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Biología de la Reproducción
- 3 3 3Vol. 25- nº 5 - Sep t i e m b re - O c t u b re 2008
 
 
E x p resión del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) - 3 3 3
E x p resión del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) Clase I
y Clase II en gametos humanos
E x p ression of Major Histocompatibility Complex (MHC) Class I and Class II
on human ga m e t e s
G a rcía-Láez V1, De los Santos JM1, Serra V2, Pellicer A2, De los Santos MJ1.
1L ab o rat o rio de Embri o l ogía Clínica. Instituto Unive rs i t a rio IVI. Valencia, España.
2D ep a rtamento de Obstetricia y Ginecología, Instituto Unive rs i t a rio IVI. Valencia España.
R e s u m e n
La ex p resión de las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad en los gametos humanos
ha sido y es tema de deb ate por las implicaciones clínicas que de ello se deducen. La ex p resión de los
genes del HLA clase I y II en ovocitos humanos permanece poco inve s t i gada. Por el contra rio, aun-
que la ex p resión en esperm at o zoides humanos y sus pre c u rs o res ha estado ampliamente estudiada,
aún no está cl a ro si el HLA está presente en los esperm at o zoides o es producto de contaminación con
o t ras células presentes en el semen.
El objetivo del presente trabajo es estudiar la ex p resión de las moléculas del complejo principal de
h i s t o c o m p atibilidad tipo I y tipo II en ovocitos no fecundados y esperm at o zoides utilizando ri g u ro s o s
métodos de puri ficación celular combinados con RT-PCR y métodos de detección de pro t e í n a s .
El análisis de nu e s t ros resultados indican que el ARNm de los genes del HLA clase I y II, incluso de
las moléculas no clásicas como el HLA-G, está ausente en ovocitos maduros e inmaduros así como en
e s p e rm at o zoides, sin embargo en las células ge rminales inmaduras masculinas obtenidas desde el
eyaculado sí que ex p resan los productos de los genes del HLA. A pesar de ello los antígenos HLA cl a-
se I y clase II no están normalmente presentes en la superficie de estas células ga m e t ogénicas y esto
s u gi e re la existencia de dife rentes caminos en la regulación de la ex p resión de las moléculas del
MHC en las células ge rminales inmaduras masculinas. La ausencia de las moléculas del HLA puede
ser importante en el mantenimiento de la fi s i o l ogía normal del gameto y posiblemente de su estat u s
como célula inmu n o p riv i l egi a d a .
Pa l ab ras cl ave : HLA clase I. HLA clase II. Ovocito. Esperm at o zo i d e. Células ge rm i n a l e s .
Vol. 25- nº 5 - Sep t i e m b re - O c t u b re 2008
Correspondencia: Dra. Mª José de los Santos Molina
IVI-Valencia
Plaza de la Policía Local, 3
46015 Valencia, España.
mjdelossantos@ivi.es
 
 
3 3 4 - Vol. 25- nº 5 - Sep t i e m b re - O c t u b re 20083 3 4 - E x p resión del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC)
I N T RO D U C C I Ó N
El complejo principal de histocompat i b i l i d a d
(MHC) comprende genes localizados en el cromosoma
6, 6p21,3 y está dividido en tres regiones dife re n t e s
llamadas clase I, II y III.
La región MHC clase I codifica al menos siete
moléculas funcionales (HLA-A, -B, -C, -E, -F, -G y -
J) y la región clase II, tres grupos de antígenos (HLA-
DR, -DP y -DQ), los cuáles tienen la distri bución ti-
sular más re s t ri n gida que las moléculas de clase I.
Los genes de la región clase III tienen dife rentes fun-
ciones, algunos relacionados con funciones inmu n e s
como las moléculas del sistema del complemento
C 4 B, C4A, BF y C2, y las citoquinas como el fa c t o r
de necrosis tumoral (TNF) α y ß (1).
Las moléculas HLA clase I y clase II son críticas
p a ra la presentación de antígenos de fo rma que pue-
dan ser reconocidas por los linfocitos T citotóxicos
(CD8+) y ayudantes (CD4+), re s p e c t iva m e n t e. Las
moléculas del HLA clase I también pueden afectar a
la función celular de las Nat u ral Killer (NK) (2, 3). Su
c o n t ri bución a la respuesta alogénica está bien docu-
mentada. Las moléculas del MHC ex t rañas se dife re n-
cian de las moléculas del MHC propias en múltiples
residuos de aminoácidos; y se cree que este polimor-
fismo es importante para la dive rsidad de re s p u e s t a s
i n mu n o l ó gicas, y constituye la mayor barre ra para el
t ransplante de tejidos. Se cree que la ausencia de ex-
p resión de las moléculas del HLA-A, -B, -DR, -DP y -
DQ es una de la estrat egias mediante la cual ciertos te-
jidos como por ejemplo el sincitotro fo blasto, mantiene
el carácter de inmu n o p riv i l egio que le permita ev i t a r
el re ch a zo por el sistema inmune mat e rno (4).
D ebido a la importancia de este posible mecanis-
mo para evitar un ataque potencial de las células NK
y linfocitos T mat e rnos HLA-re s t ri n gidos durante la
implantación, se han realizado otros estudios con el
fin de identificar la presencia de HLA en estadios de
d e s a rrollo embri o n a rio tempranos, así como en ga m e-
tos (esperm at o zoides y ovocitos). Los estudios re a l i-
zados hasta el momento usan anticuerpos monocl o n a-
les contra las moléculas del HLA clase I y clase II
con ciertas discrepancias. Mientras que algunos han
revelado ausencia (5, 6) de ex p resión del HLA, otro s
han encontrado una discreta presencia de estas molé-
culas en ovocitos humanos (7). Otros autores han des-
c rito la ex p resión de los genes del HLA y las pro t e í-
nas tanto en ovocitos como en blastocistos humanos
(8); llegándola a relacionar incluso con la cap a c i d a d
i m p l a n t at o ria (9).
La ex p resión de los genes del HLA clase I y II en
ovocitos humanos permanece poco inve s t i gada. Por el
c o n t ra rio, aunque la ex p resión en esperm at o zo i d e s
humanos y sus pre c u rs o res ha estado ampliamente es-
tudiada, aún no está cl a ro si los tra n s c ritos de los ge-
nes del HLA están presentes en los esperm at o zo i d e s
humanos y si hay ex p resión como proteínas superfi-
ciales (6, 10).
En este estudio, combinamos dos estrat egias de
detección, por un lado re a l i z a remos RT-PCR (del in-
glés; Reve rse Tra n s c riptase - Po l i m e rase Chain
Reaction) y por otro utilizaremos los métodos de de-
tección de proteínas combinadas con ri g u rosos pro t o-
colos de puri ficación celular para inve s t i gar la ex p re-
sión de las moléculas del HLA clase I, incluidos los
a n t í genos no clásicos HLA-G, y las moléculas del
HLA clase II y en ovocitos y esperm at o zoides huma-
nos. Nuestros resultados ap o rtan una evidencia de la
existencia de dife rentes fo rmas de regulación de la
ex p resión del MHC, entre la ovogénesis y esperm at o-
génesis humanas.
Vol. 25- nº 5 - Sep t i e m b re - O c t u b re 2008
S u m m a ry
The ex p ression of histocompatibility leuko cyte antigen (HLA) class I and class II antigens on human
o o cytes and sperm cells has been under deb ate due to the immune connotation of this issue. The study of
the HLA ex p ression on human oocytes has not been deep ly studied; however this is not the case on the
s p e rm cells. Sperm cells HLA ex p ression is not clear since the presence of other cells such as ep i t h e l i a l
cells of white blood cells or sperm ge rm cells can be a source for HLA ex p ression contaminat i o n .
The aim of the study was to inve s t i gate whether both human oocytes and sperm cells ex p ress HLA
class I and class II combining highly methods of cell puri fi c ation with indirect immu n o fl u o re s c e n c e
a s s ay and RT-PCR. Our results demonstrated that both human oocytes and sperm cells lacked these
a n t i gens, however gra nulosa cells and immat u re sperm cells are able to ex p ress HLA class I and cl a s s
II molecules at mRNA leve l .
Key wo rd s : HLA class I. HLA class II. Oocy t e. Sperm at o zoa. Germ cells.
M ATERIALES Y MÉTO D O S
Gametos humanos
Se analizaron un total de 155 ovocitos humanos
no viables de mu j e res que part i c i p aban en lastécnicas
de la rep roducción asistida (TRA) en el hospital
B righam and Women´s, Boston, MA.
Las mu e s t ras de semen (n=11) fueron re c ogi d a s
de seis donantes sanos para el análisis de la pre s e n c i a
de ex p resión genética del HLA clase I y II en esper-
m at o zoides puri ficados (n=7) y en células ge rm i n a l e s
p u ri ficadas (n=4). La ex p resión superficial del HLA
clase I y II fue analizada por citometría de flujo, en
o t ras 21 mu e s t ras de semen adicionales re c ogidas de
10 hombres con fe rtilidad probada y 11 hombres que
e s t aban participando en las TRA en el hospital
B righam and Women´s, Boston. Otras 5 mu e s t ras de
semen de 5 va rones VIH-1 sero p o s i t ivos (3 con SI-
DA) obtenidos desde el Fe n way Community Health
C e n t e r, fueron también testadas para ver la posible in-
fluencia de la infección en la ex p resión superficial del
HLA en las células ga m e t ogénicas masculinas. El
consentimiento info rmado fue obtenido de todos los
i n d ividuos. El semen fue re c ogido por masturbación
en contenedores estériles y licuado a temperat u ra am-
biente durante 30 minutos antes de pro c e s a rl o .
Métodos de puri ficación de esperm at o zo i d e s
A) Puri ficación de esperm at o zoides móviles por gra-
dientes discontinuos Pe rc o l l .
El esperma puro se obtuvo mediante el uso de dos
p rotocolos dife rentes: bien con gradiente discontinu o
Pe rcoll de 90%, 70% y 45% (Pharmacia LKB, Nucl e a r
Inc Gaithers bu rg, Mary l a n d, USA) o un gradiente de
95% de Isolate (Irving Scientifi c, Santa Ana, CA, USA)
combinado con un paso adicional de puri ficación usan-
do inmunobeads para eliminar las células positivas para
los antígenos CD45+ y CD14+. Breve m e n t e, el semen
fue depositado suavemente sobre gradientes de Pe rc o l l
45% o Isolate 95% y centri f u gado a 600 g durante 20-
30 minutos. Las células del pellet fueron usadas para
RT-PCR o citometría de fl u j o .
B) Selección negat iva de células ge rminales del
plasma seminal y células blancas sanguíneas me-
diante inmunobeads para CD45+ y CD14+.
Las células redondas presentes en el plasma semi-
nal (células blancas sanguíneas (CBS), células ge rm i-
nales y células epiteliales) se aislaron por una técnica
de centri f u gación estándar de gradientes de densidad
( Ficoll-Hypaque; Pharmacia Biotech, AB, Uppsala,
S weden). Breve m e n t e, las células redondas fueron re-
suspendidas en 1 mL de tampón de lavado, 0,1% de
BSA en PBS, e incubadas con i n mu n o b e a d s re c u b i e r-
tos con un anticuerpo monoclonal contra CD45
(Dynal, Lake Success, NY) a 4ºC durante 2 horas. Las
células CD45+ del sobrenadante fueron tra n s fe ridas a
un segundo tubo, y el sedimento resuspendido en otro
mL de tampón de lavado e incubado de nu evo con i n -
mu n o b e a d s c u b i e rtas con un anticuerpo monocl o n a l
contra CD14 (Dynal) a 4ºC durante 1 hora. El anticuer-
po monoclonal usado contra CD45 fue el cl o n
TT29/33, el cual se une a la membrana celular de todos
los leucocitos ex c epto los macrófagos, y el cl o n
RMO52 usado contra CD14, el cual se une a los mono-
citos (>95%) incluyendo macrófagos y granulocitos.
Aislamiento de ARN de ovocitos humanos, esper-
m at o zoides y células ge rm i n a l e s
Pa ra tal fin utilizamos ovocitos no fecundados de
FIV que se lava ron cuidadosamente en medio Ham´s
F-10 tamponado con Hepes y colocados en una solu-
ción de ácido Ty rode´s, pH 2,1 (ambos de Gibco BRL
L i fe Te ch n o l ogies, Grand Island, NY, USA) para
romper la zona pelúcida y eliminar las células de la
c o ro n a - c ú mulus asociadas a ella. Los ovocitos fuero n
g u a rdados a -80ºC en 19 µl de la mezcla para re a l i z a r
la tra s c ripción reve rsa conteniendo 0,5% de Nonidet
P40 hasta pro c e s a rl a s .
Las células ge rminales, esperm at o zoides maduro s
y CBS seminales fueron disueltas en 6 M de la solu-
ción tiocianato de guanidinio consistente en 0,5% de
s a rc o s i n ato de lauril sulfato sódico y 0,1% de mer-
c aptoetanol (Sigma Co; St Louis MO, USA). Las cé-
lulas lisadas se pasaron sobre una capa de CsCl y
c e n t ri f u gadas a 15ºC durante 26 horas a 94.000 g. El
R NA fue mezclado con 3 M de acetato de sodio y
100% de etanol y guardado toda la noche a -20ºC
hasta pre c i p i t a r. El RNA del ra n go de 300.000 a
5.000.000 de esperm at o zoides puros y un ra n go de
300.000 a 500.000 de células ge rminales fue poste-
ri o rmente analizado. El RNA del sedimento fue lava-
do con 70% de etanol y disuelto en agua destilada. La
c o n c e n t ración de RNA se midió por espectro fo t o m e-
tría a 260 nm.
Tra s c ripción reve rs a - reacción en cadena de la po-
l i m e rasa (RT- PCR)
La RT-PCR se realizó con el ARN de las fra c c i o n e s
c e l u l a res de semen (esperm at o zoides, células ge rm i n a-
- 3 3 5Vol. 25- nº 5 - Sep t i e m b re - O c t u b re 2008 E x p resión del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) - 3 3 5
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les y células blancas), en células del cúmulus, en 50 cé-
lulas de la línea celular de cori o c a rcinoma JEG-3, así
como en ovocitos individuales. La tra s c ripción reve rs a
se realizó en 20 µl de tampón consistente en 5,2 mM
M g C l2, 10,5 mM Tris-HCl, 52,6 mM KCl, 20 U de in-
hibidor de la RNAasa, 0,05 nmol de hex á m e ros aleat o-
rios, 50 Ul del tra n s c riptasa reve rsa (MuLV) (Pe rk i n -
E l m e r, Bra n ch bu rg, New Je rs ey, USA) y 5,3 nm de
m e z cla de cada desox i ri b o nu cleótido tri fo s fato (dNTP).
La reacción estuvo 10 minutos a 22ºC y 42 minu-
tos a 42ºC seguidos de un paso final de incubación de
5 minutos a 95ºC para inactivar a la MuLV.
El cDNA de los esperm at o zoides maduros, células
ge rminales seminales, CBS, células del cúmulus y
ovocitos, se utilizó para amplificar los productos de
los genes del HLA clase I, incluido el HLA-G y el
HLA clase II (DPα y DRα) por medio de la Amplitaq
Gold Po l i m e rasa (Pe rkin-Elmer) en 30 µl de una re a c-
ción mezcla que contiene 1,67 mM MgCl2, 10mM
t ris-HCl, 50 Mm KCl, y 200 µM de mezcla de dNTP.
Se usó como control positivo células JEG-3 de cori o-
c a rcinoma. El perfil de los 42 ciclos consistió en des-
n at u ralización a 95ºC durante 30 segundos, anilla-
miento a 55-60ºC durante 30-90 segundos, y 72ºC
d u rante 30 segundos, con un paso final de extensión a
72ºC durante 7 minutos. Los pri m e ros fueron escogi-
dos en intrones dife rentes para evitar la contamina-
ción con de DNA genómico. Los pri m e ros de ß-acti-
na eran de Continental Lab o rat o ry Products Inc (San
D i ego, CA) y se usaron para aseg u rar el éxito de la
síntesis del cDNA. Además, la PCR para CD45 fue
usada como control de la presencia de células bl a n c a s
sanguíneas mientras que la Ke ratina-18 se utilizó co-
mo control de la presencia de células epiteliales. En
la tabla 1 se mu e s t ran las secuencias de los pri m e ro s
y la longitud esperada de los productos de la PCR
después de la h e m i n e s t e d PCR. Los productos fuero n
visualizados por tinción con bro mu ro de etidio en un
gel de aga rosa al 1,5%.
Heminested PCR
En la h e m i n e s t e d PCR usamos el mismo pri m e r
u p s t ream y un primer dow n s t ream interno dife re n t e
( Tabla 1) para ve ri ficar la especificidad de los pro-
ductos obtenidos y mejorar la detección de los pro-
ductos de la PCR cuando se analiza una pequeña can-
tidad de DNA. En la h e m i n e s t e d PCR se empleó entre
0,6 µl y 1 µl de los productos amplificados para la se-
gunda amplificación de la PCR. Las condiciones del
tampón y los volúmenes de reacción usados en la se-
gunda PCR fueron idénticos a los de la pri m e ra PCR.
Tabla 1
Secuencias de primer usados para detectar la ex p resión del mRNA del MHC en ovocitos y células esperm á t i c a s
5´a 3´ p b T ª
HLA I A cgcttacga c gg c a aggat t a c 4 1 9 6 0 º C
B tctgctcttctccaga agg c a
C tgctgcacat g c agg t g t atc
H L A - G A ttgtccttgcag c t g t ag t c a c 2 3 8 60 ºC
B ctgg t c t c t g c a c a agagagg
C tgaga c agaga c ggaga c at c
H L A - D P A gccctctccttgg c t t t c c t g c t g 3 8 2 60 ºC
B aaga a c t t g t c a at g t gg c agat g
C acgtga c g t t gag c a c t gg t ggg
H L A - D R A ctgat gag c g c t c agga at c at gg 2 8 5 60 ºC
B agg t a c at t gg t gat c ggag t at a
C gttcgtgag c a c ag t t a c c t c t gg
C D 4 5 A gga at t c c a a ag c c c a a c a c c 3 4 0 55 ºC
B acttgtgtaaat c at g t a a
K - 1 8 A cgaga aggaga c c at g c a a ag c 4 5 3 55 ºC
B ctgg c a at c t ggg c t t g t agg
A y B rep resentan los primer upstream y dow n s t ream. C es el primer interno dow n s t ream usado en la heminested PCR. La se-
cuencia de primer para HLA de clase II y CD45 fueron obtenidas de Meye rs et al 1991 (36) y Fo rsyth et al 1993 (37) re s p e c-
t iva m e n t e.
Análisis por Citometría de fl u j o
Pa ra los análisis de citometría de flujo se utilizó
un método de inmu n o fl u o rescencia directa con los si-
guientes anticuerpos monoclonales: W6/32 conjuga-
do con fi c o e ri t rina (FE) (Dako, Carpintería, CA,
USA) el cual reconoce al epítopo monomórfico del
p roducto polipéptido de 45 KDa de los loci HLA-A, -
B y -C (también reconoce al HLA-G), el y el anti-
c u e rpo CR3/43 conjugado con isocianato fl u o re s c e i n
(FITC) que reconoce todos los productos de las su-
b regiones de los genes de DP, DQ y DR. Como con-
t rol positivo se utilizó anticuerpo CD55 conjuga d o
con FE y FITC (Pharm i n gen, San Diego, CA) ex p re-
sado en la superficie de las células ge rminales y es-
p e rm at o zoides. Un re a c t ivo doble color para el CD45
clon T29/33 y para CD14 clon TUK3 (Dako) fue usa-
do como control para ver la presencia de CBS. Los
c o n t roles negat ivos fueron anticuerpos de isótopos
i rre l evantes conjugados con FE y FITC. Como con-
t rol positivo para los anticuerpos HLA clase I y HLA
clase II se utilizaron células sanguíneas mononu cl e a-
res peri f é ricas (PBMC).
El procedimiento fue el siguiente: fracciones enri-
quecidas con células ge rminales y esperm at o zo i d e s
m a d u ros fueron divididas, si era posibl e, en 5 alícuo-
tas conteniendo entre 6x104 y 106 células dep e n d i e n-
do de la calidad de las mu e s t ras de semen. Cada alí-
cuota fue incubada con una combinación de antic u e rp o s
de isótopos irre l evante conjugados con PE y FITC,
con anticuerpos CD55 FITC conjugado y CD55 PE
c o n j u gado, o con una combinación de W6/32 RPE y
CR3/43 FITC conjugados, y finalmente el doble color
re a c t ivo como control de la contaminación con CBS.
Todos los anticuerpos fueron diluidos 1:50 en PBS
con 0,1% de BSA e incubados durante 30 minutos a
4ºC. Después de ser lavadas dos veces, las mu e s t ra s
f u e ron fijadas en 1% de para folmaldehido y guard a-
das en oscuridad a 4ºC durante no más de 48 hora s ;
10.000 células/mu e s t ra fueron analizadas con un
FACScan (Beckton Dick i n s o n ) .
I n mu n o c i t o q u í m i c a
La inmunocitoquímica fue realizada sobre 40 ovo-
citos no fecundados con el mismo anticuerpo mono-
clonal usado para el análisis por citometría de fl u j o .
Un total de 26 ovocitos se utilizó para localizar el
HLA clase I y II; 14 ovocitos adicionales fueron usa-
dos como control negat ivo del ex p e rimento. Breve-
m e n t e, los ovocitos no fijados se tra n s fi ri e ron a go t a s
de 200 µl de 0,1% de BSA en solución de lavado PBS,
tras tres rondas de lavado se incubaron durante 30 m i-
nutos a 4ºC en gotas de 100 µl de una solución de
ambos anticuerpos monoclonales W6/32-PE y
CR3/43-FITC a una dilución 1:50.
Después de tres ciclos más de lavado, los ovo c i t o s
finalmente fueron fijados en 2% de para fo l m a l d e h i d o
d u rante 30 minutos y montados para ser eva l u a d o s
s o b re el microscopio de fl u o rescencia (Olympus BH-
2), donde fueron fo t ogra fiados con una unidad de
c o n t rol de exposición (Olympus). Los controles nega-
t ivos fueron procesados con los anticuerpos de isóto-
pos irre l evantes conjugados con PE y FITC.
Análisis estadístico
Se utilizó el test no para m é t rico de Wi l c oxon para
a comparación de la ex p resión superficial del HLA I
y HLA II en todas las células ge rminales y fra c c i o n e s
c e l u l a res de esperma. Va l o res de p<0,05 fueron con-
s i d e rados estadísticamente signifi c at ivo s .
R E S U LTA D O S
Detección de los productos de los genes HLA cl a s e
I y clase II en ovocitos humanos.
Pa ra ve ri ficar la síntesis sat i s fa c t o ria de cDNA uti-
lizamos 1 µl de cDNA de ovocitos y células del cú-
mulus y se sometieron a una PCR usando pri m e rs de
ß-actina. Ningún producto fue detectado en el cultivo
s o b renadante ex t raído de los ovocitos y sometido a
RT-PCR, el cual fue usado como control negat ivo .
Ap roximadamente la mitad del total del cDNA obte-
nido de los ovocitos individuales fue usado para am-
p l i ficar dos antígenos HLA. Independientemente del
estado meiótico analizado (pro fase I (PI), metafase I
(MI), o metafase II (MII)) no se pudo detectar ningún
d e t e rminante HLA clase I o II en ovocitos humanos.
Sin embargo, las células del cúmulus ex p re s a ro n
t ra n s c ritos para HLA-DPα y DRα ( Fi g u ra 1A).
La ex p resión para el gen HLA-G fue evaluado en
un total de 42 ovocitos (9PI, 16 MI, 15 MII y 2 part e-
n ogenotas). Las 50 células de cori o c a rcinoma JEG-3
usadas como control positivo reve l a ron una banda de
292 pb junto con otra banda no específica a 200 pb,
como previamente describió Ju ri s i c ova et al., 1996a
(8). La falta de las 200 pb cuando CBSs fueron usadas
s u gi e re que este art e facto fue debido al RNAm de las
células JEG-3. La amplificación del HLA-G reve l ó
que no había tra n s c ritos en los ovocitos no fe c u n d a d o s
m a d u ros o inmaduros (Fi g u ra 1B). La sensibilidad pa-
ra el primer HLA-G fue de un equivalente de 0,3 célu-
las de cori o c a rcinoma JEG-3. Altern at ivamente se
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u s a ron otros sets dife rentes de pri m e rs, G.526, G. 1 2 2 5
y G.1200 (11), que daba un producto de 710 pb, pero
la amplificación del RNAm del HLA-G seguía siendo
no sat i s fa c t o ria. Las células del cúmulus no ex p re s a-
ron tra n s c ritos del HLA-G (Fi g u ra 1B).
H e m i n e s t e d PCR fue realizada con los pri m e r
d ow n s t ream internos (Tabla 1) con el fin de ve ri fi c a r
la autenticidad de los productos de la PCR para JEG-
3 y células del cúmulus. Los ovocitos seguían care-
ciendo de tra s c ripción del HLA.
Detección de los productos de los genes HLA cl a s e
I y clase II en esperm at o zoides, células ge rm i n a l e s
i n m a d u ras y CBS seminales
El análisis RT-PCR revela que las moléculas del
HLA clase I (incluidas las moléculas de HLA-G) y
clase II (DPα y DRα) estaban tra n s c ritas en las célu-
las ge rminales obtenidas del semen. Los esperm at o-
zoides maduros puros no contenían ningún mRNA de
HLA clase I, clase II o HLA-G, aunque los tra n s c ri-
tos de ß-actina fueron detectados (Fi g u ra 2). Las CBS
obtenidas del semen usado como control positivo pa-
ra la ex p resión de los genes del HLA clásico clase I y
clase II también reveló la presencia de tra n s c ritos de
H L A - G. La especificidad de los productos fue confi r-
mada en la h e m i n e s t e d P C R .
E x p resión superficial de los antígenos del HLA
clase I y clase II en ovocitos humanos.
El análisis inmunocitoquímico del HLA cl á s i c o
clase I y clase II reveló un patrón de tinción at í p i c o
en los ovocitos. La mayoría de los ovocitos no mostró
i n mu n o re a c t ividad para ningún HLA clásico clase I y
clase II, pero, 3 de 26 (11,5%) ovocitos analizados,
m o s t ra ron una fuerte tinción positiva para ambos ti-
pos de antígenos, clase I y II. Sin embargo, 2 de 14
ovocitos usados como control negat ivo también re a c-
c i o n a ron positivamentepara ambos tipos del HLA.
Los antígenos del HLA estaban ausentes en la zo n a
pelúcida, incluso para los ovocitos positivos para am-
bos tipos del HLA.
Las células de la corona radiada fueron positiva s
p a ra el HLA clase I, pero no para las moléculas del
HLA clase II (Fi g u ra 3).
E x p resión superficial de los antígenos del HLA
clase I y clase II en esperm at o zoides humanos y
células ge rminales inmadura s
La citometría de flujo para el semen de ambos va-
rones, fértiles e infértiles, reveló un porcentaje mu y
bajo (1%) de células positivas para el HLA clase I en
3 3 8 - Vol. 25- nº 5 - Sep t i e m b re - O c t u b re 20083 3 8 - E x p resión del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) Vol. 25- nº 5 - Sep t i e m b re - O c t u b re 2008
Fi g u ra 1
E x p resión mediante RT-heminested PCR de las moléculas
de los genes MHC, HLA clase I, HLA-DP, HLA-DR y
HLA-G en ovocitos (O) y células del cúmulus (CC).
Los ovocitos no mostra ron ninguna activ i d a d
t ra n s c ripcional para ninguna de las moléculas del MHC
estudiadas. Sin embargo las células del cúmulus tenían
R NAm para el HLA de clase I y clase II pero fue negat ivo
p a ra la ex p resión genética de HLA-G.
Fi g u ra 2
La ex p resión de los genes MHC en esperm at o zoides (Sp),
células blancas sanguíneas (CBS) y células ge rm i n a l e s
i n m a d u ras (G) obtenida desde el eyaculado. Se escogi ó
como control positivo la ex p resión de ß-actina. El RNA m
de la moléculas HLA clase I, HLA-DPa, HLA-DRa
y HLA-G fue positivo en las células ge rminales inmadura s
y también en las células blancas sanguíneas. Sin embargo ,
los esperm at o zoides, a pesar de ser positivos para la
ß-actina, no se encontra ron tra n s c ritos para ninguna
molécula del MHC estudiada. La ausencia de
contaminación con CBS en la fracción enri q u e c i d a
de células ge rminales fue determinada por defi c i e n c i a
de ex p resión de CD45.
f racciones enriquecidas con células ge rminales y cé-
lulas espermáticas, comparadas con sus re s p e c t ivo s
c o n t roles negat ivos (Fi g u ra 4 A, B). Este re s u l t a d o
p ro b ablemente fue debido a la presencia de un por-
centaje muy bajo de células CD45+ asociadas (1,15 ±
1,31%). La ex p resión del HLA clase II no fue encon-
t rada en ningún esperm at o zoide o célula ge rminal in-
m a d u ra de ninguno de los va rones, fértiles y subfért i-
les, o en los controles negat ivos. No se encontra ro n
d i fe rencias en la ex p resión de los antígenos HLA cl a-
se I y clase II entre las células ge rminales y las célu-
las espermáticas dentro un grupo dado (Fi g u ra 4).
Tampoco había dife rencia en el nivel de ex p resión de
HLA en esperm at o zoides y células ge rminales de va-
rones fértiles comparados con los va rones infért i l e s .
No se encontró dife rencia en la ex p resión de HLA
clase I y clase II entre células ge rminales y células
e s p e rmáticas dentro de un grupo dado. De fo rma si-
m i l a r, el análisis FACS de va rones sero p o s i t ivos VIH-
1 reveló que no había ex p resión de los antígenos del
HLA clase I o clase II en las células ge rminales y es-
p e rm at o zoides (Tabla 2). Solo una de 11 mu e s t ras de
semen de va rones infértiles mostró un alto porc e n t a j e
de células positivas para el HLA clase I, en las fra c-
ciones enriquecidas con en células ge rminales (8%) y
en células espermáticas (10%) re s p e c t iva m e n t e.
- 3 3 9Vol. 25- nº 5 - Sep t i e m b re - O c t u b re 2008 E x p resión del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) - 3 3 9Vol. 25- nº 5 - Sep t i e m b re - O c t u b re 2008
Fi g u ra 3
I d e n t i ficación inmunocitoquímica del HLA clase I y HLA clase II en ovocitos humanos no fecundados y en las células
de la corona radiada. Las fi g u ras a y b mu e s t ran microscopia de contraste de fase en uno de los ovocitos humanos y células
del cúmulus; c y d mu e s t ran un patrón de tinción negat iva para HLA de clase I y II. Las células del cúmulus mostra ro n
ex p resión positiva para el HLA clase I (e) pero negat iva para los antígenos del HLA clase II (f). (x100).
Ruido de HLA clase I Ruido de HLA clase II p
n = 5 fo n d o fo n d o
E s p e rm at o zo i d e s 0,42 ± 0,41* 1,68 ± 0,81 1,00 ± 0,74 0,48 ± 0,64 N S
Células ge rm i n a l e s 0,81 ± 0,54 1,64 ± 0,86 0,68 ± 0,64 0,68 ± 0,82 N S
Tabla 2
E x p resión del HLA clase I y clase II en esperm at o zoides y células ge rminales de hombres VIH-1 sero p o s i t ivo s
* Va l o res que son signifi c at ivos ± Desviación Estándar obtenida de análisis FAC S.
NS: No signifi c at ivo
3 4 0 - Vol. 25- nº 5 - Sep t i e m b re - O c t u b re 20083 4 0 - E x p resión del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) Vol. 25- nº 5 - Sep t i e m b re - O c t u b re 2008
Fi g u ra 4
Análisis mediante FACS de esperm at o zoides y células ge rminales. Las células fueron teñidas directamente con W6/32 PE
c o n j u gado y CR3/43 FITC conjugado para el HLA clase I y clase II, re s p e c t iva m e n t e. Los controles negat ivos fuero n
e s p e rm at o zoides y células ge rminales inmaduras teñidas con anticuerpos de isótopos irre l evantes conjugados con PE y
FITC. Un pequeño porcentaje presentó marcaje positivo para HLA clase I, que fue siempre similar al porcentaje de células
p o s i t ivas CD45 que quedaron después de nu e s t ro procedimiento de puri ficación. El HLA clase II no fue encontrado en
e s p e rm at o zoides y células ge rminales inmadura s .
D I S C U S I Ó N
E x p resión del MHC en ovocitos humanos y
células del cúmu l u s
La ex p resión de los antígenos MHC en los ga m e-
tos humanos ha rep resentado desde siempre un tema
de interés debido a su posible implicación en la fe rt i-
lidad humana. Este es uno de los pri m e ros trab a j o s
que inve s t i ga la presencia de ARNm de los genes cl á-
sicos del HLA en ovocitos humanos.
En este estudio no detectamos los productos de los
genes HLA clásicos clase I y clase II (DPα y DRα) en
ovocitos humanos no fecundados, indep e n d i e n t e m e n-
te del estado de maduración nu clear (PI, MI, MII) en
el que se encontra ran. El significado funcional que de
estos resultados se desprende es que la ausencia de
ex p resión de HLA se ori gina tanto a nivel de tra n s-
c ripción como de traducción a proteína y que la ex-
p resión de HLA puede empezar a darse cuando co-
mienza la tra n s c ripción propiamente embri o n a ria y
no antes.
De hecho, se piensa que procesos de regulación de
ex p resión génica como son la metilación del ADN
pueden estar evitando la ex p resión de dichos loci (12).
El hecho de que ni ovocitos ni esperm at o zo i d e s
ex p resen en su superficie los antígenos HLA cl á s i c o s ,
los haría suscep t i bles al ataque inmu n o l ó gico media-
do por células NK (2), fue por este motivo por el cual
se decidió ave riguar si por ellos mismos existía ex-
p resión de los determinantes no clásicos, esto es ex-
p resión de HLA-G. La búsqueda de este antígeno era
i m p o rtante en tanto en cuanto su presencia podría re-
p resentar protección frente a los NK deciduales ma-
t e rnos tal como se pensaba ocurría con el tro fo bl a s t o
ex t rave l l o s i t a rio que invade la decidua mat e rna (3).
Sin embargo, nosotros no detectamos ARNm para el
HLA-G en ovocitos no fecundados. Nuestros re s u l t a-
dos no ap oyan artículos previos (8) en los cuáles la
p resencia de mRNA del HLA-G fue detectado por
RT-PCR usando RNA de un pool de ovocitos con fa-
llo de fecundación. En nu e s t ro estudio, el cDNA ob-
tenido de los ovocitos se utilizó para realizar PCR
con el mismo set de primer capaces de amplificar una
t e rc e ra parte de una célula de cori o c a rcinoma JEG-3
en nu e s t ras condiciones ex p e rimentales. El uso de un
s egundo set de pri m e rs también específico para HLA-
G ve ri ficó la ausencia del HLA-G en los ovo c i t o s .
Tres de 26 (11,5%) ovocitos con fallo de fe c u n d a c i ó n
analizados para la ex p resión del HLA clase I y cl a s e
II mostra ron una inmunotinción intensa para estos
dos antígenos.Sin embargo, como también se obser-
va ron uniones no específicas de los anticuerpos, un
14% ap roximadamente de los controles negat ivos re-
s u l t a ron positivos y pensamos que podría existir cier-
ta afinidad del fl u o ro c romo por la membrana del ovo-
cito o a la zona pelúcida, como ha sido mostrado en
ratón con FITC (13), o bien una podría existir una
unión no especifica a los re c ep t o res Fc, los cuáles se
conoce que se ex p resan en los ovocitos humanos
(14). Roberts et al., 1992 inve s t i ga ron sobre un pat r ó n
atípico de la ex p resión de la proteína HLA en ovo c i-
tos con fallo de fecundación que habían sido fi j a d o s
en acetona, donde 2 (18%) de 11 ovocitos eran teñi-
dos positivamente con el mismo anticuerpo monocl o-
nal W6/32, el cual también reconoce al HLA-G (7).
O t ros estudios, sin embargo, no detectaron la ex p re-
sión de ninguna molécula de HLA de clase I o cl a s e
II en ovocitos no fecundados, ovocitos con fe c u n d a-
ción anormal o embriones bloqueados (5, 6). Otra s
i nve s t i gaciones han descrito una alta ex p resión super-
ficial de HLA-G en ovocitos con fallo de fe c u n d a-
ción; concretamente 6 de 13 ovocitos (46%) con el
a n t i c u e rpo monoclonal W6/32, y 15 de 25 (60%) con
el anticuerpo de ratón (8). La función del HLA-G en
ovocitos sigue estando poco cl a ra ya que, antes de la
implantación, los ovocitos no deberían estar en con-
tacto con las células NK deciduales o con los linfo c i-
tos citotóxicos que serían los únicos tipos celulare s
c apaces de at a c a rlos. En cualquier caso, tal vez otro
tipo de mecanismo de defensa como la presencia de
la zona pelúcida y las proteínas reg u l a d o ras del com-
plemento ex p resadas en los ovocitos podrían ser mu y
i m p o rtantes para la defensa inmune de él mismo du-
rante el período pre i m p l a n t at o rio (7, 15). Por otro la-
do, la ausencia de las moléculas de HLA en los ga m e-
tos tiene cierto sentido ya que sería crucial para
p e rmitir la evolución evitando el re ch a zo si la ge n e ra-
ción de nu evos alelos ocurre bien por causas ge n é t i-
cas o bien por conve rsión génica.
O t ras de las células asociadas al ovocito que se es-
t u d i a ron fueron las células del cúmulus, su análisis
mostró ex p resión positiva para HLA clase I, pero
también ex p resión para los determinantes de tipo II
como DPα y DRα. Nuestros resultados ap oyan dat o s
a n t e ri o res que demu e s t ran la reacción positiva de
c i e rtas subpoblaciones de células del cúmulus (ex c ep-
to las células del cúmulus de la corona), para los antí-
genos DP y DR (6). Hill et al en 1990 también ap o rt ó
que las células de la gra nulosa de los ova rios estimu-
lados con go n a d o t ropinas ex p re s aban antígenos del
HLA de clase II e interferón gamma (INF-γ) puede
inducir la ex p resión del HLA clase II en las células
de la gra nulosa (16). La mayoría de las células de los
m a m í fe ros son capaces de endocitar y procesar las
p roteínas antigénicas. La ex p resión del HLA clase II
- 3 4 1Vol. 25- nº 5 - Sep t i e m b re - O c t u b re 2008 E x p resión del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) - 3 4 1Vol. 25- nº 5 - Sep t i e m b re - O c t u b re 2008
3 4 2 - E x p resión del Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC)
a nivel de proteínas y RNAm puede permitir a las cé-
lulas del cúmulus funcionar como células pre s e n t a d o-
ras de antígenos. Además, la ex p resión del HLA cl a s e
II no es un fenómeno aislado, otras células como las
células epiteliales de la trompa de Falopio son cap a-
ces de ex p resar antígenos del HLA clase II en condi-
ciones fi s i o l ó gicas normales (17).
E x p resión del MHC en esperm at o zoides humanos
y células ge rminales inmadura s
El análisis de los esperm at o zoides mostró que,
aunque son positivos para RNAm de ß-actina, no po-
seían tra n s c ritos para los genes clásicos del HLA cl a-
se I y clase II y para el HLA-G. Nuestros datos, aun-
que de acuerdo con algunas inve s t i gaciones (18, 19),
no concuerdan con otros estudios que describen la ex-
p resión de las moléculas clásicas del HLA clase I y
HLA-G en los esperm at o zoides maduros demostra d o
mediante RT-PCR (20, 21). Sin embargo, las células
ge rminales inmaduras del semen, ex p re s a ron HLA
clase I y clase II (DPα y DRα) incluso los determ i-
nantes no clásicos como HLA-G; los cuáles, de
a c u e rdo con los resultados previos, mu e s t ran que tan-
to los esperm at o zoides como las espermátidas aisla-
das del testículo contienen bajos niveles de RNA m
del HLA clase Ia y Ib (22, 19). Además estos dat o s
indican que estos genes se tra n s c riben de fo rma conti-
nua o bien se presentan como RNAm estables en las
células ge rminales a lo largo de su viaje por el tra c t o
rep ro d u c t ivo. Los mecanismos postraducionales ne-
c e s a rios para evitar la presencia de moléculas del
MHC en la membrana de las células ge rminales per-
manecen desconocidos. La presencia de rep re s o re s
t raduccionales se ha suge rido para otros RNAm en el
testículo (23). Otra posibilidad es la pérdida de la
ß2m i c rog l o bulina cuya síntesis se encuentra detenida
en el estado de espermátida (22). Las proteínas de
HLA también se encontra ron ausentes en el esperm a-
t o zoide humano (24, 25).
El análisis FACS de los esperm at o zoides y de las
células ge rminales, en hombres fértiles e infértiles re-
veló que incluso después de la eliminación de las po-
blaciones de células redondas y células ge rm i n a l e s ,
puede haber ra s t ros de contaminación con otros tipos
c e l u l a res, lo cual puede admitirse dentro del error de
la técnica o incluso de los procesos de puri fi c a c i ó n .
Ap roximadamente el 50% de nu e s t ras mu e s t ras con-
tenían un 1% de células blancas determinadas por an-
t i c u e rpos CD45-CD14, y estas mu e s t ras son positiva s
cuando se analiza la ex p resión de los antígenos del
HLA. Ninguna de las mu e s t ras negat ivas para CD45-
CD14 ex p resó antígenos del HLA. Nuestros re s u l t a-
dos, de acuerdo con previos estudios, describen la au-
sencia de moléculas de HLA clase I y II en células
ge rminales inmaduras obtenidas del tejido testicular
(26, 22) o del semen (27). La ex p resión de los antíge-
nos del HLA en las fracciones enriquecidas del esper-
ma y células ge rminales de va rones fértiles e infért i-
les fue similar a la encontrada en va rones fért i l e s ,
como ha sido previamente descrito (28). En este estu-
dio el 14% de los pacientes infértiles ex p resó HLA
clase I y II y los dos antígenos fueron siempre asocia-
dos con unos y otros en todos los casos con pre s e n c i a
de células blancas. Dado que la leucocitospermia está
asociada en mu chos casos con la pobre calidad esper-
mática (29), es posible que estas mu e s t ras tengan más
contaminación con células blancas que cuando solo
se usa la técnica del swim-up. Se ha demostrado que
los linfocitos T CD4, los cuáles producen IFN-γ, son
nu m e rosos en el testículo de los hombres que pade-
cen una obstrucción testicular unilat e ral, pacientes
p o s t vasectomía con anticuerpos antiesperm at o zo i d e
(30) y hombres infectados con VIH-1 (31). La con-
c e n t ración local de IFN-γ en el tejido testicular podría
inducir la ex p resión del HLA en las células dentro de
un área esperm at ogénica específica. Sin embargo, ha
sido demostrado que las células ge rminales son nega-
t ivas para la ex p resión superficial de HLA clase I, en
h o m b res con anticuerpos en el esperma (32), así co-
mo en va rones positivos para VIH.
Dada la discrepancia en los resultados de ex p re-
sión de HLA en los esperm at o zoides, algunos autore s
han propuesto un mecanismo dependiente del ciclo de
la inhibina para explicar la discrepancia en la ex p re-
sión superficial del HLA entre los distintos grupos de
i nve s t i gación (21); nosotros analizamos un total de 26
mu e s t ras pero ninguna de ellas tenía un incre m e n t o
en la ex p resión del HLA que no pudiera haber sido
explicado por la presencia de CBS.
La ausencia deantígenos HLA en la mayoría de es-
p e rm at o zoides, puede ser importante para evitar posi-
bles reacciones inmunes contra antígenos HLA pat e rn o s
ex p resados en la membrana de los zigotos, los cuáles
pueden afectar a la rep roducción normal (33, 34).
Además de la importancia inmu n e, la ausencia de
a n t í genos del HLA en esperm at o zoides y ovocitos su-
gi e re que el HLA no juega el mismo papel en la inte-
racción ovo c i t o / e s p e rma humano como se ha suge ri-
do que ocurre en ratón, o cual podría explicar por qué
no hay ex p resión a estos niveles en humanos (35).
En resumen, nu e s t ros datos indican que el RNA m
de los genes de HLA clase I y II y las moléculas del
HLA-G están ausentes en ovocitos maduros e inmadu-
ros y en esperm at o zoides maduros, sin embargo en las
células ge rminales inmaduras masculinas obtenidas
Vol. 25- nº 5 - Sep t i e m b re - O c t u b re 2008
desde el eyaculado sí que se ex p resan los productos de
los genes del HLA. A pesar de ello los antígenos HLA
clase I y clase II no están normalmente presentes en la
s u p e r ficie de estas células ga m e t ogénicas y esto sugi e-
re la existencia de dife rentes caminos en la ex p re s i ó n
de las moléculas del MHC en las células ge rm i n a l e s
i n m a d u ras masculinas. La ausencia de las moléculas
del HLA puede ser importante en el mantenimiento de
la fi s i o l ogía normal del gameto y posiblemente de su
e s t atus como célula inmu n o p riv i l egi a d a .
AG R A D E C I M I E N TO S
A gradecer a Je n n i fer Nelly, Aida Nure dd i n ,
Shehua Shen, Caroline Balint and Kat hy Ja ckson del
l ab o rat o rio de Fecundación In Vi t ro del Hospital
B righam and Women´s por su colab o ración en la re-
colección de los ga m e t o s .
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