T24 QB - Metabolismo del ARN

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@rose.studygram_
teórico 24
Metabolismo del ARN
Dogma central del ADN → el ADN es quien guarda la info. genética, tenía TODA la info. y posee capacidad de replicarse o transcribirse en determinado momento. La transcripción no es total, se transcribe una pequeña porción en determinado momento y varía según las necesidades de la célula, el tipo de tejido, etc …
Esto hace que la info codificada en la ADN llegue a las proteínas, la transcripción es más selectiva que la replicación. 
¿Qué diferencia hay entre ADN y ARN? La de ADN son más estables mientras que la del ARN son más lábiles, esto se relaciona con las funciones que cumplen ambas, también depende de su estructura.
· La timina es más estable que el uracilo, con lo cual contribuye a la estabilidad del ADN frente al ARN. 
· Al presentar doble enlace, el ADN es capaz de formar puentes de hidrógeno para aumentar la estabilidad.
Tipos de ARN
Se denomina transcriptoma al conjunto de moléculas de ARN presentes en una célula en determinado momento. 
Hebra codificantes y hebra templado
El ADN tiene la doble hélice, por convención una de las hebras 5´→3´ se la denomina codificante que se lee directamente para la síntesis de proteínas, mientras que la otra es la hebra templado/molde.
La hebra molde tiene una región crítica llamada promotor, esa zona se une al ARN polimerasa para iniciar la transcripción que requiere de la separación de la doble hebra. Se abre en una burbuja y a medida que se va copiando forma una doble cadena híbrida de ARN (fucsia) y ADN molde que solamente se mantiene unido por 8 pares de bases (pb).
La burbuja es poco estable, por ello a medida que se sintetiza el ARN el mismo se va sacando generando una especie de “cola” visto desde la diapositiva. 
En general 1 sola era la hebra codificantes, no es necesario que siempre sea así sino que se pueden codificar ambas hebras, ej: virus.
Síntesis de ARN dependiente de ADN 
· La transcripción (como la replicación) usa un molde y tiene polaridad (dirección de síntesis 5´→3´) 
· No requiere cebador 
Presenta fases: 
1. La iniciación incluye unión al ADN e inicio de la síntesis de ARN.
2. Elongación.
3. Terminación
Además de la hebra molde, requiere que haya de ribonucleótidos, Mg2+ y Zn2+. La ARN-polimerasa agrega ribonucleótidos en el extremo 3´-OH y sintetiza ARN en dirección 5´→3´.
La ARN-polimerasa es más activa si usa ADN bicatenario como molde. No requiere un cebador, el inicio de la transcripción ocurre por unión al promotor. El trifosfato en 5´ no se libera del ARN naciente.
Durante la síntesis se forma una doble hélice híbrida (ADN-ARN) temporal, de 8 pb a medida que la reacción procede, el ARN naciente se separa del molde y el ADN se reaparea. En la imagen de la derecha se observa la burbuja abierta y los 8 pb que forman el híbrido durante la síntesis.
Mecanismo de transcripción
· Para que comience la transcripción, el ADN se tiene que desenrollar.
· Durante la transcripción se mantienen 17 pb desenrollados = burbuja de transcripción.
· Se incorporan 50-90 nucleótidos por segundo = elongación.
· El movimiento de la burbuja de transcripción obliga al ADN a superenrollarse por delante y por detrás.
En la imagen se ve el efecto de superenrollamiento del ADN. Se genera una torsión de ambos lados y por ello la polimerasa invierte mucha energía en la síntesis de ADN, para ir abriendo la siguiente sección para que se copie y a su vez ir cerrando para liberar toda la tensión de lo que ya se usó.
ARN polimerasa procariota
Tiene una estructura de 6 subunidades donde:
· las ß y ß´son subunidades catalíticas.
· las subunidades ⍺ permiten la iniciación de la cadena, la interacción con proteínas reguladoras y elementos promotores.
· subunidad σ, forma un núcleo dado por toda la estructura que va por encima del ADN sin esta subunidad, entonces será el núcleo central de la enzima que presenta actividad perse, baja y poco específica.
· se une transitoriamente al complejo núcleo
· da especificidad por promotor, dice a la polimerasa DÓNDE se tiene que unir. Entonces podemos pensar que cambiando una sola subunidad se controla lo que se va a expresar. 
Promotores
¿qué eran? secuencias de unión de la ARN polimerasa. Están hacia 5´ del inicio de transcripción, donde empieza el ARNm o cualquiera, tomamos como el +1 (todo lo que esté a la izquierda hacia 5´) → se llama up stream o corriente arriba.
Se vio que en procariotas había 2 regiones que presentaban secuencias consenso, es decir, elementos en común en -10 y -35, estas 2 son lo que identifican las polimerasas y las subunidades σ de las mismas. Además, suele haber otro elemento que se llama up porque está en el upstream del promotor.
La secuencia a -10 se conoce como caja de Pribnow
El reconocimiento del promotor es el paso limitante en la velocidad de transcripción. Cuanto más se parece un promotor a la secuencia consenso, más eficiente es la transcripción → El cambio de una sola base puede disminuir la tasa de unión en varios órdenes de magnitud.
Las diferencias en las secuencias de los promotores permiten regular la velocidad de transcripción. Obviamente hay genes que se usan todo el tiempo en la vida de una bacteria y hay genes que solamente se usan si la bacteria está bajo determinadas condiciones, de esa manera se regula la expresión de proteínas.
Síntesis del ARN dependiente del ADN
La transcripción tiene que estar regulada → existen proteínas que activan la transcripción y proteínas represoras inhiben a la ARN polimerasa. La ARN-pol no tiene actividad exonucleasa 3´→5´ de corrección (proofreading) ¿por qué? porque si se genera un error no es muy importante, siendo que se sintetiza mucho ARN y se copia muchas veces el ADN entonces si hay un error 1 cadena más o menos no funciona con lo cual no habría muchas cadenas de proteínas que se malogren.
La ARN-polimerasa procariota no se disociaría del ADN, sino que seguiría buscando otro promotor aguas abajo.
En la imagen de la derecha tenemos: la polimerasa sobre el promotor, en celeste se encuentra el gen y al final está el sitio de terminación.
La polimerasa transmite hasta ese sitio, la polimerasa se une y comienza la síntesis de ARN (iniciación), luego se libera el factor σ ya que no hace más falta; prosigue la síntesis (elongación) hasta que se llega a un punto donde se indica a la polimerasa que no hace falta seguir alargando la cadena y la polimerasa se libera (finalización).
Inicio de la transcripción
La polimerasa (con el factor σ) se une al promotor y forma un complejo cerrado → el ADN se desenrolla, se transforma en un complejo abierto. Esta es la primera etapa donde la polimerasa se une al ADN.
La polimerasa debe abrir la burbuja de transcripción en el +1, ahí comienza la transcripción y se da la burbuja de transcripción, se copian de a 8 pb desprendiendo la cadena naciente. 
La cadena molde sufre un doblado brusco en la zona del promotor. La incorporación del primer nucleótido provoca la relocalización de la cadena y la apertura del canal de entrada de rNTPs.El plegado evita el retroceso de la enzima.
El “timón” guía el desprendimiento de la hebra naciente.
Comienza la síntesis, la enzima abandona el promotor, el factor σ se disocia → etapa de elongación.
La utilización de distintas subunidades σ permite la unión a distintos promotores (distintos genes y distintos procesos metabólicos en la célula).
Elongación de la cadena
La proteína NusA se une al complejo, en reemplazo de la subunidad σ.
Cuando termina la transcripción, NusA se separa de la enzima, la enzima se disocia del ADN y vuelve a unir a la subunidad σ. La ARN-polimerasa tiene alta procesividad → no se disocia del templado hasta no terminar la síntesis del ARN. 
Finalización
Mecanismo intrínseco o independiente de ρ: La terminación de la transcripción está indicada por dos señales: 
1. Una secuencia autocomplementaria que permite al ARN naciente formar una horquilla de 15- 20 pb, rica en GC 20 →La zona rica en GC hace más lenta a la transcripción permite que se separe el ARN naciente y se disocie del complejo.
2. Una secuenciade 3-8 residuos de A (que se transcriben como U) cerca del extremo de la horquilla → La región rica en U en el extremo 3' del transcripto hace al híbrido ADN-ARN más inestable y el ARN se pueda disociar. 
Dependiente de ρ : es una enzima con actividad de helicasa que reconoce en el ARN naciente un sitio rut para ρ. Esta helicasa promueve la translocación de la proteína a lo largo de la cadena de ARN naciente, se une cerca del 3´del ARN naciente y lo separa de la hebra molde.
ARN polimerasa eucariota
La ARN-polimerasa bacteriana transcribe los tres tipos de ARN (mensajero, ribosomal y de transferencia). Es inhibida por el antibiótico rifampicina.
Eucariotas tienen tres polimerasas, una para cada tipo de ARN. Son inhibidas diferencialmente por la α-amanitina:
· ARN-polimerasa I (ARNr) → resistente
· ARN-polimerasa II (ARNm) → a bajas concentraciones
· ARN-polimerasa III (ARNt) → a altas concentraciones
Diferencias de la transcripción entre procariotas y eucariotas
Ejemplo de transcripción y traducción simultánea
ARN polimerasa II
La ARN-polimerasa II reconoce múltiples sitios promotores. Uno de los más conocidos en eucariotas es la caja TATA → es poco abundante (20-30 %), pero tiene alto nivel de expresión.
Tiene los promotores para el inicio de la transcripción y varias secuencias reguladoras, algunas de ellas pueden estar a varios pb río arriba del inicio de la transcripción. 
Además de la caja TATA tenemos caja de inicio (Inr). 
Estructura de la polimerasa II:
· Tiene 12 subunidades 
· La subunidad mayor, RBP1, tiene una cola carboxilo terminal (CTD), que tiene una secuencia de 7 aa – YSPTSPS- repetidos muchas veces (27 en levaduras, 52 en humanos).
· La fosforilación en las serinas 2 y 5 son centrales en la progresión de la transcripción: cambios dinámicos regulan inicio, elongación y terminación.
La ARN-pol II necesita, además, varios factores de transcripción
Inicio de transcripción en eucariotas
La polimerasa II requiere de varios factores de transcripción generales, que participan en:
· reconocimiento del promotor 
· reclutamiento de la polimerasa 
· interacción con factores regulatorios 
· desenrollado del ADN 
· reconocimiento del sitio de inicio de la transcripción
Factores de transcripción en el promotor:
· La proteína de unión a TATA (TBP) se une al ADN doblándolo. 
· TFIIB y TFIIA se unen al complejo TBP-ADN → TFII A,B y D reconocen al promotor 
· TFIIF se une con la pol II, permite que esta una ADN doble cadena → forman el complejo previo al inicio de la transcripción (PIC) 
· TFIIH tiene actividad helicasa, permite desenrollar al ADN se forma el complejo abierto (OC) 
· TFIIE establiliza la hebra no-templado en el complejo abierto y comienza la síntesis del ARN ⇒ complejo de iniciación de la transcripción (ITC).
TFIIH también tiene actividad quinasa y fosforila a los residuos Ser del CTD. La mayor parte de los residuos de serina del CTD deben estar fosforilados para que la pol II abandone el promotor.
TFIIH también va abriendo el ADN durante la síntesis (avance de la burbuja).
Mediator se une al CTD y estabiliza al complejo de inicio de la transcripción (ITC).
Elongación
Mediator participa en la formación del PIC, sirve como anclaje entre la pol y el sitio promotor. Una vez que la transcripción comienza, mediator se desprende (queda ligada al sitio de inicio). El grado de fosforilación del CTD cambia a medida que progresa la transcripción = elongación.
Ahí se unen los factores de elongación y cuando se termina la transcripción el CTD se desfosforila.
MYC : es un factor de transcripción que actúa en la etapa de la elongación: se une a promotores y recluta al factor de elongación P-TEFb.
Secuencias potenciadoras de la transcripción: secuencia corta de ADN (50-150 pb) que pueden estar alejadas del sitio de inicio de la transcripción, siempre en cis. Une proteínas (TF) (activadoras) que aumentan la transcripción de un gen.
Si la regulación es negativa, la secuencia se llama silenciadora y la proteína (TF), represora. 
Maduración del ARN
Por corte y empalme (splicing) se eliminan los intrones del ARN para formar una secuencia continua que codifique para un polipéptido funcional.
Los ARN mensajeros eucariotas también se modifican en ambos extremos:
· 5’: se agrega un casquete 
· 3’: se agrega una cola de poliA
Los procesos de maduración ocurren a medida que el transcripto primario se sintetiza. El capping (agregado del casquete en 5’) ocurre durante la transcripción, mientras que el ensamblado (splicing) puede ocurrir durante la síntesis o después de la liberación.
CAPPING: se le agrega un residuo de 7-metil-guanosina al extremo 5´del ARN, a través de un enlace 5´,5-trifosfato. El casquete protege de ribonucleasas y participa de la unión a ribosomas para iniciar la síntesis proteica.
Además, las dos primeras bases del ARNm suelen ser metiladas. La metilación de bases está mediada por S adenosil-metionina.
El agregado del casquete ocurre luego de que se genere un transcripto de 20- 30 residuos. El complejo de formación del casquete se une al CTD de la ARN-pol II. Una vez agregado el casquete, este complejo deja el CTD y se une una proteína de unión del casquete (CBP) que lo mantiene unido al CTD.
Exones e intrones
Los exones tienen una longitud de menos de 1000 nucleótidos (la mayor parte de 100 a 200), es decir, que codifican para intervalos de 30-60 aminoácidos. El tamaño de los intrones varía entre 50 y 20.000 nucleótidos.
Hay 4 tipos de intrones, los tipo I y II realizan autocorte y empalme (self-splicing).
Eliminación de intrones 
MECANISMO TIPO I: una molécula de guanosina actúa como nucleófilo sobre el enlace fosfodiéster El exón 3´habitualmente comienza con G.El intrón eliminado se degrada Es un mecanismo presente en procariotas y organelas.
Catalizado por ribozimas.
MECANISMO TIPO II: una adenina en la secuencia intrónica actúa como nucleófilo sobre la G terminal (extremo 3´del exón 5´), la adenina actúa sobre la guanina y la va a escindir. Luego el U´ terminal del exón 5´ actúa como nucleófilo, completando la reacción → Mecanismo de procariotas y organelas.
MECANISMO TIPO III: puede ocurrir asociado a la transcripción, el espliceosoma puede unirse al CTD de la ARN-polimerasa II. La velocidad de transcripción no es homogénea, es más lenta al final (cerca de la señal de poliA), para permitir el ensamblado simultáneo.
Los intrones de espliceosoma tienen secuencias identificatorias de dos nucleótidos.
El espliceosoma es un conjunto especializado de complejos ARN-proteínas, llamados pequeñas ribonucleoproteínas nucleares (snRNP). Cada snRNP tiene ARN de 100-200 nucleótidos, los ARN nucleares pequeños (snRNA). 
MECANISMO TIPO IV: para ARN de transferencia, es por corte y unión directa de dos segmentos de ARN, por acción de una endonucleasa. Los mecanismos de tipo I y II se asocian a organismos inferiores (procariotas) y organelas derivadas de ellos.
MECANISMO TIPO V: es el único que requiere enzimas proteicas. 
Poliadenilación en 3´
Al final del transcripto se agrega una cola de 80-250 residuos de A. La cola de poliA protege al mensajero de la degradación enzimática.
La señal de corte está dada por la secuencia AAUAAA, la ARN-pol II extiende la cadena más allá de esa secuencia. Un complejo enzimático se asocial al CTD de la ARN-polimerasa: 
· Tiene actividad endonucleasa que reconoce la secuencia AAUAAA y corta la cadena de ARN a 30 residuos.
· La poliadenilato polimerasa agrega la cola de poliA en el sitio de corte.
Proceso global
Vemos que en la secuencia de ADN aparecen varios exones e intrones, se transcriben todo, se agrega la caperuza en 5´ y se copia un extremo extra en el ARN. Tenemos el ensamblado, el clivaje y la poliadenilación. 
Obtenemos el ARN maduro con el capping y la secuencia exónica que dará origen a la proteína y la cola poli A.
Destino patrón de poliadenilación y ensamblado alternativo
Puede haber distinto patrón de poliadenilación, indicando distintos sitios para el mismo generando diferentes transcritos y en consecuencia, proteínas. Esto permitela variabilidad de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas.
Además, se encuentra el mecanismo de ensamblado alternativo (imagen de la derecha), donde la mayor parte de los genes de los mamíferos son pasibles de ensamblado alternativo, por lo que sería mayor el número de proteínas codificadas por los genes. Entonces desde un único gen se producen distintas proteínas.
· Para cada gen se podrían esperar 10 variantes alternativas.
· Casi todos los genes presentan un transcripto principal, pero en el 1/3 de los casos, este cambia según el tejido.
Ensamblaje alternativo → Si bien la mayor parte de los genes tiene la posibilidad de permitir múltiples ensamblados, en la práctica no hay tantas variantes de cada proteína como las predichas; casi todos los genes tienen una isoforma predominante.
Secuenciación completa del exoma
El exoma representa el 1,5 % del genoma y sus mutaciones el 85 % de las enfermedades genéticas (desórdenes de un solo gen). Se usa para el diagnóstico de enfermedades genéticas raras.
Se puede secuenciar el exoma de una sola célula → comparar el exoma de distintas células en un tumor para ver si es homogéneo.
Tipos de ARN
ARN no codificante (IncRNA)→ presenta las siguiente características:
· Transcriptos de ARN de más de 200 nucleótidos 
· No presentan marcos abiertos de lectura 
· Muchos son procesados por la ARN-pol II, empalmados y poliadenilados 
· Codificados en regiones intergénicas 
· Participan del control de la expresión génica, la formación de soportes (scaffold) y el control epigenético
ARN ribosomal (rRNA)→ se genera a partir de un precursor, el ARN pre ribosomal. Hay un transcripto inicial de 30s donde por distintos procedimientos se modifica el transcripto, es corta y aparecen finalmente por exonucleasas ARN maduros de bacteria y algunos ARNt.
En eucariotas: está formado por un transcripto primario de 45S es incorporado en el complejo nucleolar 90. Tiene más de 100 de los 14000 nucleótidos del 45S son metilados, y ocurren varias otras modificaciones.
Las reacciones de corte requieren de ARN pequeños nucleolares (snoRNA), que forman complejos con proteínas snoRNPs. El ARN5S se sintetiza por la ARN polimerasa III.
Imagen izquierda, vemos el transcripto primario que es madurado y las formas definitivas
· 5s no se forma a partir del transcripto primario sino que se copia de otro lado, pero se incorpora para formar el complejo de 60s.
Llegamos a las zonas ribosomales maduras que deben ser exportadas al citoplasma.
ARN pequeños nucleares (snoRNA)→ son pequeños ARN que asisten a las reacciones de modificación, donde las más comunes son de metilación y pseudouridililación. 
Tenemos en la imagen como se une el ARNm y los snoRNA, está marcada la caja C/D (guia de la metilación) y más abajo el nucleótido metilado.
El snoRNA de caja H/ACA guía la pseudouridililación. 
 ARN de transferencia (tRNA)→ la mayor parte de las células tiene entre 40 y 50 ARNt distintos. Las células eucariotas tienen varias copias de los genes para ARNt.
· Se procesan los extremos y se modifican algunas bases específicas. 
· Los preARNt de eucariotas tienen un intrón que se elimina en el último paso. 
· El trinucleótido CCA 3´-terminal donde se unen los aminoácidos para la síntesis de proteínas se agrega durante el procesamiento, catalizado por la enzima ARNt nucleotidil transferasa el templado no depende de ADN sino de la enzima.
Micro ARN (miRNA)→ es un ARN no codificante que interviene en regulación génica, son secuencias de 22 nucleótidos complementarias a secuencias codificantes del ARNm.
Regulan la función del mensajero cortándolo o inhibiendo su traducción, cuando más perfecta sea la homología de secuencia entre el miRNA y el mensajero, más probable es la degradación. Mientras que, una hibridización no perfecta sino que solo hay apareamiento, se inhibe la traducción, un tercio de los mensajeros pueden ser inhibidos por este mecanismo. 
Ribozimas
Son enzimas que no proteínas, algunas se sus características son:
· El sustrato habitual es el ARN 
· Catalizan reacciones de hidrólisis (corte) y de transesterificación (empalme) 
· Están codificadas en secuencias intrónicas 
· Tamaño entre 40 y 400 nucleótidos 
· La estructura 3D es muy importante
Arriba está simplificado el mecanismo de autocorte y como con un estructura secundaria bien definida se reconoce a la secuencia y son capaces de escindirla, actúan degradando el mensajero en este caso.
Degradación del ARNm
Uno de los niveles de control de las expresión de genes es la concentración celular de su ARNm → importa la velocidad de síntesis y la de degradación. La vida media del ARNm en eucariotas es de 3h, en bacterias de 1,5 min.
En bacterias la degradación es por endorribonucleasas seguidas por exorribonucleasas 3´→5´.
En eucariotas inferiores primero se acorta la cola de poliA, luego se remueve el casquete en 5´, para permitir la degradación desde 5´. En eucariotas superiores es más importante la vía 3´→5´.
El exosoma es un complejo de 10 exoribonucleasas implicado en la degradación desde 3´de ARNr, ARNt y algunos ARN pequeños. 
Polinucleótido fosforilado: es una enzima independiente de molde y además cataliza la síntesis de polinucleótidos a partir de dinucleótidos fosfatos no NTPS. La función probable de la enzima consiste en la degradación del ARNm. 
Síntesis de ADN y ARN a partir de ARN
Se sabe que el ARN se puede autorreplicar o retro transcribir, no es lo más común que suceda.
Característico de retrovirus que presenta la enzima transcriptasa reversa. Estas enzimas catalizan 3 reacciones:
· síntesis de ADN dependiente de ARN
· Degradación del ARN
· Síntesis de ADN dependiente de ADN.
Requieren de un cebador = un ARNt
No tiene actividad correctora 3´→5´
Algunos virus (fagos y virus eucariotas) tienen genomas de ARN monocatenario que también funciona como ARN mensajero. Se replican en el huésped por una ARN polimerasa dependiente de ARN (ARN replicasa), a diferencia de las polimerasas, la replicasa solo copia ARN viral; el virus solo codifica para la subunidad catalítica, las otras tres subunidades las toma del huésped. 
Las transcriptasas reversas tienen una tasa de error de 1:20,000 nucleótidos agregados; la RT del HIV tiene una tasa de error diez veces mayor que las otras RT.
Las terapias contra el HIV implican el uso de inhibidores enzimáticos, contra la RT o contra proteasas.
Elementos génicos móviles
Un transposón o elemento genético transponible es una secuencia de ADN que puede moverse de manera autosuficiente a diferentes partes del genoma de una célula. 
Un retrotransposón es una secuencia de ARN, que para poder moverse a diferentes partes del genoma de una célula debe llevar una retrotranscriptasa.
Telomerasas
· Los telómeros son secuencias oligonucleotídicas cortas y repetitivas que se ubican al final de los cromosomas para protegerlos.
· Pueden tener varios miles de pb de extensión.
· Una de las hebras es rica en TxGy es más larga que la complementaria (varios cientos de pb).
· La telomerasa contiene un cebador de ARN complementario al telómero, sirve para extender la hebra TxGy.
· Luego una polimerasa extiende la hebra complementaria.
· La telomerasa es una transcriptasa reversa.
Las células de la línea germinal tienen telomerasas pero las células somáticas no
ADN copia
El ADN complementario o ADN copia (ADNc) es una molécula de ADN de doble cadena, en la que una de sus hebras constituye una secuencia totalmente complementaria al ARN mensajero a partir del cual se ha sintetizado. 
Se usa para la clonación de genes eucariotas en células procariotas, ya que no tiene intrones, y para la cuantificación de ARN mensajero (expresión génica) porque el ADN es más estable que el ARN.