DCUCS10098

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La presente tesis es publicada a texto completo en virtud de que el autor 
ha dado su autorización por escrito para la incorporación del documento a la 
Biblioteca Digital y al Repositorio Institucional de la Universidad de Guadalajara, 
esto sin sufrir menoscabo sobre sus derechos como autor de la obra y los usos 
que posteriormente quiera darle a la misma. 
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA
CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS DE LA SALUD
DOCTORADO EN FARMACOLOGÍA
TESIS DE GRADO
ESTUDIO COMPARATIVO DE MELATONINA Y
TRATAMIENTOS INMUNOMODULADORES (INTERFERON
BETA Y ACETATO DE GLATIRAMERO) EN UN MODELO
MURINO DE ENCEFALITIS AUTOINMUNE
EXPERIMENTAL
Q.F.B. ELSY JANETH RAMOS GONZÁLEZ
Guadalajara, Jalisco a Julio del 2016.
UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA
CENTRO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS DE LA SALUD
DOCTORADO EN FARMACOLOGÍA
TESIS DE GRADO
ESTUDIO COMPARATIVO DE MELATONINA Y TRATAMIENTOS
INMUNOMODULADORES (INTERFERON BETA Y ACETATO DE GLATIRAMERO)
EN UN MODELO MURINO DE ENCEFALITIS AUTOINMUNE EXPERIMENTAL
PRESENTA:
Q.F.B. ELSY JANETH RAMOS GONZÁLEZ
DIRECTOR DE TESIS:
DR. EN C. OSCAR KURT BITZER QUINTERO
CO-DIRECTORES DE TESIS:
DR. EN C. GENARO GABRIEL ORTIZ
DR. EN C. LUIS JAVIER RAMIREZ JIRANO
Guadalajara, Jalisco a Julio del 2016.
DIRECTOR
Dr. en C. Oscar Kurt Bitzer Quintero.
Laboratorio de Neuroinmunomodulación, División de Neurociencias,
Centro de Investigación Biomédica de Occidente, IMSS. Guadala-
jara, Jalisco. México. neuronim26@yahoo.com Tel. 33683000 ext.
31950
CO-DIRECTOR
Dr. en C. Genaro Gabriel Ortiz.
Laboratorio de Desarrollo y Envejecimiento y Enfermedades Neu-
rodegenerativas, División de Neurociencias, Centro de Investigación
Biomédica de Occidente, IMSS. Guadalajara, Jalisco, México. genaro-
gabriel@yahoo.com
CO-DIRECTOR
Dr. en C. Luis Javier Ramírez Jirano.
Laboratorio de Neuroinmunomodulación, División de Neurociencias,
Centro de Investigación Biomédica de Occidente, IMSS. Guadalajara,
Jalisco, México. ramirez_jirano@hotmail.com
PRESENTA
Q.F.B. Elsy Janeth Ramos González.
Doctorado en Farmacología, Departamento de Fisiología, Centro
Universitario de Ciencias de la Salud, Universidad de Guadalajara.
Guadalajara, Jalisco, México. elsy.jrg@gmail.com
El presente proyecto de investigación se llevó a cabo en el
Laboratorio de Neuroinmunomodulación del Centro de Investigación
Biomédica de Occidente del Instituto Mexicano del Seguro So-
cial.
Este proyecto doctoral tuvo financiamiento por parte del Fondo
de Investigación en Salud del Instituto Mexicano del Seguro So-
cial con el número de registro FIS/IMSS/PROT/G13/1232, con-
vocatoria 2013 otorgado al Dr. Oscar Kurt Bitzer Quin-
tero.
También contó con la participación de la becaria Q.F.B.
Elsy Janeth Ramos González, número de becario CONACYT
268156.
“Los sueños parecen
al principio imposibles, luego
improbables, y luego cuando
nos comprometemos,
se vuelven inevitables”.
Gandhi.
Dedicatoria
Dedico esta tesis a mi novio Reynaldo, por estar conmigo, apoyarme y animarme a conseguir
mis metas en todo momento.
A mis hermanos Mayra e Iván, quienes me acompañaron y animaron a su realización.
A mis padres, Fernando y Elsa, por alentarme a seguir con mis sueños y objetivos de vida, no
importando que tuviera que estar lejos de casa.
Y a mis amigos, Elizabeth, Eloisa y Christian, quienes me procuraban a pesar de la distancia.
También a Alicia, Luli y Marisol, quienes caminaron conmigo en nuestra formación como
investigadoras, por las experiencias y risas que vivimos juntas.
Agradecimientos
Agradezco profundamente a todos y cada una de las personas que me acompañaron a lo largo
de la realización de este proyecto. A quienes dedicaron un minuto de su tiempo para instru-
irme, guiarme o darme algún consejo útil para llevar a cabo las tareas programadas y animarme
a continuar con este arduo trabajo.
Quisiera agradecer especialmente a mi tutor, el Dr. Oscar K. Bitzer Q., por dejarme participar
activamente en todas las decisiones tomadas para realizar esta investigación. Al Dr. Javier
Ramirez Jirano por apoyarme constantemente en el laboratorio. Al Dr. David García por tener
la paciencia para adiestrarme en técnicas de cirugía experimental. A la Dra. Caridad Leal y
al Dr. Luis Jave por guiarme en la realización de las técnicas analíticas. Finalmente, pero no
menos importante, al equipo de enfermeras y auxiliares técnicos de la División de Cirugía Ex-
perimental, Elisa, Normita y Lupita, quienes estuvieron asistiéndome todo el tiempo mientras
realizaba lo procedimientos experimentales.
Sin la participación de cada uno de ellos no hubiera sido posible mi crecimiento y aprendizaje.
A todos ustedes, mil gracias.
i
ÍNDICE GENERAL
Pag.
ÍNDICE DE FIGURAS Y GRÁFICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . iv
ÍNDICE DE TABLAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vi
ABREVIATURAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . vii
RESUMEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . xv
1 MARCO TEÓRICO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1 ESCLEROSIS MÚLTIPLE (EM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1.1 Definición de EM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1.2 Epidemiología de la EM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1
1.1.3 Fisiopatología de la EM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3
1.1.4 Clasificación de EM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6
1.2 ENCEFALITIS AUTOINMUNE EXPERIMENTAL (EAE) . . . . . . . . . . . 8
1.2.1 Definición . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8
1.2.2 Ventajas del modelo EAE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.2.3 Inducción de la EAE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9
1.2.4 Patogénesis de la EAE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10
1.2.5 Curso clínico de la EAE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.3 TEJIDO CEREBRAL DE INTERÉS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.3.1 Líquido cefalorraquídeo (LCR) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.4 CITOCINAS Y SISTEMA NERVIOSO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.4.1 Interleucina 1β . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
1.4.2 Interleucina 12 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
1.4.3 Factor de necrosis tumoral alfa . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23
1.5 TRATAMIENTOS INMUNOMODULADORES DE LA EM . . . . . . . . . . 29
1.5.1 Interferón beta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
1.5.2 Acetato de glatiramero . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
1.6 MELATONINA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
1.6.1 Funciones de la MLT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39
1.6.2 Síntesis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
1.6.3 Receptores de MLT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41
1.6.4 Farmacocinética de MLT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
ii
Pag.
1.6.5 Inmunomodulación de MLT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
2 ANTECEDENTES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44
3 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45
4 JUSTIFICACIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
5 PREGUNTA DE INVESTIGACIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48
6 HIPÓTESIS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
7 OBJETIVOS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
7.1 OBJETIVO GENERAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
7.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
8 METODOLOGÍA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
8.1 DISEÑO DEL ESTUDIO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
8.2 UNIVERSO DE ESTUDIO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
8.3 VARIABLES DE ESTUDIO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
8.3.1 Variables independientes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
8.3.2 Variables dependientes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
8.4 GRUPOS DE TRABAJO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
8.4.1 Cálculo del tamaño de muestra . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
8.4.2 Grupos de trabajo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52
8.5 Posología de los tratamientos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
8.6 INDUCCIÓN DEL MODELO DE EAE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53
8.7 EVALUACIÓN CLÍNICA DE LA EAE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
8.8 EXTRACCIÓN DE LIQUIDO CEFALORRAQUÍDEO . . . . . . . . . . . . . 54
8.9 FLUJOGRAMA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
8.10 TÉCNICAS ANALÍTICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
8.10.1 Cuantificación de la expresión de citocinas proinflamatorias . . . . . . 57
8.10.2 Cuantificación de citocinas proinflamatorias . . . . . . . . . . . . . . . 59
8.11 PLAN DE ANÁLISIS DE RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
8.12 CONSIDERACIONES DE BIOSEGURIDAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
8.13 CONSIDERACIONES ÉTICAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
8.14 CONFLICTO DE INTERÉS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
8.15 FINANCIAMIENTO . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
iii
Pag.
9 RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
9.1 ESTANDARIZACIÓN DEL MODELO DE EAE . . . . . . . . . . . . . . . . 63
9.2 EVALUACIÓN CLÍNICA DE LA EAE. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
9.2.1 COMPORTAMIENTO DE LOS DATOS . . . . . . . . . . . . . . . . 64
9.3 EXPRESIÓN GÉNICA DE LAS CITOCINAS PROINFLAMATORIAS (IL-
1β, IL-12p70 Y TNF-α) EN LCR. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
9.4 CONCENTRACIÓN DE CITOCINAS PROINFLAMATORIAS (IL-1β, IL-
12p70 Y TNF-α) EN LCR. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
9.4.1 Curva Estándar De Concentración De Analitos . . . . . . . . . . . . . 72
9.4.2 CONCENTRACIÓN DE ANALITOS EN LAS MUESTRAS DE LCR 76
10 DISCUSIÓN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
10.1 EVALUACIÓN CLÍNICA DEL MODELO MURINO DE EAE . . . . . . . . . 84
10.2 TRATAMIENTO CON IFN-β . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
10.3 TRATAMIENTO CON AG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87
10.4 TRATAMIENTO CON MLT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
10.5 EXPRESIÓN DE CITOCINAS PROINFLAMATORIAS EN EL LCR . . . . . 90
CONCLUSIONES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91
REFERENCIAS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
ANEXOS
ANEXO A: EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE ARNm . . . . . . . . . . . 104
ANEXO B: SÍNTESIS DE ADNc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106
ANEXO C: PCR EN TIEMPO REAL . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108
ANEXO D: TÉCNICA DE MULTIPLEX . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110
iv
ÍNDICE DE FIGURAS Y GRÁFICAS
Figura Pag.
1.1 Prevalencia de esclerosis múltiple a nivel mundial . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2
1.2 Patogénesis de la EM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4
1.3 Distribución de EM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7
1.4 Mecanismo patogénico propuesto de EM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11
1.5 Curso clínico de la EAE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.6 Eje hipotálamico-pituitario-adrenal (HPA). . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
1.7 Estructura química tridimensional del interferon β. Tomada del internet libre. . . . 31
1.8 Estructura química del acetato de glatiramero. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
1.9 Estructura química de la melatonina. Tomada del internet libre. . . . . . . . . . . 40
8.1 Extracción de LCR en rata. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
9.1 Curva dosis-respuesta. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63
9.2 Comparación de la evaluación clínica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
9.3 Evaluación EAE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65
9.4 Evaluación EAE-IFN-β . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
9.5 Evaluación EAE-AG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66
9.6 Evaluación EAE-MLT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
9.7 Comparación entre los grupos EAE contra EAE-IFNβ . . . . . . . . . . . . . . . 68
9.8 Comparación entre los grupos EAE contra EAE-AG . . . . . . . . . . . . . . . . 69
v
Figura Pag.
9.9 Comparación entre los grupos EAE contra EAE-MLT . . . . . . . . . . . . . . . 69
9.10 Comparación entre los grupos EAE-IFNβ contra EAE-AG . . . . . . . . . . . . . 70
9.11 Comparación entre los grupos EAE-IFNβ contra EAE-MLT . . . . . . . . . . . . 70
9.12 Comparación entre los grupos EAE-AG contra EAE-MLT . . . . . . . . . . . . . 71
9.13 . Curva de amplificación y gráfica del melting peaks . . . . . . . . . . . . . . . . 72
9.14 Curva estándar para IL-1β . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
9.15 Curva estándar para IL-12p70 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
9.16 Curva estándar para el analito TNF-α . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
9.17 Concentración de IL-1β presente en el LCR de ratas . . . . . . . . . . . . . . . . 80
9.18 Concentración de IL-12p70 presente en el LCR de ratas . . . . . . . . . . . . . . 80
9.19 Concentración TNF-α presente en el LCR de ratas . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
9.20 Representación de los grupos entre los que se encontraron diferencias significati-
vas para TNF-α . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
vi
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla Pag.
8.1 Secuencias de los oligonucleótidos y tamaño del producto de la PCR de citocinas
proinflamatorias. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59
9.1 Estadística descriptiva de la evaluación clínica por grupo experimental. . . . . . . 64
9.2 La medición del estándar de IL-1β . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
9.3 La medición del estándar de IL-12p70 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
9.4 La medición del estándar de TNF-α . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75
9.5 Concentración de citocinas grupo control . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
9.6 Concentración de citocinas grupo EAE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
9.7 Concentración de citocinas grupo INF-β . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
9.8 Concentración de citocinas grupo AG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
9.9 Concentración de citocinas grupo MLT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
9.10 Concentración de citocinas grupo EAE-IFNβ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
9.11 Concentración de citocinas grupo EAE-AG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
9.12 Concentración de citocinas grupo EAE-MLT . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
9.13 Grupos comparados estadísticamente conla prueba post hoc U de Mann Whitney
para TNF-α . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82
vii
ABREVIATURAS
ACTH Hormona adrenocorticotropa (del inglés adrenocorticotropic hormone and corti-
cotropin).
ADN Ácido desoxirribonucleico.
ADNc Ácido desoxiribonucleico complementario.
AG Acetato de glatiramero.
AMPA Ácido α-amino-3-hidroxi-5-metilo-4-isoxazolpropiónico (del inglés, α-amino-3-
hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid).
Bcl-2 Linfoma de células B 2 (del inglés B-cell lymphoma 2).
BHE Barrera hematoencefálica.
Ca2+ Calcio iónico.
CCL3 Ligando 3 de quimiocinas (motivo C-C) (del inglés C-C motif ligand 3).
CCR3 Receptor tipo 3 de quimiocina motivo C-C (del inglés C-C motif chemokine re-
ceptor 3).
CCR5 Receptor tipo 5 de quimiocina motivo C-C (del inglés C-C chemokine receptor
type 5).
viii
CD Cúmulo de diferenciación (del inglés cluster of differentiation).
CLMF Factor de maduración de linfocitos citotóxicos (del inglés cytotoxic lymphocyte
maturation factor).
Cmax Concentración máxima.
CPA Célula(s) presentadora(s) de antígeno(s).
CRF Hormona liberadora de corticotropina (del inglés corticotropin-releasing factor).
CRH Hormona liberadora de corticotropina (del inglés Corticotropin-releasing hor-
mone).
CTNF Factor neurotrófico ciliar (del inglés ciliary neurotrophic factor).
DD Dominio de muerte (del inglés death domain).
EAE Encefalitis autoinmune experimental.
EM Esclerosis múltiple.
EMPP Esclerosis múltiple primaria progresiva.
EMPR Esclerosis múltiple progresiva recurrente.
EMRR Esclerosis múltiple remitente recurrente.
EMSP Esclerosis múltiple secundaria progresiva.
ep Edad postnatal.
Fas Dominio proteico del receptor tipo 1 del factor de necrosis tumoral.
FDA Administración de alimentos y medicamentos (del inglés food and drug adminis-
tration).
ix
FOXP3 Factor de transcripción con dominio “forkhead” P3.
GABA Ácido γ-aminobutírico (del inglés γ-aminobutyric acid).
GAD Enzima ácido glutámico descarboxilasa (del inglés glutamic acid decarboxy lase).
GAT Transportador de recuperación de GABA (del inglés GABA transporter).
GM-CSF Factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (del inglés granulo-
cyte macrophage colony-stimulating factor).
GPCR Receptor acoplado a proteínas G (del inglés G-protein-coupled receptors).
HPA Hipotalámico-Pituitario-Adrenal.
ICAM-1 Molécula de adhesión intercelulares 1 (del inglés intercellular adhesion molecu-
le 1).
IFN-α Interferon alfa.
IFN-β Interferon beta.
IFN-γ Interferon gamma.
Ig Inmunoglobulina (s).
IL-1 Interleucina 1.
IL-1α Interleucina 1 α.
IL-1β Interleucina 1 β.
IL-1R Receptor de interleucina 1.
IL-1R1 Receptor de interleucina 1 tipo 1.
IL-1R2 Receptor de interleucina 1 tipo 2.
x
IL-2 Interleucina 2.
IL-3 Interleucina 3.
IL-4 Interleucina 4.
IL-5 Interleucina 5.
IL-6 Interleucina 6.
IL-10 Interleucina 10.
IL-12 Interleucina 12.
IL-12p35 Interleucina 12 fracción 35.
IL-12p40 Interleucina 12 fracción 40.
IL-12p70 Interleucina 12 fracción 70.
IL-12R Receptor de interleucina 12.
IL-13 Interleucina 13.
IL-17 Interleucina 17.
IL-18 Interleucina 18.
IL-1Ra Antagonista del receptor de interleucina 1.
IL-23 Interleucina 23.
IL-27 Interleucina 27.
IM Intramuscular.
IP Intraperitoneal.
JAK2 Cinasa Janus 2 (del inglés Janus kinase 2).
xi
JNK Jun-n terminal cinasa (del inglés c-Jun kinase).
kDa Kilodaltones.
LC Locus coeruleous.
LCR Líquido cefalorraquídeo.
LPS Lipopolisacárido.
LTD Depresión a largo plazo (del inglés long term depression).
LTP Potenciación a largo plazo (del inglés long-term potentiation).
MAPKp38 Proteincinasa activada por mitógeno tipo 38 (del inglés mitogen activated
protein kinase class 38).
MHC I Complejo mayor de histocompatibilidad tipo I (del inglés major histocompati-
bility complex class 1).
MHC II Complejo mayor de histocompatibilidad tipo II (del inglés major
histocompatibility complex class 2).
MHC Complejo mayor de histocompatibilidad, del inglés major histocompatibility
complex.
MIP-1α Proteína 1 alfa inflamatoria de macrófagos (del inglés macrophage inflammatory
protein 1-alpha).
MLT Melatonina.
MMP Metaloproteinasas de matriz (del inglés matrix metalloproteinase).
MOG Glicoproteína oligodendrocítica de mielina (del inglés Myelin oligodendrocyte
xii
glycoprotein).
MSFI Federación internacional de esclerosis múltiple (del inglés Multiple Sclerosis
Federation International).
MT1 Receptor de melatonina tipo 1.
MT2 Receptor de melatonina tipo 2.
MT3 Receptor de melatonina tipo 3.
NFκB Factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activa-
das (del inglés nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells.
NGF Factor de crecimiento nervioso (del inglés nerve growth factor).
NK Asesinas naturales (del inglés natural killer).
NKSF Factor estimulante de células natural killer (del inglés Natural killer cell
stimulatory factor).
NMDA N-metil-D-aspartato.
NO Óxido nítrico (del inglés nitric oxide)
NTS Núcleo del tracto solitario.
qPCR Reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (del inglés quantitative poly-
merase
chain reaction).
PBM Proteína básica de mielina.
PLP Proteína proteolípida de mielina (del inglés myelin proteolipid).
RNAm Ácido ribonucleico mensajero.
xiii
RT-PCR Reacción en cadena de la polimerasa con retrotranscripción (del inglés reverse
transcription polymerase chain reaction).
SAM Simpato-Adreno-Medular.
SC Subcutánea/o.
SNC Sistema nervioso central.
solTNF Factor de necrosis tumoral soluble (del inglés soluble tumor necrosis factor).
STAT Señal de transducción y activador de transcripción (del inglés signal transdu-
cer and activator of transcription).
Tamb Temperatura ambiental.
T CD4+ T helper maduro que expresa el cúmulo de diferenciación 4 (del inglés cluster
of cuadruple differentiation).
T CD8+ T citotóxico maduro que expresa el cúmulo de diferenciación 8 (del inglés
cluster of differentiation 8).
T-bet Factor de transcripción T-box.
Tbx-21 Factor de transcripción específico de células Th1.
TCR Receptor de células T (del inglés T cell receptor).
TGF-β Factor de crecimiento transformante beta (del inglés transforming growth
factor beta).
Th T helper.
Th1 T helper tipo 1.
xiv
Th2 T helper tipo 2.
Th17 T helper tipo 17.
TLR Receptor tipo Toll (del inglés toll-like receptor).
tmTNF Factor de necrosis tumoral transmembranal (del inglés transmembrane tumor
necrosis factor).
TNFR1 Receptor de TNF tipo 1 (del inglés tumor necrosis factor receptor class 1).
TNFR2 Receptor de TNF tipo 2 (del inglés tumor necrosis factor receptor class 2).
TNF-α Factor de necrosis tumoral alfa (del inglés alpha tumor necrosis factor).
TRAIL Domino proteico del receptor tipo 1 del factor de necrosis tumoral
Treg T reguladoras.
TYK2 Tirosincinasa 2 (del inglés tyrosine kinase 2).
VCAM-1 Proteína de adhesión vascular celular 1 (del inglés Vascular cell adhesion pro-
tein 1).
VLM Ventrolateral medular.
RESUMEN
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad crónica autoinmune desmielinizante del sis-
tema nervioso central (SNC) que conduce a la neuroinflamación. El modelo animal de la EM
es la encefalitis autoinmune experimental (EAE). La EM ha sido tratada clásicamente con in-
munomoduladores tales como el interferón beta (IFN-β) y el acetato de glatiramero (AG). La
melatonina (MLT) es conocida por su papel en muchos procesos fisiológicos, dentro de los
que destaca la modulación del sistema inmune, por lo que pudiera estar relacionada con la
supresión de enfermedades autoinmunes, incluyendo la EAE.
Nuestro estudio compara el efecto inmunomodulador de la administración de MLT contra los
tratamientos de IFN-β y AG en la EAE, midiendo el efecto de cada tratamiento sobre la expre-
sión, cuantificación de citocinas proinflamatorias (TNF-α, IL-1β, IL-12) y evaluación clínica
de la EAE. Nuestros resultados indican que la administración de IFN-β, AG y MLT atenúan
elproceso inflamatorio en la EAE reflejándose en una disminución de los signos y síntomas
clínicos en el modelo, en mayor o menor medida según el tratamiento, además de disminuir
la concentración del TNF-α en el líquido cefalorraquídeo. Sin embargo, el IFN-β demostró
porque es considerado el estándar de oro en la prescripción clínica ya que controló de mejor
manera la EAE que los tratamientos de AG y MLT.
xvi
ABSTRACT
Multiple sclerosis (MS) is a chronic autoimmune demyelinating disease of the central nervous
system (CNS) leading to neuroinflammation. The animal model of MS is experimental au-
toimmune encephalitis (EAE). MS classically has been treated with immunomodulators such
as interferon beta (IFN-β) and glatiramer acetate (GA). Melatonin (MLT) is known for its
role in many physiological processes, within which highlights the modulation of the immune
system, which could be related to the suppression of autoimmune diseases, including EAE.
Our study compares the immunomodulatory effect of administration of MLT against treatments
IFN-β and AG in EAE, measuring the effect of each treatment on the expression and quantifi-
cation of proinflammatory cytokines (TNF-α, IL-1β, IL-12) and clinical evaluation of EAE.
Our results indicate that administration of IFN-β, AG and MLT attenuate the inflammatory
process in EAE reflected in a reduction in clinical signs and symptoms in the model, a greater
or lesser extent depending on the treatment, besides decreasing the concentration of TNF-α in
the cerebrospinal fluid. However, IFN-β demonstrated the because it is considered the gold
standard in clinical prescription as better controlled EAE treatments AG and MLT.
Capítulo 1
MARCO TEÓRICO
1.1 ESCLEROSIS MÚLTIPLE (EM)
1.1.1 Definición de EM
La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad crónica inflamatoria autoinmune desmieli-
nizante que afecta a la materia blanca del sistema nervioso central (SNC) con lesiones focales
y macroscópicas, con la subsecuente degeneración del axón nervioso[1, 2, 3], de etiología des-
conocida y que produce una discapacidad neurológica importante en adultos jóvenes genética-
mente predispuestos[4, 5, 6]. La etiología exacta de la EM permanece poco clara, pero se ha
pensado que involucra una combinación de factores ambientales y genéticos que conducen al
desarrollo de la autoinmunidad y progresión de la enfermedad en individuos susceptibles[7].
Se piensa que en la mayoría de los pacientes con EM, la enfermedad es mantenida y dirigida
por la reactividad del sistema inmune contra la mielina y tal vez otros componentes neuronales;
sin embargo, a la fecha, la cascada exacta de acontecimientos que desembocan en la autoinmu-
nidad no está esclarecida[3].
1.1.2 Epidemiología de la EM
A nivel mundial, de acuerdo con la Federación Internacional de Esclerosis Múltiple (MSIF
por sus siglas en inglés), el número estimado de personas con EM se ha incrementado de 2.1
millones en el 2008 a 2.3 millones en el 2013, con una prevalencia media de 33 por cada 100000
habitantes a nivel mundial en 2013. También la MSIF reporta que la EM se puede encontrar en
2
cada una de las regiones del planeta, presentándose con mayor frecuencia en mujeres con una
relación mujeres a hombres de 2:1[8].
En México se calcula que las personas que padecen EM asciende a unas 15 000, con una
tasa de prevalencia de 15 por cada 100 000 habitantes, siguiendo la misma proporción de
mujeres a hombres que a nivel mundial[3, 8] (figura 1.1), pero sin duda esta cifra puede ser
subestimada debido a la infraestructura del sistema de salud y a los subdiagnósticos, así como
a la poca aplicabilidad de los criterios de McDonald para el diagnóstico en algunos centros de
salud, aunque también se cree que el aumento de los casos es debido al mestizaje puesto que
la incidencia en indígenas es baja[9].
Figura 1.1 Prevalencia de esclerosis múltiple a nivel mundial
Mapamundi que presenta la prevalencia de esclerosis múltiple por país a nivel mundial[8]
En un estudio realizado en el 2003 por el grupo de investigación del Dr. M. Velázquez
Quintana se describe el perfil sociodemográfico de la EM en México, ellos concluyen que el
perfil de los pacientes mexicanos con EM no difiere del publicado en otros países, además de
que la baja prevalencia se atribuye a factores étnicos que sugieren que el mestizaje confiere
cierto grado de protección. En este mismo estudio, la mayor parte de los casos son mestizos y
se concentran en las zonas norte y centro del país[10], lo cual apoyaría la teoría del gradiente
3
de latitud que se observa en otras regiones del planeta así como en américa latina[10, 11].
También se ha descrito que la ausencia de EM en indígenas americanos sin mestizaje sugiere
que la enfermedad tiene una incidencia extremadamente baja en estos grupos, observándose
este mismo fenómeno en el resto de América Latina[12].
La encuesta realizada por la MSIF confirma que la EM usualmente es diagnosticada en
adultos jóvenes alrededor de la tercera década de vida (a pesar de que pueda ser diagnosticada
a cualquier edad) por lo que las personas tienen que vivir con esta enfermedad y su desarrollo
progresivo por varias décadas[8], siendo la causa más común de discapacidad neurológica
crónica de inicio temprano en la edad adulta[13].
El diagnóstico de EM es difícil, dado que se debe considerar un gran número de padec-
imientos que cursan con síntomas similares a esta enfermedad[5]. Por lo regular, el diagnós-
tico de la EM depende de múltiples eventos neurológicos centrales separados por tiempo y
espacio (anatómicamente). Así mismo, se apoya de estudios paraclínicos como resonancia
magnética, bandas oligoclonales en líquido cefalorraquídeo (LCR) y potenciales evocados de
tallo visual[9].
1.1.3 Fisiopatología de la EM
Durante las últimas décadas, el concepto de que la EM es una enfermedad autoinmune di-
rigida por células Th1 afectando la materia blanca (mielina) ha cambiado radicalmente a un
proceso patológico complejo involucrando células T autoreactivas y células B orquestando un
ataque autoinmune y humoral sobre los axones mielinizados del SNC [15]. La EM está carac-
terizada patológicamente por la disrupción de la BHE, un flujo de leucocitos dentro del SNC
(conduciendo a un ambiente local inflamatorio) y la desmielinización resultante en pérdida de
la velocidad de conducción por los axones [6] (figura 1.2).
4
Figura 1.2 Patogénesis de la EM
A través del receptor TCR, las células T son activadas en la periferia por antígenos extraños o autoantígenos presentados por
el MHC tipo II de las células presentadoras de antígenos, incluyendo células dendríticas y células B. Las células T activadas
migran, se adhieren y penetran a través de la BHE, un paso mediado por moléculas de adhesión, proteasas y quimiocinas.
Dentro del SNC, las células T son reactivadas en el contexto del MCH-II sobre CPA residentes, principalmente células de
la microglia. Estas células T reactivadas secretan citocinas proinflamatorias, tales como IFN-γ o IL-2 e indicen inflamación
del SNC por la subsecuente activación de macrófagos, otras células T y células B como células efectoras. Los macrófagos
y las células T atacan las vainas de mielina de los oligodendrocitos a través de mediadores citotóxicos, principalmente
TNF-α, radicales de oxígeno y óxido nítrico. Las células B se diferencian en células plasmáticas que secretan anticuerpos
desmielinizantes. Ellos pueden guiar y activar a macrófagos o iniciar la cascada del complemento con ensamblaje del
complejo de ataque de membrana lo cual causa la formación de un poro en las membranas de mielina [14].
La visión general que han dado los datos experimentales y clínicos ha sido que la patología
de la EM comienza con el desarrollo agudo de lesiones inflamatorias y daño a la BHE. Esta
idea está fundamentada principalmente por las observaciones de lesiones activas que están car-
acterizadas por la infiltración perivascular de células T activadasperiféricamente con potencial
encefalitogénico (células T autoreactivas)[6, 7, 16]. La activación periférica y la subsecuente
migración de las células Th1 autoreactivas y células Th17 dentro del SNC está ampliamente
aceptada como un paso esencial en la patogénesis de la EM[17](figura 1.2).
Una vez que atraviesan la barrera hematoencefálica (BHE) y se encuentran dentro del SNC,
son reactivadas por células presentadoras de antígenos (CPA) activadas, las cuales presentan
los autoantígenos contra mielina, comienzan a liberar citocinas proinflamatorias que van a
activar a la microglia[6, 7, 16]. Los macrófagos y la microglia activada secretan quimiocinas
que contribuyen al reclutamiento de células T intracerebrales, además de macrófagos y células
dendríticas. Las CPA activadas, locales e infiltradas, presentan antígenos de mielina asociados
5
al complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) II y expresan moléculas coestimuladoras
capaces de promover más infiltración de linfocitos. Las citocinas proinflamatorias (ej. TNF-
α), especies reactivas de oxígeno y enzimas proteolíticas/ lipolíticas también son liberadas por
la activación de la microglia/ macrófagos con lo que se amplifica la activación inicial de las
células T [16].
Existe una vasta evidencia del papel de las células B en la patogénesis de la EM. Las célu-
las B específicas para mielina, que ya se encuentran dentro del SNC, pueden causar desmielin-
ización a través de la deposición de inmunoglobulina (Ig) G y por mecanismos mediados por
el sistema del complemento [17]. Además, exhiben múltiples funciones proinflamatorias y
reguladoras en la patogenia de la EM: i) se diferencian en células plasmáticas y secretan Ig las
cuales procesan antígenos para la activación de células T y/ o la fagocitosis de macrófagos; ii)
actúan como CPA para las células T autoreactivas; y iii) secretan citocinas proinflamatorias y
antiinflamatorias [16].
Durante el curso de la neuroinflamación, la microglia adquiere un fenotipo proinflamatorio.
No está bien esclarecido que la reprogramación proinflamatoria pudiera deberse a citocinas
proinflamatorias (IFN-γ, IL-1β, factor de necrosis tumoral (TNF)-α y GM-CFS) liberadas por
las células T reactivas a la mielina. Los macrófagos son una población no homogénea con
deferentes orígenes y funciones, tal es el caso de los macrófagos derivados de los monocitos
que están involucrados en la destrucción de la mielina, mientras que los macrófagos derivados
de la microglia limpian los restos celulares en la EAE [17].
En la EM, el sistema inmune tanto innato como adaptativo están desregulados y se cree
que las células T CD4+ reactivas a la mielina juegan un papel central en el desarrollo de la
patogénesis de la EM. La inflamación característica de la EM está fuertemente asociada con la
desmielinización y la neurodegeneración en todas las etapas de la EM, pero es más marcada
en la EM de recaída, mostrando correlación con los infiltrados de células T y B. Los eventos
moleculares que se asocian a la desmielinización y a la neurodegeneración son la inflamación
mediada por células Th1/Th17, la activación de la microglia, el estrés oxidativo y la muerte
celular o el daño al ácido desoxirribonucleico (ADN) [17].
6
La función alterada de las células T reguladoras (Treg) y la homeostasis es perjudicial para
la patogénesis de la EM debido a que las células Treg juegan un papel significativo en el control
de las células T autoreactivas e inducen tolerancia periférica a través de mecanismos inmuno-
supresores. Tal desregulación en las células Treg también contribuye a reducir la salida tímica
y/o la proliferación de células Treg defectuosas. Por lo tanto, la pérdida de la tolerancia per-
iférica puede conducir a la activación y proliferación de las células Th1/ Th17 y a la expansión
de las células B autoreactivas. Sucesivamente, estas células se convierten en las iniciadoras de
la enfermedad de EM por la disrupción de la BHE, lo que lleva a la infiltración de las células in-
munes dentro del parénquima del SNC con la subsecuente neuroinflamación, desmielinización
y neurodegeneración [17].
Tradicionalmente la EM ha sido considerada como una enfermedad mediada por células
T CD4+. Entre las células T CD4+ efectoras, las células T helper (Th) han tenido papeles
divididos sobre su diferenciación en células Th1 (proinflamatorias) o Th2 (antiinflamatorias).
El fenotipo Th1 es promovido por la interleucina (IL)-12 y caracterizado por la secreción de
interferon (IFN)-γ, factor de necrosis tumoral (TNF)-α e IL-2, mientras que el fenotipo Th2 es
promovido por la IL-4 y está caracterizado por la secreción de citocinas antiinflamatorias, las
cuales incluyen IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 e IL-13 y el factor de crecimiento transformante
(TGF)-β. El equilibrio entre las poblaciones de células Th dentro del sitio de inflamación es
crítico en la determinación de la evolución de la patología de la enfermedad [6].
1.1.4 Clasificación de EM
La EM se distingue así misma de otras enfermedades neurológicas crónicas por su curso
fluctuante, en el tiempo y en el espacio [18], por lo que, basados en su histopatología y mecan-
ismos de patogenicidad, así como en la evolución clínica de los pacientes, se han identificado
cuatro subtipos. La más común es el tipo remitente recurrente (EMRR) donde las incapaci-
dades neurológicas ocurren de vez en cuando seguidas por una recuperación total o parcial.
En algunos de estos pacientes, las discapacidades neurológicas se acumulan sin una adecuada
recuperación, a esto se le conoce como EM secundaria progresiva (EMSP). Otros pacientes
llevan un curso progresivo de la enfermedad que se manifiesta desde el principio, por lo que
7
es llamada primaria progresiva (EMPP). Existe otra forma de EM, la progresiva recurrente
(EMPR), donde el curso es progresivo combinado con recaídas ocasionales [1, 19].
La vasta mayoría de pacientes con EM (aproximadamente entre el 85-87%) presentan
ataques de recaída-remisión, caracterizada por ataques agudos (recaídas) seguidas de una re-
cuperación total o parcial (remisión), precipitando los déficits clínicos dependiendo de su lo-
calización, casi siempre seguido por la resolución de los signos, síntomas y de las lesiones T2
evidentes en la imagen de resonancia magnética [1, 8, 18]. Se ha estimado que más del 80% de
estos pacientes desarrollarán EM del tipo secundaria progresiva, mientas que un 10% fueron
diagnosticados con EM primaria progresiva y un 5% con EM del tipo recaídas progresivas [8]
(figura 1.3).
Figura 1.3 Distribución de EM
Tipos de EM al momento ser diagnosticada [8].
El curso de la enfermedad es variable entre los sujetos afectados, pero la mayoría de los
pacientes con EM presentan un curso de la enfermedad bifásico que es caracterizado por re-
caídas agudas y la acumulación de déficits neurológicos progresivos irreversibles [2, 6]. Las
recaídas son consideradas como manifestaciones clínicas de las lesiones inflamatorias recur-
rentes agudas desmielinizantes diseminadas por todo el SNC asociadas con el incremento de la
permeabilidad de la BHE y por la infiltración masiva de una población heterogénea de células
y mediadores del sistema inmune [2].
Se ha observado que la fase inflamatoria de la enfermedad es la que caracteriza a los es-
tadíos tempranos, mientras que la neurodegeneración es la consecuencia de las agresiones
repetidas por la inflamación y la desmielinización irreversible comienza a observarse en es-
tados tardíos de la enfermedad [2].
8
Típicamente la enfermedad afecta el cerebro, médula espinal y nervio óptico en el SNC y
los nervios periféricos en el sistema nervioso periférico. Durante una recaída, la inflamación
ocurre en áreas de la materia blanca del SNC denominadas placas. Este proceso es seguido
por la destrucción de la mielina en el cerebro y en la médula espinal, provocando disminución
o pérdida de la función. Un amplio rango de síntomas clínicos incluyen disfunciónmotora,
fatiga, temblores, parálisis aguda, pérdida de la coordinación o equilibrio, dificultad para hablar
o ver y daño cognitivo [20].
1.2 ENCEFALITIS AUTOINMUNE EXPERIMENTAL (EAE)
El modelo de encefalitis autoinmune experimental (EAE) nace de tratar de entender la
patogénesis de la encefalomielitis postvacunación, por ejemplo, después de la vacunación con-
tra la rabia, durante la década de 1920 y 1930 [21]. Por los siguientes 80 años, desde su in-
troducción en monos en 1933, la EAE fue estudiada en muchas especies, incluyendo primates
y roedores, siendo caracterizada por el método de inducción y por el curso de la enfermedad,
algunos modelos se diseñaron para mimetizar específicamente algunos aspectos, por ejemplo,
la desmielinización axonal [21, 22]. Mientras que un modelo no pueda recrear todos los as-
pectos de la EM, los modelos animales son esenciales para el entendimiento de la inducción
y patogénesis de la enfermedad de EM así como en el desarrollo de las estrategias terapéuti-
cas que limitan la progresión de la enfermedad y que eventualmente conducen a tratamientos
efectivos [23].
1.2.1 Definición
La EAE es un desorden autoinmune del SNC inducido experimentalmente. Diferentes
estudios han establecido a la EAE como un modelo adecuado de muchos aspectos de la EM,
por tanto funciona como modelo animal de la EM [24], siendo por mucho el más estudiado
y comúnmente utilizado [23, 25, 26, 27]. Este modelo es utilizado para investigar la posible
etiología de la EM [25], ha sido ampliamente usado para el estudio de las bases moleculares
9
y celulares de la EM [28], así mismo se ha utilizado para validar y evaluar nuevas estrategias
terapéuticas para la EM [23, 28, 29].
1.2.2 Ventajas del modelo EAE
Entre el modelo de EAE y la EM están presentes muchas similitudes a diferentes niveles,
dentro de las que podemos mencionar están las semejanzas clínicas (por ejemplo, la parálisis
e incontinencia) y patológicas (por ejemplo, la desmielinización, la infiltración de células in-
flamatorias en el SNC) con la EM; la susceptibilidad genética y predisposición ambiental; la
oportunidad de probar tratamientos experimentales que tienen riesgo de toxicidad; establecer
experimentos de patogénesis detallados (por ejemplo, los animales pueden ser sacrificados a
diferentes estadios de la enfermedad); se pueden realizar estudios de vías de señalización e
inmunopatogénesis que no serían posibles en humanos; existen modelos de EAE para cada una
de las formas clínicas de la EM, uno de ellos el modelo de EAE de recaída-remisión, en el cual
podemos observar parálisis de miembros posteriores que se intensifica y mengua después de
un ataque inicial [30, 31].
El modelo de EAE es rápido y puede dar perspectivas de si un mecanismo de acción en
particular de un fármaco tiene mérito cuanto se estudia en un modelo que recapitula muchos
aspectos de la enfermedad humana, la EM [31].
1.2.3 Inducción de la EAE
La inducción de la EAE por diferentes antígenos encefalitogénicos o sus péptidos en cepas
de animales susceptibles conducen al desarrollo de varias formas de la enfermedad (aguda,
recaída-remisión o progresiva) que mimetiza los diferentes patrones de la EM [32].
El modelo de EAE típicamente es inducido por una inmunización activa con proteínas
derivadas de la mielina o por péptidos en adyuvante o por una transferencia pasiva de linfoc-
itos T CD4+ activados específicos de mielina [21, 23]. Por tanto, la EAE activa puede ser
inducida por la inoculación del homogenado de médula espinal o con diferentes proteínas o
péptidos del SNC emulsificados en adyuvante completo de Freund. Las proteínas/ péptidos
comúnmente usados para inducir EAE son proteínas que conforman a la mielina e incluyen a
10
la proteína básica de mielina (PBM), proteína proteolípida de mielina (PLP) y la glicoproteína
oligodendrocítica de mielina (MOG) [24, 25, 33].
En todos los modelos descritos de EAE, la enfermedad está caracterizada por la disrupción
de la BHE, infiltrado perivascular dentro del SNC y parálisis [24]. La EAE puede ser inducida
activamente por inmunización para ser estudiada en especies de animales susceptibles [28, 33],
incluidos la rata, ratón, conejo, cobayo y monos [25]. A pesar de que el modelo de EAE
en ratón es el más utilizado como modelo de la EM, la EAE en rata también ha provisto de
novedades significativas en la patología de la EM. En el modelo de rata de EAE, la enfermedad
consiste en la infiltración de células mononucleares inflamatorias dentro de la médula espinal,
cerebelo y tronco cerebral, pero no en la corteza [23].
1.2.4 Patogénesis de la EAE
Varios grupos de investigación han realizado estudios del curso de la enfermedad de la
EAE, encontrando evidencia de que se trata de un proceso en el que están involucrados varios
pasos que median la infiltración de células T y macrófagos al SNC produciendo el proceso
inflamatorio. Las células T autoreactivas y las células B autoreactivas son activadas en los
órganos linfoides que drenan los sitios en los cuales el antígeno en adyuvante es inyectado. Se
ha mapeado las rutas migratorias de las células T autoreactivas. Antes de entrar en el SNC,
las células T autoreactivas se reúnen en el bazo donde sufren cambios de fenotipo. Después
interaccionan con las CPA del SNC y sólo aquellas células T que reconozcan los antígenos
presentados localmente tienen permiso para atravesar la BHE [15, 26].
Inicialmente la migración dentro de los sitos de inflamación por las células T comienza con
el anclaje y rodamiento por los vasos, después se adhieren y migran fuera de la vasculatura
en la BHE [27]; existen rutas alternativas que pueden ser tomadas para atravesar la BHE,
tales como la vía del plexo coroideo y LCR o la vía de las vénulas postcapilares [15, 26].
La interacción de las células T con las CPA locales, como la microglia, inicia una cascada
compleja de eventos fisiopatológicos que conducen a la formación de las lesiones de la materia
blanca y de la materia gris. Finalmente se da el drenaje de restos celulares del SNC, de los
11
Figura 1.4 Mecanismo patogénico propuesto de EM
Las células T autoreactivas pudieran ser reclutadas de los órganos linfoides periféricos y después migrar a través de la BHE
para ser reactivados en el SNC, donde la cascada de inflamación es iniciada provocando el posterior daño a la mielina y
a los axones. Alternativamente, la degeneración axonal y oligodendroglia pudiera ser seguida por el proceso autoinmune
inflamatorio. Tomada de Mix, E. Progress in Neurobiology. 92, 386-404 (2010) [34].
antígenos liberados de las lesiones provocadas a través de los fluidos intersticiales y del LCR a
los nódulos linfáticos del SNC [15, 26] (figura 1.4).
La EAE está mediada predominantemente por células T autoreactivas CD4+ específicas del
SNC; las células T CD8+ específicas de mielina también puede jugar un papel en la supresión
y regulación de las células T o en las células T efectoras en la patogénesis de la EAE. Por lo
tanto, ambas poblaciones, las células T CD4+ y CD8+, intervienen en la patogénesis de la EAE
y están presentes en las lesiones de la EAE y de EM [25].
12
La activación de los macrófagos/ microglia domina la escena patológica temprana en el
curso de la enfermedad de EAE. La microglia actúa como CPA y es la responsable de la sub-
secuente activación e infiltración de las células T. Además, la microglia fagocita la mielina
estimulando la inducción de células T CD4+ autoreactivas [26].
La reacción inflamatoria en el SNC se desencadena por la inducción de células T autore-
activas las cuales se introducen al cerebro [26]. Durante la activación de las células T, la
producción de citocinas y quimiocinas influencia el microambiente local y finalmente deter-
mina la respuesta funcional del sistema inmune, así como la diferenciación de las células T
CD4+ naive en células Th1 con fenotipo proinflamatorio pudieran iniciar la autoinmunidad en
el SNC [21]. La vulnerabilidadde la médula espinal y la progresión de las lesiones de manera
caudal a rostral en la EAE se han atribuido al incremento en la permeabilidad de la BHE y a la
susceptibilidad del motor distal y de las fibras sensoriales para mediar la desmielinización por
los macrófagos/ microglia [26].
1.2.5 Curso clínico de la EAE
Los signos clínicos de la EAE incluyen pérdida de peso, ataxia, incontinencia, flacidez,
espasticidad o parálisis de las extremidades posteriores ascendentes [25, 35]. Las lesiones en
EAE están caracterizadas por inflamación y frecuentemente por desmielinización [25] (figura
5).
1.3 TEJIDO CEREBRAL DE INTERÉS
1.3.1 Líquido cefalorraquídeo (LCR)
La anatomía del SNC es compleja por lo que, a groso modo, puede ser dividida en los sigui-
entes compartimientos: fluido extracelular cerebral, parénquima cerebral y sistema ventricular.
El sistema ventricular ha sido considerado como la vía de comunicación de las cavidades a
través de LCR; está subdividido en ventrículo lateral derecho e izquierdo, tercer ventrículo, el
acueducto cerebral, el cuarto ventrículo, la cisterna magna y el espacio subaracnoideo [36]. El
LCR funciona como un amortiguador para el cerebro y la médula espinal dentro del cráneo y la
13
Figura 1.5 Curso clínico de la EAE
Las ratas desarrollan la enfermedad de EAE asociada con un comienzo agudo y una recuperación espontánea, que lleva
semejanza con los signos clínicos vistos en la EM de recaída-remisión. Modificada de Baker, D. ACRN. 6, 10-12 (2007)
[29].
columna vertebral. Así mismo actúa como medio de transporte de neuropéptidos, aminoácidos
neurotransmisores, señales hormonales biológicas y de comportamiento [37].
El LCR es producido y eliminado constantemente. Provee una circulación continua que
actúa como un sistema de drenaje cerebral. Bajo condiciones normales una rata tiene una tasa
de producción de 2.2µL/ min, siendo el volumen total de 250µL. La mayor parte del LCR se
produce en los plexos coroideos y en los ventrículos laterales [36].
Diversas técnicas se han desarrollado para la obtención del LCR de las ratas, dentro de
las que podemos mencionar la implantación de una cánula o catéter en la zona ventricular, la
14
punción lumbar dentro del espacio intratecal, la recolección de LCR percutánea en animales
anestesiados o asfixiados y por punción directa en cisterna magna [37, 38].
1.4 CITOCINAS Y SISTEMA NERVIOSO
Hasta hace pocos años se manejaba el concepto de que el SNC era un sitio “inmunológica-
mente privilegiado”, actualmente se propone que el SNC es un sitio con inmunidad selectiva
y modificada [39, 40]. Aunque el estatus de privilegio fue originalmente reconocido en el
contexto de la respuesta inmune adaptativa, ahora se ha demostrado que esta regulación se
extiende también a componentes de la respuesta inmune innata, que a su vez funciona como
primera línea de defensa en contra de un amplio rango de agentes tóxicos e infecciosos [39].
Todos estos estos mecanismos son mantenidos por sistemas de interacciones célula-célula y por
la liberación de mediadores solubles que se encargan de “mediar” las respuestas del sistema
inmune a nivel central a través de las citocinas [39, 42].
Las células de la línea mieloide son participantes activos en múltiples procesos y estados pa-
tológicos del SNC, incluido el daño a tejidos, desórdenes neurodegenerativos y enfermedades
autoinmunes como la EM [43, 44].
Actualmente existe evidencia de que el efecto de las citocinas no es el mismo en todas
las áreas del SNC; por ejemplo, se ha demostrado que una inyección local del antagonista del
receptor de IL-1 (IL-1Ra) en el giro dentado y en la región CA3 del hipocampo conduce a
una reducción en el estado febril de las ratas en respuesta a la administración periférica de
lipopolisacárido bacteriano (LPS), mientras que esta misma molécula, la IL-1Ra, no muestra
efectos sobre la región CA1 del hipocampo [42, 44, 45].
Las citocinas pueden ejercer su efecto a nivel de SNC de manera directa o indirecta; una
acción directa por las mismas citocinas presentes en el cerebro sobre o alrededor de células
neuronales o a través de la inducción de efectos secundarios resultado de la acción de citocinas
sobre células o grupos de células blanco [45]. Las citocinas que pueden afectar directamente
al SNC pueden tener dos posibles orígenes (figura 1.6):
15
1. Citocinas que se originan en órganos inmunes periféricos y que cruzan la BHE, las citoci-
nas alcanzan el SNC cruzando áreas carentes de BHE como es el caso de los órganos
circunventriculares, aún en condiciones de homeostasis y niveles basales [45].
2. Citocinas que son producidas dentro del SNC por neuronas y células de la glia, en nive-
les basales o en respuesta a infecciones, inflamación, isquemia - reperfusión, trauma
craneoencefálico y otro tipo de daño; se ha propuesto que estas citocinas participan en
complejas respuestas autónomas, neuroendócrinas, metabólicas y de comportamiento
[45, 47].
3. No existe a la fecha mucha información sobre la manera en que contribuye el tráfico
de células inmunes en el cerebro con la consecuente señalización por la activación de
citocinas proinflamatorias y las consecuencias en el comportamiento; por ejemplo, la de-
presión es una condición de comorbilidad altamente prevalente en pacientes con EM. En
el modelo de EAE en roedores se ha asociado la liberación de citocinas proinflamatorias
con signos claros de enfermedad y comportamientos depresivos [47].
1.4.1 Interleucina 1β
La interleucina 1 (IL-1) es una citocina producida por múltiples estirpes celulares, princi-
palmente por macrófagos activados y en el SNC por células de la microglia activada [48, 49,
50]. La IL-1 existe en dos formas principales, la IL-1α y la IL-1β. La IL-1β juega un papel
importante en una gran variedad de enfermedades agudas y crónicas y se la ha considerado
como potente mediador de respuestas a infección y daño [48, 51].
Un incremento en la producción de IL-1β se ha reportado en pacientes con procesos in-
fecciosos, inflamación, trauma, enfermedades isquémicas, tumores, coagulación intravascular,
desórdenes autoinmunes (EM y lupus), enfermedades de rechazo de injerto y en sujetos sanos
después de realizar un ejercicio intenso [51, 52].
La microglia es capaz de liberar citocinas proinflamatorias en el caso de la respuesta a
infecciones y daño. En el caso de la microglia fetal [40].
16
Figura 1.6 Eje hipotálamico-pituitario-adrenal (HPA).
Existen 3 maneras en las que los mediadores del sistema inmune alcanzan el hipotálamo y la glándula pituitaria. La primera,
el hipotálamo es señalizado a través del núcleo autonómico del tronco cerebral, el cual tiene proyecciones al hipotálamo.
Entonces, las fibras eferentes, particularmente el nervio vago, contribuyen a la atenuación de la inflamación y en resumen
a la homeostásis. La segunda, los mediadores inflamatorios liberados en la sangre desde los tejidos pueden alcanzar la
circulación portal en la eminencia media, localizada fuera de la BHE. Los mediadores son transpotados dentro de las
estructuras cerebrales, a través de las áreas carentes de BHE. La tercera, la inflamación sistémica puede causar rompimiento
de la BHE, facilitando el tráfico de citocinas a las estructuras cerebrales profundas [46]
Existen receptores para IL-1β en varias regiones del cerebro, con altos niveles de expresión
en hipocampo e hipotálamo. El principal mediador de la señalización a través de la IL-1 en el
SNC es el receptor tipo I de la IL-1 (IL-1R1), el cual inicia la cascada de eventos intracelulares
de señalización después de su unión a IL-1β. Se ha observado también la presencia del receptor
tipo II (IL-1R2) en SNC; presenta la misma afinidad por la IL-1β que el tipo I, pero carece de
la habilidad para inicial la cascada de eventos de transducción de señales y solamente sirve
como un receptor señuelo atenuando la señalización inducida por la IL-1 [42, 53].
17
Se ha demostrado que a nivel centralla IL-1β exhibe una amplia variedad de efectos, se
encuentra implicada en procesos centrales de regulación de fiebre, patrones de sueño de ondas
lentas, supresión de apetito en núcleos hipotalámicos y en procesos neurodegenerativos [42].
La IL-1β, junto con otras citocinas como TNF-α, IFN-γ y TGF-β1, se encuentra direc-
tamente involucrada en la modulación de la astrogliosis reactiva, la administración de IL-1β
en el cerebro de mamíferos induce una potente respuesta inflamatoria y de astrogliosis reac-
tiva [39, 42]. Se ha demostrado que en ratones deficientes de IL-1β los astrocitos fallan en
sobreregular la expresión del factor neurotrófico ciliar (CNTF) después del daño en el SNC,
además de que se ha implicado a esta misma citocina en la inducción de expresión de factor de
crecimiento nervioso (NGF) por los mismos astrocitos. En este caso la IL-1β induce la expre-
sión de un subtipo de genes asociados con el crecimiento y la supervivencia glial y neuronal,
entre los que se incluye a IL-6, CNTF y NGF [39].
La IL-1β es capaz de activar al eje hipotalámico-pituitario-adrenal (HPA) induciendo la lib-
eración de hormona liberadora de corticotropina (CRF), hormona adrenocorticotropa (ACTH)
y de corticosterona, esta última tiene un efecto de retroalimentación negativa sobre la produc-
ción de citocinas proinflamatorias; esto es un ejemplo de los mecanismos de regulación a la
baja mediados por la actividad de IL-1β y de IL-1R [54].
La gran mayoría de los desórdenes neurológicos y neurodegenerativos va acompañado de
un componente inflamatorio, de activación glial y liberación de citocinas como la misma IL-
1β. Esto sucede bajo condiciones agudas como el daño traumático cerebral y en padecimientos
crónicos como la enfermedad de Alzheimer, epilepsia, esclerosis lateral amiotrófica y enfer-
medad de Parkinson; así como en enfermedades autoinmunes como EM, miastenia gravis y
síndrome de Guillan-Barré [48, 54].
La IL-1β junto con citocinas como TNF-α, IL-6 e IL-12 controlan procesos infecciosos y
regulan la producción de proteínas de fase aguda y el aumento de temperatura corporal [54, 55,
56].
Un número importante de estudios indican que el estrés es capaz de regular a la baja re-
spuestas del sistema inmune como proliferación de linfocitos, actividad de células natural killer
18
(NK) y producción de citocinas como el IFN-γ, entre otras [55, 56]. La IL-1β tiene la ca-
pacidad de mediar la respuesta inmunológica y psicológica al estrés, ya que esta citocina se
ha asociado con la modulación de sistemas de regulación y control como el eje HPA y el
eje simpato-adreno-medular (SAM), regulando la actividad de estos, el proceso de compor-
tamiento y la plasticidad neuronal; lo que indica que esta citocina puede funcionar como un
mediador de respuestas adaptativas ante el estrés y se le puede asociar con respuestas neuro y
psicopatológicas relacionadas con estrés [55].
La IL-1β participa en la neuromodulación bajo condiciones que no necesariamente involu-
cran al sistema inmune, se ha demostrado que los agentes estresores de tipo psicológico son
capaces de activar el sistema IL-1 y que la activación del eje HPA por esta citocina no ocurre
solamente durante procesos de enfermedad, sino también en respuesta a agentes estresores psi-
cológicos. El resultado fisiológico y en el comportamiento inducido por la IL-1β vía activación
inmune y/o estrés psicológico es muy semejante e incluye, en los dos casos, activación sim-
pática (eje SAM), activación del eje HPA, fiebre, síntomas de sickness behavior, alteraciones
en el ciclo de sueño y una reducida actividad exploratoria, social y sexual. Por otro lado,
los agentes estresores físicos y psicológicos son capaces también de activar componentes del
sistema inmune periférico, como la elevación en los niveles de proteínas de fase aguda, acti-
vación de macrófagos, incrementos en el conteo de células blancas circulantes y de los niveles
de citocinas en el suero [55].
En regiones cerebrales que forman parte del eje HPA como el hipotálamo y la glándula
pituitaria, el incremento en los niveles de IL-1β después de un estímulo de estrés es inmediato,
mientras que en otras regiones del sistema nervioso como el núcleo del tracto solitario y en el
hipocampo, este incremento en los niveles de la citocina aparecen al menos 24 horas después
de que finalizó el estímulo estresante [55].
Los agentes estresantes considerados como leves o moderados también son capaces de
activar el sistema de IL-1β cuando son administrados o aplicados de manera crónica, el estrés
por frío eleva la expresión del gen de IL-1β en varias áreas cerebrales (área preóptica medial,
eminencia media, hipotálamo), pero no en otras zonas como la corteza cerebral y el hipocampo;
solamente se eleva en estas últimas áreas cuando es aplicado durante al menos una semana,
19
cinco semanas de estrés moderado crónico inducen la liberación de IL-1β a nivel central y
periférico [55]. Por otro lado, se ha demostrado que también ciertos tipos de estrés crónico
social pueden inducir la reducción en los niveles de la citocina en el mismo hipocampo [57]. El
patrón de activación de IL-1β en el SNC es estresor específico, el aislamiento social incrementa
los niveles de la citocina en áreas sensibles al estrés, como el hipocampo y el hipotálamo, pero
no en la glándula pituitaria [55].
Posterior a una exposición a agentes estresores del tipo inmunológico la IL-1β periférica
puede tener influencia directa sobre núcleos del tallo cerebral como el núcleo del tracto solitario
(NTS), el locus coeruleous (LC) y el núcleo ventrolateral medular (VLM), así como también
puede arribar al hipotálamo vía órganos circunventriculares. La IL-1β periférica puede acti-
var vías eferentes vagales que inervan al NTS y al VLM, estos núcleos proyectan conexiones
al VLM, estos núcleos proyectan conexiones al hipotálamo, el cual induce la liberación de
norepinefrina. Ésta a si vez promueve un incremento importante en los niveles de IL-1β, posi-
blemente vía activación microglial; se elevan los niveles de la citocina y estimula a neuronas
CRH-hipotalámicas [55].
Se ha sugerido que, en condiciones fisiológicas de homeostasis, niveles bajos de IL-1β
promueven respuestas adaptativas a eventos de estrés, mientras que bajo condiciones de daño
severo y de estrés crónico esta misma citocina es capaz de provocar severas alteraciones
cognoscitivas y emocionales asociadas con respuestas de estrés [55, 58].
Otros de los sistemas alterados en pacientes con EM relacionados con citocinas proinflama-
torias como IL-1β, es el sistema inhibitorio del ácido γ-aminobutírico (GABA) en el cerebro;
la enzima ácido glutámico descarboxilasa (GAD) sintetiza GABA; el receptor a GABA y sus
subunidades y el transportador de recuperación de GABA (GAT) se encuentran alterados en
lesiones crónicas de EM en corteza motora, a nivel de transcritos de genes y de expresión pro-
teica. La alteración de estas subunidades en EM y en EAE conlleva a cambios funcionales
en los receptores y en la transferencia de señales. La desregulación de moléculas en la vía de
señalización de GABA en EM y en EAE pudiera ser la causa, la consecuencia o solamente
estar correlacionada con el proceso de la enfermedad y relacionada con el infiltrado de células
inmunes y los niveles elevados de citocinas proinflamatorias [59].
20
Los estudios en modelos animales de desórdenes neurodegenerativos muestran anormali-
dades en la transmisión sináptica, como el primer paso de la cadena de eventos que conduce a
la muerte neuronal. En la EM, la frecuencia de episodios inflamatorios en estadios tempranos
de la enfermedad se ha correlacionado con la posterior neurodegeneración y el curso clínico
progresivo [60].
Como se ha mencionado anteriormente, en la EM y en su modelo, la EAE, la neurodegen-
eración está precedida por un proceso inflamatorio que induce incremento en la transmisión
glutamatérgica y posteriormente genera exitotoxicidad[60, 61].
Mediadores inflamatorios como las citocinas TNF-α e IL-1 β son capaces de aumentar de
manera significativa la transmisión glutamatérgica [58, 59, 61].
El incremento en los niveles de glutamato y el proceso inflamatorio llevan a un desarrollo de
neurodegeneración en la EM. La sobre reactividad del glutamato en sus receptores ionotrópi-
cos y metabotrópicos contribuye al daño y la patología neuronal y oligodendrial en la EM, así
como en la EAE. La inflamación focal provoca lesiones que incrementan la actividad de la
IL-1β, que tiene influencia sobre procesos de transmisión mediada por glutamato y difunde al
sistema de circulación del LCR. El incremento del glutamato por sobreestimulación de recep-
tores AMPA en el LCR “inflamado” provoca un daño neuronal irreversible, sugiriendo que la
inflamación cerebral en EM provoque aumento en la transmisión glutamatérgica y encontrán-
dose involucrado el proceso neurodegenerativo que acompaña a esta enfermedad [60].
Se ha demostrado que la IL-1β está íntimamente asociada con un incremento en la seña-
lización glutamatérgica en EM y en EAE, pero además se sabe que otros mediadores solubles
como TNF-α e IFN-γ son liberados en respuesta a la infiltración linfocitaria y potencialmente
contribuyen a provocar alteraciones en la excitabilidad sináptica y a la excitotoxicidad [60].
1.4.2 Interleucina 12
La interleucina 12 (IL-12) es una citocina producida por células accesorias como macrófa-
gos y células dendríticas, la cual es activada por diferentes microorganismos, por productos de
microorganismos o por células T [62, 63]. La IL-12 se encuentra implicada en la activación de
las mismas células que la producen, macrófagos y células dendríticas, junto con otra citocina
21
de la familia de la IL-12, la IL-23. El efecto autocrino de estas citocinas sobre los macrófagos
específicamente pudiera tener que ver con su habilidad para modular y controlar infecciones
parasitarias [62].
La IL-12 fue descubierta en 1989 y se le denominó como factor estimulador de células NK
(NKSF), en 1990 otro grupo la denominó como factor de maduración de linfocitos citotóxicos
(CLMF)[62].
La IL-12 fue la primera citocina con estructura heterodimérica descubierta. Está compuesta
por dos subunidades, p35 y p40, que están unidas covalentemente; cada subunidad es expresada
por su propio gen y están localizadas en diferentes cromosomas [62]. La IL-12 está involucrada
con la familia de la IL-6, aunque la IL-12 tiene su propia familia, comparte alguna de sus
subunidades con otras citocinas de su propia familia, como la IL-23 (p40p19) y con la IL-
27 (p40p28). Todos los miembros de la familia son producidos y activados por macrófagos
y células dendríticas, que funcionan como CPA, pero la expresión de las subunidades p35,
p19 y p28 se ha encontrado en diferentes tipos celulares, mientras que la transcripción de p40
se restringe solamente a CPA. La coexpresión de ambas cadenas de IL-12, IL-23 e IL-27 en
una célula es requerida para generar una forma bioactiva de cualquiera de los miembros de esta
familia [60]; en otras palabras, para la generación de la molécula bioactiva IL-12p70 (p40+p35)
ambos genes de las subunidades deben expresarse en la misma célula [62, 63].
El receptor de IL-12 (IL-12R) es una molécula compuesta por dos cadenas, β1 y β2, que
fue inicialmente descubierto en la superficie de las células T y NK. Sin embargo, gracias a la
actividad autocrina de esta citocina se ha observado que los macrófagos y las células dendríticas
expresan IL-12R [62]. Ambos receptores, IL-12Rβ1 e IL-12Rβ2, poseen cadenas que son
miembros de la familia de receptores tipo 1 de citocinas, y están íntimamente relacionados con
la glucoproteína gp130, la cadena β del receptor de la superfamilia de citocinas de la IL-6 [62].
En relación con la transducción de señales, la IL-12 induce, vía sus complejos de receptores
IL-12Rβ1/β2, la fosforilación de la cinasa janus JAK2 y TYK2, las cuales a su vez activan al
transductor de señales y activador de transcripción (STAT). STAT-4 es esencial para los efectos
específicos celulares de la IL-12 [63, 64]. Hasta ahora se han identificado en la familia de
la IL-12 al menos cuatro proteínas JAK (JAK1 y JAK2, además de TYK-1 y TYK-2) y siete
22
STAT (STAT-1, STAT-2, STAT-3, STAT-4, STAT-5a, STAT-5b y STAT-6) [62, 63, 64]. Después
de unirse a su receptor la IL-12 activa la fosforilación de STAT-4, lo que a su vez induce la
expresión de otra molécula de señalización, T-bet (Tbx-21), que funciona como un regulador
maestro de la diferenciación de células Th1. Estas células Th1 liberan IL-2 e IFN-γ; esta última
citocina es considerada como un mediador importante en proceso de autoinmunidad [64, 65].
Se ha descrito un importante papel de la IL-12 en actividades antitumorales y antimetásicas
[62, 66]; esta actividad está asociada con la capacidad de la IL-12 para inducir la producción de
IFN-γ [66]. Como se mencionó anteriormente, la IL-12 tiene efectos autocrinos sobre macrófa-
gos y células dendríticas; además de inducir la síntesis y liberación de IFN-γ por células Th1,
induce la producción de NO por los macrófagos en respuesta a lipopolisacárido bacteriano,
además de que sobreregula la presentación antigénica [62, 66].
La IL-18, una citocina secretada por macrófagos fue originalmente designada como “factor
inductor de IFN-γ”, actúa sinérgicamente con la IL-12 para estimular la producción de IFN-γ
por células T, células NK, células B, macrófagos y células dendríticas. Aunque la IL-18 per
se no induce la producción de IFN-γ por los macrófagos, se obtiene una respuesta óptima de
la IL-12 en presencia de IL-18. Se ha demostrado que la IL-12 induce la expresión de ARNm
de IFN-γ en macrófagos, pero la IL-18 es esencial para la traslocación nuclear de STAT-4, que
culmina con la secreción de IFN-γ [62]. Sorprendentemente, la citocina tipo Th2 se sinergiza
también con la IL-12 para inducir la producción de IFN-γ por las células dendríticas pero por
una vía de transducción de señales independiente de p38 [62].
Otras citocinas como IFN-α y TGF-β regulan negativamente los efectos autocrinos de la
IL-12. IFN-α regula a la baja la expresión del IL-12R en macrófagos; TGF-β inhibe la síntesis
de la misma IL-12 e interfiere con la producción endógena de IFN-γ, lo que reduce la actividad
microbicida de los macrófagos [62, 99, 66, 67].
Aunque la IL-12 es una citocina importante en la respuesta del huésped, una sobreex-
presión de la IL-12 provoca un estado de inflamación persistente que conduce a desórdenes
autoinmunes como la EM [67]. IL-12 e IL-23 comparten atributos estructurales y funcionales,
23
ambas son capaces de inducir síntesis y liberación de IFN-γ; una expresión aberrante de IL-
23p19 puede resultar en una severa inflamación, lo que sugiere que la IL-23 juega también un
papel importante en el desarrollo y el mantenimiento de inflamación autoinmune [67, 68].
En la EAE se ha descrito que la IL-23 es esencial como efector de mecanismos de infla-
mación locales y la IL-12 contribuye en la expresión de la enfermedad al promover el desar-
rollo de un fenotipo Th1 [64, 68, 69], por la liberación de IFN-γ en el SNC; esta última citocina
puede llegar a modular la viabilidad de diferentes tipos celulares en el sistema nervioso, como
neuronas, astrocitos, oligodendrocitos y microglia [64].
Además de promover la diferenciación de células T, la IL-12 promueve su migración den-
tro del SNC por sobreregulación de moléculas de adhesión como el ligando glucoproteico
p-selectina y el receptor de quimiocinas CCR5, así como de otros ligandos/ receptores como
CCL3/ MIP-1α, que son expresados en SNC en estadios tempranos de EAE [68, 69].
Aunque la IL-12 incrementa el potencial encefalitogénico de las células T, no es esencial en
la enfermedad desmielinizante, los ratones deficientes en IL-12p35 son capaces de desarrollar
EAE [68]. El IFN-β altera el balance de IL-12/ IL-10 en EAE y en la EM, IFN-β suprimea
la IL-12 sobreregulando la producción de IL-10. En ratones el IFN-α/β inhibe la producción
de IL-12 por leucocitos esplénicos e inducen la secreción de IL-10 por linfocitos y monocitos
[69].
1.4.3 Factor de necrosis tumoral alfa
El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) pertenece a la superfamilia de los factores de
necrosis tumoral y se encuentra íntimamente relacionado con la promoción de señales inflama-
torias [70, 71]. Bajo condiciones fisiológicas de normalidad el TNF-α “orquesta” un número
importante de funciones involucradas en supervivencia y defensa inmune, homeostasis celular
y protección contra padecimientos neurológicos [72].
El TNF es capaz de unirse a dos receptores diferentes, el receptor 1 (TNFR1, Tntrs1a) y
el receptor tipo 2 (TNFR2, Tntrst1b). Estos dos receptores difieren en su perfil de expresión,
afinidad de ligandos, estructura de la cola citoplasmática y vía de activación por señalización
“corriente abajo”. TNFR1 es expresado por la mayoría de los tipos celulares y puede ser
24
activado por TNF soluble (solTNF) o transmembranal (tmTNF), preferentemente por solTNF;
mientras que TNFR2 es expresado primariamente por células del sistema inmune, incluida la
microglia y preferentemente activado por tmTNF [70]. TNFR1 contiene un dominio de muerte
(DD) citoplasmático, característico de muchos de los miembros de la superfamilia de TNF, que
permite el ensamblaje de TNFR1A toda una serie de moléculas de señalización que conforman
la cascada de eventos relacionados con apoptosis [71, 72].
La señalización vía TNF en el SNC exhibe importantes funciones, entre las que se incluyen
el daño mediado por activación de la microglia, activación de astrocitos, regulación de la per-
meabilidad de la BHE, respuestas febriles, transmisión glutamatérgica, plasticidad sináptica y
mecanismos de plasticidad homeostática postsináptica, entre otros [70]. Específicamente en
el sistema nervioso en TNF exhibe roles divergentes, el patrón diferencial de localización de
receptores a esta citocinas en neuronas y células gliales, su perfil de expresión, el estado de
activación celular y los efectos “corriente abajo” que activa son cruciales para determinar el
papel del TNF, si va a tener un papel protector o citotóxico [39, 42, 70, 73].
El TNF-α puede ser inducido posterior a un daño cerebral y promover neuroinflamación
y neurodegeneración. Niveles elevados de esta citocina se han asociado con efectos y estados
patológicos en una variedad importante de enfermedades infecciosas, neurológicas, degenera-
tivas y en condiciones de neurotoxicidad [39, 70, 72]. En pacientes con EM se han observado, a
la autopsia, niveles elevados de TNF-α en los sitios específicos de lesión y se ha reportado que
los niveles de esta citocina se encuentran elevados en el LCR y en suero de pacientes con EM,
en comparación con individuos sanos y esto se ha correlacionado con la severidad de lesiones.
Existe evidencia de un incremento importante en los niveles de TNF-α en pacientes con EM,
justamente antes de un periodo de exacerbación de los síntomas, comparado con los niveles de
la misma en pacientes en remisión; específicamente se ha observado que la sobreexpresión de
TNF-α puede conducir a una enfermedad de tipo desmielinizante [70, 72].
Los mecanismos a través de los cuales el TNF-α puede mediar sus efectos tóxicos en el
SNC, incluyen:
25
1. Estimulación de células endoteliales y la alteración en la integridad de la BHE, lo cual
promueve la adhesión de células inmunes y su infiltración hacia el parénquima cerebral
dañado [72].
2. La estimulación de cascadas apoptóticas en células endoteliales microvasculares cere-
brales [72].
3. El TNF-α activa a células de la microglia disparando un círculo vicioso de estrés oxida-
tivo y liberación de citocinas proinflamatorias [72].
4. Induce la modulación de la expresión de componentes de MHC en neuronas y astrocitos
se vuelven más vulnerables a la toxicidad de células T [72].
5. Potenciación de la toxicidad mediada por glutamato, TNF-α previene la captura y recap-
tura de glutamato desde el espacio extracelular [72].
6. TNF-α induce un incremento en el edema vasogénico en el parénquima cerebral [72].
7. Induce la modulación de iones y liberación de calcio intracelular [72].
8. Interfiere con la regulación de potenciales de membrana y con procesos de potenciación
a largo plazo [72].
Por otro lado, existe evidencia de que el papel de esta citocina no es estrictamente neurotó-
xico [72], además de su papel en el mantenimiento de la homeostasis en SNC, se ha demostrado
que el TNF-α puede ejercer un papel clave sobre la diferenciación, proliferación y crecimiento
de algunas células del sistema nervioso. Esta citocina promueve la remielinización en modelos
experimentales de desmielinización y exhibe funciones de protección contra el daño cerebral
[72, 74]. El TNF-α promueve la supervivencia de oligodendrocitos facilitando de esta manera
la remielinización. Protege de la muerte neuronal inducida por β-amiloide, el mecanismo pro-
tector se atribuye a su papel regulador en la generación de peróxido, la acumulación de calcio
y la activación del factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B
activadas (NFκB) y de vías antioxidativas [56, 72, 75].
26
Esta citocina juega un papel importante de tipo neuroprotector en procesos de excitoto-
xicidad de neuronas corticales mediada por sobre expresión de receptores NMDA, la cual es
abolida por TNF-α. Además de conferir neuroprotección en respuesta a neurotoxicidad por
óxido nítrico (NO) [72].
Mientras que, elevados niveles de TNF-α se asocian con neuroprotección contra el daño
excitotóxico en hipocampo, la pérdida de una expresión aumentada de TNF-α en el hipocampo
se ha asociado con un daño significativo por inducción química en esta área del SNC [72].
Estos efectos paradójicos sugieren que el TNF-α es capaz de mediar efectos diferenciales
en áreas específicas del cerebro, que tienen un papel específico para cada región cerebral.
Promueve la degeneración en cuerpo estriado mientras que protege contra la degeneración
neuronal en el hipocampo [72].
Los mecanismos a través de los cuales TNF-α puede mediar sus efectos neuroprotectores
incluyen:
1. La activación de la astroglia y la estimulación, por estas células de factores neurotróficos
[72].
2. La activación de los procesos de reparación de nervios periféricos y de microvasculatura
cerebral [72].
3. Estimulación de las sinapsis existentes, y de esta manera mediar en el proceso de plasti-
cidad neuronal [72].
4. Activación de la vía de NFκB [72].
5. Inducción de factores antiapoptóticos como Bcl-2 [72].
6. Inducción de vías de defensa antioxidante mediadas por ceramidas [72].
7. Regulación de los niveles de calcio extracelular [72].
En relación a los papeles de neurotoxicidad y neuroprotección del TNF-α existen datos
que indican que las funciones paradójicas de esta citocina son el resultado de una activación y
estimulación simultánea de vías de muerte y de supervivencia celular. Mientas que los niveles
27
basales fisiológicos de TNF-α no son necesariamente indicativos de su función neurotóxica vs
neuroprotectora, las diferencias en la activación y en la expresión de receptores a TNF-α y los
efectores corriente abajo si pueden establecer diferencias en cuanto a su función; los patrones
de expresión diferencial de receptores a TNF en neuronas y en glia determinan si es citotóxico
o neuroprotector. Otro factor asociado a este efecto dual del TNF es la heterogenicidad en la
distribución, morfología y activación de la microglia en diferentes áreas del SNC. La neuro-
toxicidad dopaminérgica estriatal está asociada con activación microglial y con la liberación de
TNF-α por estas células, el TNF-α induce generación de terminales nerviosas dopaminérgicas
a través de la señalización vía receptores de TNF localizados en terminales dopaminérgicas.
La deficiencia de receptores a TNF suprime