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BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUIMICA ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUIMICA EFECTO IN VITRO DEL ZUMO DE Vaccinium corymbosum L. SOBRE Escherichia coli TESIS I Autores: ADRIANZEN RAMIREZ JILWER JOEL CHIROQUE SANCHEZ JAIME ANDREE Asesor: Dr. Q.F. QUISPE DIAZ IVAN TRUJILLO- PERU 2017 Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A I PRESENTACION Señores Miembros del Jurado: Dando cumplimiento a las disposiciones establecidas en el reglamento de Grados y Títulos de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de Trujillo, sometemos a consideración y elevado criterio científico el presente informe de trabajo de investigación: “EFECTO IN VITRO DEL ZUMO DE Vaccinium corymbosum L. SOBRE Escherichia coli” Es propicia la oportunidad para manifestar mi sincero agradecimiento a los docentes de la Facultad de Farmacia y Bioquímica, quienes en su labor de educadores nos han orientado durante mi formación profesional. En consecuencia, Señores Miembros del Jurado sometemos el presente trabajo para su respectiva evaluación y veredicto, esperando sea de interés y gran utilidad para la facultad y la sociedad. Trujillo, enero de 2017 ____________________________ ______________________________ Adrianzén Ramírez, Jilwer Joel Chiroque Sanchez, Jaime Andree Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A iii JURADO EVALUADOR Dra. Mantilla Rodríguez Ana Elena _________________ Presidente Mg. Ybañez Julca Roberto Osmundo _________________ Miembro Dr. Quispe Díaz Iván Miguel _________________ Miembro Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A iv DEDICATORIA Para mis padres por su apoyo, consejos, comprensión, amor, ayuda en los momentos difíciles, y por ayudarme con los recursos necesarios para estudiar. Me han dado todo lo que soy como persona, mis valores, mis principios, mi carácter, mi empeño, mi perseverancia para lograr mis sueños. ADRIANZEN RAMIREZ JILWER JOEL Esta tesis se la dedico a Dios quién supo guiarme por el buen camino, darme fuerzas para seguir adelante y no desmayar en los problemas que se presentaban, enseñándome a encarar las adversidades sin perder nunca la dignidad ni desfallecer en el intento. CHIROQUE SANCHEZ JAIME ANDRE Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A v AGRADECIMIENTO Queremos agradecer al Dr. Iván Miguel Quispe Díaz, por habernos permitido trabajar en esta investigación y guiarnos con sus conocimientos en el desarrollo de la presente tesis. A los miembros del jurado Dr. Roberto Ibáñez Julca, Dra. Elena Mantilla Rodríguez, por los conocimientos impartidos durante la carrera profesional. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A vi INDICE Página RESUMEN i ABSTRAC ii I. INTRODUCCIÒN 1 II. OBJETIVOS 7 III. MATERIAL Y METODO 8 IV. RESULTADOS 17 V. DISCUSIÒN 19 VI. CONCLUSIONES 23 VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 24 ANEXOS 29 Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A ii RESUMEN El presente estudio tuvo como objetivo evaluar el efecto del zumo de Vaccinium corymbosum L. sobre el crecimiento in vitro de la cepa de Escherichia coli. La cepa empleada fue reactivada en caldo Müller Hinton y se incubó durante 18 horas a 37°C. Luego se tomó una asada de la bacteria y se ajustó con solución fisiológica al patrón de turbidez de Mac Farland N°0.5 (1.5x108 UFC/mL) para la realización del ensayo se procedió a determinar la concentración mínima bactericida (CMB) y la concentración mínima inhibitoria (CMI). Los resultados obtenidos muestran un efecto inhibitorio del zumo de Vaccinium corymbosum L. sobre Escherichia coli, por presentar una menor turbidez del medio que contuvo a Escherichia coli en 50uL al 100%v/v y para la concentración mínima bactericida (CMB) se pudo evidenciar que el zumo de Vaccinium corymbosum L. difunde sobre la cepa de Escherichia coli, a la concentración de 100% v/v, evidenciándose un halo de 4 mm de diámetro. Palabras claves: Vaccinium corymbosum L., Escherichia coli. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A ii ABSTRACT This study aimed to evaluate the effect of juice Vaccinium corymbosum L. on the in vitro growth of Escherichia coli strain. The strain used was reactivated in Müller Hinton broth and incubated for 18 hours at 37 ° C. Then a roast of the bacteria was taken and adjusted with saline solution turbidity standard Mac Farland No. 0.5 (1.5x108CFU / mL) for the conduct of the trial proceeded to determine the minimum bactericidal concentration (MBC) and the concentration minimal inhibitory (MIC). The results show an inhibitory effect of juice Vaccinium corymbosum L. on Escherichia coli, have a lower turbidity medium containing Escherichia coli in 50uL 100% v / v for the minimum bactericidal concentration (MBC) was evident that the juice Vaccinium corymbosum L. spreads on the strain of Escherichia coli, at the concentration of 100% v / v, showing a halo of 4 mm in diameter. Key words: Vaccinium corymbosum L., Escherichia coli. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A I. INTRODUCCION Las infecciones urinarias (IU) se encuentran entre las enfermedades microbianas más prevalentes1.2. Se estima que globalmente ocurren al menos 150 millones de casos de infecciones al tracto urinario (ITU) por año3. En los Estados Unidos, las IU son responsables de más de 7 millones de visitas médicas al año4. En torno al 15% de todos los antimicrobianos de prescripción comunitaria en los Estados Unidos se dispensa por IU, con un coste anual calculado que supera los 1 000 millones de dólares4. En el Perú se desconocen cifras exactas de su incidencia. Más de la mitad de todas las mujeres tiene al menos una ITU, durante su vida y su presentación más común es durante el embarazo. Afecta al 50% de las mujeres, siendo rara en los hombres de 20 a 50 años2. En el adulto mayor, la ITU, es la infección bacteriana más común.1 Las ITU, son clasificadas de diversas formas: alta o baja, aguda o crónica, no complicada o complicada, sintomática o asintomática, nueva o recurrente y comunitaria o nosocomial. 1 En cuanto a su etiología, más del 95% son monomicrobianas, siendo Escherichia coli el microorganismo implicado con mayor frecuencia (70-80% de los casos). Menos frecuente puede aparecer Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis, Staphylococcus saprophyticus (casi exclusivo de mujer premenopáusica), Streptococcus agalactiae, Klebsiella pneumoniae y otros bacilos Gram negativos. 2 En los últimos años se ha observado en muchos hospitales y clínicas privadas variaciones significativas en la susceptibilidad microbiana, observándose la aparición progresiva de resistencia a las cefalosporinas de primera, segunda y tercera generación, fluoroquinolonas y otros antimicrobianos comúnmente empleados en el tratamiento empírico de la ITU extra hospitalaria. 3 1 Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 2 La resistencia bacteriana en nuestro medio hospitalario peruano actualmente es un problema con una serie de bacterias, principalmente las Gram negativas. En un estudio previo, Escherichia coli tuvo una sensibilidad a ciprofloxacino en el 26% de los casos y a ceftriaxona en el 43%, por lo que los autores no recomiendan su uso como terapia empírica1. Del mismo modo se encontró una resistencia menor al 10% para amikacina. 4 En pacientes con ITU complicada (malformaciones, cateterización, falla renal crónica, inmunosupresión, trasplante renal, hemodiálisis y diálisis peritoneal) e ITU recurrente la resistencia antibacteriana a ampicilina fue 73%, ceftriaxona 11,8%, cefalexina 41,1%, ciprofloxacino 3,8%, gentamicina 43,2%, meropenem 2%, ácido nalidixico 29,3%, nitrofurantoína 13,3%, norfloxacino 11% y trimetoprima-sulfametoxazol 59,5%.5 Las tasas de resistencia antibacteriana han sufrido importantes variaciones con los años, por lo que el tratamiento empírico de la ITU, requiere la constante actualización de la sensibilidad antibiótica de las principales bacterias causantes de la zona, país o institución donde se trabajen, en particular de Escherichia coli, el principal uropatógeno. 6 Aunque los antibióticos son casi siempre efectivos para eliminar la infección de la vejiga, el tratamiento con antibióticos no necesariamente previene infecciones recurrentes en la misma persona a menos de que se eliminen las bacterias contaminantes del colon y del tracto vaginal. La terapia profiláctica con antibióticos puede ser utilizada también para prevenir recurrencias en mujeres con ITU. 1 Las infecciones en pacientes hospitalizados son causadas mayoritariamente por bacterias multirresistentes a los antibacterianos adquiridos en el ambiente hospitalario. Las infecciones renales son más difíciles de tratar que las infecciones de la vejiga debido a que algunos antibióticos no llegan adecuadas concentraciones al tejido renal. 7 El antibacteriano de mayor prescripción para la cistitis aguda es la nitrofurantoina por vía oral, o una combinación de sulfonamida-trimetoprim, Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 3 asimismo, se pueden utilizar amoxicilina, cefalexina o ciprofloxacina. Cada uno de estos regímenes curaba del 90 al 95% de cistitis agudas en mujeres, sin embargo, esto ha cambiado debido a las resistencias desarrolladas por las bacterias ante estos y otros antimicrobianos. 7 La capacidad de Escherichia coli para adquirir genes de resistencia hace impredecible determinar su sensibilidad a diferentes antimicrobianos, por tal motivo es muy recomendable realizar antibiogramas. 7 Hoy en día la medicina natural tiene un auge sin precedentes en todo el mundo, estos conocimientos populares, son fuentes de estudio en busca de nuevos conocimientos y medicamentos más efectivos con menos efectos secundarios. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), el 80% de la población mundial recurre a la medicina natural para atender sus necesidades básicas de salud. 8,9 En el Perú existen unas 20 000 especies de plantas a las que se les atribuyen propiedades medicinales, de las cuales 1 109 son plantas medicinales nativas, utilizadas por los grupos indígenas para cubrir sus necesidades de salud. 10 En la actualidad, los medicamentos modernos presentan con más frecuencia, una serie de contraindicaciones y efectos indeseables, lo que no sucedía al usar los remedios en su forma natural2. Agregado a esto, gran parte de la población no pueden acceder a la medicina convencional. En gran parte por sus costos elevados por lo que recurren a la compra de plantas medicinales.11 Se han utilizado diversas técnicas microbiológicas para demostrar la actividad antimicrobiana de plantas frente a microorganismos patógenos para el hombre. Entre ellas la utilización de extractos, por ejemplo: decoctos e infusiones. 12 Estos antimicrobianos de origen vegetal tienen un potencial terapéutico enorme. Son eficaces en el tratamiento de enfermedades infecciosas y al mismo tiempo pueden mitigar muchos de los efectos secundarios que se asocian a menudo con antimicrobianos sintéticos13. Se han realizado diversos estudios de los extractos de plantas sobre los efectos antimicrobianos de muchas bacterias. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licenciaCreative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 4 En un reporte sobre la evaluación de la actividad antimicrobiana de extractos etanólicos y/o aceites esenciales de las especies vegetales, Hesperomeles ferruginea “pujin”, Myrciantes rhopaloides “arrayán negro” y Passiflora manicata “flor de la pasión” frente a microorganismos patógenos y fitopatógenos; al analizar los resultados de los diferentes ensayos señalaron que el extracto etanólico de Passiflora manicata presentó mayor actividad antimicrobiana frente a Escherichia Coli, Candida albicans y bacillus subtilis. 14 En otro estudio, donde se analiza los principios activos de especies mexicanas de Pimpinella anisum “anís” y evaluación de su actividad biológica sobre microorganismos patógenos, se reportó que la extracción metanólica de Pimpinella anisum, presenta una inhibición porcentual del 75 % sobre Escherichia coli a una concentración mínima inhibitoria (CMI) de 45.5 mg. 15 En el siguiente estudio sobre la actividad antibacteriana in vitro del extracto etanólico de propolis de Apis mellífera en bacterias aisladas, de pacientes del centro referencial de la libertad, se reportó que el extracto posee buena actividad antibacteriana contra Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Pseudomona aeruginosa y Serratia marcescens. En este estudio se evidenció que para el caso de la Escherichia coli, a una concentración de 23% presentó un efecto bactericida. 16 El arándano o mora azul (Vaccinium corymbosum L.) es un frutal menor nacido nativo de Norteamérica, que pertenece a la familia de las Ericáceas, subfamilia Vacciniaceae, subgénero Cynacoccus y es considerado dentro del grupo de las frutillas. 17 Es un arbusto pequeño de 0.2 – 0.4 metros de altura, aunque existen variedades que llegan a medir 2.5 metros. Tanto los tallos como las hojas están cubiertas por un polvo blanquecino llamado pruina cenicienta, las hojas son persistentes, con espinas en el pecíolo y nervio medio, verde oscuro en el haz y blancuzco en el envés. Es un arbusto longevo, de hoja caduca y de madera leñosa. Las flores, miden de 2 – 3 cm de diámetro y son de color blanco o rosado. 17 Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 5 El fruto es una baya casi esférica, que dependiendo de la especie y cultivar puede variar en tamaño de 0,7-1,8 cm de diámetro y posee un color azul metálico18. En la base de la planta se encuentra la corona, de donde se forman los tallos, la cual está conformada por una gran cantidad de raíces superficiales. El sistema radicular es profundo, puede llegar a profundizar más de un metro dependiendo del suelo y el subsuelo. 17 El arándano azul, es la cuarta frutilla de interés económico en el mundo, debido al contenido de antioxidantes y a la resistencia del cultivo a diversas condiciones ambientales adversas. Sus propiedades antioxidantes se atribuyen al contenido de flavonoides, antocianinas, polifenoles y ácido ascórbico. 19 El jugo de arándano es una opción para prevenir la infección de vías urinarias, cualidad demostrada en diferentes publicaciones recientes, en las que se destaca que su mecanismo de acción radica en el efecto que ejercen las proantocianidinas, especialmente las de tipo A, en el urotelio, que evitan que Escherichia coli se adhiera a éste; es así como ejerce su acción antibacteriana20. Experimentos in vitro han demostrado reducción de la adhesión de Escherichia coli a las células endoteliales cuando las bacterias son preincubadas con 5 a 75 mg de proantocianidinas tipo A. También se ha demostrado in vitro que estas proantocianidinas modifican la superficie celular de las bacterias al capturar los lipopolisacáridos de la pared celular y modificar los patrones de unión a las células epiteliales. 20 Las investigaciones recientes sugieren que el consumo de arándano previene la adhesión bacteriana de uropatógenos, especialmente Escherichia coli, que es la causante de 90% de las infecciones de vías urinarias. 20 Existe una creencia generalizada de que el jugo de arándano puede tratar las infecciones del tracto urinario. No hay evidencia concluyente de ya sea in vitro o en estudios in vivo para confirmar esto. Sin embargo, hay una fuerte evidencia in vitro e in vivo que confirma la hipótesis de que las infecciones urinarias se puede prevenir por la disminución de la adherencia bacteriana a las células uroepiteliales. 21 Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 6 El mecanismo beneficioso históricamente se creía que se debe a los ácidos de frutas que causan un efecto bacteriostático en la orina. Sin embargo, recientemente, investigadores reportan que los metabolitos que participan en la actividad antiadhesiva bacteriana contra cepas susceptibles y resistentes a los antimicrobianos de Escherichia coli; se debe a las proantocianidinas (PACs) tipo A.22 En el mundo, los principales países productores son Estados Unidos y Canadá. Perú se considera como una región no tradicional en la producción de arándanos junto con otras regiones subtropicales como el norte de Argentina, Chile y España; En nuestro país la producción de arándanos se desarrollan en: Mala, Cañete, Arequipa, La Libertad, Caraz, Pisco, Cajamarca, Cusco y Lima. 23 Cada día se hace más difícil el tratamiento antimicrobiano por la capacidad de dichos microorganismos de crear resistencia, tal fenómeno ha sido considerado emergente en todo el mundo, especialmente en los hospitales mostrando cifras anuales en aumento del 25% en el manejo de pacientes. Los fármacos disponibles actualmente, tienen una toxicidad importante, producen recurrencia o causan resistencia, razón por la cual se está procurando descubrir nuevos agentes antimicrobianos más potentes, pero sobre todo seguros. Los consumos de frutas y/o zumo de Vaccinium corymbosum L. es de interés en este contexto porque comprenden alternativas más seguras y eficaces que los agentes antimicrobianos producidos sintéticamente, lo cual motiva a que estos compuestos naturales sirvan como base para el desarrollo de nuevos agentes antimicrobianos que sean más eficaces que los sintéticos. En base a los antecedentes se formula el siguiente problema: ¿Cuál es el efecto In Vitro del zumo de Vaccinium corymbosum L. sobre Escherichia coli? Postulándose la siguiente hipótesis. El zumo de Vaccinium corymbosum L. tiene efecto antibacteriano in vitro sobre Escherichia coli; debido a la presencia de antocianinas. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 7 II. OBJETIVOS 2.1. Objetivo general: Evaluar el efecto In Vitro del zumo de Vaccinium corymbosum L. sobre Escherichia coli2.2. Objetivos específicos: Determinar la concentración mínima inhibitoria (CMI) del zumo de Vaccinium corymbosum L. sobre Escherichia coli. Determinar la concentración mínima bactericida (CMB) del zumo de Vaccinium corymbosum L. sobre Escherichia coli. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 8 III. MATERIAL Y MÉTODO 3.1. MATERIAL 3. 1.1. Material de estudio 1.5 Kg de frutos de Vaccinium corymbosum L. 3.1.2. Material de vidrio Placas Petri 100x15mm Frasco de vidrio ámbar con tapa de plástico de 100ml Tubos de ensayo 150x15mm 3.1.3. Equipos Balanza triple brazo OHAUS 700/800 series Liofilizador LABCONCO 195 (A65412906) Incubadora Memmert Congeladora Coldex 271lt Extractor de fruta Imaco. 3.1.4. Reactivos Tricloruro férrico al 3%, Sigma Ácido clorhídrico concentrado 37% de pureza Sigma Magnesio metálico Sigma Anhídrido acético 98% pureza Sigma Ácido Acético glacial 99.8% de pureza Sigma Ácido Sulfúrico 98% de pureza Sigma Acido benzoico 99.5% de pureza Sigma Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 9 Tolueno 99.5% de pureza Sigma Diclorometano 98% de pureza Sigma Hidróxido de sodio al 10% Sigma Metanol 99.5% pureza Sigma Etanol de 96°GL Alkofarma Agua destilada Agua bidestilada Medifarma 3.1.5. Material Microbiológico Escherichia coli ATCC 25992 3.1.6. Material Farmacológico. Ciproquin (Ciprofloxacino) 200mg/100ml solución inyectable para inyección LT 2F51675 Claris Lifesciences Limited. 3.1.7 Medios de cultivo. Agar Müller Hinton LT 35124 Britania Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 10 3.2. MÉTODOS 3.2.1. Identificación taxonómica. La especie de Vaccinium fue llevada al Herbariun Trujillense de la Universidad Nacional de Trujillo, para su identificación taxonómica, esta fue determinada mediante el código 58493, para su identificación se registraron los siguientes datos; familia, nombre científico, hábito, procedencia y altitud. 3.2.2. Método farmacognóstico 3.2.2.1. Obtención de la muestra Los frutos maduros y frescos de Vaccinium corymbosum L. de entre 12 y 15 mm de diámetro fueron obtenidos del valle de Virú (50 msnm), distrito de Virú provincia de Virú, departamento La Libertad, latitud sur 08°24' 34", longitud oeste 78°45' 05" en el mes de abril, del 2016. 3.2.2.2. Preparación de la muestra Las muestras Vaccinium corymbosum L. fueron lavadas con agua destilada, se cortó por la mitad retirándose las pepas y se realizó cortes del pericarpio en rajas de 5 cm de largo y 0,5 cm de ancho. Las muestras fueron depositadas en bandejas de aluminio en finas capas y se congelaron a - 40°C durante 24 horas antes de su liofilización, a 0,026 bars y a -58°C durante 48 h. El Vaccinium corymbosum L. liofilizado se trituró para la obtención de un producto en polvo. La liofilización se realizó en la Escuela de Ingeniería Industrial, Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Nacional de Trujillo. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 11 3.2.3. IDENTIFICACION DE METABOLITOS 3.2.3.1. MARCHA FITOQUÍMICA24 Basada en la separación por disolventes de diferente polaridad y la identificación Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 12 3.2.3.1. 1. Extracto acuoso 3.2.3.1. 1.1. Identificación de Flavonoides: Reacción de Shinoda: Se midió X gotas del zumo de Vaccinium corymbosum L., lo llevamos a sequedad, después se redisolvió en 1 ml de metanol y trasvasamos a un tubo de ensayo agregamos limadura de magnesio metálico más II gotas de HClcc. 3.2.3.1. 1.2. Identificación de Fenoles: Reacción con Tricloruro férrico: Se midió X gotas del zumo de Vaccinium corymbosum L., en un tubo de ensayo, luego lo llevamos a sequedad, después se redisolvió en 1ml de metanol y se añadió II gotas de tricloruro férrico al 5% en etanol. 3.2.3.1. 1. 3. Identificación de Saponinas: Ensayo de espuma: Se midió XX gotas del zumo de Vaccinium corymbosum L. Agitamos vigorosamente por 30 segundos y, esperamos 15 en reposo. 3.2.3.1. 1. 4. Identificación de Antocianinas Ensayo de Rosenhein: Se midió XX gotas del extracto y lo llevamos a sequedad; se redisolvió el residuo en X gotas de solución de ácido clorhídrico 2N/1-propanolol, transvasamos a un tubo de ensayo y lo llevamos a ebullición de 15-30 minutos en baño maría. 3.2.3.1. 2. Extracto diclorometánico. 3.2.3.1. 2.1. Identificación de Quinonas: Reacción de Borntranger: Se midió X gotas del zumo de Vaccinium corymbosum en una capsula, luego lo llevamos a sequedad y después se redisolvió en XX gotas de tolueno, transvasamos a un tubo de ensayo y agregamos XX gotas de NaOH 10%. Agitamos mezclando las fases y se dejó en reposo hasta su recuperación. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. 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La concentración mínima inhibitoria (CMI), del zumo Vacciniun Corymbosun L. se trabajó por triplicado, mediante el método de dilución en caldo Müller Hinton, a la concentración de 5%v/v, 25%v/v, 50%v/v y100%v/v, utilizando agua bidestilada como solvente y blanco y, al ciprofloxacino como control. 3.2.4.2. Preparación de ciprofloxacino. Se utilizó 200ul de ciprofloxacino, a la concentración de 2mg/ml como control positivo para determinar la concentración mínima bactericida y 10ul para la concentración mínima inhibitoria a la misma concentración. 3.2.4.3. DETERMINACION DE LA CONCENTRACION MINIMA BACTERICIDA (CMB). La concentración mínima bactericida (CMB). Es la menor concentración capaz de destruir o matar 105 bacterias en 1 ml de medio de cultivo, tras 18-24 horas de incubación. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 14 3.2.4.3.1. Método de difusión de agar en placa 3.2.4.3.1.1. Preparación de la muestra Para la preparación de la muestra se pesó 50 g de Vaccinium corymbosum L. fresco, para posteriormente extraer el zumo (2-3 mL) por medio de un extractor de frutas. 3.2.4.3.1.2. Reactivación del cultivo La bacteria fue reactivada en caldo de Müller Hinton y se incubó durante 24 horas a 37°C. Luego se tomó una asada de la bacteria y se ajustó con solución fisiológica al patrón turbidez de Mac Farland N°0.5 (1.5x108 UFC/mL). 3.2.4.3.1.3. Sembrado Se colocó en 6 placas petri, 20 mL de Agar Müller Hinton, luego se sembró Escherichia coli mediante siembra en superficie. Se tomó un hisopo y se distribuyó uniformemente girando cada placa 30 grados por 10 veces aproximadamente. Sobre una de las placas sembradas se realizó 2 perforaciones en las cuales se colocó 200 µL del zumo Vaccinium corymbosum L. a las diferentes concentraciones de 5% v/v, 25%v/v, 50% v/v y 100% v/v y en otra placa se realizó 2 perforaciones en las cuales se colocó como blanco 200µL de agua bidestilada y control al ciprofloxacino 200mg/100 mL en cada perforación. Luego las placas petri se incubaron a 37°C por 24 horas. Se determinó los diámetros de halo de inhibición del zumo de Vaccinium corymbosum L. a las concentraciones de 5% v/v, 25% v/v y 50%v/v frente a Escherichia coli. Finalmente, se midió el halo de inhibición utilizando una regla milimetrada. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 15 3.2.4.3.2. DETERMINACION DE LA CONCENTRACION MINIMA INHIBITORIA (CMI). La concentración mínima inhibitoria (CMI). Es la menor concentración de antibiótico capaz de inhibir el crecimiento de 105 bacterias en 1 ml de medio de cultivo, tras 18-24 horas de incubación. 3.2.4.3.2. Método de Dilución en caldo Muller Hinton 3.2.4.3.2. 1. Preparación de la muestra A partir del zumo de Vaccinium corymbosum L. se prepararon diluciones a concentraciones de 10µL, 20 µL, 30 µL, 40 µL y 50 µL disueltos en agua bidestilada. 3.2.4.3.2. 2. Reactivaciones de las cepas Las cepas de Escherichia coli fueron reactivadas en caldo Müller Hinton y se incubó durante 18 horas a 37°C. Luego se tomó una asada de la bacteria y se ajustó con solución fisiológica al patrón de turbidez de Mac Farland N°0.5 (1.5x108 UFC/mL). 3.2.4.3.2. 3. Enfrentamiento con el microorganismo Se utilizaron tubos de ensayo, en los cuales se colocó 1mL de agar de Müller Hinton (AMH) y cuando el medio aún estuvo líquido se añadió 10 µL de cada una de las concentraciones de las diluciones del zumo preparadas anteriormente, luego en cada tubo de ensayo se colocó 2 µL de la suspensión de la bacteria y se incubó a 37°C por 24 horas. Se empleó como control al ciprofloxacino 50µl a una concentración de 2mg/mL y se trabajó bajo las condiciones anteriormente descritas. Después de 24 horas de incubadas a 37°C, los tubos de ensayo se examinaron visualmente. Se consideró la concentración mínima inhibitoria a la menor concentración de la dilución del zumo a la cual el microorganismo ensayo no presentó desarrollo visible. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 16 3.3. LECTURA E INTERPRETACIÒN DE RESULTADOS. La lectura de los resultados del CMB se realizó en aquellas placas donde el antimicrobiano fue capaz de eliminar completamente el desarrollo bacteriano o que eliminó al 99,9% de bacterias, comparándolo con el control positivo. Para la lectura del CMI, se utilizó como criterio la turbidez, para esto se colocó cruces de acuerdo a la intensidad de turbidez en los diferentes tubos de ensayo, máximo de cruces fueron 3, este es que presenta mayor turbidez y cero (0), al que presenta la CMI. La CMI fue interpretada como la concentración de antimicrobiano, contenida en el tubo de la serie que inhibió el crecimiento visible de la bacteria, para lo cual fue necesario comparar cada uno de los tubos con los controles positivo y negativo. 3.4. EVALUACIÓN ESTADÍSTICA 26 Se realizó la prueba estadística de ANOVA para hallar la diferencia significativa de la concentración de mínima bactericida a diferentes concentraciones del zumo de Vaccinium corymbosum L. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 17 IV. RESULTADOS Tabla 1. ANOVA de la concentración mínima bactericida del zumo de Vaccinium corymbosum L. frente a Escherichia coli. A=5% de zumo de Vaccinium corymbosum L., B=25% de zumo de Vaccinium corymbosum L., C=50% de zumo de Vaccinium corymbosum L., D=100% de zumo de Vaccinium corymbosum L. Fuente: Investigadores Gràfico 1. Diámetro promedios de los halos de inhibición de crecimiento bacteriano de Escherichia coli por acción del zumo de Vaccinium corymbosum L. y Ciprofloxacino. 0 10 20 30 40 50 1 0 0 2 4 45 D ia m et ro d e H al o s (m m ) Concentraciòn Vs diámetro de los halos A B C D Ciprofloxacino 2mg/ml Origen de las variaciones Suma de cuadrados Grados de libertad Promedio de los cuadrados F Probabilidad Valor crítico para F Entre grupos 20,16944444 5 4,033888889 0,969231796 0,474148863 3,105875239 Dentro de los grupos 49,94333333 12 4,161944444 Total 70,11277778 17 Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 18 Tabla 2. Evaluación de la concentración mínima inhibitoria de Vaccinium corymbosum L., ciprofloxacino y agua bidestilada frente a Escherichia coli por dilución en agar. Muestra Concentración Número de muestra Turbidez Tubo 1 +++ 10 µl Tubo2 +++ Tubo 3 +++ Tubo 4 +++ 20 µl Tubo 5 +++ Tubo 6 +++ Zumo de Vaccinium corymbosum L. Tubo 7 +++ 30 µl Tubo 8 +++ Tubo 9 +++ Tubo 10 +++ 40 µl Tubo 11 +++ Tubo 12 +++ Tubo 13 + 50 µl Tubo 14 + Tubo 15 + Ciprofloxacino 2mg/ml Tubo 16 0 50µl Tubo 17 0 Tubo 18 0 Agua bidestilada Tubo 19 +++ 50µl Tubo 20 +++ Tubo 21 +++ Fuente: Investigadores. Leyenda: 0: Sin turbidez +: Menor turbidez ++: Mediana turbidez +++: Mayor turbidez Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 19 V. DISCUSION En la Tabla 1, el análisis estadístico de ANOVA de los promedios de los halos de inhibición del zumo de Vaccinium corymbosum L. sobre Escherichia coli se determinó que el valor crítico es 3.1 se acepta la hipótesis nula (Ho: µ= µo con α = 0.05) con un nivel de confianza de 0.95 y se concluye que existe diferencia significativa entre las concentraciones evaluadas, y que la concentración al 100% es más eficiente en relación a las concentraciones de 50%, 25% y 5%. En la Gráfico 1, se observa que el zumo de Vaccinium corymbosum L. a la concentración de 100%v/v, presentó efecto mínima bactericida (4mm) sobre las cepas de Escherichia coli. Su efecto mínima bactericida se debe a una menor concentración proantocianidinas presentes en el zumo Vaccinium corymbosum L., estos metabolitos se encuentran en mayor proporción en su piel.24 Las proantocianidinas, son compuestos fenólicos estables que bloquean la expresión de las fimbrias P de Escherichia coli 22. Estudios realizados en la Universidad estatal de New Jersey, USA; determinaron que la actividad antibacteriana de proantocianidinas incluye, la posible inhibición de las enzimas bacterianas extracelulares, la privación de los sustratos necesarios para el crecimiento bacteriano o la acción directa sobre su metabolismo mediante la inhibición de la fosforilación oxidativa. 25 Asimismo en el misma Gráfico 1, se observa que el zumo de Vaccinium corymbosum L. a la concentración de 25%v/v, no presentó efecto bactericida sobre las cepas de Escherichia coli A este porcentaje no hay suficiente concentración de proantocinidinas que alcancen el sitio de activo o bien, la estructura de las porinas impida el paso del principio activo al interior de la célula bacteriana. 25 En una revisión sistemática de ensayos clínicos aleatorizados de la base de Cochrane, que incluyó a 24 estudios con un total de 4473, reportó en 14 estudios que el zumo de Vaccinium corymbosum L., es poco eficaz frente a Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 20 Escherichia coli aunque en algunos de los estudios demostraron un pequeño beneficio para las mujeres con infecciones urinarias recurrentes, pero no hubo diferencias estadísticamente significativas cuando se incluyeron los resultados de un estudio mucho más grande. 26 Según el estudio realizado en la Universidad de Cartagena, Colombia; demuestra que el criprofloxacino presenta actividad bactericida en un 63,9% sobre las cepas de Escherichia coli 28. En otro estudio realizado en la Universidad Privada Cayetano Heredia, Perú; demuestra que estas bacterias Gram negativas, presentaban sensibilidad a ciprofloxacino en un 44,5% 29. Por otro lado, en el estudio realizado en la Universidad de Salamanca, España; determinaron que las cepas Escherichia coli eran susceptibles a ciprofloxacino en 77,2%. 30 En el Gráfico 1, se observa que el zumo de Vaccinium corymbosum L. a la concentración de 5%v/v y 50%v/v, en la primera observamos que las cepas de Escherichia coli, no presentaron sensibilidad. En la segunda concentración dichas cepas presentaron efecto mínima bactericida (2mm). La explicación de esto, responde a que las cepas de Echerichia coli, bacteria Gram negativa, presenta dos membranas lipídicas una interna y otra externa, entre las que se localiza una fina pared celular de peptidoglucano. La membrana externa protege a las bacterias de varios antibióticos, colorantes y detergentes que normalmente dañarían la membrana interna o la pared celular de peptidoglucano, por esto se necesita una mayor concentración de proantocianidinas en el zumo de Vaccinium corymbosum L. para inhibir dicha cepa. 30 En la Tabla 2, se observa que en el tubo de ensayo que contenía 50uL de zumo de Vaccinium corymbosum L. al 100%v/v, se evidenció un mayor efecto inhibitorio (CMI) por presentar una menor turbidez del medio que contenía la cepa de Escherichia coli. En la Tabla 2, se observa que en el tubo de ensayo que contenía 40 uL de zumo de Vaccinium corymbosun al 100%v/v, se pudo evidenciar un menor efecto Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 21 inhibitorio (CMI) por presentar una mayor turbidez del medio que contenía la cepa de Escherichia coli. En la Tabla 2, se observa que en los tubos de ensayo que contenía 30 uL y 20uL respectivamente del zumo de Vaccinium corymbosun L. al 100%v/v, se pudo evidenciar que no presentó efecto inhibitorio (CMI) alguno, por presentar una mayor turbidez del medio que contenía a la cepa Escherichia coli. Estudios revelaron que de 240-300 mL de zumo de Vaccinium corymbosun L. podría prevenir la recurrencia de ITU, lo que sugiere que una dosis de <240 mL/ día no proporcionó protección suficiente. La ingesta de zumo Vaccinium corymbosun L. inhibe la adherencia de cepas independientemente de si producen P-fimbrias y fimbrias tipo 1, así como tanto resistente a los antibióticos y las cepas susceptibles31. Durante el paso inicial en el desarrollo de una infección urinaria, Escherichia Coli produce fimbrias-pelo así sobresalen de la superficie bacteriana. Estas fimbrias llevan adhesinas que se unen a receptores en las células uroepiteliales31. El zumo de Vaccinium corymbosun L. contiene las proantocianidinas, que inhiben las cepas de Escherichia coli adhesinas y muestran una fuerte actividad inhibidora frente a fimbrias-P. El índice de adherencia (es decir, el número de bacterias adheridas a cada celda) representa la actividad de una fracción oligomérica de las proantocianidinas pertenezcan al tipo A, lo que sugiere que el zumo de Vaccinium corymbosun L. afecta a varios fimbrias, pero particularmente P-fimbrias. Los presentes resultados confirman la existencia de un efecto dependiente de la dosis sobre la adherencia in-vitro de Escherichia Coli a las células epiteliales de la vejiga.31 Al ser dosis dependiente, cuando se aumentó el volumen, se evidencio un mayor efecto inhibitorio, esto nos hace inferir que si aumentáramos el volumen el efecto podría ser mejor, también se debe tener en cuenta que el tiempo de tratamiento es importante para producir el efecto antibacteriano y como profilaxis para tratar problemas de ITU recurrentes. 31 Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajola licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 22 Según el estudio del Grupo Cochrane de Riñón Registro Especializado, sugiere que zumo de Vaccinium corymbosun L. es menos eficaz para la prevención de ITU recurrente, Aunque algunos estudios pequeños han demostrado un beneficio menor para las mujeres con IU recurrentes, hubo diferencias estadísticamente significativas en los resultados, el zumo de Vaccinium corymbosun L. no se recomienda para la prevención de la ITU. 26 Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 23 VI. CONCLUSIONES Se determinó que la concentración de 50uL al 100%v/v del zumo de Vaccinium corymbosum L. sobre Escherichia coli, fue el que presentó mayor efecto inhibitorio. Se determinó que el zumo de Vaccinium corymbosum L. tiene efecto mínima bactericida sobre Escherichia coli, a la concentración 100%v/v. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 24 VII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. Echevarría J.; Sarmiento E.; Osores F. Infección del tracto urinario y manejo antibiótico. Acta Med Per. 23(1) 2006. 2. INFAC. Información Farmacoterapéutica de la Comarca. Infección Urinaria en el adulto: Actualización. 19 LIBURUKIA. 9 Zk. 2011.VOLUMEN 19 .Nº 9. 2011. 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Multicopias. 2014. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ http://www.clinicalmicrobiologyandinfection.com/article/S1198-743X(14)62807-X/fulltext http://www.clinicalmicrobiologyandinfection.com/article/S1198-743X(14)62807-X/fulltext BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 29 ANEXOS TABLA 1. Identificación cualitativa de los fitoconstituyentes del extracto acuoso del fruto liofilizado de Vacciniun corymbosum L. METABOLITO REACCION/ PRUEBA COLORACION PRECIPITADO RESUTADO Saponinas Espuma - - Negativo (-) Flavonoides Shinoda Rojo - Positivo (+++) Antocianinas Rosenhein Marrón - Positivo (+++) Fenoles Tricloruro férrico Verde oscuro - Positivo (+++) Fuente: Investigadores. TABLA 2. Identificación cualitativa de los fitoconstituyentes del extracto acuoso del fruto liofilizado de Vacciniun corymbosum L. METABOLITO REACCION/ PRUEBA COLORACION PRECIPITADO RESUTADO Quinonas Bortranger - - Negativo (-) Fuente: Investigadores. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 30 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA BACTERICIDA (CMB) FIGURA1: Determinación de la concentración mínima bactericida de cepas de Echerichia coli frente al Ciprofloxacino como patrón y agua como blanco. Se observa que el ciprofloxacino a la concentración de 2mg/ml (200ul), presentó efecto bactericida (50mm) sobre las cepas de Escherichia coli y no se observó efecto alguno con el blanco (agua) FIGURA 1 Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 31 FIGURA 2: Determinación de la concentración mínima bactericida (CMB) de Cepas de Echerichia coli frente al zumo de Vaccinium corymbosum L. a la concentración de 100%v/v y al 25% v/v. Se puede evidenciar que el zumo de Vaccinium corymbosum L. difunde sobre las cepas de Escherichia coli, a la concentración de 25% v/v no se evidencio efecto bactericida pero a la concentración de 100% v/v se pudo evidenciar un halo de 4 mm de diámetro. FIGURA 2 Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 32 FIGURA 3: Determinación de la concentración mínima bactericida de cepas de Echerichia coli frente al zumo de Vaccinium corymbosum L. a la concentración de 50%v/v y al 5% v/v Se puede evidenciar que el zumo de Vaccinium corymbosum L. difunde sobre las cepas de Escherichia coli, a la concentración de 5% v/v no se evidencio efecto bactericida pero a la concentración de 50% v/v se pudo evidenciar un halo de 2 mm de diámetro. FIGURA 3 Biblioteca Digital - Direcciónde Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 33 DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA INHIBITORIA (CMI) FIGURA 4: Determinación de la concentración mínima inhibitoria de caldo Müller Hinton con cepas de Echerichia coli frente a 50uL de zumo de Vaccinium corymbosum L. a la concentración de 100%v/v Mayor efecto inhibitorio (CMI) del zumo de Vaccinium corymbosum L. por presentar una menor turbidez del medio que contenía la cepa de Escherichia coli. FIGURA 4 Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 34 FIGURA 5: Determinación de la concentración mínima inhibitoria de caldo Müller Hinton con cepas de Echerichia coli frente a 40uL de zumo de Vaccinium corymbosum L. a la concentración de 100%v/v Menor efecto inhibitorio (CMI) del zumo de Vaccinium corymbosum por presentar una mayor turbidez del medio que contenía la cepa de Escherichia coli. FIGURA 5 Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 35 FIGURA 6: Determinación de la concentración mínima inhibitoria de caldo Müller Hinton con cepas de Echerichia coli frente a 30uL de zumo de Vaccinium corymbosum L. a la concentración de 100%v/v Efecto inhibitorio mínimo (CMI) del zumo de Vaccinium corymbosum por presentar una mayor turbidez del medio que contenía la cepa de Escherichia coli. FIGURA 6 Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 36 FIGURA 7: Determinación de la concentración mínima inhibitoria de Caldo Müller Hinton con cepas de Echerichia coli frente a 20uL de zumo de Vaccinium corymbosum L. a la concentración de 100%v/v No se presencia efecto inhibitorio (CMI) del zumo de Vaccinium corymbosum L. sobre la cepa de Escherichia coli por presentar un alto grado de turbidez del medio que contiene la cepa de Escherichia coli. FIGURA 7 Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 37 MARCHA FITOQUÍMICA DE VACCINIUM CORYMBOSUM L. Flavonoides: Shinoda Saponinas: Ensayo de la espuma Quinonas: Borntrager: Extracción diclorometánico. Ensayo: (+) Color: rojo Ensayo: (-) No se formó espuma. Ensayo: (-) No se evidencio el color rojo Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 38 Fenoles: Tricloruro Férrico Antocianinas: Rosenhein Ensayo: (+++) Color: Verde oscuro Ensayo: (+++) Color: Rojo Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 39 Comparación de antocianidinas presentes en el fruto sin piel, y en la piel de Vaccinium corymbosum L. “Arándano azul” Bilberry (Vaccinium Corymbosum) Figura 1. Total antocyanins content in bilberry and blueberry cultivarse, Berry and Berry skins Tabla 1. Antocyanins content in bilberry and blueberry cultivars berry skins Tabla 2. Antocyanins content in bilberry and blueberry cultivars berry Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 40 Obtención del zumo de Vaccinium Corymbosum L. Muestras de Vaccinium corymbosum L. aptas para realizar el trabajo de investigación Extracción del zumo de Vaccinium corymbosum Zumo de Vaccinium corymbosum al 25%v/v 50%v/v y 100%v/v Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 41 Materiales y equipos microbiológicos Estandarización de la cepa aislada de Eschericia coli Escala de Mc Farland 0.5 Patrón: Ciproquin (Ciprofloxacino) Asa bacteriológica Placas petri Mechero de alcohol Ajuste con solución fisiológica al patrón turbidez de Mac Farland N°0.5 (1.5x108 UFC/mL). Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 42 Prueba de la Acción antibacteriana del zumo de Vaccinium corymbosum L. “arándano azul” Sembrado. Enfrentamiento. Concentración mínima inhibitoria (CMI) Concentración mínima bactericida (CMB) Asada de Echerichia coli Extracción de ul de zumo de Vaccinium corymbosum L. Enfrentamiento del zumo de Vaccinium corymbosum L. frente a Echerichia coli, para determinar la CMB Enfrentamiento del zumo de Vaccinium corymbosum L. frente a Echerichia coli, para determinar la CMI Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 43 Incubación. Lectura de las medidas de los halos de inhibición y de la turbidez de las cepas Incubación de las placas petri (CMB) y tubos de ensayo (CMI) se incubaron a 37°C por 24 horas. Lectura de la capacidad antibacteriana (CMB) de Zumo de Vaccinium corymbosum L. Halos de inhibición Lectura de la capacidad antibacteriana (CMI) de Zumo de Vaccinium corymbosum L. Turbidez Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 44 Liofilización de Vaccinium corymbosum L. “Arándano azul” Lectura de la capacidad antibacteriana (CMB y CMI) de Zumo de Vaccinium Corymbosum L. Liofilizando el Vaccnium corymbosum L. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 45 Conservación de Vaccinium corymbosum L. liofilizado. Conservando el liofilizado de Vaccnium corymbosum L. en bolsas de polietlieno. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/ BI BL IO TE CA D E FA RM AC IA Y B IO QU IM IC A 46 Identificación taxonómica de la planta de Vacciniun corymbosum L. en el herbario truxillenses de la universidad nacional de Trujillo. Biblioteca Digital - Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No Comercial-Compartir bajola misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licences/by-nc-sa/2.5/pe/
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