escalosfrios, cefalea, malestar, nauseas y vomitos. La faringe puede presentarse levemente eritematosa o francamente enrojecida, con exudados amarillo grisáceos que con frecuencia sangran cuando se efectúan hisopados para cultivos. Habitualmente presentan adenopatías cervicales anteriores y leucocitosis. Pueden verse sindromes clínicos indistinguibles de una faringitis estreptocócica en la difteria, mononucleosis infecciosa e infecciones por virus respiratorios. Aunque estreptococs grupo A no es considerado flora normal, la portación faríngea puede ocurrir sin sintomatología clínica de enfermedad. Ciertos serotipos de proteína M tales como M1,3,6,14,18,19 y 24 estan asociados con faringitis y fiebre reumática. Estreptococos grupos C y G formadores de colonias grandes, también pueden causar faringitis y deben ser distinguidos en los cultivos de garganta de los del grupo A. estreptococos grupo C y G no producen fiebre reumática usualmente. Las secuelas supurativas de faringitis (abscesos amigdalinos,septicemia,mastoiditis, osteomielitis) pueden producirse ya sean por diseminación al tejido contiguo o por diseminación hemática. Las cepas de estreptococo grupo A capaces de producir fiebre escarlatina portan genes para la producción de una o mas de las toxinas pirogénicas A, C y B. La asociación de un enrojecimiento escarlatiniforme (eritema que se blanquea con la presión, inicialmente compromete tronco y cuello y luego extremidades, pudiendo producir descamación durante la convalescencia) es casi diagnostica de infección estreptocócica. La fiebre escarlatina, 17 BOLILLA N° 11 generalmente asociada a infección de garganta, también puede ser debida a infección estreptocócica en otros sitios. Infección de la piel: impétigo o pioderma: los microorgaismos pueden ingresar al huésped por abraciones de la piel y otros tipos de lesiones, produciendo infección superficial de la piel, caracterizada por la formación de costras y lesiones de color ambar que pueden comenzar como pequeñas vesículas. Las lesiones tempranas habitualmente contienen solo estreptococos, pero también pueden estar acompañadas por estafilococos. Estos pueden sobreinfectar porteriormente, haciendo difícil el aislamiento de S. pyogenes. Algunas cepas que infectan la piel y poseen serotipos particulares de proteína M tales como M2,49,57,60 y 61 estan asociados a glomerulonefritis aguda postestreptocócica (GNPE). Los organismos que colonizan piel no causan fiebre reumática, pero pueden también colonizar garganta y son estas las cepas faríngeas capaces de conducir a glomerulonefritis. Una vez que entra el microorganismo, puede producir: A- erisipela caracterizada por eritema de las capas superficiales de la piel; y B- celulitis cuando afecta al tejido subcutáneo. Enfermedades severas: síndrome de shock toxico y fascitis necrotizante: la infección por estreptococo grupo A productor de shock toxico puede ocurrir en muslo y en aponeurosis. Se produce luego de la entrada del germen a través de la piel. Las manifestaciones clínicas de infección estreptococica invasiva incluyen hipotensión y shock, rápida necrosis de los tejidos subcutáneos y piel e incluso gangrena. Los factores predisponentes pueden ser trauma de piel, cirugía, varicela y quemaduras. Sepsis puerperal: S. pyogenes puede infectar mucosa vaginaly utero conduciendo a enfermedad severa o septicemia. El síndrome clásico se caracteriza por escalosfrios, fiebre, enrojecimiento facial, distención abdominal con sensibilidad pelviana y secreción vaginal serosanguinoleta. La mortalidad ha disminuido por los antibióticos, pero aun con tratamiento la recuperación puede ser complicada y prolongada. Secuelas no supurativas. Glomerulonefritis postestreptococica: la glomerulonefritis asociada a pioderma por estreptococo grupo A ocurre mas frecuentemente en verano. En los climas frios, la glomerulonefritis esta relacionada con faringitis. Sin embargo, el mismo organismo que afecta piel como impétigo también infectaría garganta. En general la infección de piel precede a ésta. La ausencia de recurrencia individual puede ser debida a la presencia de anticuerpos tipo específicos contra los factores nefritogenicos. La nefritogenicidad de S. pyogenes parece estar relacionada a serotipos específicos de proteína M, pero no todas las cepas de un mismo serotipo son nefritogenicas. Los serotipos predominantes asociados a pioderma y glomérulo nefritis son: M2,49,42,56,57 y 60 mientras que M1,4,12 y 25 estan asociadas a faringitis y glomerulonefritis. Las cepas que causan piodermitis producen factor de opacidad o lipoproteinasas, mientras que los que causan faringitis no. Las características de las GNPE incluyen edema,hipotensión, hematuria, anormalidad del sedimento urinario, disminución de los niveles del complemento en suero, fiebre leve. Cuando la cepa tiene origen faríngeo, los títulos de Ac antiestreptolisina O (ASTO), anti DNasa B y antihialuronidasa son elevados, a diferencia de las cepas que provienen de piel que presentan títulos bajos de ASTO por inhibición local de estreptolisina O. En general en la GNPE no hay daño permanente de riñon en niños. Sin embargo Bisno sostiene que el 1% de los chicos con fiebre, desarrollan fallas renales irreversibles, glomerulonefritis crónica o hipertensión. El probable mecanismo de patogénesis de GNPE se relaciona a un fenómeno inmunológico que involucra complejos inmunes, proteína nefritogenica estreptocócica o ambos. Se han propuesto numerosos mecanismos, incluyendo deposición de inmunocomplejos, reacción de Ac que presentan reactividad cruzada con estreptococo y Ag glomerular, alteración del tejido glomerular por productos estreptocócicos tales como 18 BOLILLA N° 11 proteinasas o estreptoquinasas y activación directa del complemento por componentes estreptocócicos depositados en el glomérulo. Una proteína estreptocócica diferente de M, llamada endostreptasin puede ser depositada en el riñon y da lugar a un deposito de inmunoglobulinas y activación del complemento por la via alternativa. En los estreptococos aislados de nefritis, se observo la presencia de una proteína unida a plasmina conocida como Proteinase zimogen estreptococal con actividad de proteasa, precursora de la exotoxina pirogénica B. Hay evidencias de que la estreptocinasa nefritogenica ataca el tejido renal. Esta estreptocinasa se une y activa plasminogeno a plasmina, potente proteasa, la cual podría activar el complemento y llevar a una glomerulonefritis. Fiebre reumática: es una secuela tardia de faringitis estreptocócica. Si bien el huésped inmune y la respuesta inmune están involucrados en el desarrollo de esta enfermeda, estreptococo grupo A juega el papel central. Se manifiesta como una inflamación de las articulaciones( artritis), corazón(carditis), SNC, piel y/o nódulos subcutáneos. Esta enfermedad es autoinmune y es el resultado, probablemente en parte, de la producción de Ac autorreactivo y células T, que dan reacción cruzada con componentes del germen y tejidos del huésped. La importancia medica de la fiebre reumática es que si bien la artritis no produce daño permanente, la lesión que sufre el corazón puede ser severa (miocarditis o valvulitis) pudiendo llevar a la muerte o al reemplazo valvular. La fiebre reumática es la principal causa de enfermedad cardiaca de niños en el mundo, principalmente en regiones no desarrolladas, donde el acceso al cuidado medico es limitado. Los factores responsables de la enfermedad, incluidos el antígeno mayor de histocompatibilidad y potenciales antígenos tipo específicos están siendo aun investigados. Se tiene evidencia de que los linfocitos T juegan un papel muy importante en la patogénesis de la carditis reumática. Huésped susceptible. No obstante la alta prevalencia de faringitis estreptocócica, solo un pequeño porcentaje de individuos desarrollan fiebre reumática. Existe un factor genético caracterizado como reservorio autosomal. Si bien se supone que hay susceptibilidad genética, los factores ambientales influyen en la susceptibilidad a la enfermedad. Se postula que al igual que muchas enfermedades autoinmunes, la fiebre reumática es multifactorial, debida a una combinación de factores que comprenden susceptibilidad del huésped,aquellos inherentes al proceso y los ambientales. Tratamiento y prevención. Las cepas de S. pyogenes son sensibles a penicilina. Actualmente todavía no se ha logrado obtener vacunas efectivas para la enfermedad que produce. Diagnostico: ( el libro daba en conjunto el DX para todos los tipos de estreptococos, alfa, beta y gamma hemolíticos) Toma de muestra: 1- Garganta: la técnica de hisopado de fauces es muy importante en el aislamiento de estreptococos. Es necesario frotar las amígdalas con un hisopo esteril, evitando tocar la lengu y la uvula. 2- Nariz: los cultivos nasales deben tomarse con un alambre flaxible, esteril ¿, con punta de algodón. El hisopo puede humedecerse con aguja esteril o soluciones salinas antes de introducirlo en la nariz del paciente. El hisopo se introduce suavemente a lo largo del piso de la cavidad nasal, por debajo del cornete medio, hasta llegar a la pared faríngea. El diagnostico de sinusitis se debe realizar por puncion de senos maxilares. 3- Piel: las muestras para cultivo se obtienen mejor de lesiones cutáneas quitando las costras de las pustulas o vesículas. El hisopo esterilizado debe frotarse firmemente en la lesión, procedimiento necesario para asegurar la máxima recuperación de estreptococos. 19 BOLILLA N° 11 4- Sangre, LCR, esputo, orina: se siguen las indicaciones clásicas descriptas ara la obtención de estas muestras destinadas a cultivos. Transporte: si no transcurren mas de dos horas entre la recolección de la muestra por hisopado y su examen en el laboratorio, no son necesarias precausiones especiales. Si no se va a procesar hasta el dia siguiente debe usarse un medio de transporte como Stuart o Amies. Conservación: la mayoría de los estreptococos sobreviven durante varios meses en agar sangre en un recipiente bien tapado a 4°C. son excepcionales las cepas neumococicas y algunas de estreptococos grupo viridans que no sobreviven mas de una semana. Todos los estreptococos sobrevive 1 a 2 años congelados a -70°C y durante 20 o mas años si están liofilizados. Procesamiento e interpretación: S. pyogenes: puede ser identificado por sensibilidad a bacitracina. Cualquier halo de inhibición se considera sensible. Todos dan la prueba de PYRasa positiva. Reaccionan con Ag de Lancefield tipo A. S. pneumoniae: puede ser identificado presuntivamente por dos propiedades bioquímicas: por su sensibilidad a optoquina y solubilidad en bilis. La confirmación se realiza mediante test de Quellung( tipificación de antígeno polisacárido capsular). Esta prueba puede ser aplicada directamente en muestras clínicas como esputo, LCR, liquido pleural. En meningitis se puede realizar un diagnostico rápido presuntivo, detectando antígeno capsular soluble, en el LCR, realizando contrainmuno- electroforesis (CIE), principalmente cuando al paciente se le administro antibióticos y los cultivos pueden resultar negativos. S. agalactiae: puede ser identificado presuntivamentepor propiedades bioquímicas como hidrólisis de hipurato de sodio. La mayoría son capaces de producir una proteína extracelular difusible (factor CAMP) que actua sinérgicamente con la beta hemolisina estafilococica, causando lisis únicamente de eritrocitos de carnero o bovino. La confirmación de este microorganismo se realiza por serología(antígeno grupo B de Lancefield). Estreptococo grupo viridans: la identificación puede ser realizada mediante propiedades bioquímicas: producción de acetoina (VP), hidrólisis de urea, utilización de azucares (manitol, sorbitol), esculina, arginina. Enterococo: la identificación presuntiva de cocos Gram positivos como enterococos es aquella cepa que hidrolice esculina en presencia de bilis 40%, hidrolice PYR y produzca LAP, que sea capaz de crecer en caldo con 6.5% de NaCl, y sea capaz de desarrollar a 10°C y a 45°C. la demostración de la presencia de antígeno grupo D puede ser de ayuda en la identificación de algunas cepas, pero esta reacción debe ser interpretada cautelosamente. La mayoría de las cepas de Pediococcus y aproximadamente la mitad de las cepas de Leuconostoc aislados de fuente humana, también tienen Ag grupo D. La tardanza o débil reacción con antígeno D se puede observar con algunas cepas de Vagococcus. Estreptococo grupo B. Los estreptococos beta hemolíticos con antígeno de Lancefield grupo B se denominan S. agalactiae. Son causa importante de infección neonatal severa, caracterizada por sepsis y meningitis. La colonización densa con este microorganismo del tracto genital materno constituye un riesgo de enfermedad neonatal, asociada a proceso neumónico, que puede irrumpir precozmente en los primeros días después del parto. La aparición tardia usualmente ocurre después de una semana de edad. Streptococcus agalactiae puede ser responsable de infecciones postparto. Las manifestaciones clínicas pueden ser: bacteriemia, endocarditis, infección de piel, de tejido blando y osteomielitis. Las condiciones que predisponen a infecciones por este microorganismo incluyen DBT y HIV. Estreptococos beta hemolíticos grupos C y G. 20 BOLILLA N° 11 Los estreptococos grupos C y G que forman grandes colonias son estreptococos similares a S. pyogenes y causan un amplio rango de infecciones severas como bacteriemia, endocarditis, meningitis, artritis séptica e infecciones del tracto respiratorio y piel. Aunque los síntomas de infección faríngea causada por estos estreptococos son similares a las del grupo A, no parecen estar asociadas generalmente con secuelas no supurativas. Las cepas del grupo C y G formadoras de colonias grandes normalmente son aisladas a partir de animales, no son frecuentes en infecciones humanas. Algunos de estos, forman colonias pequeñas beta hemolíticas, estas pueden expresar antígeno de Lancefield grupo A,C,F, o G o ser no agrupables. Usualmente son identificados como especies miembros del grupo anginosus. Si bien viven como comensales en la faringe, y no son considerados agentes de faringitis, pueden ser aislados a partir de infecciones piogénicas. Enterococos. Evidencias genéticas de que S.faecalis y S.faecium son lo suficientemente diferentes de los otros miembros del genero Streptococcus, ha determinado que se los agrupe en un genero separado. Características del genero. Son cocos Gram positivos que se presentan solos, en pares o en cadenas cortas. Son anaerobios facultativos. La mayoría de las cepas crecen a 10°C y a 45°C, la T° optima de crecimiento es 35°C. todas las cepas se desarrollan en caldo conteniendo NaCl al 6.5% e hidrolizan esculina en presencia de 40% de sales biliares(medio de bilis esculina). Algunas son móviles. La mayoría de los enterococs hidrolizan PYR. Todas las cepas producen leucina aminopeptidasa (LAP), son catalasa negativas, si bien ocasionalmente pueden ser catalasa positivas. Casi todas las cepas son homo fermentativas y producen acido láctico como producto final de la fermentación de glucosa, sin producción de gas. La mayoría posee una pared celular asociada al Ag glicerol acido teicoico, que es identificado con Ag estreptococico grupo. Su detección es a veces dificultosa. Hábitat natural. La naturaleza de este microorganismo permite que crezca y sobreviva en medio ambiente desfavorable. Puede ser encontrado en suero, agua,animales, pajaros e insecto. Habita el tracto intestinal y genito urinario de humanos y otros animales. La prevalencia de diferentes especies enterococales varia de acuerdo con el huésped, influye la edad, dieta y otros factores que se relacionan a los cambios en las condiciones fisiológicas. E. faecalis y E. faecium son las bacterias mas frecuentemente aisladas del tracto gastrointestinal humano. Significado clínico. Debido a la naturaleza ubicua de este microorganismo, se requiere precausion al establecer el signifiado clínico de un aislamiento. Es especialmente importante realizar el test de sensibilidad antimicrobiana. Son responsables del 10% de las infecciones del tracto urinario. La bacteriuria enterococica ocurre usualmente en pacientes con anormalidades estructurales y/o al sufrir manipulaciones urológicas. Son los microorganismos mas frecuentes en infecciones intraabdominales y pélvicas. Sin embargo generalmente son procesos polimicrobianos y el papel de enterococos en dichas infecciones es controvertido. El proceso mas común que produce esta bacteria es la bacteriemia, que tiene lugar a menudo en pacientes adultos con problemas médicos subyacentes y en inmunodeprimidos con prolongada hospitalización. La endocarditis es una infección enterococal severa siendo E. faecalis responsable del 5-20% de estos procesos. 21 BOLILLA N° 11 Enterococo es el segundo agente nosocomial(después de E. coli) en infecciones del tracto urinario y es el tercero(después de Staphylococcus aureus y estafilococos coagulasa negativos) como causa de bacteriemia hospitalaria. Adenovirus. Introducción. A medida que se fueron aislando los 51 serotipos de adenovirus(ADV), un cierto numero de ellos se fueron asociando a sindromes clínicos adicionales, fundamentalmente a nivel respiratorio, ocular e intestinal. El ADV tipo 12 fue el primer virus patogenode humanos que se demostró podía causar tumores malignos en animales pero hasta ahora no se los puede asociar convincentemente con cáncer en humanos. Epidemiologia. Las infecciones por ADV ocurren en todo el mundo, en humanos y en distintas especies animales. Con pocas excepciones, los serotipos humanos no son patógenos para los animales, y los ADV animales son solo patógenos para la especie de origen. Presentan una gran variabilidad genética y por lo general infectan a sus huéspedes a través de las mucosas ocular, faríngea o intestinal, la transmisión fecal-oral es la responsable de la mayoría de las infecciones en los niños. La expansión inicial de la infección ocurre desde la via respiratoria, pero los pacientes que son portadores crónicos del virus en su intestino convierten a las heces en una fuente comun de infección que provoca enfermedad aguda durante las recurrencias intermitentes y en las que se eliminan cantidades considerables de partículas virales. La infección por adenovirus puede ser asintomática, pero cuando presenta sintomatología clínica se puede manifestar como casos aislados o en forma epidémica, dependiendo del serotipo y de la edad de la población. El diagnostico clínico en muchos casos no es patognomónico de los ADV. Factores adicionales como las condiciones de hacinamiento o de fatiga son factores contribuyentes(soldados). En cuanto a las rutas de infección, se demostró que el virus aerosolizado inhalado por voluntarios producía la infección respiratoria baja, mientras que la aplicación a la mucosa nasal o intestinal de capsulas recubiertas entéricas no la produce. Las infecciones del ojo pueden adquirirse en piletas de natación o pequeños lagos. En nuestro
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