1 Validacion, UV, FIA y Fluorescencia docx

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VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS
Para que un producto farmacéutico pueda liberarse a la venta debe cumplir con una serie de requisitos, por lo
cual a través de ensayos químicos, físicos y microbiológicos se comprueba si el producto cumple o no con los
requisitos establecidos.
Método analítico: conjunto de ensayos necesarios para efectuar el análisis completo de una sustancia, que
aseguran la calidad de los productos. Algunos son específicos mientras que otros son más generales.
Existen 4 tipos fundamentales de ensayos:
- Ensayos de identificación, para verificar la presencia de un compuesto contrastando con un patrón del
mismo.
- Ensayos de pureza, donde verifico la presencia del producto de interés y los posibles contaminantes o
excipientes.
- Ensayo de cuantificación, a través del cual verificamos que la concentración del principio activo en la
forma farmacéutica sea la correcta.
- Ensayos de disolución, donde determino el comportamiento de la disolución de los principios activos.
Existen 4 tipos fundamentales de métodos analíticos según su calidad:
● Métodos estándar (de referencia): son los de mayor calidad analítica y son desarrollados por organización
de prestigio y están rigurosamente validados.
● Métodos oficiales: son de uso exigido por organismos gubernamentales y satisfacen regulaciones
estatales, han sido previamente validados.
● Métodos de revistas científicas: necesitan previa validación, deben usarse con precaución.
● Métodos de propio laboratorio: para su uso deben estar previamente documentados y validados.
Sub-Métodos:
- Método de materias primas: identifico a la droga por IR y comparación con sustancias de referencias
- Método de productos intermedios: separación de compuestos para su análisis
- Método para productos terminados: “
Métodos de análisis:
❖ Métodos clásicos: se basaban en propiedades químicas del analito. Ej.: gravimetría, volumetrías y los
métodos de análisis cualitativos clásicos.
❖ Métodos instrumentales: dan información del analito, basados en la medición de propiedades
fisicoquímicas. Dentro de los métodos directos tenemos los espectroscópicos como IR, UV-Visible,
Fluorescencia y fosforescencia, RMN y AA; dentro de los electroquímicos, potenciometría directa,
métodos dinámicos o estáticos y amperométricos.
❖ Métodos de separación: separación de compuestos para eliminar las interferencias y facilitar las
medidas. Se usa cuando no puedo utilizar métodos directos. Ej. CG, EC. MASA, HPLC
Definiciones
Técnica: medio de obtener información sobre el analito ej.: IR, UV
Método: conjunto de operaciones y técnicas aplicadas al análisis de una muestra.
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Calibrar: se aplica a instrumentos de medida. NO se calibran equipos ni sistemas. Calibrar es dejar evidencia
documentada de que un instrumento mide de acuerdo a los estándares de medida de la unidad de ese
instrumento.
Cuando un instrumento es calibrado su unidad de medida se verifica y/o corrige frente a un estándar o patrón.
Esto permite que todos mis instrumentos muestren una medida real y no arbitraria según el instrumento
utilizado.
Calificar: se aplica a equipos o maquinarias. NO se califica un sistema. Es dejar evidencia que el equipo está
instalado, operando y desempeñándose de acuerdo a lo establecido por el fabricante y/o usuario del equipo.
Consta de 3 etapas:
1. Calificación de instalación: comprueba la correcta instalación del equipo de acuerdo a las
especificaciones de diseño o las instrucciones del proveedor.
2. Calificación operacional: comprueba que lo solicitado y crítico para la calidad funcional del equipo
opera según lo previsto.
3. Calificación de desempeño o performance: verifica que el equipo funciona.
Luego de todo esto se hace un reporte de calificación (QR) resume los resultados y los desvíos de las
actividades de calificación y define el estado de calificación del equipo. Esta documentación debe ser guardada
para posteriores consultas y auditorías.
Solo se podrá calificar un equipo si sus instrumentos de medida y los instrumentos utilizados para probarlo o
instalarlo están previamente calibrados.
Validar es el proceso de verificar que un método o proceso es adecuado para el objetivo para el cual fue
diseñado (que hace lo que tiene que hacer y que este resultado puede repetirse en las condiciones adecuadas
de trabajo), es decir para un problema analítico particular.
“Se llama validación a la obtención de pruebas (convenientemente documentadas) que demuestran que un
método de fabricación o un método de análisis es lo suficientemente confiable como para producir el
resultado previsto dentro de intervalos definidos’’.
Se puede validar: métodos analíticos, métodos de control de limpieza, equipos e instalaciones, procesos,
programas de computación, personal, etc. Se puede validar el método de un análisis completo del producto (es
decir todos los ensayos que constituyen el análisis) o bien sólo uno de los ensayos del producto.
Es necesario validar porque:
1. Proporciona un alto grado de confianza y seguridad en el método analítico y en la calidad de los
resultados.
2. Permite un conocimiento profundo de las características del método analítico
3. Genera una disminución del número de errores y repeticiones con el consiguiente ahorro de costos
involucrados
4. Facilita el cumplimiento de los plazos previstos de análisis
Definición de Farmacopea: ‘’La Farmacopea es el texto oficial que codifica los principios activos, excipientes y
productos farmacéuticos y contiene las especificaciones que éstos deben cumplir para demostrar su calidad y
resguardar la salud de la población”. Los métodos descritos en las farmacopeas se consideran validados,
aunque solo se refiere a métodos generales y materias primas. Un producto terminado debe tener validado su
método analítico.
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Tipos de validación:
● Validación prospectiva: para métodos nuevos.
● Validación retrospectiva: para métodos repetidamente utilizados, no validados anteriormente, con
documentación para probar la bondad del método.
● Revalidación: repetición parcial o total de una validación debido a cambios efectuados que pueden
afectar la bondad del método validado. La revalidación puede realizarse por dos motivos:
1. Cuando se ha introducido un cambio significativo en las condiciones originales en las que se ha
realizado la validación, como modificar los aparatos/materiales utilizados, modificaciones en la muestra
problema o modificaciones en la técnica analítica.
2. Cuando el método analítico lleva largo tiempo utilizándose, la revalidación demostrará que el
laboratorio sigue dando resultados confiables cuando analiza el producto. En este caso puede utilizarse
como un método retrospectivo.
Fases de una validación
1) Protocolo de validación: la redacción del protocolo es el primer paso. Consiste en un plan experimental
diseñado para brindar evidencia de que el sistema ha sido validado. Incluye definición del sistema a
validar e identificación de los parámetros a evaluar, así como el procedimiento y las especificaciones.
2) Realización de la valoración
3) Evaluación de los resultados analíticos: los datos deben ser archivados.
4) Informes técnicos: debe incluir la descripción del procedimiento para la determinación de los
parámetros a evaluar, los resultados de las determinaciones de cada parámetro (incluyendo esquemas)
y las conclusiones que indican la aceptación o no del la validación del método- También se aceptan
limitaciones para un tipo de muestra
5) Certificado de validación: es el documento formal de aprobación firmado por las personas
responsables. Se archiva durante el tiempo de vida del producto.
¿Cómo se valida un método?
La validación de un método, implica la evaluación de una serie de parámetros analíticos:
1) Especificidad y selectividad:
Se evalúan las posibles interferencias. La selectividad es la capacidad de detectar en forma exclusiva al analito
en la muestra en presencia de otros componentes y denota el grado de ausencia de interferencias debidas a
otras especies contenidas en la matrizde la muestra (las interferencias introducen un error sistemático en el
resultado, pueden ser positivas causando un aumento de la señal, o negativas causando una reducción de la
señal)
DETERMINACIÓN de selectividad
a) Mido el analito en muestras a las cuales les introduzco interferentes y se compara la respuesta del método
de dichas mezclas con respeto a soluciones que contengan solamente al analito.
b) Mido productos de degradación del analito (posible interferencia) sometiéndolo a estrés y se compara la
respuesta del método con respecto a la del analito solo. Debe utilizarse una solución blanco para cada
tratamiento, que se prepara con diluyente en lugar de muestra y luego se somete a las mismas condiciones de
estrés.
c) Comparo la habilidad del método de medir en analito en la muestra en comparación con otros métodos o
técnicas.
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La especificidad es la capacidad de detectar al analito sin interferencias de ningún otro compuesto.
DETERMINACIÓN de especificidad
Se mide una solución preparada solo con el analito y otra con el placebo. El placebo es una preparación en la
que se incluyen todos los excipientes del producto terminado exceptuando al principio activo o analito.
No se deben detectar interferencias y si las hay debe ser menor al porcentaje límite establecido.
2) Linealidad:
Es la capacidad de un método analítico de obtener resultados linealmente proporcionales a la concentración
de analito en la muestra, dentro de un intervalo determinado. Es un intervalo o rango de concentración de
analito para los cuales el método es satisfactorio y hay proporcionalidad entre la concentración del analito y la
respuesta del método
DETERMINACIÓN
Se hace tanto sobre patrones y muestras, que tengan concentraciones crecientes de analito. El sistema
instrumental de medición debe ser más amplio que el intervalo de concentraciones a estudiar. Se preparan una
serie de patrones de analito de concentraciones crecientes de acuerdo con las cantidades esperadas de analito
en la muestra y se hace una curva de calibración que relaciona la respuesta del método con la concentración
del analito. Luego se hace el tratamiento estadístico para evaluar la linealidad y la proporcionalidad. Se hace la
interpretación estadística de la regresión lineal, donde el R2 debe ser mayor o igual a 0,995.
El ensayo se debe efectuar al menos por duplicado.
3) Exactitud:
Es la capacidad del método analítico para dar resultados lo más próximos posibles al valor verdadero. Si la
diferencia entre el valor hallado y el valor verdadero es pequeña, la exactitud es buena. Una diferencia grande
significa que la exactitud es inadecuada y revela la existencia de errores sistemáticos o determinados que
deberían corregirse
DETERMINACIÓN
a) Se analiza un material de referencia cuya concentración del analito se conozca y se compara el valor medido
con el real. Desventaja: no siempre es fácil encontrar un material de referencia.
b) Se comparan los resultados obtenidos por el método a validar con los obtenidos con otros métodos
alternativos bien caracterizados y cuya exactitud ha sido bien definida.
c) Se aplica el método a blanco de muestra (con las sustancias que conforman la matriz del material a analizar)
a la cual se le agregan cantidades conocidas del analito
d) Se agregan cantidades conocidas de analito a la muestra (adición de estándar) dando una solución
fortificada y se compara con la misma muestra sin fortificar y se calcula la exactitud como % de recuperación.
𝑅𝑒𝑐𝑢𝑝𝑒𝑟𝑎𝑐𝑖ó𝑛 %( ) = 𝐶1−𝐶2( ) 𝐶3 𝑥 100
C1: concentración determinada en la muestra fortificada
C2: concentración determinada en la muestra sin fortificar
C3: concentración de fortificación
4) Precisión:
Es la concordancia entre un grupo de resultados obtenidos al aplicar repetidamente e independientemente el
mismo método sobre una muestra homogénea. Indica la capacidad del método para dar resultados
semejantes cuando se aplica repetidamente a una muestra.
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Mide el error aleatorio de un análisis y matemáticamente se expresa mediante la desviación estándar absoluta
(SD), desviación estándar relativa (RSD) , y el coeficiente de variación(CV).
Se distinguen 3 tipos de estudios dentro del término de la precisión de un método:
a) Repetitividad: dispersión de resultados de ensayos independientes utilizando el mismo método, en las
mismas condiciones por un mismo analista, en el mismo laboratorio, con los mismos equipos y reactivos.
b) Precisión intermedia: dispersión de los resultados de ensayos independientes utilizando el mismo método
aplicado a la misma muestra pero en diferentes condiciones.
c) Reproducibilidad: cuando se realiza en un laboratorio distinto .
DETERMINACIÓN → se ensaya un número suficiente de alícuotas (6 a 10) de una muestra homogénea de
manera de poder calcular estadísticamente la SD o RSD.
5) Robustez:
Es la resistencia de un método al cambio de respuesta cuando se introduce pequeñas variaciones a los
parámetros del mismo.
DETERMINACIÓN → se realizan variaciones en el procedimiento (pH, temperatura, cc de rvos, analista,
instrumentos) y se estudia el efecto que tienen sobre el desempeño del método, principalmente sobre su
exactitud y precisión.
Se trabaja con materiales de referencia, muestras de composición conocida o materiales de referencia
certificados. Se identifican aquellas variables que afectan más al método asegurando que cuando el mismo sea
usado, sean cuidadosamente controladas. Para ello en la redacción del método se especifican las etapas
críticas remarcando la necesidad de un estricto control de las mismas. Si las variables son muy críticas se
rediseña el método para aumentar su robustez.
6) Sensibilidad (S):
Es la variación de la señal al variar la concentración del analito
Es la pendiente de la curva de calibración, la cual en la mayoría de las determinaciones analíticas es constante
ya que se utilizan curvas de calibración lineales.
7) Límite de detección (LoD):
Es la menor concentración de analito en la muestra que puede detectarse pero no necesariamente
cuantificarse con una certeza estadística. Es la menor concentración de analito en una muestra de ensayo que
puede ser confiablemente distinguida del blanco, es decir a partir de la cual es factible realizar el análisis.
La matriz tiene influencia, por lo que para su determinación es necesario contar con blancos de muestra.
La mínima señal analitica distinguible del blanco (XLOD) se define como:
𝑋
𝐿𝑜𝐷
= 𝑋
𝑏𝑙
+ 𝑘𝑆𝐷
𝑏𝑙
X LoD: mínima señal analítica distinguible del blanco
X bl: media de las medidas del blanco
SD bl: desviación estándar de las medidas del blanco
K: factor numérico en base al nivel de confianza, en general k=3
El límite de detección puede expresarse en forma de concentración (LoD), donde S es la sensibilidad.
𝐿𝑜𝐷 = 
𝑋
𝐿𝑜𝐷
− 𝑋
𝑏𝑙 
𝑆
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También puede calcularse como a menor concentración de analito que produzca una señal 2 o 3 veces mayor
al ruido o blanco (Medición de la relación señal-ruido)
𝑋
𝐿𝑜𝐷 =𝑅𝑢𝑖𝑑𝑜*3 = 𝑋
𝑏𝑙
*3 
DETERMINACIÓN
a) Realizando 10 medidas independientes del blanco de muestra y se calcula la media y la SD de la señal de
blanco (calculo XLoD y LoD).
b) Se preparan blancos de muestra fortificados con concentraciones crecientes de analito, con replicados para
cada una. Se miden las señales y se calcula la media y el CV y se grafica en función de la concentración del
analito en la muestra. El LoD será la menor concentración de analito en la muestra que de una señal con
CV=2%
c) Medición de la relación señal-ruido: preparo solución placebo y la inyecto al HPLC, defino qué zona del ruido
voy a analizar (debe ser cercana al tiempo de retención del analito), mido la altura del ruido y transformo los
mm de la altura a unidades mAU, el límite de detección será 3 veces ese ruido y todo pico que tenga un altura
mayor o igual a esta puede ser considerado analito y todo pico con una altura menor a esta será ruido.
Preparo una solución testigo del analito y la inyecto en el HPLC, mido la altura del pico,y paso los mm de la
altura a mAU, y relaciono esta altura con la concentración del testigo y con la mínima altura necesaria (ya
calculada) para ser considerado analito, por último calculo la concentración mínima de analito detectable, con
posterior verificación.
8) Límite de cuantificación (LoQ)
Es la mínima concentración de analito en la muestra que puede ser determinada con una precisión
(repetitividad) y exactitud aceptable.
La minima señal analitica cuantificable (XLoQ) se define como:
𝑋
𝐿𝑜𝑄
= 𝑋
𝑏𝑙
+ 10 * 𝑆𝐷
𝑏𝑙
X bl: media de las medidas del blanco
SD bl: desviación estándar de las medidas del blanco
El límite de cuantificación puede expresarse en forma de concentración (LoQ) según:
𝐿𝑜𝑄 = 
𝑋
𝐿𝑜𝑄
− 𝑋
𝑏𝑙 
𝑆
DETERMINACIÓN
a) 10 medidas del blanco de muestra y se calcula la media y la SD de la señal y del blanco (calculo XLoQ y LoQ)
b) Se preparan alícuotas de blancos de muestra fortificados con varias concentraciones de analitos cercanas al
LoD, se miden varios replicados para cada concentración. Luego grafico la media y el CV en función de la
concentración, el LoQ será la menor concentración de analito en la muestra que de una señal con un CV=10%
c) Medición de la relación señal-ruido: preparo solución placebo y la inyecto al HPLC, defino que zona del ruido
voy a analizar (debe ser cercana al tiempo de retención del analito), mido la altura del ruido y transformo los
mm de la altura a unidades mAU, el límite de cuantificación será 10 veces ese ruido y todo pico que tenga un
altura mayor o igual a esta puede ser cuantificado y todo pico con una altura menor a esta no puede ser
cuantificado por no tener la seguridad si por debajo de esa concentración se cumple la linealidad.
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Preparo una solución testigo del analito y la inyecto, mido la altura del pico, y paso los mm de la altura a mAU,
y relaciono esta altura con la concentración del testigo y con la mínima altura necesaria (ya calculada) para ser
cuantificable, por ultimo calculo la concentración mínima de analito cuantificable, con posterior verificación.
Otras definiciones importantes
❖ Blanco de muestra: Son matrices sin el analito. En blanco de muestra es necesario para realizar una
estimación realista de las interferencias que puedan ser encontradas en la muestra.
❖ Material de referencia (RM): es material o sustancia que tiene una o varias de sus propiedades
suficientemente bien establecidas que permita su uso para:
▪ Calibrar un aparato
▪ Validar un método analítico
▪ Asignar valores a un material o sistema
❖ Material de referencia certificado (CRM): es material de referencia que tiene certificados uno o varios
valores de una o más de sus propiedades por procedimientos técnicamente validados llevados a cabo por un
organismo competente.
ANALISIS POR INYECCION EN FLUJO: FIA
La automatización es utilizada para reducir los costos de las operaciones en el laboratorio, así mismo permite
analizar un mayor número de muestras en tiempos cortos y es muy útil para todas aquellas situaciones en que
el ser humano corre riesgo de exposición. Una técnica que se utiliza en la automatización es Análisis por
Inyección en Flujo(FIA).
Sistemas de flujos
1) Sistemas de flujos segmentados:
Las muestras se transportan a través del sistema hasta el detector por medio de un flujo acuoso, que
contienen burbujas de aire próximas entre sí (para evitar la dispersión de la muestra, promover el mezclado de
la muestra y el reactivo y limpiar las paredes del tubo impidiendo contaminación entre muestras sucesivas).
En un sistema de flujo segmentado el producto de reacción se obtiene, cuando una parte de una corriente del
reactivo es introducida dentro de la corriente de la muestra que está contenida entre dos burbujas de aire. Las
burbujas de aire delimitan zonas donde se lleva a cabo la reacción, ya que a medida que las soluciones se
mueven a través del tubo se crea la convicción necesaria para mezclar los reactivos y productos.
Para que este sistema sea reproducible necesito un control estricto de las burbujas, medir las señales cuando
la reacción haya alcanzado el estado estacionario (porque el mezclado no siempre es igual, por las burbujas) y
tiempos largos de estabilización del sistema.
El único problema es que las burbujas de aire son comprensibles, lo que afecta el mezclado, haciendo que no
sea siempre igual dando irreproducibilidad al sistema. Por eso se debe esperar a alcanzar el estado
estacionario para hacer la medición.
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2) Sistemas de flujo no segmentados:
Es el método que más se aplica actualmente por eso se lo usa como sinónimo de FIA.
FIA surge de la eliminación de las burbujas de aire de los sistemas anteriores. Esto proporciona que:
1. Ser un sistema reproducible, ya que no contiene componentes que introducen variabilidad en la
medida, a diferencia de los flujos segmentados que contienen las burbujas de aire. En FIA se observa
una convección reproducible, lo que nos da idénticas condiciones físicas y químicas. Y siempre que el
sistema no cambie, no se necesita alcanzar el estado estacionario de la reacción para hacer la medición
de la misma.
2. Velocidades más rápidas de análisis (100-300 muestras/hora)
3. Mejores tiempos de respuesta (a menudo menos de un minuto entra la inyección y la respuesta del
detector)
4. Tiempos de puesta en marcha y parada mucho más rápidos (menos de 5 minutos para cada uno)
5. Componentes más versátiles y sencillos, exceptuando el sistema de inyección.
Componentes del flujo continuo:
Las soluciones se bombean por medio de una bomba
peristáltica. La muestra se introduce mediante una
válvula a una solución carrier (buffer x ej) y se une con
el tubo a través del cual fluye el reactivo. Así pasan por
el helicoide de reacción, luego por el detector y se
traduce la señal (por el registrador).
Los inyectores son similares a los utilizados en HPLC.
Fundamentos
FIA es el resultado de dos procesos
cinéticos, físico (por dispersión) y
químico (reacción entre muestra y
reactivo). La muestra cuando se mueve
en el interior del tubo, tiene lugar un
ensanchamiento de la banda o
dispersión, dada por la convección que
resulta de que el centro del fluido se
mueve más rápido que el líquido
adyacente a las paredes y por la
difusión (hay de dos tipos radial, o
perpendicular a la dirección del flujo y
longitudinal, o paralela al flujo).
La dispersión se define como:
D (dispersión)=Co (cc del analito en mtra inyectada)/C (cc del pico del detector)
¿Cómo se mide?
La dispersión se mide inyectando una solución de colorante de concentración conocida Co y a continuación
midiendo la absorbancia en la celda de flujo continuo. Mediante una calibración con patrones del colorante, se
calcula C a partir de la Ley de Beer.
La dispersión está influenciada por:
● El volumen de la muestra (D=1, > volumen, no hay mezcla entre reactivos y muestra, se busca D>2)
● La longitud del tubo (a >L, >D)
● La velocidad de bombeo
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Separaciones en FIA
Las separaciones por diálisis, extracción líquido/líquido y difusión gaseosa se realizan en forma rápida y
automática con los sistemas de inyección en flujo.
1) Diálisis y difusión de gases
Separa iones inorgánicos (Na, Cl) o moléculas orgánicas
pequeñas (glucosa) de especies de elevado peso molecular
(como proteínas). Los iones difunden desde la solución
hasta una corriente aceptora, que tiene un reactivo que
reacciona con el analito, formando una especie coloreada
que se determina colorimétricamente. Las moléculas
grandes permanecen en la corriente original y son
desechadas.
La transferencia suele ser incompleta, por lo que un análisis
cuantitativo requiere un control de la temperatura y de los caudales de muestra y patrones (se logra con FIA).
2) Extracción:
Se usa para la determinación colorimétrica de
un catión inorgánico a partir de la extracción
de la solución acuosa de muestra con una
solución de agente complejante disuelto en
cloroformo.
La solución orgánica confluye con la corriente
de la muestra, se segmenta y la extracción
del complejo metálico se produceen el
helicoide reactor. El separador tiene una tira
o hebra de teflón que guía a la fase orgánica
más pesada hacia el lateral inferior de la T,
desde donde fluye hacia el detector.
Analizadores químicos automáticos
El aumento en el número tanto de muestras como de pruebas disponibles han apresurado el desarrollo de
analizadores químicos automáticos.
Los pasos comunes a la mayoría de los análisis son: 1) muestreo, 2) cualquier separación necesaria de los
componentes de la muestra, 3) la adición de uno o más reactivos necesarios y el mezclado subsiguiente, 4)
detección del analito de interés con un sensor apropiado y 5) recolección, almacenaje y presentación de los
datos analíticos.
Los analizadores automáticos actuales combinan estos pasos para ensayar simultáneamente hasta 20
componentes en una muestra de suero de 0,5 mL y pueden producir hasta 3000 análisis separados por hora.
Los resultados para la mayoría de los análisis se obtienen entre 10 y 100 veces más rápido que con los
métodos operados manualmente esto es, en minutos en lugar de horas o incluso días. Aún más, los resultados
no se ven afectados por la fatiga del operador o desatención momentánea.
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ESPECTROSCOPIA DE ABSORCIÓN MOLECULAR ULTRAVIOLETA Y
VISIBLE
Toda radiación viene caracterizada por una longitud de onda (λ), una frecuencia (ν) o una energía (E)
h*c / λ → a > energía, > frecuencia y < longitud de onda 𝐸 = ℎ * ν =
“Cuando la materia es sometida a una determinada radiación, sufrirá un efecto que dependerá de la energía
de dicha radiación”
Radiación:
Rayos X: ionización de las moléculas por pérdida de un electrón, se da una excitación del núcleo. Brinda
información estructural de la molécula.
UV-Visible (UV: 200-400nm, Visible: 400-700nm): transiciones electrónicas entre los orbitales atómicos
y moleculares de un nivel basal a un nivel excitado. Vemos la existencia de cromóforos y/o conjugación
en la molécula. Sirve para cuantificar.
Infrarrojo: Deformación de enlaces químicos (por vibraciones moleculares) en longitud o en ángulo de
enlace. Brinda información de grupos funcionales y zona de huellas dactilares para identificación.
Microondas: rotaciones de los enlaces químicos (moleculares).
Radiofrecuencias: transiciones de spin electrónico o nuclear en los átomos de la molécula. RMN→
Determino grupos funcionales, subestructuras, conectividades, estereoquímica, etc.
La técnica a utilizar dependerá de la información que deseo obtener, Ej. Fórmula molecular, identidad de
grupos funcionales (IR), conectividades de los carbonos (RMN), posición de sustituyentes y/o grupos
funcionales, propiedades estereoquímicas, cuantificación (UV-Visible, mejor que IR), identificación (IR en zona
de huellas dactilares).
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Transmitancia y Absorbancia
La transmitancia es la fracción de radiación incidente que logra pasar la muestra y es transmitida por esta.
𝑇 = 𝑃𝑃𝑜
La absorbancia viene definida por la ecuación:
).𝐴 =− log 𝑙𝑜𝑔 𝑇 = 𝑙𝑜𝑔 ( 𝑃𝑜𝑃
La Ley de lambert y beer dice que y se definen las distintas denominaciones de k (constante de𝐴 = 𝑘 * 𝑏 * 𝑐
proporcionalidad)
Absortividad(a): es la absorbancia de una solución cuya cc es 1g/L, medida en una celda de b=1cm
𝑎 = 𝐴𝑐*𝑏 = (𝑈𝑛𝑖𝑑𝑎𝑑)𝐿 * 𝑔
−1 * 𝑐𝑚−1
Coeficiente de extinción específica ]: absorbancia de una solución donde la cc es 1%[𝐸(1%,1𝑐𝑚)
(1g/100mL), medida en una celda de paso óptico de 1 cm.
𝐸(1%,1𝑐𝑚) = 𝐴𝑐*𝑏 = 10 * 𝑎 = 𝑔%
−1 * 𝑐𝑚−1
Absortividad molar( : es la absorbancia de una solución cuya cc es 1 mol/L medida en b=1cm. Puede∈)
calcularse como el producto de la absortividad por el PM del analito.
∈ = 𝑎 * 𝑃𝑀 = 𝑀−1 * 𝑐𝑚−1
Los valores de a, E y ε, a una longitud de onda específica y en un solvente determinado, son característicos
del analito.
Espectrofotómetro
Debe ser previamente calibrado haciendo uso de un blanco.
Esquema del
equipo:
Partes:
✔ Fuente de luz: lámpara que emite luz policromática (es decir, que contiene distintas λ).
✔ Compartimiento de la muestra (paso óptico): aquí se coloca la muestra, cubeta con un espesor conocido y
donde se hace incidir el haz de luz monocromático. A > b, > sensibilidad.
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✔ Sistema óptico: recibe la luz transmitida por la muestra, la focaliza y selecciona por longitudes de onda a la
que quiero medir (selector de λ continuo: prisma de cuarzo, redes de difracción; discontinuo: filtros de
absorción)
FILTROS → de interferencia: interfiere en el pasaje a una determinada radiación y deja pasar otras. De
absorción: absorben ciertas zonas del espectro, se deben ir cambiando según la λ deseada
MONOCROMADORES → varían en forma continua y en un amplio rango la λ de radiación, diseñados para
realizar barridos espectrales. Ej. Monocromador de red Czerney-Turner, monocromador de Bunsen
✔ Detector: recibe la señal de la intensidad de la luz transmitida (fotones) a cada longitud de onda y la
transforma en señal eléctrica que un ordenador pueda procesar (como intensidad de corriente), la cual es
proporcional a los fotones que llegan al detector. (CÉLULAS FOTOVOLTAICAS, FOTOTUBOS, TUBOS
FOTOMULTIPLICADORES, DETECTORES DE FOTOCONDUCTIVIDAD, FOTODIODOS DE SILICIO)
✔ Sistema de tratamiento de la señal
Limitaciones de la ley de Lambert y beer
Se deben a la desviación de la linealidad entre absorbancia y concentración, cuando el paso óptico (b) es
constante. Pueden ser positivas (absorbancia medida mayor a la real) o negativa (absorbancia medida menor a
la real).
a) Desviaciones reales:
La Ley de L-B solo describe bien el comportamiento de la absorción en soluciones diluidas. A concentraciones
altas (>0,01M) la distancia entre las especies absorbentes disminuye hasta que cada una afecta la distribución
de carga de la vecina y se altera la capacidad de absorber a una λ dada. Esto altera la absortividad del
absorbente. Otras desviaciones provienen de los cambios en el índice de refracción del sistema analítico,
porque como la absortividad depende del índice de refracción de la muestra, a cc 0,01M o menores este
permanece constante al igual que la absortividad específica.
b) Desviaciones instrumentales:
Se obtienen absorbancias menores a la teóricas (errores negativos). Dadas por:
● Radiación policromática: se cumple la ley si la variación de la absortividad con la longitud de onda es
constante (no presenta grandes
variaciones). En el máximo de la
curva del espectro de absorción, el
coeficiente de actividad varía más
lentamente que en el resto de la
banda y la sensibilidad a la
concentración es mayor porque la
absortividad tiene un valor máximo
en ese punto por esto se toma la
longitud de onda en el máximo de la
banda para realizar medidas
cuantitativas.
● Radiación espuria: El haz de salida de un monocromador suele estar contaminado con pequeñas
cantidades de radiación dispersada o espuria cuyas longitudes de onda son muy diferentes de las de la
banda de luz principal utilizada. La radiación espuria puede provenir de reflexiones de diversos
componentes ópticos y del monocromador, y llega al detector debido a la dispersión por partículas y
reflexiones en la superficie, pudiendo no haber atravesado la muestra. Es decir, induce una corriente
adicional en el detector que lleva a una transmisión falsa.
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c) Desviaciones químicas:
Dependen de la naturaleza química del sistema en estudio y si se trabaja bajo ciertas condiciones (pH, cc de
reactivos) es posible hacer que el sistema cumple dicha ley. Son causadas por equilibrios en solución
(reacciones químicas de asociación-disociación, ácido-base, reacciones de polimerización, formación de
complejos y reacción con el solvente) que involucran a la especie absorbente y alteran su concentración
originando desviaciones.
Si alguna reacción química que ocurra en el sistema origina un producto que absorba más fuertemente que la
sustancia ensayada, a la longitud de onda a la cual se hace la medida o longitud de onda analítica, se producirá
una desviación positiva. Si, al contrario, se origina un producto que no absorbe a la longitudde onda analítica,
la concentración de la sustancia se verá disminuida y se originará una desviación negativa.
Aplicaciones
1. Análisis cualitativo:
Se compara el espectro de una especie absorbente y el espectro estándar de dicha especie (barrido espectral).
Para esto requiere la purificación de la especie en la muestra.
Su aplicación es limitada ya que el número de máximos y mínimos de absorción es pequeño y varias especies
pueden presentar espectros de absorción semejantes por lo cual no se utiliza como criterio único de
identificación, sino como análisis complementario, siendo necesario un espectro IR.
2. Análisis cuantitativos:
La espectroscopia de absorción es una de las herramientas más útil y ampliamente utilizada en el análisis
cuantitativo. Entre sus características más importantes se incluyen:
● amplia aplicabilidad tanto a sistemas orgánicos como inorgánicos
● sensibilidades de 10-4 a 10-5 M (ampliable a 10-6 a 10-7 M con ciertas modificaciones)
● de moderada a alta selectividad
● buena precisión
● fácil y adecuada adquisición de datos
PROCEDIMIENTO
1) Selección de la longitud de onda correspondiente al pico de absorción donde la sensibilidad es máxima
(y me aseguro de que se cumpla la ley de lambert y beer)
2) Determino la relación entre absorbancia y concentración, preparo la curva de calibración que cubra un
intervalo de concentración razonable de analito
3) Método de la adición del estándar: adiciono incrementos del mismo tamaño de la solución estándar a
las alícuotas de la muestra. Voy a tener el área correspondiente a la muestra y área correspondiente a
la muestra + el std, relacionando las dos ecuaciones (k y b ctes) obtengo la cc del analito en la muestra.
3. Determinación de elementos por medio de agentes complejantes
Los cationes metálicos absorben radiación débilmente o no absorben en la región uv-visible, pero al poder
formar complejos coloreados con agentes complejantes, se puede determinarlos. Algunos de estos agentes
complejantes pueden formar complejos con un gran número de metales y por tanto no presentan gran
selectividad o especificidad, por lo que otros metales pueden interferir con el metal que se desea determinar.
Un reactivo se dice que es selectivo si reacciona con un número limitado de elementos y específico si produce
la reacción deseada de color con solamente un elemento bajo ciertas condiciones de reacción. Así la
selectividad de una reacción de color depende del reactivo escogido, el número de oxidación del elemento, el
pH y sobre todo de la constante de estabilidad del complejo; ésta constante es de gran importancia ya que
complejos débiles pueden ser convertidos en otros más estables por recomplejación.
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Debido a los altos coeficientes de absortividad molar de muchos de estos complejos es posible la
determinación de concentraciones del orden de mg/L o partes por millón (ppm), siendo aplicables en las
determinaciones de especies químicas a nivel de trazas.
4. Titulaciones o valoraciones espectrofotométricas:
Se localiza el punto de equivalencia de una valoración, siempre que el analito, el reactivo o el producto de la
valoración absorban radiación. Alternativamente,
un indicador absorbente puede proporcionar el
cambio de absorbancia necesario para la
localización del punto de equivalencia.
En este ejemplo una especie no absorbente es
valorada con un valorante coloreado que es
decolorado en la reacción. Ello da lugar a una línea
horizontal en las etapas iniciales, seguido por una
rápida subida de la absorbancia pasado el punto
de equivalencia.
5. Determinación de constantes de disociación de indicadores ácido-base:
Los indicadores son moléculas orgánicas que presentan un color diferente (o λ diferente) al de la forma sin
disociar (HIn). Son ácidos o bases débiles utilizados como indicadores por esa propiedad de tener distintos
colores en base a la especie predominante.
HIn + H2O ↔ H3O+ + In- 𝐾𝑎 = 𝐼𝑛−[ ]𝑒𝑞* 𝐻+[ ]𝑒𝑞𝐻𝑖𝑛[ ]𝑒𝑞 =
𝑝𝑟𝑜𝑑𝑢𝑐𝑡𝑜𝑠
𝑟𝑒𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑜𝑠
𝑝𝐾𝑎 =− 𝑙𝑜𝑔 𝐼𝑛−[ ]𝑒𝑞* 𝐻+[ ]𝑒𝑞𝐻𝑖𝑛[ ]𝑒𝑞 = 𝑝𝐻 − 𝑙𝑜𝑔
𝐼𝑛−[ ]𝑒𝑞
𝐻𝑖𝑛[ ]𝑒𝑞 = − 𝑙𝑜𝑔 𝐾𝑎
En el caso del indicador ácido si se hallan las concentraciones de In- e HIn en el equilibrio y se mide el pH de
dicha solución del indicador es posible calcular la constante. Experimentalmente la metodología seguida
consiste de varios pasos a seguir que se irán detallando con la ayuda de un ejemplo: la determinación
espectrofotométrica del pKa del Rojo de Metilo. Este indicador posee una forma al estado básico (In-) que se
presenta de color amarillo y una forma al estado ácido (HIn) que se presenta de color rojo.
a) Determino la longitud de onda de máxima absorción para cada una de las dos formas (In- y HIn),
preparo 2 soluciones del indicador a diferentes pH, una ácida (indicador en forma (HIn) y una básica
(indicador In-), luego grafico Abs=f(λ) para ambas soluciones y obtengo las longitudes de onda de
máxima absorción para las dos formas del indicador.
b) Verifico la ley de lambert y beer para ambas formas del indicador, preparo soluciones de distintas cc de
las forma ácida(HIn) y de la forma básica(In-) trabajando a pH extremos de manera de asegurarme que
solo exista una forma del indicador en la solución, luego grafico Abs=f(cc) para cada una y obtengo de
la curva de calibración los valores de absortividad de ambas formas a las dos longitudes de onda de
máxima absorción. Los valores de las absortividades se utilizan para calcular la cc de las dos formas del
indicador a distintos pH, cercanos al valor del pKa que se desea determinar.
c) Determino la concentración de ambas formas del indicador a distintos pH cercanos al pKa, dado que no
se trabaja a pH extremos el indicador existe como Hin y In- y las absorbancias a las dos λ máxima se
deben a contribución de absorbancia de ambas formas
Abs 520nm=a 520nm HIn*b*cc HIn + a 520nm In-*b*cc In-
Abs 430nm=a 430nm In-*b*cc In- + a 430nm HIn*b*cc Hin
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d) Armo un sistema de dos ecuaciones con dos incógnitas, despejando Cc InH y Cc In-, y conociendo el pH
y la concentración de Hin y In-, calculo el pKa y el Ka (las cuales espero sean similares a los distintos pH
a los que hice la determinación)
Espectroscopia de fluorescencia
La fluorescencia, fosforescencia y quimioluminiscencia son procesos fotoluminiscentes en donde las moléculas
del analito se excitan para dar una especie cuyo espectro de emisión, suministra información para el análisis
cualitativo y cuantitativo.
Estos métodos, tienen un límite de detección del orden de partes por billón (alta sensibilidad) y un amplio
rango lineal, permitiendo la determinación cuantitativa de un conjunto de especies orgánicas e inorgánicas
importante, a niveles de trazas. Debido a su alta sensibilidad, suelen aplicarse como método de detección en
cromatografía líquida (HPLC) y electroforesis capilar. Sin embargo su utilidad está limitada, por el hecho de que
pocas especies presentan fotoluminiscencia.
Fluorescencia Fosforescencia Quimioluminiscencia
● Vida media corta
● Se emite
simultáneamente con la
excitación
● No hay cambios en la
multiplicidad de espín
● App: determinación de
especies inorgánicas
por métodos directos o
indirectos,
determinación de
especies orgánicas
(enzimas, coenzimas,
medicamentos,
esteroides, vitaminas)
● Fenómeno en el cual un fotón
es absorbido, excitando un
electrón hacia un nivel de
energía mayor y luego lo libera
para volver al estado basal
(mido emisión de fotones)
● Vida media larga
● Emitida después de la
excitación
● Cambia la multiplicidad de
spin, típicamente de triplete a
Singulete o viceversa (requiere
tiempo para convertirse y
regresar a su estado basal),
también de cuadruplete a
doblete
● App: determinación de
especies aromáticas y
bioquímicas
● Emisión en forma de luz (fotones)
de la energía liberada en una
reacción química, esta reacción
genera entidades moleculares en un
estado electrónico excitado, a partir
de reactivos en su estado
fundamental (quimioexcitacion), el
regreso delproducto a su estado
fundamental da lugar a la emisión
de la luminiscencia
● App: detección en inyección en
flujo, CL y EC (permitió detectar
niveles bajos de contaminantes,
siendo muy sensible) Ej.
Dioxaetanos, rcion de Luminol
● Usada para analitos en baja cc ej.:
iones metálicos (Fe), hidrocarburos.
En App de dx clínico; posible
sustituto del marcado isotópico.
(ventaja: sensibilidad de rciones QL)
Estados excitados
Singulete (↑↓): 2 electrones en un orbital con espín opuesto (apareados), siendo diamagnética (las moléculas
no presentan campo magnético neto), por lo que no son atraídas ni repelidas por un campo magnético
permanente.
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Doblete (↑ o ↓): estado donde hay electrones desapareados, estado fundamental para un R* libre. El electrón
impar puede tomar 2 orientaciones frente a un campo. Son paramagnéticas y son atraídas o repelidas cuando
se encuentran en un campo magnético.
Singulete (↑↓) o triplete excitado (↑↑): 1 de los electrones de una molécula es excitado a un nivel de energía
superior. El Singulete (diamagnético) continúa apareado con el electrón del estado fundamental, sin embargo
en el estado triplete (paramagnético) el electrón está desapareado.
Absorción de energía
Cuando la energía no es suficiente para provocar un salto a un estado excitado, se produce un movimiento del
estado vibracional. La transición (electrón promovido a un nivel basal superior) se da cuando la energía es
suficiente para producir el salto a un estado excitado.
Proceso de desactivación
La fluorescencia y fosforescencia llevan a la emisión de un fotón de radiación para que la molécula excitada
vuelva a su estado fundamental (desexcitacion por procesos radiativos).
❖ Fluorescencia: transición desde el menor nivel vibracional de un Singulete excitado hacia los niveles
vibracionales del estado basal
❖ Fosforescencia: desactivación desde un estado triplete excitado, luego de un cruce entre sistemas
En cambio los procesos no radiativos consisten en:
● Relajación vibracional: el exceso de energía se pierde por las colisiones de las moléculas de las especies
excitadas y las del solvente.
● Conversión interna: es un proceso intermolecular, es más eficaz cuando los niveles de energía están cerca
como para que haya un solapamiento de los niveles de energía vibracional. La molécula pasa a un estado
electrónico de menor energía sin emisión de radiación.
● Pre-disociación: el electrón pasa de un estado electrónico alto a un estado vibracional alto de un estado
electrónico más bajo y se produce la ruptura de un enlace debido a la elevada energía vibracional.
● Disociación: el electrón llega a un estado vibracional alto, donde se produce la ruptura del enlace.
● Conversión externa o amortiguación colisional: ocurre por interacción y transferencia de energía entre la
especie excitada y el disolvente u otro soluto. Si se disminuye el número de colisiones (bajo temperatura,
aumente viscosidad) se aumenta la fluorescencia.
● Cruce entre sistemas: en este proceso se invierte el espín de un electrón excitado y da como resultado un
cambio en la multiplicidad de la
molécula. La probabilidad de esta
transición aumenta cuando los niveles
vibracionales de los dos estados se
solapan. Frecuente en moléculas con
átomos pesados (Br o I), donde el
acoplamiento espín/orbital se hacen
grandes, favoreciendo un cambio en el
espín. La presencia de especies
paramagnéticas en la disolución, como
el oxígeno molecular, favorecen este
proceso y disminuyen la fluorescencia.
El diagrama de Jablonski es un diagrama
que ilustra los estados electrónicos de
una molécula y las transiciones que se pueden producir entre esos estados.
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Fluorescencia y Fosforescencia
En ambos casos la desexcitación implica reemisión de la radiación que ha sido absorbida. La fosforescencia
comprende la desactivación desde un estado triplete excitado, luego de un cruce intersistemas. La
fluorescencia implica una transición desde el menor nivel vibracional de un singulete excitado hacia los niveles
vibracionales del estado basal.
Como consecuencia de la alta eficiencia de la relajación vibracional, la desactivación ocurre desde el menor
nivel vibracional del estado excitado hacia el menor estado vibracional del estado basal, con lo cual se produce
un corrimiento de la banda de emisión con respecto a la de absorción, hacia mayores longitudes de onda. Este
fenómeno se conoce como “VARIACION DE STOKES”. Al considerar que el triplete tiene menor energía que el
singulete excitado, la banda de la fosforescencia emitida al desactivarse desde un triplete será de mayor
longitud de onda que la observada por la desactivación fluorescente desde un singulete excitado.
Variación de stocks
Es un corrimiento de la banda de emisión, con respecto a la de absorción hacia mayores λ. Dado que el triplete
tiene menor energía que el singulete excitado, la radiación emitida por fosforescencia al desactivarse será a
mayor λ que la desactivación fluorescente. La fosforescencia tiene mayor vida media y se detecta la emisión a
mayor tiempo que la fluorescencia.
Variables que afectan la fluorescencia y fosforescencia
1. Rendimiento cuántico (Φ): es relación entre el número de moléculas que emiten luminiscencia
respecto al número total de moléculas excitadas. Cuando Φ se acerca a 1, mayor cantidad de fotones
absorbidos son emitidos (poco frecuente porque mucha de la energía absorbida se va a liberar por
procesos no radiativos). Las especies químicas que no presentan fluorescencia apreciable tienen
eficacias que se acercan a cero.
2. Factores estructurales: la fluorescencia es más intensa en compuestos con grupos aromáticos, por
transiciones π→π*, por grupos dadores de electrones, grupos carbonilos, etc.
3. Temperatura: al aumentar, aumentan las colisiones entre las moléculas y así aumento la probabilidad
de desactivación por conversión externa, disminuyendo la fluorescencia.
4. Solvente: si disminuyo la viscosidad, aumento la probabilidad de conversión externa, disminuyendo la
fluorescencia. Esta también disminuye con solventes con átomos pesados (porque aumento la
velocidad de formación de tripletes)
5. pH: por componentes aromáticos con sustituyentes ácidos o básicos, a mayor número de formas
resonantes, mayor estabilidad del estado excitado, dando fluorescencia en la región uv.
6. Efecto del Oxigeno disuelto: disminuye la intensidad de fluorescencia, debido a oxidación de la
sustancia o de las propiedades paramagnéticas del oxígeno molecular.
7. Concentración: a cc altas se pierde la linealidad (de la cc y la intensidad de fluorescencia), dando
desviaciones negativas de la misma.
● Autoaniquilacion o autoquenching: es la pérdida de energía no radiante por colisiones entre las
moléculas excitadas, producido por el choque entre moléculas excitadas y se produce una desactivación
en forma de energía no radiante.
● Autoabsorcion: la λ de emisión se solapa con la de absorción produciendo una disminución de la
fluorescencia.
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Sensibilidad y especificidad
La alta sensibilidad se debe a que el poder de la fluorescencia se puede medir independientemente del poder
de la lámpara; en cambio en espectrofotometría se requiere evaluar Po y P, ya que la Absorbancia es
proporcional a la relación entre ambas intensidades. Para aumentar la sensibilidad se puede aumentar la
potencia de la lámpara o amplificar la señal fluorescente.
Es especifico porque se deben tener 2 espectros, el de excitación y el de emisión, y es poco probable que 2
compuestos tengan la misma λ de excitación y emisión de fluorescencia.
INSTRUMENTOS DE MEDIDA
Fluorimetro o espectrofluorímetro (fluorescencia, fosforescencia y dispersión):
Casi todos los instrumentos de fluorescencia utilizan ópticas de doble haz, para compensar las fluctuaciones en
la potencia de la fuente. El haz proveniente de la fuente atraviesa un filtro o monocromador de excitación que
transmite la radiación y excluye la de emisión. La fluorescencia es emitida en todas las direcciones, pero la
mejor manera de observarla es en un ángulode 90º con respecto al haz de excitación. A otros ángulos, la
dispersión por la solución y las paredes de la cubeta, puede causar grandes errores en la medida de la
intensidad. La radiación emitida llega al detector fotoeléctrico luego de atravesar el filtro o monocromador de
emisión. El haz de referencia pasa por un atenuador, que reduce su poder aproximadamente 100 veces. Ambos
rayos llegan a un amplificador diferencial y de allí al registrador.
● FLUORIMETROS→ utilizan filtros para seleccionar las λ de excitación y emisión (se cambian según λ
deseada).
● ESPECTROFLUORÍMETROS→ hay dos tipos. Tipo 1: utiliza un filtro para seleccionar la λ de excitación y un
monocromador de red o prisma para la λ de emisión. Tipo 2: son los verdaderos espectrofluorímetros,
utiliza dos monocromadores (para la excitación y emisión).
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Partes:
✔ Fuente o lámpara de laser: a mayor potencia podemos lograr una mayor fluorescencia. Puede ser:
Lámpara de vapor de mercurio, lámpara de alta presión de xenón(radiación continua), Láser (para
detección de ultratrazas)
LÁSER→ se utilizan cubetas con cuarzo, para muestras muy pequeñas como cromatografía con
microcolumnas o EC. Fuente de radiación de mayor energía (potencia) que una lámpara, mejorando la
detección y sensibilidad del método.
✔ Selector de λ (filtro o monocromadores) trabajo con filtros o monocromadadores; el haz de la fuente
atraviesa un filtro o monocromador de excitación que transmite la radiación y excluye la de emisión, la
radiación emitida va al detector.
✔ Cubeta de la muestra: la fluorescencia se emiten en todas direcciones, detecto a 90° para mejorar la
especificidad y evitar que la radiación proveniente de la fuente llegue al detector (sin haber atravesado
la muestra).
✔ Detector fotoeléctrico: recibe fotones, emite intensidad de corriente. La radiación pasa al filtro o
monocromador de emisión, el haz de referencia pasa por un atenuador y ambos rayos llegan a un
amplificador diferencial y al registrador.
FOTOMULITIPLICADORES → Amplifica la señal (dado q la señal de fluorescencia es de baja intensidad y
necesita factores de amplificación. Sensible
✔ Sistema de tratamiento y lectura de señales
Equipo emisión (fosforescencia) y quimioluminiscencia
✔ Fuente y cubeta con la muestra
✔ Selector de longitudes de onda
✔ Detector fotoeléctrico
✔ Sistema de tratamiento y lectura de señales
Aplicaciones
1. Determinación de especies inorgánicas
Existen dos tipos de métodos. Los directos donde se forma un quelato fluorescente y se mide su emisión; y los
indirectos, donde se miden la disminución de emisión que se debe a la acción atenuadora de la sustancia que
se quiere determinar. Este último método es más utilizado en la determinación de aniones.
2. Determinación de especies orgánicas
Se pueden determinar enzimas, coenzimas, medicamentos, productos naturales, esteroides y vitaminas.
Siendo útil en el análisis de productos alimentarios, farmacéuticos, muestras clínicas y productos naturales.
FIN DE LA GUÍA (de acá en adelante es información de teóricos)
FOSFORESCENCIA→ fosforimetro, difiere del fluorometro/espectrofluorometro en que necesita un dispositivo
que irradie alternativamente a la muestra y después de un retraso de tiempo, mide la intensidad de
fosforescencia (para diferenciarla de la fluorescencia)
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QL (Quimioluminiscencia)
● Célula de reacción: donde se mezclan
los reactivos QL
● No necesito fuente de radiación
porque se lo da la reacción química
Quimioluminiscencia
● La medición debe hacerse en forma inmediata al producirse la reacción química (depende del tiempo de
emisión del reactivo quimioluminiscente).
● Tipo de reacciones: el P* está con exceso de energía; el fluoróforo (F) actúa recibiendo el exceso de
energía y se desexicta emitiendo fotones.
● Las medidas de QL están influenciadas por factores experimentales que afectan al rendimiento cuántico y
a la velocidad de reacción, como: La estructura química del precursor QL; la naturaleza y cc de otras
sustancias que afectan el proceso de QL; el catalizador seleccionado; la temperatura; el pH y la fuerza
iónica; l presencia de aceptores de la energía transferida.
● Llamo bioluminiscencia a quimioluminiscencia proveniente de organismos vivos o sistemas derivados de
ellos Ej. Reacción de la luciferasa de luciérnaga.
● FIA Y QL: FIA me permite ir inyectando diferentes muestras (impulsadas por un flujo) y al ir llegando al
detector, nos va dando una señal; integrando el área de la señal, podemos definir una cc (con previa curva
de calibración, que relacione las áreas con la cc) y puedo cuantificar dicha muestra.
Debo tener en cuenta el tiempo de emisión→ debo ajustar el flujo, para que al llegar al detector haya
ocurrido la QL; si el flujo es rápido, la muestra no llega al detector; si el flujo es lento se apaga el equipo.
La distancia recorrida al detector→ si es muy larga provoca fenómenos de difusión y ensanchamiento de
banda, provocando baja señal (porque se fue diluyendo la muestra)
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INMUNOENSAYO POR POLARIZACIÓN DE FLUORESCENCIA- FPI → buena sensibilidad y límites de detección
muy bajos.
Es un inmunoensayo homogéneo (porque se lleva a cambio en una solución) competitivo por fluorescencia,
hay una unión competitiva entre el antígeno de una muestra contra el reactivo marcado antígeno-fluoresceína
(AgF, tiene una marca fluorescente) por la unión con un anticuerpo. Las moléculas más grandes (AC-AgF), rotan
más lentamente que las moléculas más pequeñas en la solución (AgF); la luz polarizada distingue la marca AgF
del AC-AgF, por sus diferentes propiedades de polarización por fluorescencia al ser expuestos a la luz
polarizada, ya que dependiendo con la velocidad que se mueven, diferirá la emisión, el complejo AC-AgF tiene
un alto nivel de fluorescencia por movimiento lento (se conserva la polarización de la luz que incidió en la
muestra, mismo plano), moléculas más pequeñas(AgF), al rotar esta
rápidamente, se mide una baja señal porque solo una fracción de la
radiación logra atravesar el filtro de polarización (porque la radiación
se emite en una plano diferente al de la emisión).
A valores bajos de analitos, se produce una señal alta de fluorescencia,
lo que le da la sensibilidad al ensayo, por la mayor unión del AC a AgF,
a mayor cc del analito, se desplaza al AgF, disminuyendo la
fluorescencia. Esta técnica se emplea para moléculas de bajo peso
molecular Ej. Etanol, paracetamol.
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