T25 QB - Metabolismo de las Proteínas

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@rose.studygram_
Teórico 25
Metabolismo de las Proteínas
Dogma general de las proteínas: el DNA se duplica, pasa a RNA y desde éste es traducido el código genético para la síntesis de proteínas. El código genético pasa del DNA al RNA, y el idioma de nucleótidos hacia aa es llevado a cabo por los ARNt. 
Las proteínas son los productos finales de la mayoría de las rutas de la información. Cualquier célula necesita en cada instante miles de proteínas diferentes y dichas proteínas deben ser sintetizadas en función de las necesidades celulares del momento. 
La secuencia de aminoácidos de una proteína se construye a partir de la traducción de la información codificada en el ARNm. Este proceso se lleva a cabo en los ribosomas y requiere moléculas adaptadoras, los ARNt. Los ARNt son el elemento decodificador que permite traducir de un lenguaje de nucleótidos (el que tiene el DNA y el mRNA) a un lenguaje de aminoácidos (el de las proteínas). Para ello es necesario el código genético que define la relación entre secuencias de tres nucleótidos, llamadas codones, y aminoácidos.
Código genético
Permite asociar una secuencia de nucleótidos a una de AA. 
En la década del ´60 estaba claro que se requerían al menos tres residuos nucleotídicos del DNA para codificar cada aminoácido, ya que dupletes solo podrían dar lugar a 16 combinaciones distintas de dupletes (42 =16), pero combinaciones de 3 bases pueden dar lugar a 64 codones diferentes (43 =64). Sin embargo restaba determinar cuál era la composición y secuencia de las tres bases para cada aminoácido. 
Con la utilización de diferentes RNAm artificiales producidos por la polinucleótido fosforilasa a partir de mezclas de partida diferentes de ADP, GDP, UDP y CDP, los grupos de Nirenberg y Ochoa pronto identificaron la composición de bases de los tripletes. Los polinucleótidos sintéticos utilizados en estos experimentos se obtuvieron mediante la polinucleótido fosforilasa que no requiere molde y fabrica polímeros con una composición de bases que refleja la concentración relativa de los precursores nucleotídicos. 
Así pudo determinarse la composición de los codones; sin embargo, aún restaba determinar su secuencia. Experimentos posteriores en los que se usaron trinucleótidos sintéticos de secuencia conocida, permitieron descubrir los codones correspondientes a cada aminoácido.
En estos experimentos, se ponía un determinado polinucleótido, eso se ponía en diferentes tubos con toda la mezcla de AA, los tubos difieren en la marcación de esos AA. Entonces se incubaba adecuadamente el polinucleótido, en el caso de la imagen Poli U, y a partir de uno de ellos se obtenía un polipéptido marcado.
Con secuencias cortas de nucleótidos de secuencia conocida, se pudo determinar la secuencia de los codones. 
En definitiva se llegó al código genético donde 64 de los codones posibles, tenemos que 61 codifican para diferentes AA, y 3 de esos codones corresponden a codones de terminación.
El código genético está dado por:
· unidad codificadora : triplete: secuencia de 3 nucleótidos (codón) especifica 1 aminoácido.
· no superpuesto : no se comparten nucleótidos de codones consecutivos.
· no tiene signos de puntuación : no existen nucleótidos entre codones.
· degenerado : más de un codón codificante para el mismo aminoácido. Degeneración no uniforme.
· universal : es relativamente conservado en virus, procariotes y eucariotes
¿Qué era un codón? Un codón es un triplete de nucleótidos que codifica un aminoácido específico. La traducción tiene lugar de manera que estos tripletes de nucleótidos se leen secuencialmente y sin solapamiento. Un primer codón específico determina el marco de lectura, en el que un nuevo codón empieza cada tres nucleótidos. La secuencia de una proteína está definida por una secuencia lineal de tripletes contiguos.
Se describieron diferencias respecto al uso por distintos organismos de los codones sinónimos, pero incluso también preferencias en el uso de determinados codones sinónimos por genes pertenecientes al mismo genoma. 
De un total de 20 aminoácidos existentes, 18 son codificados por 2 o más codones sinónimos. Sin embargo, usualmente, los codones sinónimos se utilizan de modo dispar en el genoma. Tal sesgo en el uso de codones se denomina Codon Usage Bias, CUB. Es así como en los genomas, los genes altamente expresados tienden a tener un alto CUB en comparación con los débilmente expresados. Este incremento del sesgo en el uso de codones relacionado con los niveles de expresión de los genes ha sido observado en organismos de todos los dominios de la vida.
Esto tiene impacto en: eficiencia de transcripción, estructura de proteína, el plegamiento, entre otros.
El “adaptador” ARNt
Los ARNt de bacterias y citosol de células eucariotas tienen entre 73 y 93 nucleótidos. Los ARNt de cloroplastos y mitocondrias son algo menores.
Consiste en una única hebra de ARNt, a la derecha de ve la estructura secundaria bidimensional:
· presenta un brazo amino acilo al cual se une el AA por la porción 3´
· brazo anticodón, funciona para unirse al anticodón del ARNm
· brazos para el plegamiento e interacción con el ribosoma
Además observamos la forma tridimensional del ARNt, en uno de los extremos tenemos el anticodón y en el otro, el extremo 3´. En el extremo 5´ hay un guanilato característico del ARNt → forma de L torcida.
El aminoácido activado y el anticodón del ARNt están en los extremos opuestos de la molécula con forma de L. La arquitectura de la molécula del ARNt se ajusta a su papel de adaptador: el anticodón puede interaccionar con el codón apropiado del ARNm mientras que el otro extremo está unido a un aminoácido activado en posición adecuada para la formación del enlace peptídico.
Aproximadamente, 1 de cada 10 nucleótidos del ARNt son nucleótidos modificados. La modificación covalente se produce una vez que el nucleótido ha sido incorporado a la cadena de ARN.
A la izquierda observamos las modificaciones más típicas del ARNt, tenemos la estructura de la inosina que se produce por deaminación de la adenina cuando ya es parte del ARNt. 
Los RNA de transferencia se aparean con los codones del mRNA mediante una secuencia de bases del RNAt (anticodón). Si el triplete del anticodón de un tRNA determinado reconociese solamente un codón mediante apareamiento en las tres posiciones, las células tendrían un tRNA diferente para cada codón de un aminoácido. Sin embargo, NO es así porque los anticodones de algunos tRNA establecen una unión no clásica con más de un nucleótido por medio de las 2 primeras bases de su anticodón → HIPÓTESIS DE BALANCEO. 
Estos apareamientos son mucho más débiles que los G-C y A-U. La tercera base del codón permite la disociación rápida del tRNA durante la síntesis proteica. Las dos primeras bases de un codón son responsables de la mayor parte de la especificidad del código. De esta manera las interacciones codón-anticodón equilibran los requerimientos de precisión y velocidad.
Cuando un aminoácido es especificado por múltiples codones, la diferencia entre ellos normalmente se encuentra en la tercera base.
Imagen de arriba: se observa que cuando la inosina está posicionada en la tercera base del anticodón, la inosina puede interaccionar de manera no específica con 3 nucleótidos, A, U y C. Entonces este ARNt puede interpretar 3 codón distintos, GCA, GCC y GCU, y así sucede con otros nucleótidos. 
De esta manera los ARNt pueden interpretar los 61 codones que existen. Las interacción de las 2 primeras son más específicas y fuertes, mientras que la 3 es más débil compensando, entonces las interacciones codón-anticodón equilibran los requerimientos de precisión y velocidad.
· Precisión: dada por la interacción entre las 2 primeras posiciones del codón
· Velocidad: dada por la tercera interacción que es menos específica y por ende se produce más rápido su asociación y disociación.
Dependiendo de la base presente en la posición 3, de bamboleo, hay diferentes bases que pueden ser reconocidas. Debajo tenemos una tabla donde está en la posición de bamboleo,algunas de estas bases pueden interaccionar cuando cualquiera de las bases que se muestran en el anticodón. 
Ejemplo → la inosina en la primera posición del anticodón puede interaccionar con 3 posible nucleótidos, en procariotas; en eucariotas, la inosina en la primera posición puede interaccionar solo con 2, esto depende de la estructura tridimensional y las características de los ARNt y ribosomas.
Ribosoma
A principios de la década del ´50 Paul Zamecnick y colaboradores diseñaron experimentos para determinar en qué lugar de la célula se sintetizan las proteínas. 
Estas partículas, visibles en los tejidos animales por microscopía electrónica, se identificaron como el sitio de la síntesis proteica a partir de aminoácidos, más tarde fueron llamados ribosomas.
Cuando se inyectaron los AA y transcurrieron horas, se observó que todas las fracciones contenían proteínas, mientras que si se dejaban minutos se veía que las proteínas marcadas se encontraban en las fracciones subcelulares.
Los ribosomas contiene: 
· ARN ribosomal, quien presenta la actividad catalítica. 
· Proteínas, son muy diversas en forma y tamaño, generalmente presentan dominios globulares.
Las subunidades ribosómicas son grandes moléculas de RNA y, las dos subunidades ribosómicas forman una hendidura .La estructura ribosómica es muy similar en todos los organismos y orgánulos.
La subunidad mayor y menor del ribosoma se ensamblan en el núcleo, al núcleo entran las proteínas ribosomales que se ensamblan con el ARNr y luego pasan a la subunidad mayor del ribosoma donde se ensamblan para la síntesis proteica.
Abajo hay una comparación entre ribosoma en procariotas y eucariotas, son bastante semejantes:
· Subunidad mayor y menor, en eucariotas son de tamaño mayor.
· La subunidad 16s de la subunidad menor y su homólogo en eucariotas. 
· ARNr 23s en procariotas con actividad y su homólogo en eucariotas 28s. 
Los ribosomas de procariotas tienen tres lugares de unión para los ARNt conformados por las subunidades 30S y 50S.
Sitio A: ingresa el ARNt para incorporar la cadena polipeptídica.
Sitio P: se encuentra el ARNt que sostiene la cadena polipeptídica en crecimiento.
Sitio E: se encuentra en procariotas, contiene el ARNt ya utilizado y pasa la cadena polipeptídica.
En eucariotas sólo encontramos el sitio A y P.
Síntesis de proteínas
Habiendo examinado las estructuras de los ribosomas y de los ARNt consideremos ahora las cinco etapas de la síntesis proteica. 
Tal como sucede para la síntesis del DNA y el RNA, la síntesis de biomoléculas poliméricas se puede analizar en términos de fases de inicio, elongación y terminación. Estos procesos fundamentales están flanqueados por dos etapas adicionales: la activación de los precursores con anterioridad a la síntesis y la maduración post sintética del polímero.
Fase 1 
La activación de los aminoácidos se lleva a cabo en el citosol y no en los ribosomas. Esta reacción tiene lugar mediante 2 pasos en el sitio activo de la enzima. 
En el primer paso, se forma un intermediario ligado a la enzima: el aminoacil adenilato (aminoacil-AMP), implica hidrólisis de ATP. 
En el segundo paso, se transfiere el grupo aminoacilo desde el aminoacil-AMP unido a la enzima a su correspondiente ARNt, este último queda cargado. 
 
Los intermediarios activados de la síntesis proteica son ésteres de aminoácidos en los que el grupo carboxilo de un aminoácido está unido o bien al grupo hidroxilo 2´ o 3´de la ribosa situada en el extremo 3´ de un ARNt.
Enzima que cataliza la reacción → aminoacil ARNt sintetasa.
Existe al menos un aminoácil ARNt sintetasa para cada AA, ya que hay que cargar el AA a un ARNt de transferencia correspondiente al AA. Por ello hay una enzima por cada AA, se clasifican en 2 clases:
· Clase 1, adiciona el aminoacilo en la posición 2´ de la ribosa terminal. Por transesterificación pasan a 3´.
· Clase 2, adiciona en la posición 3´
Se diferencian estructuralmente por cómo se adicionan al ATP y en general las de clase 1 son monoméricas, mientras que la 2 es dimérica.
Objetivos de esta fase: 
1) Activación de los aminoácidos para facilitar la formación del enlace peptídico. 
2) Unión del aminoácido al ARNt que le corresponde.
Aminoacil-ARNt sintetasa favorece la activación de un determinado aminoácido por dos mecanismos:
· Unión específica del sustrato 
· Corrección de prueba: unión de los aminoacil-AMP incorrectos a otro sitio activo de la enzima. Los sustratos unidos a este sitio activo son hidrolizados.
Cada enzima es específica de un aminoácido y de uno o más de los ARNt correspondientes. La mayor parte de los organismos tiene un aminoacil ARNt sintetasa para cada aminoácido. En el caso de aa a los que corresponden dos o más ARNt normalmente la misma enzima los aminoacila a todos !!
La identidad del aminoácido unido al ARNt no se comprueba en el ribosoma, por lo que la unión del aminoácido correcto a cada ARNt es esencial para la fidelidad de la síntesis proteica. 
La mayoría de las aminoacil-ARNt sintetasas contiene lugares de revisión además de lugares de acilación. Esta complementariedad de controles funciona como un doble tamiz para asegurar una fidelidad muy alta. Las pocas aminoacil ARNt sintetasas que activan aminoácidos sin análogos estructurales muestran poca o ninguna actividad de corrección de prueba, en estos casos el sitio de aminoacilación puede discriminar suficientemente entre el sustrato correcto y cualquier aminoácido incorrecto.
Por regla general los lugares de acilación rechazan aminoácidos mayores que el correcto debido al poco espacio para alojarlos mientras que el lugar hidrolítico rompe a las especies activadas que son menores que la correcta. 
Ejemplo: si la enzima es específica para la Val, esta ingresa en el sitio activo de la enzima pero la Ile no va a poder entrar al sitio activo por su tamaño, entonces ya es discriminada. Ahora si la enzima correspondiera a la Ile, tanto la Ile como la Val pueden ingresar ya que la Val es más pequeña entonces puede esterificarse en forma incorrecta, por ello hay un segundo paso donde actúa el sitio editor. Este sitio cuando se une la Ile al AMP, al ser muy grande no entra pero la Val si puede entrar y entonces se hidroliza ese enlace.
Cuando no hay una análogo estructural, existe un aminoacil sintetasa específico pero el ARNt sintetasa no tendrá el sitio editor, generalmente es más útil para AA que presenten análogo estructural.
La activación del aminoácido por la aminoacil-ARNt sintetasa es un proceso de 2 reacciones con 2 selectividades:
· el aminoácido: el aminoacil-AMP permanece unido a la enzima y la unión del aminoácido correcto es verificado por el sitio editor de la aminoacil-ARNt sintetasa.
· tRNA: Una determinada aminoacil-ARNt sintetasa debe ser específica no sólo de un aminoácido sino también de ciertos ARNt. “Segundo código genético” → hay sitios específicos del ARNt que son reconocidos por la aminoacil-ARNt sintetasa.
La discriminación entre docenas de ARNt es tan importante para la fidelidad global de la biosíntesis de proteínas como la distinción entre aminoácidos. Los determinantes de la especificidad están mayormente en los brazos del ARNt y en el anticodón, incluídos los nucleótidos del propio anticodón.
Fase 2 
La síntesis de proteínas empieza en el extremo amino-terminal y avanza de sucesivos aminoácidos hacia el extremo carboxilo-terminal.
Requiere:
· fmet-tRNAfmet (fmet = N-formilmetionina)
· codón de iniciación (AUG) del mRNA
· subunidad ribosomal 30S
· subunidad ribosomal 50S
· factores de iniciación IF-1, IF-2, y IF-3 
· Energía en forma de GTP y Mg2+
Tanto en procariotas como eucariotas el codón de inicio es AUG, para procariota es el ARNt que interacciona con el AUG carga formilmetionina, y para eucariotas es metionina. 
Aunque solo existe un codón para la metionina, todos los organismos contienen dos ARNt para este aminoácido:
· ARNt exclusivamente usado cuando el AUG es el codón de inicio.
· ARNt utilizado cuando la metionina está en posición interna.
La metionina se une a estas dos clases de ARNt por mediode la misma aminoacil ARNt sintetasa. Una enzima específica formula después el grupo amino de la metionina que está unida al ARNtf.
En procariotas, la señal de inicio está precedida por la secuencia Shine-Dalgarno rica en purinas, 5’-GGAGGU-3’ habitualmente alrededor de 10 nucleótidos antes del AUG inicial, que funciona uniéndose a secuencia complementaria, rica en pirimidinas, cerca del extremo 3´ del RNAr 16S de la sub 30S. Esta secuencia indica que el AUG no es de la proteína, sino de la metionina de inicio y esta secuencia es la que ubica el codón de inicio AUG en el sitio correcto del ribosoma porque es capaz de interaccionar con una secuencia rica en pirimidinas del ARNr 16s de la subunidad menor
Si el mismo codón AUG codifica para la metionina de inicio y la presente en posiciones internas del polipéptido, ¿cómo es distinguido el codón AUG de inicio? La interacción ARNm-ARNr sitúa la secuencia de inicio 5´AUG del ARNm en la posición correcta en la subunidad 30S para el inicio de la traducción. Además, el 5´AUG específico al que debe unirse el formilmetionina-ARNt se distingue de otros codones de metionina por su proximidad a la secuencia Shine-Dalgarno del ARNm.
Procariotas
El inicio de la síntesis requiere la formación del complejo de iniciación formado por :
· mRNA
· subunidad ribosomal 30S 
· fmet-tRNAfmet
· GTP
· IF-3; impide que las subunidades 30S y 50S se unan prematuramente 
· IF-2; une GTP y ayuda en la selección del fmet-tRNA (fmet) 
· IF-1; facilita la unión de IF-3 y IF-2 
· subunidad ribosomal 50S 
La unión de estos elementos produce el complejo de iniciación 70S
Paso 1, la subunidad ribosómica 30S une los factores de inicio IF-1 e IF-3. IF-3 impide que las subunidades 30S y 50S se unan prematuramente. A continuación se une la subunidad 30S al ARNm y el iniciador AUG es situado en la posición correcta por la secuencia Shine-Dalgarno. 
En el paso 2, IF-2 unido a GTP asociado al fMet-ARNt interacciona con sitio P de ribosoma. La fMet-ARNt distingue el AUG iniciador al que debe unirse por su proximidad a la secuencia de Shine-Dalgarno. El fMet-ARNt es el único aminoácido que puede unirse al sitio P del ribosoma. El factor de inicio IF-1 se une al sitio A impidiendo la unión de ARNt a este sitio. IF-2 tiene especificidad únicamente por el ARNt iniciador. 
En el paso 3 entra la subunidad 50S, GTP se hidroliza y los tres factores de iniciación abandonan el ribosoma.
Eucariotas
El 5´ AUG iniciador es detectado por el ARNm por barrido del ARNm a partir del extremo 5´ hasta encontrar el primer AUG que marca el inicio del marco de lectura, es decir, la subunidad ribosómica menor con un complejo de factores de iniciación se une a la porción 5´ del ARNm y va haciendo un barrido a lo largo de este hacia el extremo 3´ y cuando encuentra el primer AUG lo considera como el iniciador y así comienza la síntesis de la proteína.
Los ARNm eucarióticos están unidos al ribosoma formando un complejo eIF4F con un conjunto específico de proteínas de unión.
El complejo de pre-iniciación interacciona con otro complejo que se une al ARNm 5´ que tiene actividad de helicasa, entonces el complejo escanea el ARNm hasta encontrar el primer AUG, luego de ellos los factor de iniciación de disocian, se establece la unión del ARNt iniciador y luego se incorpora la subunidad mayor. 
La secuencia de Kozak es una secuencia de ARNm que facilita el reconocimiento de la secuencia de iniciación (AUG) durante el proceso de traducción en los eucariontes. Esta secuencia tiene una determinada composición consenso, se toma al primer nucleótido como la sección +1 y se supone que tiene en la posición 4 una guanidina y en la posición 3 una adenina o guanina. Cuando se respete estamos hablando de un codón de iniciación fuerte, con proteínas de tasa de expresión alta; sino puede ser moderado o de menor velocidad, en este último caso la secuencia Kozak es muy diferente a la secuencia consenso.
Fase 3
Los ribosomas tienen 3 sitios a los cuales el tRNA se puede unir:
· sitio A: sitio aminoacilo 
· sitio P : sitio peptidilo 
· sitio E : sitio de salida
Requiere:
· El complejo de inicio (ribosoma 70S + mRNA)
· aminoacil-tRNAs
· factores de elongación → EF-Tu, EF-Ts y EF-G
· GTP y Mg2+
Paso 1-unión del aminoacil-ARNt entrante
Es digno de mención que el EF-Tu no interacciona con el fMet-ARNt, por esto dicho ARNt iniciador no entra en sitio A. En cambio todos los demás aminoacil-ARNt sí se unen a EF-Tu. Esto explica porque el ARNt iniciador no lee los codones AUG internos. Inversamente el factor de iniciación IF-2 reconoce al fMet-ARNt pero no a los demás ARNt.
Entra el ARNt con el primer AA de la secuencia unido al factor de elongación Tu y GTP, forman el complejo aminoacil-tRNA-EF-Tu-GTP. Cuando se da la elongación se hidroliza el GTP, luego el factor de elongación unido a GDP se recupera por la intervención del factor de elongación Tu y GTP.
Paso 2-formación del enlace peptídico
Entre los 2 ARNt se establece el enlace peptídico, catalizado por ARNr 23s que corresponde a la subunidad mayor. Produce un ataque nucleofílico del AA que recién entró hacia el que estaba cargado en la posición P. 
Paso 3-translocación
El movimiento del ribosoma a lo largo del ARNm requiere EF-G (también denominado translocasa) y la energía es proporcionada por otra molécula de GTP.
El ARNt cargando el péptido naciente queda en la posición P del ribosoma, y la posición A queda libre para que entre el nuevo ARNt con el nuevo AA de la secuencia. 
* El ciclo de elongación en los eucariotas es muy similar, tres factores de elongación: eEF1a, eEF1bg, y eEF2 tienen funciones análogas a las de los factores de elongación procariotas. Los ribosomas eucarióticos no tienen sitio E, los ARNt descargados son liberados directamente desde el sitio P.
Fase 4
Codones de terminación: UAA, UAG, UGA. Son reconocidos por los factores de terminación. 
Factores de terminación; RF-1, RF-2 y RF-3. Presentan una estructura semejante al extremo 3´ del ARNt entonces cuando encuentran un codón de terminación, catalizan la transferencia de una molécula de H2O y de esta manera hacen que se disocie el péptido del ARNt, así el péptido es liberado al citoplasma, se desensamblan las subunidades y los factores de terminación son recuperador para asociarse a otra porción. 
RF-3 liberaría la subunidad ribosómica.
* En los eucariotas, un solo factor de liberación, denominado eRF, reconoce los tres codones de terminación.
La terminación implica: 
1. La hidrólisis del enlace peptidil-ARNt terminal.
2. Liberación del polipéptido y del último ARNt ya descargado del sitio P. 
3. Disociación del ribosoma 70S en sus subunidades 30S y 50S (EF-G y RRF)
Fase 5
Es el procesamiento post traduccional y plegamiento.
tenemos una proteína recién sintetizada que requiere ensamblarse y plegarse adecuadamente, puede requerir de algunos cambios como fosforilaciones, etc …
Entre las modificación post traduccionales tenemos:
· Modificaciones N-terminales como C-terminales
· Corte proteolítico
· N-acetilaciones 
· Modificaciones de AA concretos
· Fosforilaciones
· Carboxilaciones
· Metilación
Ej: 
Caseina de la leche → grupos fosfoserina que fijan Ca2+ 
Protrombina → 𝛾-carboxiglutamato importantes cargas negativas para fijar calcio para la coagulación.
· Unión de cadenas laterales a glúcidos: oligosacáridos unidos por enlace N (Asn) o unidos por enlace O (Ser,Thr)
· Adición de grupos isoprenilos 
· Adición de grupos prostéticos (biotina, grupo hemo)
· Modificación proteolítica
· Formación de puentes disulfuro 
Antibióticos que inhiben la síntesis de proteínas
La síntesis de proteínas es una función central en la fisiología celular y es una de las principales dianas de muchos antibióticos y toxinas naturales. Las diferencias entre la síntesis de proteínas en las bacterias y eucariotas, aunque a veces sean mínimas, son suficientes para que la mayoría de los antibióticos sean relativamente inocuos para las células eucariotas. 
La puromicina tiene una estructura muy similar al extremo 3´de un aminoacil-ARNt loque le permite fijarse al sitio A del ribosoma y participar en la formación del enlace peptídico produciendo peptidil-puromicina. 
Destinos de las proteínas sintetizadas
La síntesis de los millares de proteínas diferentes de una célula está estrechamente regulada para que solo se fabrique la cantidad necesaria en las condiciones metabólicas imperantes. Para mantener la mezcla apropiada y la concentración adecuada de proteínas, los procesos de direccionamiento y degradación han de estar coordinados con la síntesis. 
La célula eucariota consta de muchas estructuras, compartimientos y orgánulos con funciones específicas que requieren distintos tipos de proteínas y enzimas. Dichas proteínas, con la excepción de las pocas sintetizadas en cloroplastos o mitocondrias, se sintetizan en el citosol pero luego deben ser direccionadas a sus destinos celulares. 
Secuencia señal: es una corta secuencia de aminoácidos que dirige la proteína hacia su localización apropiada en la célula. A menudo, es eliminada durante el transporte o después de que la proteína haya alcanzado su destino final. 
En las proteínas destinadas a mitocondrias, cloroplastos o RE la secuencia señal se encuentra en el extremo N-terminal del polipéptido. En muchos casos, se ha podido confirmar la capacidad de direccionamiento de ciertas secuencias señal fusionando la secuencia señal de una proteína con una segunda proteína, la señal dirige a la segunda proteína a la localización donde normalmente se encuentra la primera proteína.
Modificación en el RE
La secuencia señal está en el N-terminal y generalmente contiene AA hidrofóbicos. Presenta residuos cargas + en N-terminal y AA de cadena corta en el sitio de corte. Cuando la proteína llega a destino es clivada por una enzima y se libera.
Características:
· longitud entre 13-36 AA
· 10-15 residuos hidrofóbicos
· Residuos cargados + en el N-terminal
· AA de cadena corta cerca del sitio de corte
¿Cómo ocurre el direccionamiento? La secuencia señal interacciona con una partícula de reconocimiento que tiene un receptor en el RE, entonces lleva al ribosoma con la proteína que está siendo sintetizada al RE. Entonces hay un receptor de ribosoma que permite la translocación del péptido en síntesis al lumen del RE, la translocación consume GTP y luego de ello la proteína se sigue sintetizando hacia el interior del lumen, la partícula de reconocimiento de la señal se disocia y se recupera para ser utilizada.
Como la proteína llegó al RE, la secuencia señal es clivada por una enzima del RE y la proteína termina de ser sintetizada quedando en el RE. 
Luego la proteína puede sufrir determinadas modificaciones como adiciones HdeC que se unen por enlace N-glucosídico. Esto se da por un dolicol fosfato le cede a la proteína naciente un núcleo de HdeC de 14 monómeros que luego es procesado de diferentes formas y siempre queda un núcleo de 5 residuos que va a estar en todas las proteínas que se modificaron en el RE.
Proteínas destinadas a lisosomas, MP o secreción
Cuando la proteína sale del RE es transportado por vesículas al aparato de Golgi donde sufre modificaciones como la unión de glúcidos por enlace -O, puede sufrir más enlaces o modificaciones adicionados por enlace -N. Luego en el lado -trans del Golgi son seleccionadas y clasificadas para direccionarlas a diferentes lugares.
Direccionamiento a mitocondrias y cloroplastos
El direccionamiento comienza cuando la proteína ya terminó de sintetizarse en el citosol dependiendo de la secuencia señal, se dirigen a mitocondrias o cloroplastos.
Para ello interaccionan con chaperonas citosólicas que tienen receptores y transmiten su translocación al interior de la mitocondria, aquellas que quedan a la matriz mitocondrial la señal es escindida cuando llegan a mitocondria, hay algunas que quedan inmersas en la membrana o en el espacio intermembrana, y en esos casos la señal se encuentra en el medio de la estructura para que no sea clivada.
Proteínas hacia mitocondrias
En la mitocondria hay transportadores que facilitan el pasaje de las proteínas, tenemos :
· El complejo TOM, transportador de membrana externa. Permite la entrada de las proteínas mitocondriales, tiene una zona receptora que interacciona con la secuencia señal o la chaperona unida a la proteína y tiene una porción para la translocación.
· Complejo SAM, permite el adecuado posicionamiento de las proteínas que tiene que quedar inmersas en la MME
· TIM 22 y TIM 23, permiten la entrada de proteínas a la membrana mitocondrial interna (MMI) o la matriz mitocondrial (MM).
· Complejo OXA para el adecuado posicionamiento en la MMI. 
Proteínas destinadas a núcleo
La secuencia señal que dirige la proteína al núcleo, la secuencia de localización nuclear (NLS), no es eliminada una vez la proteína ha alcanzado su destino. Se encuentra en el medio de la estructura, es importante que no se elimine porque luego de sintetizar la proteína el ADN se desintegra y todos los componentes nucleares pasan al citosol, entonces aquellas proteínas deben saber que tiene que direccionarse el núcleo.
NLS:
· Puede encontrarse en casi cualquier posición de la secuencia primaria de la proteína.
· Muy variables pero generalmente constan de 4 a 8 residuos entre los cuales se cuentan Arg y Lys consecutivos.
· Interaccionan con importinas, serán las que permitan la transferencia al interior del núcleo. Pueden interaccionar con la secuencia señal o por medio de proteínas adaptadoras. 
Las proteínas adaptadoras reconocen la secuencia de la proteína señal y a su vez tiene un sitio de unión que les permite unirse a la importina; las importinas pueden unirse a nucleoporinas permitiendo la translocación de las proteínas nucleares al núcleo, este proceso requiere de energía → colaboración de la GTP Ran. 
Sistema de degradación de proteínas
· Sistema lisosomal: recicla aminoácidos de las proteínas de membrana, extracelulares y a partir de proteínas de vida media larga. 
· No selectivo 
· Proteasas en entorno ácido: catepsinas, actúan en medio ácido. 
· Sistemas citosólicos dependientes de ATP: fundamentalmente degradan proteínas defectuosas y las que tienen vida media corta. 
· Selección de las proteínas a ser degradadas y marcadas con ubiquitina. 
· Degradación por el proteosoma, implica un control porque constituye un sistema de regulación de funciones biológicas que quizás requiere de degradación. 
Sistema lisosomal
Sistema dependiente de ATP
La ubiquitina es quien detecta las proteínas para su destrucción, características:
· Proteína de 76 AA y 8,5 kDa. 
· Carboxilo terminal extendido (activación y enlace a otras proteínas).
· Lys 48, sitio de adición de moléculas de ubiquitina por C-terminal. La señal de degradación consiste en poliubiquitinación. 
La glicina del extremo carboxilo de la Ub se une covalentemente ε-amino de lisinas de proteína a ser degradada. Esta reacción consume ATP.
Esta conjugación de la proteínas por medio de ubiquitina es llevada a cabo por 3 enzimas (mirar nombre en la diapo de abajo). Primero la ubiquitina es activada por unión de ATP → AMP-ubiquitina, luego es transferido a la E1 y a partir de él se transfiere a E2. Finalmente acciona E3 que es la enzima que reconoce a la proteína que debe ser ubiquitinada y cataliza la transferencia de ubiquitina desde E2 a la proteína blanco.
¿Cómo reconoce E3 a la proteína target? esto depende de la proteína en particular, en general la aparición de señales en las proteínas responden a 2 mecanismos:
· Se produce la activación de E3 para una determinada proteína. Activada por:
· fosforilación
· aparición de la célula en un determinado modificador alostérico
· subunidad que hace que pase a su forma activa
· Se modifica a la proteína para que interaccione con E3:
· Fosforilación
· Degradación proteolítica que desenmascara una subunidad
· Clivaje proteolítico para desenmascarar la señal. 
¿Qué es lo que determina si va a ser ubiquitinada? 
· Residuo N-terminal
· Cajas de destrucción de ciclinas
· Proteínas rican en prolina, ácido glutámico, serina y treonina (secuenciasPEST). 
Proteosoma
Es un complejo proteico muy grandes, es el 1% de la proteína en célula, formado por:
· subunidad proteolítica → proteosoma 20s
· 2 módulos regulatorios → proteosoma 19s
En total constituyen el proteosoma 26s:
Proteosoma 20s → está formado por 4 anillos de 7 subunidades c/u, 7 subunidades ⍺ en los extremos y 7 subunidades ß en el medio. La actividad catalítica está en el centro y forma parte de las subunidades ß que encaran hacia el centro del barril.
Para ello la proteína que fue ubiquitinada interacciona con la subunidad 19s que tiene un sitio de unión de ubiquitina, escinde la cadena de ubiquitina para que pase al citosol, y tiene una actividad que permite desnaturalizar la proteína para que pase por la subunidad reguladora hacia el core del proteosoma donde se produce la degradación.
Los AA y pequeños péptidos que resultan de esta no se liberan al citoplasma hasta que se da la degradación completa de la proteína.