Microbiología Agrícola

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MICROBIOLOGÍA 
AGRÍCOLA 
 
 
 
 
Leonor Carrillo 
Dra. en Ciencias Químicas (Orientación Biológica) 
Profesora Titular en 
Facultad de Ciencias Agrarias, UNJu 
y Facultad de Ingeniería, UNSa 
 
 
 
© Universidad Nacional de Salta 
ISBN 987-9381-16-5 
 
 
 (http://www.unsa.edu.ar/matbib) 
 
 
 
 
 
 
 
 
2003 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
CONTENIDO 
 
 
1.Microorganismos. 
Reinos. Organismos procarióticos: eubacterias, arqueobacterias, actinomicetos, cianobacterias, 
mixobacterias. Organismos eucarióticos: mohos levaduras, macromicetos, mixomicetos, protozoos, 
algas, líquenes. Organismos acelulares: virus, viroides, priones. Transferencia genética en bacterias: 
conjugación, transformación, transducción, fusión de protoplastos. 
 
2. Vida y muerte de los microorganismos. 
Crecimiento. Tipo de nutrición. Factores de crecimiento orgánicos y minerales. Transporte de solutos. 
Factores ambientales: agua y presión osmótica, tensión superficial, pH, oxígeno, potencial redox, 
temperatura. Medios de cultivo. Esterilización. Acción del calor, radiaciones, luz ultravioleta, 
microondas y ultrasonido. Separación por filtración. Desinfección. Interacciones microbianas: antibiosis, 
mutualismo y simbiosis. Fijación simbiótica del nitrógeno. Micorrizas. Biopelículas. Predación. 
 
3. Actividad microbiana. 
Suelo. Metabolismo. Degradación de biopolímeros: celulosa, almidón, levanos, xilanos y otras 
hemicelulosas, pectinas, quitina, lignina, lípidos, proteínas, polinucleótidos. Metabolismo productor de 
energía. Respiración: degradación de hexosas, ciclo del ácido tricarboxílico, cadena de transporte de 
electrones, fosforilaciones. Fermentaciones: lácticas, alcohólica, propiónicas, fórmicas, butírico-
butanólica, acéticas, de aminoácidos. Oxidaciones incompletas. Respiración anaeróbica. Desnitrificación, 
reducción a nitritos, sulfatorreducción y metanogénesis. Bacterias autotróficas. Nitrificación, 
sulfooxidación, ferrooxidación. Biosíntesis. Síntesis de proteínas y otros compuestos. 
 
4. Estructuras fúngicas. 
Estructuras somáticas. Estructuras reproductoras anamórficas y teleomórficas. 
 
5. Rumen y biogas. 
Metanogénesis, diversidad de las arqueobacterias metanogénicas. Rumen, un digestor natural. 
Características del biogas. Digestores anaeróbicos, materia prima, factores ambientales, criterios de 
diseño y construcción, operación, peligros potenciales y seguridad. 
 
6. Micotoxinas. 
Hongos en el campo y el almacenamiento. Honhos toxigénicos y micotoxinas “naturales”. Producción 
de micotoxinas. Peligros. Prevención. 
 
7. Hongos. 
Clasificación. Macromicetos. Ascomycota y Basidiomycota. Hongos micorrizantes, inoculación de 
plantines. Cultivo del champiñón, obtención del micelio, preparación del compost, siembra del inóculo, 
producción. Cultivo de hongos lignívoros, preparación del substrato, inoculación y producción de las 
setas, cultivo sobre troncos. 
 
Apéndice 
Medios de cultivo y esterilización. Aislamiento y cultivo de microorganismos. Fijación simbiótica de 
nitrógeno en leguminosas. Microorganismos del suelo. Inhibidores y desinfectantes. Digestión 
anaeróbica de residuos agrícolas. Morfología microscópica de hongos. Identificación de mohos 
toxigénicos. Micorrizas. Microorganismos del agua. 
 
 
 
ÍNDICE 
Actinomicetos 1-8 
fijadores de nitrógeno 2-7 
Aerobio 2-7 
Agua 2-5 
actividad 2-5 
humedad relativa 2-5 
microorganismos A-31 
potencial 2-6 
Algas 1-13 
Amonificación A-16 
Anaerobio 2-7, 3-19 
Antibacteriano 2-14, A-21 
Antibiosis 2-14 
Antifúngico 2-14, A-21 
Arqueobacterias 1-7, 3-21, 5-2 
Autotótrofo 2-2, 3-21, A-2 
Bacterias 
 butíricas 3-19 
 celulolíticas 3-6 
 eubacterias 1-4 
 fijadoras simbióticas 2 -16 
 fijadoras vida libre 3-24 
 formas 1-7 
 gram-positivas 1-4 
 gram-negativas 1-4 
 halófilas 1-8 
 lisogénicas 1-14 
 metanógenas 1-8, 3-21, 5-1 
 ruminales 3-21, 5-4 
 termoacidófilas 1-8 
Bactericida 2-14 
Bacteriocinas 2-14 
Bacteriófago 1 -14 
Bacteriostático 2-14 
Bacteroide 2-16, 3-25 
Biodegradación 3-5 
Biogas 5 -1 
 características 5-8 
Biopelícula 2-18 
Biosíntesis 3-20, 3-23 
 ácidos grasos 3-25 
 aminoácidos 3-23 
 glúcidos 3-26 
 nucleótidos 3-25 
 proteínas 3 -23 
Cadena respiratoria 3-16, 3 -20 
Capacidad de campo 2-6, 3-3 
Catabolismo 3-14 
Células 
eucarióticas 1-10 
procarióticas 1-3 
Cianobacterias 1-9, 3 -25 
Ciclo del 
azufre 3-21 
citrato 3-16 
 nitrógeno 3 -21 
Colonias de bacterias 1-6 
Coloraciones A-10 
Crecimiento 2-1 
Cultivos 
 bacterias 2-9, A-8 
 hongos 7-11, 7-12, A-11 
 medios 2 -9, A-2 
Degradación de 
 almidón 3-8 
 biopolímeros 3-4 
 celulosa 3-6, A-18 
 hemicelulosas 3-9 
 hexosas 3-15 
 levanos 3-15 
 lignina 3-11 
 lípidos 3-12 
 pectinas 3-10 
 polinucleótidos 3 -14 
 proteínas 3-13 
 quitina 3-11 
 xilanos 3-9 
Desinfección 2-13, A-21 
Desnitrificación 3-19, A-16 
Digestión anaeróbica 5-2, A-23 
 carga 5-13, 5-14 
 construcción 5-10 
 criterios de diseño 5-10 
 digestores rurales 5-5 
 etapas 5-2 
 factores ambientales 5-9 
 microorganismos 5-2 
 operación 5 -13 
 otros digestores 5-6 
 parámetros 5-7. 5-11 
 residuos 5-6 
 seguridad 5 -14 
División celular 1-7 
Endosporos bacterianos 1-6 
 termorresistencia 2-11 
Esporas fúngicas 1-11, 4-2 
Esterilización 
 calor 2-11, A-3 
 filtración 2-13, A-4 
 presión autoclave 2-11 
 radiaciones 2-12 
 
Factores de crecimiento 2-3 
Factores ambientales 2-5, 3-3, 5-9 
 actividad agua 2-5 
 luz ultravioleta 2 -13 
 microondas 2-13 
 oxígeno 2-7 
 pH 2 -6 
 potencial agua 2-6 
 potencial de reducción 2-8 
 presión osmótica 2-5 
 radiaciones 2-12 
 temperatura 2-8, 3-3 
 tensión superficial 2-6, 2-14 
 ultrasonido 2-13 
Facultativo 2-7 
Fermentaciones 3-17 
 acética 3-19 
 ácida mixta 3-18 
 aminoácidos 3-19 
butanodiólica 3 -18 
 butírico-butanólica 3-19 
 etanólica 3-18 
 fórmicas 3 -18 
 lácticas 3-17 
 propiónicas 3-18 
Ferrooxidación 3-22 
Fijación del CO2 3-26 
Fijación de nitrógeno 
 vida libre 3-24, A-17 
 inoculante 2-17, A-13 
 mecanismo 3 -24 
 simbiótica 2-16, A-13 
Flagelos bacterianos 1-5 
Fotosíntesis bacteriana 3-26 
Fotótrofo 2-2, 3-26 
Genética bacteriana 1-15 
 conjugación 1-16 
 genoma 1-4 
 plásmidos 1-6 
 recombinación 1-16 
 replicación 1-15 
 transducción 1-18 
 transforma ción 1-17 
Halófilo 2-6 
Heterótrofo 2-2, A-2 
Hongos 4-1, 7-1, A-25 
 ascomicetos 4-4, 7 -3 
 anamorfos 4-2 
 basidiomicetos 4-5, 7-4 
 clasificación 7-1 
 champiñón 7-11 
 cultivo 7-11, 7-12 
 deteriorantes 6-1 
 estructuras somáticas 4-1 
 estruct. reproductoras 4-1 
 levaduras 1 -12 
lignívoros 3 -11, 7 -12 
 macromicetos 1-12, 7-3 
 mohos 1-11 
 micorrizantes 2-18, 7-8, A -29 
 teleomorfos 4-4 
Humedad relativa 2-5 
Inoculantes 
 bacterianos 2-17, A-13 
 fúngicos 7-10 
Interacciones microbianas 2-15 
Levaduras 1-12, 4-1 
Líquenes 1-13 
Macromicetos 1-12, 7 -3 
Medios de cultivo 2-9, A-2 
Membranas bacterianas 
 citoplasmática 1-4 
 internas 3-22 
Mesófilo 2-8 
Metabolismo 3-4 
 bacteroides 3-25 
 productor de energía 3-14, 3 -20 
Metabolitos secundarios 3 -26, 6 -1 
Metanogénesis 3-21, 5-1 
Micorrizas 
 ectomicorriza 2-18, 7-9, A-29 
 endomicorriza 2-18, 7-9, A-29 
 inoculación 7-10. A-29 
Micotoxinas 6-1 
 mohos toxigénicos 6-3, A-27 
 prevención 6-6 
 principales toxinas 6-3 
 producción 6-2 
 toxicidad 6-4 
Microorganismos 1-1 
 agua A-31 
amilolíticos 3-8 
 celulolíticos 3-6 
 desnitrificantes 3 -19 
 eucariotas 1-10 
 lignívoros 3 -11, 7 -12 
 pectinolíticos 3-10procariotas 1-3 
 quitinolíticos 3-11 
suelo 3-1 
 tamaño 1-1, A-12 
Micronutrientes 2-3 
Mixobacterias 1-9 
Mixomicetos 1-12 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 1 
 Apéndice 
Guía de trabajos prácticos 
CONTENIDO 
 
1. Medios de cultivo y esterilización 
2. Aislamiento y cultivo de microorganismos 
3. Fijación simbiótica de N2 en leguminosas 
4. Microorganismos del suelo 
5. Inhibidores y desinfectantes 
6. Digestión anaeróbica de residuos agrícolas 
7. Morfología microscópica de hongos 
8. Identificación de mohos toxigénicos 
9. Micorrizas 
10. Microorganismos del agua 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 2 
TRABAJO Nº 1. Medios de cultivo y esterilización 
Objetivo. Preparar los substratos o medios de cultivo, cuya composición varia según el tipo de 
organismos y la selectividad esperada, para estudiar los microorganismos en el laboratorio. 
Esterilizar estos materiales para eliminar los microorganismos que pudieran alterarlos antes del 
uso. 
Introducción 
Nutrición 
 Los microorganismos toman del ambiente circundante los materiales o nutrientes que son el 
punto de partida para las reacciones metabólicas que los convierten en constituyentes celulares. 
Hay nutrientes necesarios sin los cuales una célula no puede crecer, y otros útiles pero no 
indispensables. 
 La primera división en las categorías nutricionales tiene en cuenta dos parámetros: la 
naturaleza de la fuente de energía y la naturaleza de la fuente principal de carbono. Los 
organismos que usan la luz como fuente de energía se denominan fotótrofos y los que utilizan 
fuentes de energía química se denominan quimiótrofos. Los que emplean CO2 como principal 
fuente de carbono se definen como autótrofos, pero los que utilizan compuestos orgánicos para 
el mismo fin se llaman heterótrofos. Los microorganismos necesitan una diversidad de 
minerales para su crecimiento, y los más comunes son el potasio, sodio, magnesio, calcio e 
hierro. Los factores de crecimiento son compuestos orgánicos específicos requeridos en muy 
pequeñas cantidades y no puede ser sintetizados por la célula. 
Diseño de un medio de cultivo 
 En el cuadro siguiente se consideran tres medios de distinta complejidad. 
 
Medio 1 Medio 2 Medio 3 
agua 1 L agua 1 L agua 1 L 
cloruro de amonio 1 g peptona o triptona 5 g peptona de soja 10 g 
fosfato dipotásico 1 g extracto de carne 3 g glucosa 10 g 
carbonato de calcio 1 g agar 15 g extracto de levadura 2,5 g 
sulfato de magnesio 10 mg agar 15 g 
sulfato ferroso 10 mg 
cloruro de calcio 10 mg 
sales inorgánicas de 0,02 mg 
 Mn, Mo, Cu, Co, Zn de cada uno 
 
 Al elaborar un medio de cultivo para un organismo cualquiera, el objetivo pricipal consiste en 
proporcionar una mezcla equilibrada de los nutrientes requeridos, en concentraciones que 
permitan un buen crecimiento. El punto de arranque es componer una base mineral que 
proporcione las sales inorgánicas que pueden suministrarse a cualquier organismo. Esta 
solución puede suplementarse luego, si es necesario, con una fuente de carbono, una de energía, 
una de nitrógeno y algún factor de crecimiento requerido. 
 El medio 1 puede permitir el crecimiento de bacterias nitritantes autótrofas que usan el 
dióxido de carbono como fuente de carbono y oxidan amonio para obtener energía. El medio 2 
es un medio complejo que favorece el desarrollo de muchas bacterias heterótrofas que obtienen 
energía y también carbono de aminoácidos y péptidos, pero no requieren factores de 
crecimiento. El 3 contiene glucosa, varios constituyentes nitrogenados orgánicos y factores de 
crecimiento como para cubrir las necesidades nutricionales de mohos y levaduras. 
 Cualquier medio adecuado para el crecimiento de un organismo específico es, en cierto modo, 
selectivo para él. Los microorganismos deseados pueden obtenerse de los ambientes naturales 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 3 
tales como el suelo, empleando medios selectivos. 
 Como agente gelificante de los medios de cultivo se utiliza comúnmente el agar que es 
obtenido de algas pero no es nutriente para la mayoría de los microorganismos. El gel de agar 
es firme a las temperaturas de incubación pero se convierte en líquido (sol) cuando se calienta a 
la temperatura de ebullición del agua, gelificando nuevamente cuando se enfria a 45ºC. Otra 
manera de proporcionar una superficie nutritiva es utilizar un filtro de membrana de esteres de 
celulosa depositado sobre un disco de absorbente embebido con el medio de cultivo. El medio 
traspasa los poros permitiendo el desarrollo de los microorganismos que están en la superficie. 
 El extracto de carne es un extracto acuoso de músculo de bovino, concentrado hasta una 
consistencia pastosa o desecada hasta polvo, que contiene compuestos solubles tales como 
azúcares, aminoácidos y sales. El hidrolizado de proteína se obtiene por digestión de músculo 
con pepsina (peptona) o tripsina (triptona) o de caseína (casitona, tripticase) o de proteina de 
soja (peptona de soja). Los medios complejos deshidratados contienen algunos componentes 
cuya concentración varía con cada partida y suelen tener una baja capacidad reguladora del pH. 
Esterilización 
 Esterilizar significa eliminar toda clase de microorganismos. Esto puede realizarse de 
diferentes modos. Pueden eliminarse las bacterias del aire por filtración, como en las cámaras de 
flujo laminar estéril, y de los líquido a través de membranas fltrantes u otro filtro. La 
destrucción de las bacterias puede hacerse mediante calor seco o húmedo para el tratamiento de 
la mayoría de los materiales, o rayos ultravioletas para el caso de superficies, o con radiaciones 
ionizantes para esterilizar plásticos deseartables. 
 El calor seco se utiliza en estufa de aire caliente, pero 
no es un método eficaz de calentamiento porque el 
aire es un mal conductor del calor. En ausencia de 
humedad las formas más resistentes (endosporos 
bacterianos) requieren temperaturas por sobre 160ºC 
durante una hora y media para morir. 
 El vapor a presión es el procedimiento más efectivo 
de esterilización por calor húmedo. El vapor a una 
presión absoluta de 2,066 kg/cm2 proporciona una 
temperatura de 120,6ºC que es mortal para los 
endosporos bacterianos en pocos minutos, pero el 
tiempo de aplicación varía según el tiempo necesario 
para homogeneizar la temperatura en el material 
tratado. 
 La presión absoluta a la que está sometido el 
material dentro del autoclave es igual a la presión 
leída en el manómetro sumada a la presión 
atmosférica del lugar. Como esta última varia con la 
altura sobre el nivel del mar, debe calcularse la 
presión manométrica necesaria para llevar a cabo la 
esterilización en cada localidad, haciendo caso omiso 
de las graduaciones en temperaturas adicionadas al 
manómetro por los fabricantes a nivel del mar. En la figura 1 se ven las curvas de temperaturas 
alcanzadas en función del tiempo en un autoclave con distinto grado de purgado del aire. La 
figura 2 muestra el tiempo requerido para esterilizar distintos volúmenes a 120,6ºC. 
 La temperatura de ebullición del agua puede ser usada para esterilizar materiales nutritivos 
que se alterarían a temperaturas mayores, mediante el siguiente artilugio: el material es tratado 
durante 30 minutos el primer día e incubado a la temperatura ambiente, vuelto a calentar 30 
minutos el segundo día y otra vez incubado, para finalmente calentarla otros 30 minutos el 
tercer día. El tratamiento durante el primer día destruye las formas vegetativas, el período de 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 4 
incubación permite la 
germinación de muchos 
endosporos y las formas sensibles 
originadas mueren con el 
segundo calentamiento. Los 
endosporos que persistieron 
germinarán durante el segundo 
período de incubación y las 
células formadas moriráncon el 
tercer calentamiento. Como se ve, 
la tindalización es efectiva 
únicamente cuando el medio a 
esterilizar es favorable para la 
germinación de los esporos. No 
destruirá los endosporos de 
anaerobios si la incubación no se 
lleva a cabo en condiciones de 
anaerobisis y tampoco destruirá a 
los endosporos del grupo 
termofílico. 
 Teniendo en cuenta la cinética 
microbiana el fin práctico de la 
esterilización mediante un agente 
letal es lograr que la probabilidad 
de que el material tratado 
contenga tan sólo un 
superviviente, sea muy 
pequeña. Los procedimientos habituales de esterilización se proyectan siempre de forma que 
proporcionen un amplio margen de seguridad. 
Filtración 
 Los microorganismos quedan retenidos por el pequeño tamaño de los poros del filtro y con 
algunos tipos de materiales filtrantes por adsorción sobre los mismos, además de la influencia 
del pH del líquido sobre las cargas de los microorganismos y el filtro. Comúnmente en el 
laboratorio se usan membranas de esteres de celulosa con porosidades de 0,45 µm ó 0,2 µm, 
pero también suelen usarse en otros casos unos filtros de porcelana o vidrio fritado 
(sinterizado). 
Procedimiento 
Preparación del material de vidrio 
 Obturar con algodón la extremidad no aguzada de las pipetas con la ayuda de un punzón. 
Colocar dos o tres de ellas en un sobre de papel y cerrarlo con broches metálicos, o bien 
envolverlas separadamente en una tira de papel. Envolver con papel cada caja de Petri cerrada. 
Tapar los tubos de ensayo con algodón prensado de tal modo que, se pueda quitar y colocar el 
tapón sin deformarlo. Reunir unos diez tubos en un paquete. 
Esterilización por aire caliente 
 El material limpio y bien seco, una vez tapado con algodón y/o envuelto con papel, se ubica 
en el interior de la estufa (horno o esterilizador). Luego se calienta hasta que la temperatura 
alcance 170ºC y se la mantiene durante 30 a 60 minutos enfriar según la carga. Se deja enfriar el 
aparato antes de abrir, para evitar la rotura del vidrio por el contacto brusco con el aire frío. Al 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 5 
terminar la operación, el algodón y/o el papel de diario tendrán un color tostado pálido. Desde 
los 150ºC ambos comienzan a amarillear, pero a los 180ºC pierden la propiedad de detener las 
bacterias y se forman residuos carbonosos más o menos antisépticos. 
Control de la eficacia de la esterilización 
 Se coloca en la estufa, junto con el material de vidrio, un tubo con endosporos bacterianos 
(cultivo seco o suelo tamizado). Una vez sometido al tratamiento térmico, se le agrega un medio 
nutritivo líquido y se incuba a 30ºC durante 48 horas. Si se ha logrado la esterilización, no habrá 
desarrollo bacteriano. 
Preparación de medios de cultivo 
 La mayoría de las bacterias heterótrafas pueden multiplicarse en el medio 2 denominado " 
agar nutritivo". Para disolver el agar se calienta el recipiente en un baño de agua hirviente o en 
el autoclave a vapor fluente. El pH del medio debe estar próximo a 7. Si se prepara sin agar se 
obtiene el medio llamado "caldo nutritivo". 
 Los hongos suelen crecer más lento que las bacterias y toleran mejor la acidez, por lo que suele 
usarse para su cultivo el medio 3 conocido como "agar micológico" cuyo pH es 
aproximadamente 5,6, al que se le añadió extracto de levadura para que desarrollen aun los 
organismos exigentes en vitaminas. 
 Los medios se distribuyen en tubos de ensayo o en matraces de Erlenmeyer ocupando sólo un 
tercio de su capacidad. Tanto los tubos como los matraces llevan tapones de algodón, excepto 
cuando tienen tapa a rosca esterilizable. Los tubos se reúnen en cestos y se los cubre con dos o 
tres hojas de papel poroso donde se escribe con lápiz el nombre del contenido. Se cubren los 
matraces con un capuchón de papel y un hilo atado de tal forma que pueda quitarse fácilmente. 
Los medios de cultivo se esterilizan en autoclave. 
Esterilización por vapor de agua a presión 
 En el autoclave se logra que la temperatura del vapor de agua sea superior a la ebullición 
(96ºC a 1300 m s.n.m.) por medio de un aumento de la presión, luego de la eliminación del aire 
por la espita o válvula de purga. Si funciona a 1,18 kg/cm2 por sobre la presión atmosférica 
promedio local (0,88 kg/cm2 = 884 HPa), el agua hervirá a 121ºC. 
 Al mantener esta temperatura durante 15 minutos se logra la destrucción de toda forma de 
vida en volúmenes menores a 100 mL. El mismo resultado se alcanza prácticamente en 
materiales poco contaminados, calentando a 115ºC (0,84 kg/cm2 de presión manométrica) 
durante 20 minutos. Los sólidos o liquidos muy viscosos deben ser calentandos a 121ºC durante 
30 minutos. Si el autoclave está muy cargado, o los volúmenes son mayores, es necesario 
prolongar el tiempo de calentamiento. 
 Con estas condiciones de tratamiento pueden sobrevivir los endosporos de bacterias 
termofílicas, pero éstas no crecen a las temperaturas comunes de incubación (25 - 37ºC). 
 Colocar agua hasta la rejilla, ubicar los recipientes y cerrar el autoclave, ajustando las 
mariposas opuestas para que la tapa quede bien apoyada sobre la junta de goma. Encender el 
mechero. Cerrar la espita, o válvula de purga, recién cuando sale un chorro de vapor continuo 
pues entonces se ha logrado purgar el aparato. A partir de este momento comienza a aumentar 
la presión, la que se regula y mantiene con la altura de la llama. Vigilar el autoclave durante la 
esterilización. 
 Cumplido el tiempo, cerrar la llave de gas y esperar hasta que la aguja del manómetro vuelva 
a cero, antes de abrir la espita para igualar las presiones, interna y externa. Luego abrir la tapa. 
Si se abriera la espita durante el enfriamiento, la brusca descompresión producirla la ebullición 
violenta de los líquidos y los proyectarla fuera de los recipientes. Por otra parte si se abre 
demasido tarde, el vapor se habrá condensado sobre los papeles y algodones, y se habrá 
acelerado el deterioro de la junta de goma por el vacio formado. 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 6 
Control de la temperatura de esterilización 
 Se coloca un tubito con ácido benzoico en polvo (p.f. 121ºC) junto al material a esterilizar.. Si 
se alcanza la temperatura de fusión durante el proceso de esterilización, luego del enfriamiento 
quedará una masa homogénea de ácido benzoico. 
 También se usan mezclas indicadoras adheridas sobre cartón u otro material, tal como la 
compuesta por carbonato de plomo + azufre precipitado + carbonato de litio (10 + 1+ 3). Esta 
mezcla vira al gris después de 30 minutos a 100ºC, en 3 ó 4 minutos a 110ºC y en 30 segundos a 
121ºC. Toma color negro si está expuesta más de 30 minutos a 110ºC y 
en 5 minutos a 121ºC. 
Esterilización por filtración 
 Se eliminan los bacterias de las soluciones que se descomponen o 
inactivan al someterlas a la temperatura del autoclave, pasándolas a 
través de membranas con poros de 0,2 ó 0,45 µm u otros filtros. La 
membrana o disco filtrante se coloca sobre una superficie porosa rígida, 
en una suerte de embudo desmontable adaptado a un matraz de 
Kitasato (ver figura 3) mediante un tapón de goma, para poder hacer un 
vacio parcial con una bomba o una trompa de agua. La tubuladura 
lateral del matraz se conecta a un tubo engrosado en su parte media, 
donde se coloca algodón. Se envuelve el conjunto con papel y se 
esteriliza en el autoclave. Después se ubica el disco filtrante en el 
embudo desmontable cumpliendo con las reglas de asepsia y se conecta 
el matraz de Kitasato a la trompa de agua o la bomba de vacío. 
Control de la eficiencia de la filtración 
Dos porciones del material nutritivo filtrado se transfieren en condiciones de asepsia a 
recipientes estériles y se incuban, uno a 30ºC y otro a 45ºC, durante 48 horas. Si se logró la 
esterilización no debe haber desarrollo microbiano. 
 
Bibliografia 
o Madigan TM et al. Brock- Biología de los Microorganismos. PrenticeHall, Madrid, 1998 
o Stanier RY et al. Microbiología. Reverté, Barcelona, 1984 
o Carpenter P, Microbiología, Interamericana, México, 1979 
o Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 7 
TRABAJO N° 2. Aislamiento y cultivo de microorganismos 
Objetivo. Separar por métodos físicos los microrganismos, provenientes de un ambiente natural, 
de tal manera que al multiplicarse sobre un substrato nutritivo se obtenga una población (en el 
caso de bacterias o levaduras) o un individuo (en el caso de un moho). 
Reconocer al microscopio las características generales de los microorganismos mediante 
preparaciones en fresco o coloraciones de extendidos del material. 
Introducción 
Microbios uni y pluricelulares 
 Los organismos más sencillos son aquéllos que están constituidos por una sola célula. Como 
las células se miden en micrómetros (µm) estos organismos unicelulares caen dentro de la 
categoría general de microbios o microorganismos. La organización unicelular se observa en 
protozoos, algunas algas, levaduras y la mayoría de las bacterias. Un tipo más complejo de 
organización biológica es la de los organismos pluricelulares. Aunque surgen en general a partir 
de una sola célula, en estado maduro constan de varias células permanentemente unidas unas a 
otras de un modo característico, lo cual le confiere una forma típica al organismo. Así un moho 
esta compuesto por filamentos ramificados. Cada filamento se denomina hifa y al conjunto de 
hifas se lo llama micelio. 
Aislamiento, cultivo 
 Dos clases de operaciones fundamentales en la microbiología clásica son el aislamiento o 
separación de un microorganismo determinado de las poblaciones mixtas que existen en la 
naturaleza, y el cultivo o crecimiento del microorganismo en medios artificiales bajo 
condiciones de laboratorio. Estas operaciones son básicamente iguales para el estudio de las 
bacterias, los hongos, las algas, los protozoos y las lineas de células vegetales o animales (cultivo 
de tejidos). 
 Para el aislamiento directo se emplean medios gelificados. Cuando un inoculo mixto que 
contiene una cierta variedad de organismos diferentes se extiende directamente sobre la 
superficie de un medio gelificado, todos aquéllos que puedan crecer sobre el mismo producirán 
colonias. La dispersión de los microbios sobre el medio elimina gran parte de la competencia 
por los nutrientes y por ello algunos que crecen lentamente son capaces de multiplicarse en el 
mismo ambiente de los que crecen rápidamente. 
 Como consecuencia del aislamiento aparecen luego de la incubación, poblaciones de bacterias 
y levaduras e individuos fúngicos sobre la placadel medio de cultivo. Se los puede mantener 
vivos en el laboratorio mediante transplantes a otros medios de cultivo. 
Ambiente 
 Los principales ambientes naturales de los microorganismos son el suelo y el agua. Muchos 
organismos se encuentran en una capa delgada de suelo de algunos decímetros de espesor. Los 
microrganismos de las masas de agua, por ejemplo lagos, están concentrados en la superficie y 
en el fondo por encima del cieno. Los microorganismos transportados por el aire son seres que 
accidentalmente se encuentran en este medio y provienen del suelo, agua u otros organismos 
vivos. 
 Es necesario que haya ciertas condiciones en el ambiente para que sirva como reservorio de los 
microorganismos. El crecimiento depende del abastecimiento adecuado del agua y las 
substancias nutritivas, el pH conveniente, la tensión de oxigeno suficiente, la temperatura 
necesaria y otros factores. 
Oxígeno 
 Muchos organismos requieren oxigeno molecular pues dependen de la respiración aerobia 
para cubrir sus necesidades energéticas y se los denomina aerobios obligados. Entre éstos, 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 8 
algunos crecen mejor a presiones parciales de oxigeno menores que la presente en el aire y se los 
conoce como microaerófilos. Hay microorganismos son anaerobios facultativos, pues pueden 
crecer tanto en presencia como en ausencia de aire. Comprende dos subgrupos: uno, el de las 
bacterias que tienen un metabolismo productor de energia exclusivamente fermentativo pero no 
los afecta la presencia de aire; otro, el de las levaduras o bacterias que pueden pasar del 
metabolismo respiratorio al fermentativo. En cambio los anaerobios estrictos sólo fermentan y 
son sensibles al oxigeno. 
Crecimiento, colonia 
 En cualquier sistema biológico el crecimiento puede definirse como el aumento ordenado de 
todos los constituyentes químicos de un organismo. El crecimiento determina la multiplicación 
celular y en los organismos unicelulares motiva un aumento del número de individuos, 
mientras que en los 
multicelulares lleva al 
aumento del tamaño 
del individuo. 
 En el aislamiento se 
tomó una pequeña 
cantidad de células 
microbianas y al 
deslizar el asa sobre el 
agar se las distribuyó 
por la superficie. 
Durante la incubación 
la célula aislada se 
dividió repetidamente hasta formar una masa visible llamada colonia sobre el medio de cultivo. 
El crecimiento de las poblaciones bacterianas está normalmente limitado por la desaparición de 
los nutrientes accesibles o por la acumulación de productos metabólicos tóxicos. Al describir 
una colonia se usan distintos vocablos para describir forma, elevación y borde de la misma 
como se muestra en la figura 4. 
Bacterias 
 La mayoría son organismos unicelulares que se multiplican por escisión binaria transversal. Se 
distinguen varios tipos respecto a su forma y agrupación como se esquematiza en la figura 5. 
Algunas bacterias forman células de reposo, conocidas como endosporos, que tienen bajo 
contenido de agua, son muy refringentes y se tiñen con dificultad. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 Los endosporos soportan el calor, la desecación y algunas substancias químicas, muchos 
resisten a 100º.C durante unas 20 horas, otros sólo unos minutos a 90ºC 
Las bacterias móviles tienen uno o varios flagelos. Para verlos con el microscopio óptico se los 
debe engrosar mediante un mordiente antes de la coloración. Suele obs ervarse el movimiento 
bacteriano cuando se coloca una gota de un cultivo en medio líquido entre cubre y portaobjetos. 
Los actinomicetos son un grupo de bacterias filamentosas, ramificadas, que forman un micelio 
delgado y en la mayoría de los casos células de multiplicación llamadas esporos. 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 9 
Coloraciones 
 El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resulta difícil de ver con el 
microscopio óptico. La principal dificultad es el poco contraste entre la célula y el medio que la 
rodea, y la manera más simple de aumentarlo es utilizando colorantes. 
 Las células generalmente son tratadas de diversa manera, antes de teñirlas, para coagular el 
protoplasma en un proceso que se llama fijación. En el caso de las bacterias, la fijación por calor 
es lo más corriente, aunque también puede emplearse formaldehido, metanol o ácidos. La 
fijación se realiza habitualmente en células que han sido secadas sobre un portaobjetos. Luego le 
sigue la tinción. 
 La mayoría de los colorantes usados son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad 
especifica con los materiales celulares. El azul de metileno es un buen colorante que actúa 
rápidamente sobre las bacterias y es útil para detectar bacterias en medios naturales, puesto que 
no tiñe la mayor parte del material extraño. 
Tinción de Gram 
 Es un método diferencial de tinción para bacterias. Luego del tratamiento con cristal violeta 
todas las células están coloreadas. Al agregar iodo se forma un complejo con el colorante en el 
interior de las mismas. Después de añadir etanol o acetona algunos organismos se decoloran 
(Gram-negativos) y otros no (Gram-positivos) según la estructura física de la pared, no por los 
constituyentes químicospues las levaduras son gram-positivas aunque tienen una pared 
químicamente distinta a las de las bacterias. 
 Para poner de manifiesto las células incoloras se utiliza una coloración de contraste, tal como 
safranina o fucsina básica que tiñen de rojo a las células gram-negativas mientras las gram-
positivas permanecen violetas. 
Procedimiento 
Aislamiento de microorganismos del polvo ambiental 
 La técnica depende del material a partir del cual se intenta aislar los microorganismos y de las 
características de estos últimos. Vertir unos 15 mL de agar nutritivo, licuado en baño da agua 
hirviente, en una caja de Petri e igual cantidad de agar de 
Sabouraud licuado en otra. Dejar gelificar y luego exponer las placas 
al aire dejando sedimentar el polvo ambiental durante 30 minutos. 
Incubar a 27—30ºC durante 48 horas la caja con agar nutritivo y a 
25-27ºC por 5 días la del agar de Sabouraud. Al cabo de ese tiempo 
examinar las colonias microbianas presentes. 
Aislamiento de bacterias esporuladas 
del suelo 
 Calentar una suspensión de suelo por 10 
minutos en un baño de agua a 80ºC. 
Flamear el asa hasta que tenga color rojo 
brillante y dejar que se enfríe dentro de la 
zona de convección del mechero. Tomar 
una gota de la suspensión y extenderla sobre la superficie de una placa de agar nutritivo 
haciendo las primeras estrías como se muestra en la figura 6. Flamear el asa y hacer la segunda 
serie de estrias con el asa vacia. Flamear otra vez el asa y hacer la tercera serie de estrías con el 
asa vacía. Incubar las cajas con la tapa hacia abajo (invertidas) a 25-30ºC durante 48 horas. 
Aislamiento de rizobios de nódulos radicales de leguminosas 
 Lavar la raíz para quitar el suelo adherido. Elegir los nodulos de mayor tamaño, separarlos y 
colocarlos en un tubo o frasquito. Lavarlos nuevamente, agitando con fuerza para eliminar la 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 10
mayor parte de los residuos. Poner los nodulos durante 30 segundos en etanol 95% y luego 
sumergir en lavandina concentrada diluida al 1/10 durante 3 a 6 minutos. Lavar tres o cuatro 
veces, agitando enérgicamente, en sendos tubos de agua estéril. Para transferir los nodulos de 
un recipiente a otro usar una pinza con la punta previamente mojada en alcohol y flameada. 
 Tomar un nodulo y colocarlo entre dos portaobjetos cuyas caras enfrentadas habían sido 
flameadas. Aplastarlo y tomar el material del nodulo con el asa para hacer estrías sobre la placa 
del medio de cultivo especifico como se muestra en la figura 6. Incubar a 25-30ºC. 
 El medio de cultivo para rizobios contiene manitol 10 g, extracto de levadura 4 g, carbonato de 
calcio 3 g, fosfato dipotásico 0,5 g, sulfato de magnesio 0,2 g, cloruro de sodio 0,l g, agar 15 g, 
rojo Congo 25 ppm o verde brillante 125 ppm, agua 1 litro; pH 7,0. Se esteriliza a 115ºC durante 
20 minutos. 
Observación de las placas de aislamiento 
 El inoculo fue diluido progresivamente en cada estría sucesiva de tal manera que, después de 
la incubación en la estufa, el crecimiento es confluente en los trazos iniciales y las colonias están 
bien aisladas a lo largo de las últimas estrías. Observar las características macromorfológicas de 
las colonias y registrarlas en la planilla de informes correspondiente. Tomar con un asa material 
de una colonia y hacer un extendido sobre un portaobjetos. Luego de secar y fijar por calor, 
hacer una coloración de Gram para observar las células somáticas o de Wirtz para ver los 
endosporos. 
Tinción de Gram 
 Poner el portaobjetos sobre un soporte y cubrirlo con una solución de violeta cristal. Luego de 
1 minuto agregar solución de iodo. Después de 1 minuto, lavar con agua. Decolorar con alcohol 
96°. Lavar con agua y cubrir con una solución de safranina durante 1 minuto. Lavar con agua y 
secar. Colocar una gota de aceite para inmersión. Llevar el portaobjetos a la platina de un 
microscopio. Mirar a través del objetivo de bajo aumento (10x) y una vez enfocado el objeto 
colocar el objetivo de inmersión en aceite (100x) moviendo el revólver. Levantar el condensador 
pues la intensidad de la luz debe ser mayor con los objetivos de mayor aumento. Ajustar el 
enfoque mediante el tornillo micrométrico. Regular la cantidad de luz por medio del diafragma. 
 Las bacterias Gram-negativas se tiñen de rojo anaranjado y las Gram-positivas adquieren color 
violeta. Dibujar lo observado manteniendo la proporción respecto al campo microscópico . 
 La solución de violeta cristal contiene 1 g de colorante disuelto en 20 mL de alcohol 96° y 80 
mL de agua. La de safranina se prepara de igual manera usando 0,25 g de colorante. La solución 
de iodo según Lugol contiene 1 g de iodo y 2 g de ioduro de potasio en 100 mL de agua. 
Coloración de endosporos 
 Cubrir el extendido con solución de verde de malaquita. Encender un hisopo embebido en 
alcohol y calentar el portaobjetos por debajo del soporte. Apagar y repetir la operación luego de 
un minuto. Repetir el calentamiento dos veces 
más. Lavar con agua. Cubrir con solución de 
safranina durante 1 minuto. Lavar con agua y 
secar. Colocar una gota de aceite para 
inmersión. Los endosporos se verán verdes y las 
células somáticas de color rojo anaranjado. 
Dibujar lo observado. 
 La solución de verde de malaquita contiene 2 g 
de colorante disuelto en 20 mL de alcohol 96° y 
80 mL de agua. 
Selección y transplantes de colonias 
 Elegir colonias de bacterias y hongos en las 
placas anteriores y repicarlas como se muestra 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 11
en la figura 7. Incubar los cultivos de bacterias a 30-35°C en la obscuridad, si se trata de hongos 
colocarlos a 25-27°C preferentemente donde reciban una iluminación diurna difusa para 
favorecer la esporulación. 
a) cultivo de bacterias en aerobiosis 
 sobre medios gelificados . Flamear el asa hasta que tenga color rojo brillante. Tomar el tubo con 
la mano izquierda. Quitar el tapón de algodón sosteniéndolo con el dedo meñique de la mano 
derecha. Pasar la boca del tubo por la llama 
del mechero. Introducir el asa, estéril y fría, en 
el tubo y extraer un poco de material 
microbiano. Volver a flamear la boca del tubo 
y colocar el tapón. Tomar el tubo con medio 
estéril, destapar y flamear como el anterior. 
Introducir el asa y depositar los 
microorganismos rayando en zig-zag la 
superficie del medio gelificado, con mucha 
suavidad. Sacar el asa, flamear la boca del 
tubo y tapar. Flamear el asa. 
 en medios líquidos. Proceder igual que en el 
caso anterior y depositar los 
organismos dentro del medio 
líquido. 
b) cultivo de hongos 
 El procedimiento para sembrar 
levaduras es similar al empleado 
para bacterias. Para cultivar 
hongos se emplea un gancho, 
inserto en el mango de Kolle, que 
permite tomar los filamentos para 
transferirlos al nuevo medio. 
 microcultivo. Colocar sobre un portaobjetos, previamente flameado y 
enfriado, un trozo de medio gelificado de 1 cm de lado y 2 a 3 mm de 
espesor, tomado de una placa estéril. Sembrar en los bordes libres del 
trozo de agar como se muestra en la figura 8. Colocar un 
cubreobjetos, también flameado y enfriado. Incubar los microcultivos 
en una cámara húmeda, lograda poniendo algodón mojado bajo el 
soporte de los portaobjetos dentro de un recipiente cerrado. 
Observación de los cultivos en tubos 
macroscópica 
 Después de la incubación observar los cultivos a simple vista o con 
ayuda de la lupa y registrar en el informe las características 
morfológicas (ver figura 9). Evitar la agitación del medio líquido 
pues si ha crecido una película superficial, esta puede caer 
confundiéndose con el sedimento. 
microscópica 
 Hacer un preparado de las bacterias (ver figura 10), fijar por calor en 
la llama o microondas, y colorearlo según el método de Gram. 
Suspender los hongos en agua, líquido de Patterson o colorante de 
Gueguén al hacer el preparado en fresco y con ayuda de dos agujas 
separar los filamentos.Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 12
 El colorante de Gueguén contiene 0,1 g de azul de algodón y 0,1 g de Sudán III en 100 g de 
ácido láctico, además de 10 gotas de tintura de iodo. El líquido de Patterson se prepara 
mezclando 50 mL de solución acuosa de acetato de potasio al 2%, con 20 mL de glicerina y 30 
mL de etanol 96º 
 Observar el microcultivo con el objetivo de menor aumento, luego de enfocar un objeto 
adherido a la cara inferior del cubreobjetos se podrá utilizar el siguiente objetivo. 
Medida del tamaño de los microorganismos 
 El método más práctico usa un ocular 
autoenfocable, con una escala arbitraria 
dividida en cien pequeñas partes iguales, a 
veces numeradas, la que debe calibrarse con la 
escala de 1 mm con cien divisiones de diez 
micrómetros cada una, grabada en un 
portaobjetos llamado micro-métrico (ver figura 
11). Enfocar al portaobjetos y mover éste de 
modo que su escala quede paralela a la del 
ocular. 
 Observar cual número de las pequeñas 
divisiones de 10 µm grabadas en el portaobjetos 
coincide con un número entero de las 
contenidas en el ocular. Calcular el valor en 
micrómetros correspondiente a una división 
pequeña de la escala del ocular mediante la 
regla de tres simple. 
 Calibrar la escala del ocular para cada 
aumento del microscopio. Tener en cuenta que 
las rayas del ocular siempre tendrán el mismo 
espesor mientras que las del portaobjetos irán 
engrosándose al cambiar los objetivos. 
 
 
Bibliografia 
o Hall GS et al. Methods for the Examination of Organismal Diversity in Soils and Sediments. CAB International, 
Wallingford, 1996 
o Seeley HW & Van Demarck PJ. Microbios en Acción. Blume, Madrid, 1973 
o Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 13
TRABAJO Nº 3. Fijación simbiótica de N 2 en leguminosas 
Objetivo. Observar las características macro y micromorfológicas de los nódulos radicales de 
leguminosas. Comprobar la capacidad de nodular de la cepa de rizobio aislada. 
Introducción 
Fijación simbiótica del nitrógeno molecular 
 Una de las simbiosis más importantes es la que se da entre 
leguminosas y bacterias de los géneros Rhizobium y Bradyrhizobium . 
La infección de las raíces con una cepa adecuada de la bacteria (hay 
especificidad de huésped) conduce a la formación de nódulos 
radicales que tienen distinta forma según la planta hospedadora 
(figura 12). 
 Los rizobios específicos entran en la raíz por el extremo de los 
pelos absorbentes que se retuercen en forma de báculo. Se forma en 
el pelo uno o varios tubos de infección dentro de los cuales los 
rizobios se hallan dispuestos en fila. El tubo de infección penetra en 
las células del córtex de la raíz. Algunas células de la raíz se 
dividen activamente produciendo un meristema. 
 Los rizobios contenidos en el tubo de infección son liberados en el 
citoplasma de estas células meristemáticas donde adquieren una 
forma distinta al rizobio de vida libre y se los llama bacteroides. 
éstos son capaces de fijar el nitrógeno molecular. En los nódulos la 
presión parcial de oxígeno es muy baja, si se eleva la enzima 
nitrogenasa quedaría inhibida y no se produciría la fijación. Sin embargo el nódulo consume 
oxigeno provisto por la leghemoglobina, una molécula transportadora de O2 que contiene grupo 
hemo y da a los nódulos color rojizo. 
Nodulación de leguminosas 
Nódulos efectivos 
o pocos y situados sobretodo en la raíz primaria 
o voluminosos, con superficie lisa o rugosa 
o actividad meristematica y nodular prolongada 
o infección generalizada, zona bacteriana grande con muchos bacteroides 
o interior pigmentado de rojo por la leghemoglobina. 
Nodulos inefectivos 
o numerosos y repartidos en todo el sistema radicular 
o pequeños con superficie lisa 
o actividad meristematica y nodular corta 
o pocas células infectadas, pocos o sin bacteroides y granulos de almidón 
o interior no coloreado de rojo. 
Inoculante para leguminosas 
 La búsqueda y selección de buenas cepas de rizobios puede resultar inútil si las leguminosas 
nodulan eficientemente con las cepas nativas, situación frecuente en especies tropicales. Pero, en 
muchos suelos el nivel y la eficiencia de las cepas nativas pueden no ser los adecuados y la 
nodulación y la fijación de nitrógeno resultan insuficientes para satisfacer las demandas del 
cultivo. 
 La inoculación artificial resulta imprescindible cuando se introducen nuevas leguminosas, 
sobre todo si son hospedadores de alta especificidad o cuando la deficiencia en nitrógeno limita 
Figura 12 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 14
el desarrollo vegetal. El método y las condiciones de inoculación deben permitir la 
supervivencia de los rizobios, además la semilla inoculada debe poseer la especie de rizobio 
adecuada y en número suficiente. Las condiciones del suelo próximo a la semilla deben 
favorecer la colonización de la rizósfera por la bacteria para lograr la formación de los nodulos y 
su funcionamiento efectivo. 
 Para determinar la necesidad de 
inoculación se suele emplear un ensayo 
simple de tres tratamientos: 
- la inoculación con una cepa de rizobio 
conocida para saber si es efectiva en el 
hospedador, 
- la fertilización para asegurar un buen 
desarrollo del hospedador si no hay 
inhibidores en el suelo, 
- el control no inoculado para observar la 
presencia o ausencia de rizobios nativos 
y su efectividad. 
 Las cepas usadas en los inoculantes 
deben ser cuidadosamente seleccionadas 
y mantenidas, y probarse anualmente 
para minimizar la posibilidad de cambio 
en las propiedades simbióticas. 
 La eficencia de la fijación se evalúa por 
el número de nódulos, la masa nodular, 
el peso seco de la planta y el contenido de nitrógeno de la parte aérea. Son bacterias eficaces las 
que, por intermedio de los nódulos radicales, aportan nitrógeno reducido a la planta 
hospedadora produciendo un aumento de peso de la misma. 
Procedimiento 
Examen de los nódulos y bacteroides 
 Tomar un nódulo de la raíz de una leguminosa, medirlo y dibujar su forma. Cortarlo y 
observar el color. Si la fijación de nitrógeno era efectiva se lo verá rosado o rojo, a veces pardo. 
Aplastarlo entre dos portaobjetos. Extender el material interno mezclado con una gota de agua, 
haciendo movimientos circulares con el asa. Secar cerca de una llama. Fijar pasando tres veces el 
portaobjetos por dentro de la llama. 
 Colocar el portaobjetos sobre un soporte colocado en una bandeja o la pileta. Cubrirlo la 
solución colorante (fucsina básica 0,3 g, etanol 96º 10 mL, fenol 5 g, agua destilada 90 mL). 
Luego de un minuto lavar con agua. Secar cerca de una llama. Depositar una gota de aceite de 
inmersión, apoyar un cubreobjetos y sobre éste poner otra gota de ese aceite. 
 Observar al microscopio los bacteroides coloreados y dibujarlos tratando de mantener la 
proporción respecto al campo microscópico. Anotar el aumento. 
Germinación de semillas de leguminosas 
 Colocar las semillas necesarias, de buen poder germinativo, en un matraz de Erlemeyer con 
etanol al 70% v/v y agitar durante 3 a 5 minutos. Volcar y añadir agua lavandina al 10% v/v, 
agitando por igual tiempo. Lavar varias veces con agua destilada estéril. Depositarlas sobre 
agar-agua estéril y dejar germinar. 
Preparación del inoculante 
 Sembrar en matraces con 50 mL de medio de cultivo con la cepa aislada de nódulos durante el 
desarrollo del trabajo nº2. El medio de cultivo contiene: fosfato monopotásico 0,5 g, fosfato 
Testigo 
Ensayo 
Figura 13 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 15
dipotásico 0,5 g, cloruro de sodio 0,1 g, nitrato de potasio 0,8 g, sulfato de magnesio 0,2 g, 
extracto de levadura 4 g, fosfato diamónico 0,3 g, glicerol 10 g, agua 1 L, pH 6,8. Esterilizar a 
121ºC durante 15 minutos. 
Inoculación de leguminosas 
 Escoger de las placas de germinaciónlas dieciseis plántulas de mejor aspecto y trasladarlas al 
medio mineral inclinado en tubos grandes. Dejar en lugar iluminado y ventilado. Uno o dos 
días después verter 1 mL del cultivo homogeneizado de rizobio sobre la radícula de ocho 
plántulas cultivadas. 
 El medio mineral contiene: fosfato dipotásico 0,5 g, sulfato de magnesio 0,2 g, cloruro 
de sodio 0,1 g, cloruro férrico 0,01 g, fosfato tricálcico 2 g, agua 1 L, agar 15 g, pH 7. Esterilizar 
a 110ºC durante 20 minutos. 
Control de las leguminosas inoculadas 
 Medir la longitud de las plantas inoculadas y las testigo. Observar y registrar la ubicación, 
tamaño y forma de los nódulos. Controlar la humedad del substrato. 
Bibliografía 
o Balatti AP & Jardim Freire JR. Legume Inoculants. Selection and Characterization of Strains. Production, Use and 
Management. Kingraf, La Plata, 1996 
o Frioni L. Ecología Microbiana del Suelo. Universidad de la República, Montevideo, 1990 
o Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 16
TRABAJO Nº 4. Microorganismos del suelo 
Objetivo. Demostrar la biodiversidad de los grupos fisiológicos de microorganismos del suelo 
mediante cultivos selectivos que provean las condiciones ambientales y disponibilidad de 
nutrientes adecuadas. 
Introducción 
 Los microoganismos juegan un papel significativo en la mayoría de los procesos naturales que 
afectan al ambiente. Un ejemplo es la fijación del nitrógeno molecular por los organismos de 
vida libre y los simbióticos, otro es el reciclado de materiales orgánicos. La materia orgánica que 
llega al suelo a través de residuos de cosechas, la caída del follaje, las raíces y sus productos de 
descamación y exudación, los restos animales y microbianos sufren una serie de procesos de 
degradación que asegura la continuidad de los ciclos biogeoquímicos. 
 Empleando medios selectivos se puede lograr cultivos enriquecidos en microorganismos con 
una característica fisiológica determinada, por ejemplo si carece de una fuente de nitrógeno 
soluble sólo crecerán las bacterias capaces de reducir el nitrógeno gaseoso disuelto, procedente 
de la atmósfera. 
Amonificación 
 El nitrógeno orgánico de los productos de hidrólisis de proteínas y polinucleótidos, se 
convierte en amoníaco por el proceso de desaminación. La urea se hidroliza rápidamente a 
amoníaco y dióxido de carbono por la enzima ureasa producida por muchos microorganismos. 
La evolución de la microbiota varía según la materia nitrogenada transformada. En general, 
primero aparecen bacilos, esporulados o no, y cocos. Después se observan actinomicetos y más 
tarde mohos. 
 La demostración de la amonificación se basa en investigar amoníaco mediante el reactivo de 
Nessler en el medio acuoso con aminoácidos (peptona, etc). La solución de yodo-mercuriato 
potásico alcalinizada origina desde un color amarillo hasta un precipitado rojo ladrillo según la 
cantidad de amoniaco presente. 
 El amoniaco formado puede ser asimilado directamente por otros microrganismos o ser 
convertido en nitrato por las bacterias específicas. Si se añade a un suelo materiales tales como 
estiércol, aumenta en consecuencia la velocidad de nitrificación. 
Nitrificación 
 El nitrógeno tiene tres formas estables de oxidación en la naturaleza (nitrógeno molecular, 
amoníaco, nitrato) cuya interconversión está dada casi exclusivamente por bacterias. Algunos 
organismos pueden usar directamente amonio para sintetizar sus aminoácidos y otras 
moléculas nitrogenadas de la célula, pero otros, incluyendo las plantas, prefieren nitrato. La 
oxidación del amonio a nitrato se denomina nitrificación y unas bacterias autótrofas aerobias las 
llevan a cabo en dos etapas: 
1) oxidación del amonio por Nitrosomonas, Nitrosococcus 
2) oxidación del nitrito por Nitrobacter, Nitrococcus 
 Tanto la formación de nitrito como la de nitrato por los microorganismos quimioautótrofos 
constituyen procesos metabólicos aeróbicos generadores de energía. Ocurre rápidamente en 
suelos bien drenados a pH neutro. Aunque el nitrato es fácilmente asimilado por las plantas, 
como es muy soluble en agua resulta rápidamente lavado de los suelos que reciben una gran 
cantidad de lluvia. Por el contrario, el amonio queda fuertemente adsorbido a las arcillas. 
Desnitrificación 
 Es el proceso en el cual algunos organismos que pueden usar el nitrato como aceptor final de 
electrones durante la respiración anaeróbica producen moléculas reducidas gaseosas (óxido de 
dinitrógeno, nitrógeno molecular) que desaparecen del ecosistema. Existen otros 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 17
microorganismos que pueden reducir nitrato hasta amonio, manteniendo el nitrógeno en el 
ecosistema (reducción asimilatoria del nitrato). 
 Si un suelo queda anegado se producen condiciones anaeróbicas y ocurre la desnitrificación, 
principalmente si es rico en materia orgánica. También sucede cuando se originan puntos de 
anaerobiosis por otras causas. Como los productos de la desnitrificación son gaseosos se 
escapan del suelo disminuyendo el contenido en nitrógeno del mismo. En el laboratorio tales 
gases quedan atrapados en la campanita del medio de cultivo. 
Fijación de nitrógeno molecular 
 La utilización de este como fuente de nitrógeno es una propiedad que poseen ciertas bacterias 
y cianobacterías. A continuación se da una lista abreviada de organismos fijadores de nitrógeno 
de vida libre. 
 
Algunos géneros de bacterias con especies fijadoras de nitrógeno 
 Aerobios Anaerobios 
Heterotróficos Fotosintetizadores Heterotróficos Fotosintetizadores 
Azotobacter cianobacterias Clostridium Chromatium 
Klebsiella Chlorobium 
Beijerinckia Rhodospirillum 
Bacillus Heliobacterium 
Azomonas 
Azospirillum (microaerófilo) 
 
 El nitrógeno es reducido a amonio en el proceso de fijación catalizado por el complejo 
nitrogenasa, uno de cuyos componentes proteínicos contiene molibdeno, los otros hierro. La 
enzima es inactivada por el oxígeno. El nitrógeno molecular es muy inerte y su reducción 
requiere mucha energía. 
 Azotobacter crece en un medio liquido sin agitación, en forma de una película superficial. Es 
bastante sensible a la acidez pues no suele crecer por debajo de pH 6. Al microscopio se 
observan bacilos gram-negativos, grandes, de 4 a 6 µm de largo, acompañados de células de 
mayor tamaño con paredes gruesas y apariencia de levadura, conocidas como cistos. Esta 
bacteria tiene una gran capacidad respiratoria, medida como velocidad de consumo de oxigeno, 
para proveer la energía requerida por la fijación. 
 Los clostridios fijadores no sólo son incapaces de crecer en presencia de aire sino que 
generalmente son muertos por el oxígeno, a menos que se encuentren en forma de endosporos, 
pero pueden crecer por debajo de la película de Azotobacter, generando burbujas de gas por la 
fermentación de azúcares. 
Sulfo-oxidación 
 El sulfuro de hidrógeno, el azufre elemental y el ion sulfato son tres formas estables 
importantes del azufre. El sulfuro de hidrógeno es tóxico para la mayoría de los organismos y 
los sulfuros son oxidados a sulfato por bacterias aerobias del género Thiobacillus y azufre 
elemental por bacterias fotosintetizadoras anaerobias de ambientes acuáticos, el que se acumula 
en la célula, sufriendo una posterior oxidación en algunos casos. La mayoría de los 
microorganismos oxidantes del azufre son autótrofos obligados. 
Sulfato-reducción 
 El sulfato y otros compuestos oxigenados del azufre, pueden ser reducidos a sulfuro de 
hidrógeno por bacterias heterotróficas anaerobias. Esta actividad microbiana es muy evidente 
en los barros del fondo de estanques y lagos. Suelen usar hexosas, alcoholes o ácidos orgánicos 
como fuente de carbono, pero algunas especiescrecen autotróficamente con hidrógeno 
molecular y tiosulfato, por ej. Desulfovibrio. 
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 18
Celulolisis, amilolisis 
 El almidón y la celulosa están compuestos por unidades de glucosa, pero conectadas de 
diferente manera: uniones 1,4 α- y 1,4 β-glucosidicas respectivamente, lo que afecta a sus 
propiedades. La celulosa es insoluble y se digiere a mucho menor velocidad que el almidón 
soluble. La celulosa forma largas fibrillas a las que se encuentran intimamente asociados los 
microorganismos que la degradan. Muchos hongos son celulolíticos, pero entre las bacterias 
esta propiedad está restringida a unos pocos grupos: mixobacterias, clostridios y actinomicetos. 
El almidón, en cambio, es hidrolizado por muchos hongos y bacterias. 
 Las bacterias celulolíticas predominan en la zona radicular y su densidad decrece en 
muestras tomadas a cierta distancia de la planta. Por otra parte, es el proceso fundamental 
que ocurre durante el compostaje de residuos agrícolas, donde predominan los 
microorganismos termófilos. 
Solubilización de fosfatos 
 Algunos mohos comunes, por ej. Penicillium, Aspergillus, Fusarium, pueden solubilizar fosfatos 
insolubles como polvo de huesos y apatita. Aproximadamente un décimo de las bacterias del 
suelo también los solubilizan. La solubilización de fosfato de calcio se aprecia como zonas claras 
que rodean las colonias y generalmente se produce cuando los microorganismos forman ácidos 
orgánicos tales como ácido 2-ceto-glucónico (bacterias), ác. citrico u oxálico (hongos), pero éstos 
son rápidamente degradados por otros organismos del suelo. Los fosfatos de hierro y aluminio 
pueden ser solubilizados por los microorganismos productores de sulfuro de hidrógeno. 
Procedimiento 
Fijación de nitrógeno molecular 
 El medio contiene: manitol 10 g, carbonato de calcio 0,5 g, solución salina 50 mL, solución de 
oíigoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en matraces de Erlenmeyer de 250 mL de 
capacidad, a razón de 50 mL en cada uno y se esteriliza a 110ºC durante 20 minutos. Sembrar 
unos granulos de suelo e incubar a 25-27°C durante 7 días. 
 La solución salina contiene: fosfato dipotásico 5 g, sulfato de magnesio heptahidrato 2,5 g, 
cloruro de sodio 2,5 g, sulfato ferroso heptahidrato 0,05 g, agua 1 L, pH 7 - 7,5. 
 La solución de oíigoelementos contiene 0,05 g/L de las sales siguientes: molibdato de potasio, 
borato de sodio, nitrato de cobalto, sulfato de cadmio, sulfato de cobre, sulfato de zinc, sulfato 
de manganeso, cloruro férrico. 
 Hacia el tercer día el medio se enturbia ligeramente y en la superfiie aparece un velo grisáceo. 
Los días siguientes el velo se pliega, dando una superficie rugosa y mamelonada que se vuelve 
parduzca. Finalmente caen trozos de velo dentro del liquido. A su vez el liquido se enturbia 
cada vez más y suelen aparecer burbujas en el fondo. La observación microscópica del velo 
muestra células bacilares, ovales, cocoides y a veces cistos esféricos, mientras que el material 
tomado del fondo permite ver bacilos esporulados Gram-positivo o variable. 
 Medio para Azotobacter: sacarosa 20 g, fosfato dipotásico 0,05 g, fosfato monopotásico 0,15 
g, cloruro de calcio 0,01 g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,2 g, molibdato de sodio 0,002 g, 
cloruro férrico 0,01 g, azul de bromotimol (al 0,5% p/v en etanol) 2 mL, carbonato de calcio 1 g, 
agua 1 L, pH 6,8. Esterilizar a 110ºC durante 20 minutos. 
 Medio para Derxia: Reemplazar la sacarosa por almidón o glucosa y omitir el carbonato de 
calcio. 
 Medio para Azospirillum: ácido málico 5 g, fosfato dipotásico 0,5 g, sulfato de magnesio 
heptahidrato 0,2 g, cloruro de sodio 0,1 g, cloruro de calcio 0,02 g, molibdato de sodio 0,002 g, 
sulfato de manganeso 0,01 g, etilén -diamino-tetra-acetato férrico (al 1,64% p/v) 4 mL, azul de 
bromotimol (al 0,5% p/v en etanol) 3 mL, biotina 0,1 mg, agua 1 L, p H 6,8. 
 Medio para Clostridium pasteurianum : glucosa 10 g, fosfato monopotásico 0,75 g, solución 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 19
salina 50 mL, solución de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Distribuir en tubos con campanita de 
Durham. Luego de sembrar cubrir con agar al 1,5% fundido o vaselina estéril. 
Desnitrificación 
 El medio de cultivo contiene: nitrato de potasio 2 g, carbonato de calcio 5 g, glucosa 10 g, 
solución salina 50 mL, solución de oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Los tubos llevan dentro una 
campanita de vidrio y se esterilizan a 110ºC durante 20 minutos. Inocular unos gránulos de 
suelo sin agitar e incubar una semana a 25-27ºC. 
 Si se ha reducido el nitrato hasta el estado de nitrógeno molecular u óxido de nitrógeno 
quedarán retenidos en la campanita inmersa en el tubo. La formación de nitritos se comprueba 
agregando 1 mL del reactivo de Griess al tubo de cultivo. Aparecerá un color rosado si hay 
nitritos. 
 Preparar el reactivo de Griess en el momento de usarlo, mezclando partes iguales de las 
soluciones siguientes: 
o Disolver 0,05 g de naftilamina en 100 mL de ácido acético al 30% (v/v) en agua. 
o Disolver 0,32 g de ácido sulfanilico en 100 mL de ácido acético al 30% (v/v) en agua. 
Nitrificación 
 El medio de cultivo para formadores de nitritos contiene: sulfato de amonio 0,5 g, carbonato 
de calcio 1 g, solución salina 50 mL, agua 1 L. Se distribuye en matraces de Erlenmeyer de 250 
mL de capacidad, a razón de 50 mL en cada uno. 
 El medio para productores de nitratos contiene 1 g de nitrito de sodio en lugar del sulfato de 
amonio. Esterilizar a 110ºC durante 20 minutos. 
 Sembrar unos gránulos de suelo en ambos matraces e incubar a 25-27ºC durante dos semanas. 
 Formadores de nitritos. Volcar 5 mL del cultivo en un tubo de ensayo y agregar 1 mL del 
reactivo de Griess recien preparado. Aparecerá un color rosado si se han formado nitritos por 
acción microbiana. 
 Formadores de nitratos. Transferir unos 5 mL del cultivo a un tubo de ensayo y agregar 1 mL 
del reactivo de Griess. Si esta reacción da negativa los microorganismos han oxidado los nitritos 
a nitratos. Colocar otros 5 mL de cultivo en un tubo, agregar unos 50 mg de urea y 10 gotas de 
acido sulfúrico. Calentar para eliminar los nitritos. Luego añadir 1 mL de reactivo difenilamina 
por las paredes del tubo. Si en la zona de contacto aparece un color azul hay nitratos formados 
por acción microbiana. 
 El reactivo difenilamina contiene: difenilamina 1 g, agua destilada 20 mL, ácido sulfúrico 100 
mL. Colocar en frasco obscuro. 
Amonificación 
 El medio de cultivo contiene peptona 0,2 g, solución salina 50 mL, solución de 
oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en tubos y se esteriliza a 110ºC durante 20 
minutos. Sembrar unos gránulos de suelo e incubar una semana a 25-27ºC. 
 Después agregar 1 mL de reactivo de Nessler a cada tubo a ensayar. La aparición de un color 
ladrillo indica la presencia de amoniaco. 
 El reactivo de Nessler consta de dos soluciones que se mezclan en partes iguales en el 
momento de usar. 
o Colocar en un mortero 5 g de ioduro mercúrico y 3,65 g de ioduro de potasio, añadir un 
poco de agua destilada y triturar hasta disolver. Completar a 100 mL con agua. 
o Disolver 15 g de hidroxido de potasio en lentejas en 100 mL de agua destilada. 
Celulolisis 
 El medio de cultivo contiene: nitrato de amonio 1 g, solución salina 50 mL, solución de 
oligoelementos 1 mL, agua 1 L. Se distribuye en tubos con tiras de papel de 1 x 10 cm y esteriliza 
a 110ºC durante 20 minutos. Sembrar unas gotas de una suspensión de suelo, que haya sido 
abonado con estiércol, e incubar dos a tres semanas a 25-27C. 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 20
 Donde el papel sobresale del líquido se acumulan las bacterias celulolíticas aerobias y suelen 
colorearlo. Sacar la tira de papel y colocarla en un portaobjetos para observar el ataque de las 
fibras bajo la lupa. Comp robar si se disgrega con facilidad altocarla con el asa. 
 Medio para clostridios : sulfato de amonio 0,5 g, cloruro de sodio 0,1 g, fosfato dipotásico 0,7 
g, sulfato de magnesio heptahidrato 0,05 g, cloruro de calcio 0,05 g, celulosa en polvo 3 g, 
carboximetilcelulosa 1 g, extracto de levadura 1 g, azul de metileno (0,005% p/v) 1 mL, agar 15 
g, agua 1 L, pH 7,0; esterilizar a 121ºC durante 15 minutos. Agregar 0,5 mL de clorhidrato de 
cisteína (al 1% p/v) a cada tubo con 10 mL de medio estéril fundido, sembrar de inmediato con 
unas gotas de la suspensión de suelo y colocar en agua fría para una rápida gelificación. 
Amilolisis 
 El medio de cultivo contiene: almidón soluble 2 g, nitrato de amonio 1 g, solución salina 50 
mL, solución de oligoelementos 1 mL, agar 15 g, agua 1 L. Esterilizar a 110ºC durante 20 
minutos. Distribuir en cajas de Petri. Sembrar con unos gránulos de suelo e incubar a 25-27ºC. 
 Cubrir la superficie con solución acuosa de yodo, por ejemplo la de Lugol. La zona de 
hidrólisis alrededor del crecimiento microbiano aparece clara sobre un fondo azul. 
Sulfato-reducción 
 El medio de cultivo contiene: cloruro de amonio 1 g, fosfato dipotásico 0,5 g, sulfato de 
magnesio heptahidrato 2 g, sulfato de sodio 0,5 g, cloruro de calcio 0,1 g, lactato de sodio (al 
60% p/v) 6 mL, extracto de levadura 1 g, tioglicolato de sodio 1 g, agua 1 L. Repartir en tubos 
colocando 10 mL en cada uno. Esterilizar a 110ºC durante 20 minutos. Sembrar con unos 
gránulos de suelo e introducir un clavo previamente pasado por la llama y enfriado. Cubrir con 
agar al 1,5% fundido o vaselina. Incubar dos o tres semanas a 25-27ºC. Ver si el clavo se ha 
ennegrecido por la formación de sulfuro de hierro debido a los microorganismos. 
Sulfo-oxidación 
 El medio de cultivo contiene: fosfato dipotásico 0,25 g, cloruro de magnesio 0,1 g, cloruro de 
sodio 0, 1 g, nitrato de amonio 2 g, carbonato de calcio 5 g, agua destilada 1 L. Repartir en tubos 
a razón de 5 mL en cada uno y esterilizar 20 minutos a 110ºC. Agregar a cada tubo 1 mL de una 
solución a 10% de monosulfuro de sodio y sembrar unos gránulos de suelo. Incubar a 25-27ºC 
durante dos a tres semanas. 
 Volcar 2 mL del cultivo en otro tubo, acidificar con dos gotas de ácido clorhídrico concentrado 
y añadir 5 gotas de solución acuosa de cloruro de bario al 5%. p/v. La aparición de una 
opalescencia indica que se han formado sulfatos por la actividad microbiana. 
Solubilización de fosfatos 
 El medio de cultivo contiene: extracto de levadura 2 g, glucosa 20 g, agar 15 g, agua 1 L, 
fosfato tricálcico 2 g. Se esteriliza a 110ºC durante 20 minutos y se distribuye en caja de Petri. 
Sembrar unos gránulos e incubar a 25-27ºC. 
 Observar la formación de una zona transparente alrededor de las colonias. 
Bibliografía 
o Fenchel T et al. Bacterial Biogeochemistry: The Ecophysiology of Mineral Cycling. Academic Press, San Diego, 
1998. 
o Alef K & Nannipieri P. Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry. Academic Press, London, 1995. 
o Frioni L. Ecología Microbiana del Suelo. Universidad de la República, Montevideo, 1990. 
 
 
 
 
 
 
 
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 21
TRABAJO Nº 5. Inhibidores y desinfectantes 
Objetivo. Determinar la concentración inhibitoria mínima y la concentración letal mínima de 
productos comerciales usados en el campo. 
Introducción 
 Los agentes que producen efectos reversibles causan inhibición sin 
acción mortal inmediata. Los bacteriostáticos actúan sobre las 
bacterias y los fungistáticos sobre los hongos. Los compuestos de 
acción irreversible causan la muerte rápida. Los bactericidas y 
fungicidas matan bacterias y hongos, respectivamente (figura 14). 
La diferencia es cuantitativa más que cualitativa. La adición de 0,3% 
de fenol impide el crecimiento de Escherichia coli, pero no mata las 
células en varias horas mientras que 1% las elimina en minutos 
(figura 15). 
 La palabra desinfección se empleó para expresar la 
eliminación de cualquier agente que pudiera causar 
infección o enfermedad. Los desinfectantes son agentes de esterilización. Las 
células activas jóvenes tienen una notable sensibilidad a estas substancias. La 
desinfección es más rápida al aumentar la temperatura del sistema. El medio en 
que se encuentran los microrganismos puede alterar la eficacia de la 
desinfección, por combinación del material orgánico con el agente activo. 
También el pH modifica los mecanismos de desinfección. 
 Los endosporos bacterianos son más difíciles de destruir que las células 
vegetativas. También presentan cierta resistencia los organismos encapsulados. 
Otro factor que posibilita la desinfección es un contacto eficaz. La humedad es 
esencial y los agentes tensoactivos mejoran dicho contacto. 
 Las pruebas de la concentración inhibitoria mínima (CIM) y la concentración letal mínima 
(CLM) son útiles para comparar la eficacia de diversos productos químicos contra un organismo 
determinado, o la sensibilidad de diferentes organismos a un mismo producto. 
 Los microorganismos comúnmente usados son cepas de colección de Escherichia coli, 
Pseudomonas aeruginosa, Clostridium perfringens, Staphylococcus aureus, para establecer la acción 
frente a organismos coliformes, seudomónadas, clostridios y otros aerobios, respectivamente. 
El tamaño del inóculo suele ser de 104 a 10 6/mL, según el microorganismo y la substancia 
estudiada. 
Procedimiento 
Concentración inhibitoria mínima 
 Preparar una solución al 1/10 p/v ó v/v del compuesto en agua destilada estéril. Si se trata de 
un curasemillas con un principio activo poco soluble, usar alcohol o acetona al 1/2 v/v en esta 
primera dilución. 
 Poner 1 mL de la solución 1/10 en cada uno de los 9 tubos de ensayo estériles. Añadir al 
primer tubo 1 mL de agua destilada estéril, al segundo 2 mL, al tercero 3 mL y así 
sucesivamente hasta agregar al noveno 9 mL, obteniendo diluciones que van desde 1/20 a 
1/100. 
 Transferir 1 mL de la dilución original al 1/10, y 1 mL de cada una de las otras diluciones a 
sendos tubos con 9 mL de caldo nutritivo (en el caso del desinfectante) o agua estéril (en caso 
del curasemillas), comenzando por la más diluida.. Las diluciones obtenidas van de 1/100 a 
1/1000. 
Figura 15 
Figura 14 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 22
Bacterias 
 Añadir 0,1 a 0,2 mL de un cultivo de 24 hs en caldo, de Staphylococcus aureus o Escherichia coli, a 
un tubo con 9 mL de caldo nutritivo de tal manera que se obtenga un suspensión de turbiedad 
poco apreciable a simple vista. Luego transferir 0,2 mL de esta suspensión bacteriana a cada uno 
de los tubos con diluciones de desinfectante en caldo. Incubar a 35°C durante 48 hs. 
Hongos 
 Agregar agua estéril (con 0,05% v/v de Tween 80) al tubo de cultivo de 5 días a 25°C en medio 
de Czapek o Sabouraud, de Penicillium expansum, Aspergillus flavus o Cladosporium 
cladosporioides , agitando para suspender los esporos. Añadir 0,5 a 1 mL de la suspensión de 
esporos a un matraz con 50 mL de agar de Sabouraud, fundido y enfriado a 45-50°C. Mezclar y 
volcar en cuatro cajas de Petri estériles. 
 Una vez gelificado, se depositan discos de papel de filtro de 4 mm de diámetro previamente 
humedecidos con las diluciones del producto, a razón de tres discos por placa. Se incuba a 25-
28°C durante 5 días. 
Concentración letal mínima 
 Preparar, como se indicó arriba, una serie de tubos con 10 mL de cada una de las diluciones 
del compuesto, que van desde 1/100 a 1/1000, utilizando agua estéril en lugar de caldo. 
 Adicionar a cada dilución 0,2 mL de una suspensión bacteriana preparada como se describió 
arriba. Anotar la hora a la cual se agregó al primer tubo, y a intervalos de 2, 5, 10 y 15 minutos 
cargar un asa (con un diámetro interno de 4 mm) de cada dilución y llevar a un tubo de caldo 
nutritivo que contiene 0,1 % p/v de ácido tioglicólico para neutralizar la acción del 
desinfectante remanente. Incubar a 35°C durante 48 hs.Bibliografía 
o Collins CH, Lyne PM, Grange JM. Collins and Lyne’s Microbiological Methods. 7º ed. Butterworth Heinemann, 
Oxford, 1999 
o Umbreit W. Modern Microbiology. WH Freeman & Co, San Francisco, 1962 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 23
TRABAJO Nº 6. Digestión anaeróbica de residuos agrícolas 
Objetivo. Transformar los residuos agrícolas en biogas y un lodo útil como fertilizante. 
Introducción 
 Se emplea estiércol, paja y lodo procedente de otro digestor. El gas formado en la 
fermentación metanica es una mezcla de metano y dióxido de carbono. Las denominadas 
bacterias metánicas implicadas pertenecen a los géneros Methanococcus, Methanobacterium, 
Methanosarcina y otros. Dependiendo de la composición del material de partida, se puede 
producir biogas con alrededor de 70%. de metano. Estas bacterias son anaerobias estrictas y 
reducen al dióxido de carbono. 
 Las bacterias metánicas se diferencian de las demás debido a su peculiar estructura de la 
pared y la membrana celular, y forman parte de las arqueobacterias junto a las termófilas y las 
halófilas. Se encuentran en el rumen, los sedimentos de aguas estancadas y en los digestores de 
las depuradoras de aguas residuales. 
 Las metanobacterias sólo podrán desarrollarse cuando por acción de las bacterias facultativas 
se haya consumido todo el oxígeno, y las fermentadoras hayan producido suficiente dióxido de 
carbono e hidrógeno a partir de almidón, celulosa o aminoácidos. 
 Las bacterias metánicas son sensibles al descenso del pH producido por los ácidos orgánicos 
formados por los clostridios. Pero en un sistema en equilibrio consumen los ácidos a medida 
que aparecen manteniendo un ambiente neutro. 
 Las instalaciones pequeñas de biogás permiten la obtención de energía en zonas rurales. 
Procedimiento 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Equipo de digestión: 1 fermentador, 2 mecanismo de agitación con varilla, 3 material a fermentar, 4 baño 
de agua, 5 acuario, 6 calentador conectado a una bomba de circulación, 7 termómetro y termostato, 8 
depósito de gas (neumático de bicicleta), 9 frasco lavador (indicador de gas y lavado de CO2), 10 frasco 
lavador abierto (para equilibrar la presión), 11 llave de triple vía, 12 tubo de vidrio con virutas de hierro 
(arrestallamas), 13 mechero. 
 
 Colocar en un frasco de 1 L, unos 200 g de estiércol fresco de vaca, 25 g de paja cortada en 
trozos pequeños y agua hasta unos 5 cm de la boca. Poner un tapón atravesado por un agitador 
y un tubo para la salida de los gases. 
 Instalar el fermentador en un baño de agua a 37ºC. Unir la salida a un frasco lavador y éste a 
otro frasco abierto para equilibrar la presión, y a una llave de triple via que está conectada al 
Figura 16 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 24
depósito de gas y al mechero. Entre el mechero y la llave de triple via se coloca un tubo de 
vidrio lleno con virutas de hierro para evitar el retroceso de la llama. Controlar la hermeticidad 
de todos los cierres. 
 Agitar diariamente la mezcla en descomposición. Luego de uno o dos días vaciar la cámara 
para eliminar la mezcla explosiva de biogás y aire. Dejar hasta que se llene nuevamente el 
depósito y comprobar cómo arde el biogás a la salida del mechero. Controlar diariamente el 
nivel de agua del baño, la temperatura y la cantidad de gas. 
Bibliografía 
o Madigan TM et al. Brock- Biología de los Microorganismos. Prentice Hall, Madrid, 1998 
o Jagnow G, Dawid W. Biotecnología. Acribia, Zaragoza, 1991 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 25
TRABAJO Nº 7. Morfología microscópica de hongos 
Objetivo. Conocer las estructuras microscópicas de mohos, levaduras y setas. 
Introducción 
 Micelio es el cuerpo filamentoso de un hongo y un trozo del mismo se denomina hifa. Las 
hifas pueden presentar septos y entonces el micelio está tabicado. Si los tabiques están ausentes 
es un micelio contínuo. Rizoides son las hifas de succión que penetran en el substrato. 
Apresorios son unas hifas achatadas de sostén que se adhieren al hospedador o substrato. 
 Cuando el cuerpo del hongo es una sola célula se lo llama levadura. Los cortos filamentos 
formados por las células brotantes de la levadura se conocen como pseudomicelio. 
Plecténquima es un conjunto de hifas que se asemeja a un tejido. Esclerocio es un plecténquima 
generalmente macroscópico que puede permanecer largo tiempo con vida latente. 
Clamidospora es una célula de resistencia, terminal o intehifal, con pared gruesa y substancias 
de reserva. Las esporas son los elementos de multiplicación de los hongos. De acuerdo a su 
forma y origen reciben distinto nombre como se observa en la figura 17 . 
 Anamorfo es el hongo con reproducción asexuada o mitospórica. Los conidios son mitosporas 
que se hallan sésiles o sobre un 
conidióforo (simple o ramificado), o 
dentro del plecténquima de un picnidio. 
Un esporangio contiene numerosos 
mitosporas dentro de una membrana 
peridial simple. 
 Teleomorfo es el hongo con 
reproducción sexuada o meiospórica. 
Las ascosporas son meiosporas que se 
encuentran dentro de los ascos libres de 
las levaduras, o los ascos encerrados en 
el plecténquima de un ascoma o sobre el 
mismo. Las basidiosporas surgen de los 
esterigmas del basidio donde ocurrió la 
meiosis. Los basidios generalmente se 
encuentran sobre laminillas, tubos o 
espinas del basidioma. 
 Las figuras 17 y 18a muestran 
esquemas de diversas estructuras 
fúngicas. Los conidióforos simples son cortos filamentos que generalmente nacen 
perpendiculares a la hifa y originan en su extremo el o los conidios. Los ramificados suelen 
terminar en ramas con forma de botellón (fiálides) de donde surgen los conidios. Algunas 
estructuras son típicas de géneros comunes y llevan su nombre: cabeza aspergilar, penicilio. 
También los conidióforos simples o ramificados suelen estar reunidos en: coremio (como un 
fósforo), esporodoquio (como una almohadilla), picnidio (dentro de un plecténquima con forma 
de pera). 
 Un esporangio contiene innumerables esporas, pero un esporangiolo sólo contiene tres o 
cuatro y se encuentra en el ápice de una rama lateral del esporangióforo. La columela es la 
punta dilatada del esporangióforo y está dentro de la esfera del esporangio. En algunos casos, 
unas pocas esporas están reunidas en merosporangios (bolsitas como dedos de guante) que se 
asientan sobre la columela. 
 Los ascomas tienen distinta forma: cleistotecio (cerrado) que se rompe al madurar las esporas, 
peritecio (forma de pera) con abertura u ostíolo por donde salen las esporas maduras, apotecio 
(forma de copa) con los ascos expuestos. 
Figura 17 
Leonor Carrillo. 2003. Microbiología Agrícola. Apéndice 26
Los basidiomas más conocidos 
son: el champiñón con laminillas 
en la parte inferior del sombrero 
donde se originan las esporas, el 
boleto con poros en vez de 
laminillas, la bola de nieve que al 
romperse libera las esporas 
maduras (figura 18b). Hay otras 
formas como el basidioma 
excéntrico de los pleurotos, los 
estantes rígidos que crecen sobre 
troncos, las formas gelatinosas. 
 
 
Procedimiento 
Microcultivos 
 Observar los microcultivos con el objetivo 4x y una vez enfocada una estructura próxima al 
cubreobjetos o adherida al mismo, pasar al objetivo 10x. Luego para ver detalles se puede pasar 
al objetivo seco de mayor aumento, si la distancia focal de la lente lo permite. 
Preparaciones 
 Hacer preparaciones en fresco colocando un trozo de micelio en una gota de lactofenol, o 
colorante de Gueguén, y desagregar con ayuda de dos agujas, montadas en sendos mangos . 
Poner un cubreobjetos y observar al microscopio. Dibujar las estructuras vistas. 
 El lactofenol contiene: ácido láctico 100 mL, fenol 20 g, glicerol 50 mL, agua 40 mL. 
Bibliografía 
o Deacon JW . Introducción a la Micología Moderna. Limusa-Noriega,