Diagnóstico de Dirofilaria

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Diagnóstico de laboratorio
Desde un punto de vista diagnóstico es muy importante valorar la historia clínica junto al empleo de pruebas basadas en la detección de antígenos de las formas adultas y la observación al microscopio de microfilarias circulantes mediante pruebas de concentración como la prueba modificada de Knott o la prueba de filtración. Sin embargo, serán necesarias otras pruebas complementarias para evaluar el estado interno del paciente (radiología, ecocardiografía, hematología, bioquímica, urianálisis), de forma que los resultados obtenidos de cada una de las pruebas van a permitir la estadificación del paciente
En las áreas enzoóticas la sospecha clínica es fácil de establecer: el perro está cansado y presenta disnea y tos, signos que empeoran con el esfuerzo (intolerancia al ejercicio). Un análisis de sangre revela una anemia no regenerativa, leucocitosis, eosinofilia y neutrofilia. Los perros con enfermedad grave pueden presentar hiperbilirrubinemia, aumento de las enzimas hepáticas, azotemia y proteinuria. La auscultación y el electrocardiograma no ponen de relieve ninguna alteración especialmente característica, pero confirman el diagnóstico de insuficiencia ventricular derecha. El aumento de ALT, que indica degeneración hepatocelular, y el aumento de AST se atribuido a enfermedad hepática o del miocardio debido a ICCD
La infección se confirma mediante la identificación de microfilarias en sangre o la detección de antígenos circulantes de las hembras adultas, principalmente. El antígeno aparecerá en sangre alrededor de los 5 meses tras la inoculación de la larva de tercer estadio. Mientras que, las microfilarias de D. immitis aparecen por primera vez en la circulación al cabo de los 6 meses tras la exposición del perro a la picadura de los mosquitos infectados, por lo que durante el largo período de prepatencia no se pueden detectar microfilarias en las muestras de sangre de un perro infectado.
Detección de microfilarias
1. Observación directa 
Se coloca sobre un portaobjetos una gota de sangre fresca o con anticoagulantes, se cubre con un cubreobjetos y se examina directamente al microscopio. Las microfilarias revelan su presencia al agitar los eritrocitos que están cerca de ellas, moviéndose activamente, de manera ondulante y no progresiva. En general, si se observan más de 5-10 microfilarias por gota de sangre serán probablemente Dirofilaria immitis. Si se observan menos puede ser quizá una infección por otras filarias parasitas
Contras: este método no es adecuado para una identificación específica. Cuando el número de microfilarias es pequeño, pueden obtenerse falsos negativos mediante la observación directa. Para evitar que esto ocurra, se utilizan métodos de concentración o filtración.
También puede ser visible movimiento entre la capa de leucocitos y el plasma en un tubo para microhematocritos (Técnica de Woo). 
2. Concentración mediante el método de Knott
Este método permite obtener resultados más precisos (90%), determinar la ausencia o presencia de microfilarias, también permite observar la morfología y medir las dimensiones corporales con objeto de diferenciar la D. immitis de especies de filarias no patógenas como la Dipetalonema reconditum o Acanthocheilonema reconditum
Procedimiento:
1. Se mezclan 1 ml de sangre con 9 ml de formol al 2% y se centrifugan a 1.500 r.p.m. durante 5 minutos.
2. El sedimento se tiñe en el mismo tubo con unas gotas de azul de metileno al 1% durante 2-3 minutos.
3. Se toma una muestra del sedimento teñido, se coloca sobre un portaobjetos y se cubre con un cubreobjetos.
4. La observación debe hacerse a 40X.
La sensibilidad depende de la técnica, el grado de infección y del momento del día, debido a que las microfilarias circulan más en sangre durante las horas crepusculares. Algunos perros se consideran amicrofilarémicos (sin microfilarias) por diversos motivos como: infección producida únicamente por vermes machos, vermes de mayor edad, tratamiento con lactonas macrocíclicas o destrucción por el sistema inmunitario.
3. Método Histoquímico
Este método de identificación de las microfilarias es esencial porque los perros pueden estar infectados por diversas especies. Aunque el diagnóstico diferencial de las microfilarias de los géneros Dirofilaria, Acanthocheilonema o Cercopithifilaria es sencilla, la distinción entre D. immitis y D. repens es más difícil. Se basa en una tinción histoquímica que detecta la actividad enzimática de las fosfatasas ácidas. Las áreas de actividad de las fosfatasas ácidas difieren según la especie de microfilaria implicada. 
· Dirofilaria immitis: Tinción restringida a la región perianal y a la región que rodea el poro excretor.
· Dirofilaria repens: Coloración a nivel del poro anal
4. Método de filtración (difil-test®) 
Procedimiento: 
1. Se mezclan en una jeringa, 1 ml de sangre y 9 ml de carbonato sódico al 1%, agitando para una lisis completa. Se pasa lentamente por un filtro de membrana con un poro de 3 µm.
2. Enjuagar el filtro lentamente con 10 ml de agua destilada para eliminar el exceso de células y detritus. 
3. Colocar el filtro en un porta-objetos. 
4. Colocar 1-2 gotas de colorante, colocar un cubreobjetos y esperar 1 minuto. 
5. Utilizar el objetivo de 100 aumentos para observar las microfilarias teñidas.
Detección de antígenos circulantes
Los análisis rápidos de detección de antígenos de Dirofilaria disponibles actualmente en el mercado detectan las proteínas circulantes secretadas principalmente por la hembra adulta de D. immitis. Estos kits recurren a diferentes técnicas serológicas de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA o aglutinación), que son muy sensibles y permiten incluso detectar a una única hembra. Este test en concreto es específico de D. immitis porque utiliza anticuerpos monoclonales específicos de especie. Los kits pueden utilizarse para el análisis de muestras de perros, pero no de gatos, puesto que solo detectan los antígenos producidos por las filarias hembras adultas y en los felinos los parásitos suelen permanecer en un estadio inmaduro. Existen pruebas serológicas que detectan la respuesta humoral generada en todas las especies, incluida la felina.
Se ha observado que a veces los perros son negativos al antígeno cuando el número de microfilarias es elevado (50.000 a 100.000 por ml). Por tanto, si un perro adulto procede de un área con elevada prevalencia o desconocida, probablemente sería aconsejable examinar también una gota de sangre bajo el microscopio para buscar microfilarias.
El gato se diferencia del perro en varios aspectos relacionados con la infección por el verme del corazón. En primer lugar, los gatos tienden a albergar muy pocos vermes adultos y permanecen amicrofilarémicos. Por eso, por lo general, el examen de la sangre mediante métodos de concentración no es un método de detección fiable, y no hay suficiente antígeno circulante para la detección con diferentes ensayos de detección de antígenos. Existen pruebas de detección de antígenos y anticuerpos disponibles para los gatos. Los anticuerpos simplemente indican que ha habido exposición, y la detección de antígeno puede ser negativa si los gatos están infectados con pocos vermes.
Pruebas complementarias
Radiografía
La radiografía torácica proporciona información insustituible sobre la localización y gravedad de las alteraciones vasculares y del parénquima pulmonar, muestra una cardiomegalia derecha, además de cambios en la ramificación de los vasos pulmonares, lo que es bastante característico. En algunos casos, revela la diseminación de las lesiones orgánicas indicativas de dirofilariosis. 
Ecocardiografía
A diferencia de la radiografía, la ecocardiografía permite diagnosticar la dirofilariosis cardiopulmonar mediante la visualización de los parásitos adultos. También pueden observarse lesiones inespecíficas: dilatación de la arteria pulmonar principal (rama derecha), dilatación del ventrículo derecho (primero hipertrófico, después atrófico). También se observan signos específicos del parásito: filariasadultas en el ventrículo derecho y en el tronco pulmonar (el corte transversal permite visualizar numerosos elementos redondos, de 2-3 mm de diámetro, que se mueven con las contracciones del corazón) y trombos en los vasos pulmonares.