Informe de laboratorio Morfología y tinción bacteriana

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LABORATORIO DE INFECTOLOGÍA
 
 
MORFOLOGÍA Y TINCIÓN BACTERIANA
 
 
INTEGRANTES:
MARÍA GABRIELA SIERRA DIAZ | 
MARIA ISABEL GUARDIAN VEGA | 
LEONARDO FABIO CUELLO MIER | 
HILLARY IVETTE PARADA OROZCO | 
STEBAN TORO VERDOOREN | 
 
 
DOCENTE: YICETH ACOSTA
 
 
MEDICINA
 
UNIVERSIDAD DE SANTANDER
SEDE VALLEDUPAR
2022
Introducción
La morfología, definida por el tamaño, la forma, el arreglo y la estructura es una de las características más importantes de las bacterias. Según la forma se pueden clasificar como cocos, teniendo forma redonda, bacilos en forma cilíndrica y espirilos los que tienen forma de espirales.
Las células no teñidas son prácticamente transparentes, pero pueden observarse al microscopio de luz haciendo preparaciones en la lámina con la tinción de Gram y de este modo determinar sus características morfológicas.
La tinción de Gram es un procedimiento de laboratorio ampliamente utilizado en microbiología para diferenciar y clasificar bacterias en función de sus características de pared celular. Fue desarrollada por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram en 1884 y sigue siendo una herramienta esencial en el diagnóstico y clasificación bacteriana. El procedimiento implica una serie de pasos que permiten dividir a las bacterias en dos grandes grupos: las bacterias Gram-positivas y las Gram-negativas.
La pared celular presente en las bacterias es una estructura rígida y funciona como un exoesqueleto para estas, les da forma, permite que la bacteria no se rompa por presiones osmóticas y que siga manteniendo su forma a pesar de las presiones. Es el 25% del peso en seco de la célula y está compuesta por peptidoglicano. 
Ahora bien, existen diferencias importantes en la pared celular de las bacterias Grampositivas y las Gramnegativas, una de las principales diferencias es el grosor de la pared de peptidoglicano ya que en las bacterias Grampositivas es mucho más gruesa (de 50 a 100 capas de peptidoglicano), mientras que en las Gramnegativas la pared es delgada (una o dos capas); otra diferencia es la presencia de ácido teicoico y lipoteicoico solo en las bacterias Grampositivas porque en las Gramnegativas estos compuestos están ausentes; además las bacterias Gramnegativas tienen membrana interna, que es una bicapa fosfolipídica sin esteroles, y membrana externa que posee fosfolípidos en su cara interna y lipopolisacáridos en su cara externa. Estos últimos están conformados por el antígeno O en su parte más externa, el core (núcleo polisacárido) y el lípido A que es la endotoxina bacteriana con actividad pirogénica que contribuye de forma importante en la virulencia de las bacterias Gramnegativas. 
De esta manera, estas diferencias en cuanto a la estructura de la pared celular son las responsables de que las bacterias grampositivas se tiñan de un color diferente a las Gramnegativas con la tinción de Gram. Esta idea se ampliará más adelante en el informe con la descripción de los procedimientos y resultados obtenidos en el laboratorio. 
Figura 1. Clasificación bacteriana según su morfología.
Figura 2. Diferencias entre bacterias Gram positivas y Gram negativas.
MATERIALES
· cristal violeta.
· Lugol.
· Alcohol-Acetona.
· Safranina.
· Mechero.
· Agua destilada.
· Cinta de enmascarar.
· Laminas porta objeto.
· Papel secante.
· Escobillones.
· Asas de siembra
· Microscopio.
· Cepas bacterianas.
· Aceite de inmersión.
 
Figura 3. Materiales de laboratorio y cultivos a trabajar
Procedimiento:
	Paso 1, preparación del extendido: Primero se marcaron 4 pares de portaobjetos con los números 1,2,3 y 4 respectivamente. Luego se esterilizo el asa de bacteriología con el mechero de Bunsen para tomar una pequeña muestra de la cepa bacteriana, la muestra se esparció en el portaobjetos con una gota de agua destilada y después se fijó la muestra con calor. Este procedimiento se realizó con cada una de las cuatro cepas.
 Paso 2, tinción primaria: El frotis se tiño con el colorante primario, en este caso se utilizó cristal violeta que se aplica por un minuto, luego se enjuago el portaobjetos con agua. 
Paso 3, Mordiente: Se vertió una solución de yodo (Lugol) sobre el portaobjetos durante un minuto, después se enjuago con agua el portaobjetos. 
Paso 4, decoloración: Se aplico decolorante en el frotis, alcohol cetona, durante 20 segundos y se enjuago con agua el portaobjetos. 
Paso 5, contra tinción: Se añadió Safranina al frotis como tinción secundaria durante 40 segundos y después se enjuago nuevamente con agua y jabón. 
	
Paso 6, observación al microscopio: Luego de que se secara el portaobjetos con el frotis, se observó al microscopio con aumento de 100x habiendo aplicado previamente una gota de aceite de inmersión. Con la finalidad de identificar el tipo de bacteria.
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Figura 4: Observación al microscopio de bacilos Gram negativos (Pseudomona aeruginosa)
Los pasos de la tinción de Gram se realizaron con cada cepa bacteriana. Sin embargo, el procedimiento se reiteró tres veces debido a inexactitudes en factores como el tiempo de tinción e inexperiencia en la realización de esta técnica, hasta lograr observar la morfología de las bacterias y la coloración. 
Resultados
	 
	Tiempo de aplicación
	Cepa N. 1
Escherichia coli
	Cepa N. 2
Pseudomonas aeruginosa
	Cepa N. 3
Staphylococcus aureus
	Cepa N. 4
Enterococcus faecalis
	Colorante:
Cristal Violeta
	 1 min
	Color violeta
	 Color violeta
	 Color violeta
	 Color violeta
	Mordiente:
Yodo (lugol)
	 1 min
	 Color violeta
	 Color violeta
	 Color violeta
	 Color violeta
	Decolorante:
Alcohol acetona
	 20 seg
	 Incoloro
	 Incoloro
	 Color violeta
	 Color violeta
	Colorante de contraste:
Safranina
	40 seg 
	 Color rosa
	Color rosa
	 Color violeta
	 Color rojo violáceo
	Dibujo de las células bacterianas en el campo observado
	 
 
	 Ver figura 5.
	 Ver figura 6. 
	 Ver figura 7.
	 Ver figura 8.
	Descripción de lo observado (morfología y coloración de la bacteria)
	 
 
	Bacilos Gram negativos
(color rosa o rojo)
	Bacilos Gram negativos
(color rosa o rojo)
	Cocos en racimos gram positivos
(color violeta)
	Cocos en cadena Gram positivos
(color violeta)
Escherichia coli
Escherichia coli (E. coli) es una bacteria presente frecuentemente en el intestino distal de los organismos de sangre caliente. La mayoría de las cepas de E. coli son inocuas, pero algunas pueden causar graves intoxicaciones alimentarias.
La cubierta de E. coli consta de tres elementos: la membrana citoplasmática, la membrana externa y, entre ambas, un espacio periplásmico constituido por péptido-glucano. Esta última estructura confiere a la bacteria su forma y rigidez, y le permite resistir presiones osmóticas ambientales relativamente elevadas.
La mayoría de las cepas de E. coli son comensales, lo que significa que tienen una relación mutuamente beneficiosa con su huésped y desempeñan un papel en el funcionamiento normal del intestino. Ayudan en la digestión y compiten con las bacterias dañinas, lo que ayuda a prevenir su proliferación excesiva. Sin embargo, hay ciertas cepas patógenas de E. coli que pueden causar diversas infecciones y enfermedades.
Patogenia de E.coli: Mecanismos de patogenicidad
· Escherichia coli enterotoxigénica (ETEC):
· Mecanismo: Produce toxinas conocidas como enterotoxinas que afectan el intestino delgado.
· Patología: Las toxinas causan una hipersecreción de agua y electrolitos en el intestino, lo que conduce a una diarrea acuosa y autolimitada. Es común en áreas con condiciones de saneamiento deficiente y es una causa común de diarrea del viajero.
· Escherichia coli enteropatógena (EPEC):
· Mecanismo: EPEC posee un sistema de adhesión que le permite adherirse a las células del intestino.
· Patología: Las bacterias se adhieren a la superficie del intestino y causan la formación de lesiones de "adhesión y efacemento", lo que daña las microvellosidades intestinales. Esto resulta en una absorción deficiente de nutrientes y agua, lo que lleva a una diarrea acuosa y pérdida de peso,principalmente en lactantes y niños pequeños.
· Escherichia coli enterohemorrágica (EHEC):
· Mecanismo: Produce toxinas Shiga o toxinas verocitotoxinas que son similares a las toxinas producidas por la bacteria Shigella.
· Patología: Estas toxinas causan daño a los vasos sanguíneos del intestino, lo que resulta en una diarrea sanguinolenta y en algunos casos puede provocar el síndrome urémico hemolítico (SUH), una complicación grave que afecta los riñones y la sangre.
· Escherichia coli enteroinvasiva (EIEC):
· Mecanismo: Similar a Shigella, EIEC tiene la capacidad de invadir las células intestinales.
· Patología: La invasión de las células del intestino provoca la destrucción de las mismas y la activación de una respuesta inflamatoria, lo que lleva a una diarrea con sangre y moco, similar a la shigelosis.
· Escherichia coli enteroagregativa (EAEC):
· Mecanismo: EAEC se adhiere a las células intestinales y forma un agregado de bacterias.
· Patología: La bacteria libera toxinas y compuestos que dañan la mucosa intestinal, lo que provoca una diarrea persistente y crónica, especialmente en niños pequeños y personas con sistemas inmunológicos debilitados.
· Escherichia coli uropatógena (UPEC):
· Mecanismo: Posee factores de virulencia que le permiten adherirse y colonizar las células del tracto urinario.
· Patología: UPEC se adhiere a la mucosa del tracto urinario y puede ascender hacia la vejiga y los riñones, causando infecciones del tracto urinario (ITU) que incluyen cistitis y pielonefritis.
Figura 5. E.coli - bacilos gram negativo 
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa es un patógeno ubicuo, oportunista y bastante persistente en el medio ambiente. Tiene forma de bastón, con un tamaño de aproximadamente 0,5-1 µm de diámetro y 1,5-5 µm de largo. Posee un flagelo polar que le permite moverse. Es una bacteria aerobia facultativa, lo que significa que puede crecer tanto en presencia como en ausencia de oxígeno, utilizando el nitrógeno o arginina como aceptores de protones. Esta especie tiene una notable capacidad para sobrevivir en diversas condiciones y ambientes, como el agua y el suelo, con un requerimiento nutricional mínimo.
Pseudomonas aeruginosa puede crecer en un rango de temperaturas entre 20 y 43ºC, lo que la diferencia de otras especies de Pseudomonas que no pueden crecer a altas temperaturas. Además, se caracteriza por pertenecer al grupo de no fermentadores, lo que significa que no puede fermentar lactosa. Sin embargo, puede utilizar otras fuentes de carbono y nitrógeno, como el acetato y el amoniaco, obteniendo energía a través de la oxidación de azúcares.
Patogenia de P. aeruginosa: Mecanismos de patogenicidad 
Esta bacteria es un patógeno oportunista, lo que significa que generalmente infecta a personas con sistemas inmunitarios comprometidos o debilitados, como aquellos con enfermedades crónicas, pacientes hospitalizados, personas con heridas graves o quemaduras, y pacientes con sistemas inmunitarios debilitados por otros factores.
Algunas de las características clave que contribuyen a la patogenicidad de Pseudomonas aeruginosa son:
· Adherencia y colonización: La bacteria tiene la capacidad de adherirse y colonizar las superficies de los tejidos y dispositivos médicos, como catéteres y respiradores, lo que facilita su entrada en el cuerpo y la formación de infecciones.
· Factores de virulencia: Pseudomonas aeruginosa produce una variedad de factores de virulencia que le permiten evadir la respuesta inmune del huésped y causar daño a los tejidos. Algunos de estos factores incluyen exotoxinas, enzimas degradativas y pigmentos.
· Biofilm: La bacteria es capaz de formar biofilms, que son comunidades microbianas altamente organizadas que se adhieren a superficies y protegen a las bacterias del sistema inmunitario y de tratamientos antimicrobianos. Esto dificulta su erradicación y las hace más resistentes.
· Resistencia a antibióticos: Pseudomonas aeruginosa es conocida por su capacidad para desarrollar resistencia a múltiples clases de antibióticos, lo que complica el tratamiento de las infecciones causadas por esta bacteria.
Las infecciones causadas por Pseudomonas aeruginosa pueden afectar diversos sistemas y órganos del cuerpo, como infecciones respiratorias (neumonía), infecciones urinarias, infecciones de heridas y quemaduras, infecciones del torrente sanguíneo (sepsis), entre otras. Debido a su resistencia y capacidad para causar infecciones graves, Pseudomonas aeruginosa representa una preocupación importante en entornos hospitalarios y de atención médica. El tratamiento de las infecciones por esta bacteria a menudo requiere un enfoque multifacético y el uso de antibióticos específicos según la sensibilidad del patógeno.
Figura 6. Pseudomona aeruginosa - bacilos Gram negativo 
Staphylococcus aureus
Esta bacteria está clasificada como un coco Gram positivo que se agrupa en racimos, β hemolítico, catalasa y coagulasa positivo. Se describe que este microorganismo hace parte de la flora normal de los seres humanos encontrándose principalmente en la piel, en la zona nasofaríngea, pliegues inguinales y axilas. Sin embargo, este patógeno se caracteriza por generar infecciones en piel y tejidos blandos (músculos, tendones, tejidos grasos, vasos sanguíneos), invasión a dispositivos médicos y también ha sido relevante en las enfermedades transmitidas por alimentos
Patogenia de S. aureus: Mecanismos de patogenicidad
Staphylococcus aureus es considerado un patógeno oportunista, lo que significa que generalmente se encuentra en la piel y mucosas de las personas sin causar daño. Sin embargo, en ciertas condiciones, puede aprovechar una oportunidad para invadir los tejidos y causar infecciones, especialmente cuando hay una disminución en la inmunidad del huésped o cuando se producen daños en la piel o las barreras naturales del cuerpo.
· Adhesión: Staphylococcus aureus posee proteínas de adhesión en su superficie que le permiten unirse a las células y tejidos del huésped. Esto facilita la colonización de la bacteria en la piel y mucosas, y es el primer paso para iniciar una infección.
· Formación de biopelículas: Staphylococcus aureus tiene la capacidad de crear biopelículas en superficies médicas o tejidos dañados. Estas biopelículas son estructuras adherentes que protegen a las bacterias de la acción del sistema inmunológico y dificultan la penetración de los antibióticos, lo que las hace más resistentes y difíciles de eliminar.
· Enzimas extracelulares: Staphylococcus aureus produce diversas enzimas extracelulares que ayudan a dañar los tejidos y facilitan la invasión de las células huésped. Entre estas enzimas se encuentran las estafilocinasas, que degradan el tejido conectivo, y las lipasas, que descomponen los lípidos y permiten que la bacteria se disperse.
· Toxinas: Staphylococcus aureus produce varias toxinas que contribuyen a su virulencia. Algunas de las toxinas más importantes incluyen:
· Toxinas del síndrome del choque tóxico (TSST-1): Causan una reacción inflamatoria masiva que puede llevar a insuficiencia multiorgánica y shock.
· Enterotoxinas (SEs): Responsables de la intoxicación alimentaria estafilocócica, que provoca síntomas gastrointestinales agudos como vómitos y diarrea.
· Toxina alfa hemolítica: Destruye los glóbulos rojos y blancos, lo que contribuye al daño tisular y la propagación de la infección.
· Resistencia a antibióticos: Staphylococcus aureus es conocido por su capacidad para desarrollar resistencia a muchos antibióticos. Las cepas resistentes, especialmente el SARM (Staphylococcus aureus resistente a la meticilina) o MRSA (Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus), son una preocupación importante en entornos de atención médica, ya que pueden ser difíciles de tratar y causar infecciones graves.
· Invasión y destrucción celular: Staphylococcus aureus tiene mecanismos para invadir las células huésped y causar daño directo. Estos mecanismos incluyen la internalización en células epiteliales y la fagocitosis por células inmunitarias.· Modulación de la respuesta inmunológica: La bacteria puede modificar la respuesta inmunitaria del huésped para evadir la acción del sistema inmunológico y evitar ser destruida.
 Figura 7. Staphylococcus aureus 
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecalis es una bacteria gram positiva que forma parte de la microbiota normal del intestino humano y de otros animales de sangre caliente. Aunque generalmente es una bacteria comensal, es decir, no causa daño en condiciones normales, Enterococcus faecalis puede convertirse en un patógeno oportunista y causar infecciones en ciertas situaciones, especialmente en pacientes con sistemas inmunológicos debilitados o que han sido sometidos a procedimientos médicos invasivos.
Patogenia de E.faecalis: Mecanismos de patogenicidad
· Adhesión y colonización: Enterococcus faecalis tiene proteínas de adhesión en su superficie que le permiten adherirse a las células y tejidos del huésped. Esto facilita la colonización de la bacteria en diferentes partes del cuerpo, especialmente en el tracto gastrointestinal y en el tracto urinario.
· Formación de biopelículas: Enterococcus faecalis tiene la capacidad de formar biopelículas en superficies médicas o tejidos dañados. Estas biopelículas son comunidades bacterianas organizadas que se adhieren a las superficies y protegen a las bacterias de la acción del sistema inmunológico y de los antibióticos. La formación de biopelículas contribuye a la resistencia y persistencia de Enterococcus faecalis en el ambiente del huésped, lo que dificulta el tratamiento de las infecciones.
· Resistencia a condiciones adversas: Enterococcus faecalis es conocido por su capacidad para sobrevivir y prosperar en ambientes hostiles, como el tracto gastrointestinal, que contiene altas concentraciones de sal y ácidos gástricos. Su capacidad para resistir estas condiciones le permite colonizar y causar infecciones en el huésped.
· Resistencia a antibióticos: Enterococcus faecalis puede desarrollar resistencia a varios antibióticos, incluyendo la vancomicina, lo que dificulta su tratamiento en ciertos casos. Las cepas resistentes a la vancomicina (VRE) son particularmente preocupantes en entornos de atención médica, ya que pueden transmitirse fácilmente entre pacientes y complicar el manejo de las infecciones.
· Secreción de sustancias tóxicas: Enterococcus faecalis puede producir toxinas y enzimas que dañan las células y tejidos del huésped, lo que contribuye a la patogenicidad de la bacteria. Estas sustancias tóxicas pueden causar daño tisular y provocar una respuesta inflamatoria en el huésped.
Invasión de tejidos: En ciertas circunstancias, Enterococcus faecalis puede invadir y colonizar tejidos más allá de su ubicación habitual en el intestino, lo que contribuye al desarrollo de infecciones sistémicas, como bacteriemia y endocarditis.
Figura 8. Enterococcus faecalis - cocos en cadena Gram positivos
 
Discusión
Primero, es importante recordar que el cristal violeta tiñe todas las bacterias de violeta (independientemente de que sean grampositivos o gramnegativos). El yodo actúa como un mordiente que se une al tinte para formar complejos yodo-tinte más grandes en el citoplasma, luego el decolorante elimina el tinte primario de las bacterias gramnegativas mientras que las bacterias Grampositivas retienen el tinte. Por último, la tinción secundaria le imparte color rosa o rojo a las bacterias, gramnegativas.
1. Escherichia coli:
Tras realizar los 4 procedimientos de la tinción de Gram, observamos que Escherichia coli o la muestra N°1 al final se tiñó de color rosa, lo que indica que es una bacteria Gram negativa. Esto es coherente con la estructura de la pared celular de esta bacteria, que presenta una capa delgada de peptidoglicano rodeada de una membrana externa rica en lípidos, por lo cual no retiene el cristal violeta durante la decoloración, porque la presencia de lipopolisacáridos en la membrana externa que se rompen fácilmente por el decolorante formando grandes poros permiten que los complejos colorante yodo escapen del citoplasma. De modo que la bacteria toma la tinción secundaria que da como resultado la coloración rosada.
Esta muestra presentó ciertos inconvenientes como, por ejemplo, nos vimos obligados a realizar el procedimiento 4 veces en donde la primera vez no se realizó un correcto extendido de la muestra, las otras 2 fueron por problemas durante la tinción y finalmente obtuvimos el resultado esperado.
2. Pseudomonas aeruginosa:
Pseudomonas aeruginosa también mostró un resultado Gram negativo en nuestra tinción, ya que se tiñó de color rosa. Posee una pared celular similar a la de Escherichia coli, lo que impide la retención del cristal violeta durante la decoloración.
En este caso se realizó 2 veces el procedimiento porque se falló en el paso de la decoloración, entonces se observó en el microscopio una parte sin teñir y otra parte con coloración intensa, porque no se aplicó correctamente sobre la muestra, finalmente se repitió el procedimiento corrigiendo este error y obteniendo el resultado esperado.
3. Staphylococcus aureus:
En el caso de Staphylococcus aureus, observamos que se tiñó de color violeta oscuro, lo que indica que es una bacteria Gram positiva. Esto se debe a que las bacterias Gram positivas tienen una gruesa pared de peptidoglicano que actúa como una barrera que impide la pérdida del cristal violeta durante el proceso de decoloración.
En este caso se repitió dos veces el procedimiento porque durante la realización del extendido no se esparció correctamente la muestra sobre la placa de manera que las células se observaban muy agrupadas y no se podía distinguir su morfología. Finalmente se realizó el procedimiento corrigiendo así los errores, obteniendo el resultado satisfactoriamente.
4. Enterococcus faecalis:
Enterococcus faecalis también mostró una tinción Gram positiva, ya que se observó de color violeta oscuro en el microscopio. Esto concuerda con su estructura de pared celular que es similar a la de Staphylococcus aureus.
En este caso tambien se tuvo que repetir 2 veces el procedimiento debido a que, en el momento de exponer la placa al enjuague, no se tuvo en cuenta la alta presión del agua y se barrió el extendido, y al momento de observar al microscopio se observó una cantidad muy disminuida de bacterias, siendo así el segundo intento el satisfactorio.
Conclusión
La tinción de Gram es una técnica valiosa para la identificación preliminar de bacterias en el campo de la infectología. En este informe de laboratorio, pudimos diferenciar las bacterias Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa como Gram negativas, Staphylococcus aureus y Enterococcus faecalis como Gram positivas. Estos resultados proporcionan información relevante para el diagnóstico y tratamiento adecuado de las infecciones bacterianas.
Bibliografía 
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