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UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERU FACULTAD DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS TESIS PRESENTADO POR LA BACHILLER: POMA CAMARGO PATRICIA AMARILIS PARA OPTAR EL TITULO PROFESIONAL DE: INGENIERO EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS HUANCAYO - PERU 2016 Efecto de tres niveles de concentración de levadura Saccharomyces cerevisiae cepa CH 158 SIHA en la fermentación del zumo de aguaymanto (Physalis peruviana L.). ASESOR: Ing. M. Sc. EMILIO F. YÁBAR VILLANUEVA A mi madre y padre por su apoyo incondicional en todas las etapas de mi vida. ÍNDICE GENERAL RESUMEN I. INTRODUCCION II. REVISION BIBLIOGRAFICA 1 2.1 Aspectos generales del aguaymanto 1 2.2 Morfología del fruto de aguaymanto 1 2.2.1 Morfología del cáliz 2 2.2.2 Morfología del fruto 2 2.3 Cambios fisiológicos del aguaymanto 6 2.3.1 Tasa de respiración 6 2.3.2 Cambios de color 6 2.3.3 Cambios químicos 7 2.3.4 Índice de madurez 8 2.4 Problemas en el manejo del fruto de aguaymanto 12 2.5 Composición fisicoquímica y nutricional del aguaymanto 12 2.6 Utilización del fruto de aguaymanto 13 2.7 Fermentación alcohólica 14 2.7.1 Bioquímica de la fermentación alcohólica 14 2.7.2 Criterios generales para elaborar bebidas alcohólicas fermentadas 15 2.8 Factores que influyen en la fermentación alcohólica 17 2.8.1 Temperatura 17 2.8.2 pH 19 2.8.3 Ácidos orgánicos 20 2.8.4 Grado alcohólico 21 2.8.5 Aireación 21 2.8.6 Otros factores 22 2.8.7 Los nutrientes 22 2.9 Las levaduras 23 2.9.1 Clasificación de las levaduras 24 2.9.2 Especies de mayor relevancia enológica 24 2.9.3 Utilización de las levaduras en vinificación 25 2.10. Productos secundarios de la fermentación 26 2.11 Característica de una bebida alcohólica fermentada 27 2.12 Clarificación 30 2.12.1 Bentonita 31 2.13 Enfermedades en vinos 31 2.13.1 Enfermedades aerobias 32 2.13.2 Enfermedades anaerobias 32 2.14 Definiciones generales relacionadas con el producto obtenido 34 2.14.1 Bebidas alcohólicas fermentadas 34 2.14.2 Bebidas alcohólicas destiladas 34 2.14.3 Bebidas alcohólicas preparadas 35 2.14.4 Licor 35 2.15 Clasificación de los vinos 35 III. MATERIALES Y METODOS 36 3.1 Materiales 36 3.1.1 Materia prima 36 3.1.2 Insumos 36 3.1.3 Equipos 36 3.2 Métodos de análisis 37 3.2.1 Análisis fisicoquímico de la materia prima 37 3.2.2 Análisis físicoquímico de la bebida alcohólica fermentada 38 3.2.3 Análisis Microbiológico 38 3.2.4 Análisis sensorial 38 3.3 Diagrama de flujo para la elaboración de la bebida alcohólica fermentada de aguaymanto. 39 3.4 Operaciones realizadas para elaborar la bebida alcohólica fermentada de aguaymanto. 40 3.4.1 Selección 40 3.4.2 Clasificación 40 3.4.3 Lavado 40 3.4.4 Licuado 40 3.4.5 Prensado 40 3.4.6 Dilución 40 3.4.7 Corrección de mosto 40 3.4.8 Fermentación alcohólica 41 3.4.9 Trasiego 41 3.4.10 Clarificado 41 3.4.11 Filtrado 41 3.4.12 Estandarizado 42 3.4.13 Embotellado 42 3.5 Caracterización del producto final 42 3.6. Diseño experimental 42 IV. RESULTADOS Y DISCUSIONES 44 4.1 Materia prima 44 4.2 Determinación del índice de madurez del aguaymanto 45 4.3 Determinación de la fracción utilizable 47 4.4 Análisis en el mosto de aguaymanto 48 4.5 Controles realizados en el proceso fermentativo 49 4.6 Estabilización de la bebida alcohólica fermentada de aguaymanto 61 4.7 Evaluaciones organolépticas para la bebida alcohólica fermentada 62 4.8 Rendimiento final para la obtención de una bebida alcohólica fermentada de aguaymanto. 63 V. CONCLUSIONES 64 VI. RECOMENDACIONES 65 VII. BIBLIOGRAFIA 66 VIII. ANEXO 73 ANEXO 1. Análisis estadístico a diferentes concentraciones de levadura. 73 ANEXO 2. Análisis estadístico del análisis sensorial a diferentes concentraciones de levadura. 80 ANEXO 3: Ficha de análisis sensorial N° 1 84 ANEXO 4: Ficha de análisis sensorial N° 2 85 ANEXO 5: Ficha técnica de levadura. 86 ANEXO 6: Ficha técnica bentonita. 87 ANEXO 7: Límites máximos permitidos de componentes químico en bebidas alcohólicas. 89 ANEXO 8: Análisis final la bebida alcohólica fermentada. 90 ANEXO 9: Certificado del registro sanitario. 91 ANEXO 10. Rendimiento del proceso fermentativo 92 ANEXO 11: Fotografía del proceso. 93 INDICE DE FIGURAS Figura Pag. 1 Plantación de Uchuva en Machetá, Colombia 2 2 Aguaymanto 4 3 Distribución porcentual de los carbohidratos sacarosa, fructosa, glucosa y almidón en frutos maduros (izquierda) y cáliz (derecha) de la uchuva (Physalis peruviana) 5 4 Tabla de color del fruto y cáliz de uchuva 7 5 Tendencia y ecuación de regresión estimada para el contenido de solidos solubles totales y la acidez total titulable del fruto de la uchuva durante su maduración 10 6 Tendencia y ecuación de regresión estimada para el contenido de β-caroteno y la relación índice madurez del fruto de la uchuva durante su maduración 11 7 Diagrama de flujo experimental para la elaboración de la bebida alcohólica de aguaymanto 39 8 Diseño experimental del proceso 43 9 Tendencia y ecuación de regresión estimada para la relación índice madurez del fruto de aguaymanto durante su maduración 46 10 Variación de los sólidos solubles (°Bx) con relación al tiempo, durante la fermentación de los mostos corregidos a diferentes concentraciones de levadura 50 11 Variación de los grados alcohólicos con relación al tiempo durante la fermentación de los mostos a diferentes concentraciones de levadura 51 12 Variación del desarrollo microbiano en relación al tiempo durante la fermentación de los mostos a diferentes concentraciones de levadura 54 13 Variación de la densidad con relación al tiempo durante la fermentación de los mostos corregidos a diferentes concentraciones de levadura 55 14 Variación de la acidez total con relación al tiempo durante la fermentación de los mostos a diferentes concentraciones de levadura 58 15 Variación de la acidez volátil con relación al tiempo, durante la fermentación de los mostos corregidos a diferentes concentraciones de levadura. 59 16 Variación del consumo del sustrato con relación al tiempo, durante la fermentación de los mostos corregidos a diferentes concentraciones de levadura. 60 INDICE DE TABLAS Tabla Pag. 1 Calibres de la uchuva 3 2 Contenido mínimo de solidos solubles totales expresado en grados ° Brix, contenido máximo de acidez expresado en ácido cítrico e índice de madurez mínimo expresado en ° Brix/porcentaje de ácido cítrico 9 3 Reportes de la composición fisicoquímica de Aguaymanto (Physalis peruviana L) 13 4 Reportes de la composiciónnutricional de Aguaymanto (Physalis peruviana L) 14 5 Requisitos físico químicos del vino 28 6 Requisitos físico químicos del vino de frutas 29 7 Criterios de turbidez para un vino clarificado 30 8 Ventajas y desventajas del uso de bentonita 31 9 Características fisicoquímicas del aguaymanto 44 10 Porcentajes del fruto de aguaymanto 45 11 Determinación del Índice de madurez fisiológica del aguaymanto 45 12 Rendimiento del aguaymanto 47 13 Análisis fisicoquímicos del mosto de aguaymanto 48 14 Variación de los sólidos solubles (° Brix) y grados alcohólicos (° GL), durante los cinco días de fermentación de los mostos de aguaymanto a diferentes concentraciones de levadura 49 15 Concentración de levadura y densidad (g/ml), durante los cinco días de fermentación de los mostos de aguaymanto a diferentes concentraciones de levadura 53 16 Acidez total (g. Ácido cítrico/100ml) y acidez volátil (g. Ácido acético/100ml) durante los cinco días de fermentación de los mostos de aguaymanto a diferentes concentraciones de levadura 57 17 Consumo de glucosa durante el proceso fermentativo en los tres tratamientos a diferentes concentraciones de levadura 61 18 Características de los mostos corregidos a distintas concentraciones de levadura, luego de la corrección de la bebida alcohólica fermentada como producto final. 62 19 Evaluación sensorial 63 RESUMEN El objetivo fue determinar el efecto de la levadura Saccharomyces cerevisiae cepa CH 158 SIHA en la producción de etanol, consumo de sustrato, variabilidad de densidad, acidez volátil, acidez total y características sensoriales descriptivas, para poder determinar este efecto se trabajó a tres concentraciones de levadura en el zumo de aguaymanto. La investigación tiene tres etapas diferenciadas. En la primera etapa, se realizó una caracterización fisicoquímica del fruto de aguaymanto determinando el peso promedio, diámetro promedio, índice de madurez fisiológica, solidos solubles, acidez total, densidad y pH. En la segunda etapa se determinó los controles durante el proceso fermentativo donde los parámetros de inicio de la fermentación fueron: 20°Brix, dilución de pulpa 1:2, tres concentraciones de levadura, 0,2; 0,5 y 0,8 %. Los datos reportados al finalizar la fermentación fueron para el T1, grado alcohólico 10 °GL, solidos solubles de 8,17 °Brix, concentración de levadura de 28,33 cel /mL, densidad de 0,996 g/mL, acidez total de 0,717 g ácido cítrico/100mL y acidez volátil de 0,672 g ácido acético/100mL, para el T2, grado alcohólico 10,70 °GL, solidos solubles de 7,10 °Brix, concentración de levadura de 26,83 cel /mL, densidad de 0,996 g/mL, acidez total de 0,606 g ácido cítrico/100mL y acidez volátil de 0,528 g ácido acético/100mL, y para el T3, grado alcohólico 11,03 °GL, solidos solubles de 5,0 °Brix, concentración de levadura de 25,17 cel /mL, densidad de 0,993 g/mL, acidez total de 0,683 g ácido cítrico/100mL y acidez volátil de 0,638 g ácido acético/100mL,valores que se encuentran dentro de los rangos permitidos por las normas técnicas mencionadas en el trabajo de investigación. Estadísticamente existen diferencias significativas entre los 3 tratamientos siendo el tratamiento más adecuado el T3 por obtener mayor °GL y mayor consumo de levadura a diferencia de los otros. En la tercera etapa se realizó el análisis sensorial a las tres concentraciones de levadura y estadísticamente el mejor fue el T1, posterior a ello se determinó el análisis fisicoquímico a este tratamiento en un laboratorio certificado ya que es requisito para proceder al trámite del registro sanitario e inicial su comercialización. I. INTRODUCCION La naturaleza permite a las plantas elaborar azucares, mediante la fotosíntesis, obteniendo frutos maduros, dándonos la posibilidad de transformarlos en bebidas alcohólicas fermentadas, por su alto contenido de sólidos solubles, la cual es un tipo de bebida que tiene un mayor interés en el consumidor actual a diferencia de otras y deja de lado la sensibilidad con relación al precio del producto. Esto ha llevado a explorar nuevas bebidas, obtenidas de fuentes alternas a la uva, donde el enfoque principal está en el aprovechamiento de las propiedades funcionales de los compuestos naturales empleados en su producción. Impulsa el desarrollo de investigación de productos agrícolas de interés como el aguaymanto, que marcan una diferencia significativa en el mercado nacional e internacional. El problema a resolver del presente trabajo de investigación es darle un valor agregado a los frutos maduros o sobremaduros que están a punto de ser desechados, frutas que no son aptas para la exportación porque no cumplen con los requisitos del mercado, por lo tanto se plantea el uso de estos para la elaboración de una bebida alcohólica fermentada con la finalidad de evitar su desecho y disminuir las mermas en los procesos industriales a pequeña y grade escala. Con esta investigación se busca fortalecer el crecimiento y competitividad de pequeñas empresas a nivel regional, con el desarrollo de productos que generen valor agregado a la cadena, ya que razones económicas y de mercado indican la necesidad de estudiar nuevas alternativas para la industrialización, que permitan la oferta de productos novedosos y satisfagan las necesidades de nuevos mercados exigentes. Es el campo de las bebidas alcohólicas, una interesante línea de investigación que ve en la bebida alcohólica fermentada de aguaymanto un producto de gran potencial comercial. Además de dar una nueva opción al consumidor en el campo de bebidas alcohólicas. Por lo expuesto en la presente investigación se planteó los siguientes objetivos: Determinar las características fisicoquímicas del fruto de aguaymanto (Physalis peruviana L.). Determinar si existen diferencias entre las tres concentraciones de levadura en la fermentación del zumo de aguaymanto (Physalis peruviana L.). Evaluar el crecimiento microbiano, formación del producto y consumo de sustrato durante la fermentación. Determinar el mejor tratamiento que tuvo mayor aceptabilidad sensorial y sus características fisicoquímicas, en la obtención de la bebida alcohólica fermentada a base de aguaymanto (Physalis peruviana L.). 1 II. REVISION BIBLIOGRAFICA 2.1 Aspectos generales del aguaymanto El cultivo de la uchuva está bien distribuido en las zonas altas de Suramérica y en las zonas andinas peruanas. Se conoce en países como Ecuador bajo el nombre de uvilla, chuchuva en Venezuela, aguaymanto en Perú, groselha do Perú en Portugal, fisalis en Italia. El género physalis proviene del griego “physa” (vejiga o ampolla) (Fischer et al., 2014). Dostert et al., (2012) señalan la presencia de seis ecotipos para la zona norte y centro del Perú: Urquiaco (Cajamarca), Agocucho (Cajamarca), Huancayo 1 y Huancayo 2 (Junín), Cajabamba (Cajamarca) y Era (Cajamarca). En países andinos plantaciones de uchuva (aguaymanto) se encuentran entre 1500 y 3000 m.s.n.m (Food and Agriculture Organization, [FAO] 1985) y en Colombia en altitudes de 1800 y 2800 m.s.n.m. Para su crecimiento y producción las temperaturas medias óptimas están entre 13 y 16°C. Salazar et al., (2008) encontraron que la temperatura fisiológica base para el cultivo es de 6,29 °C. Temperaturas muy bajas, cerca de 0°C o por debajo queman la planta. Debido a su crecimiento indeterminado, necesita un suministro de agua constante para el desarrollo vegetativo y reproductivo de la planta, especialmente para el llenado del fruto. Por tal razón, es necesario que haya de 1000 a 1800 mm de precipitación bien distribuida durante el año, mientras los rangos óptimos de humedad relativa están entre 70% y 80% (Fischer et al., 2014). 2.2 Morfología del fruto de aguaymantoPertenece a la familia de las solanáceas. Es una hierba arbustiva con hojas acorazonadas y pubescentes, alcanzan una altura de 1-1,5m. (Figura 1). Las flores amarillas y acampanadas son polinizadas por insectos o por el viento (Fischer et al., 2005). Flórez et al., (2000) menciona que la uchuva está compuesta de aproximadamente 70 % de pulpa, 6,4 % de cáliz y semilla/cascara 23,6 %. El rendimiento de la pulpa se https://www.google.com.pe/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=2&cad=rja&uact=8&ved=0ahUKEwjPuta2ypLNAhWCPCYKHY7UDV8QFgglMAE&url=http%3A%2F%2Fwww.fao.org%2F&usg=AFQjCNFN0FJRtsVrfnxh2u66Un8onLMaSw 2 elevara a 93 % si el producto que se prepara incluye su cascara y semilla como normalmente se ingiere en estado fresco. 2.2.1 Morfología del cáliz El cáliz pequeño al comienzo del desarrollo del fruto, crece hasta formar una estructura similar a una vejiga de unos 5 cm, la cual encierra completamente el fruto maduro. El cáliz (capacho) encierra el fruto totalmente hasta su madurez y pierde su clorofila a partir de unos 40-45 días de su desarrollo, es formado por cinco sépalos persistentes. El cáliz protege el fruto contra insectos, pájaros, patógenos y condiciones climáticas extremas (Fischer et al., 1997) y además, sirve como empaque natural. 2.2.2 Morfología del fruto El crecimiento y desarrollo del fruto comprende un periodo entre 60 y 80 días dependiendo de las condiciones agroecológicas del lugar. Su desarrollo en tamaño y peso presenta la forma de una curva de tipo sigmoidal simple, con crecimiento rápido durante los primeros 10 días. Mientras el fruto aumenta su tamaño constantemente hasta el día 60 de su desarrollo, el cáliz termina su expansión después de 20 a 25 días; el fruto tiende a crecer más en longitud entre Fuente: Fischer (2014). Figura 1. Plantación de Uchuva en Machetá, Colombia. 3 los días 10 y 25, contrario a lo que sucede durante su madurez, cuando crece más en diámetro transversal (Fischer et al., 1997). Los frutos casi redondos son bayas amarillas y brillantes que miden 12,5-25mm de diámetro y pesan alrededor de 4-10 g; además, contiene muchas semillas aplanadas (Fischer et al., 2005), así mismo Valdenegro et al.,(2012) afirma que el fruto es una baya con un diámetro aproximado de 20 mm y un peso entre 4 y 5 g, es de color naranja-amarillo, con una piel lisa y brillante, al interior se encuentra una pulpa jugosa que contiene gran cantidad de pequeñas semillas (Figura 2). Según la Norma técnica colombiana, [NTC] (1999) menciona que hay cinco tipos de calibre y están determinados por el diámetro ecuatorial de cada fruto los cuales se muestran en la siguiente tabla. Tabla 1. Calibres de la uchuva. Diámetro (mm) Calibre ≤15,0 A 15,1-18,0 B 18,1-20,0 C 20,1-22 D ≥22,1 E Fuente: NTC (1999). Durante el desarrollo de los frutos que han alcanzado 10-11 mm longitud, es evidente la presencia de una sustancia pegajosa traslúcida y amarga, que los cubre parcialmente. Según Wagner (1982) es una resina terpénica. El análisis de la procedencia de esta sustancia demuestra que es producida por un tejido glandular localizado en la cara interna de la base del cáliz. Debido a la posición péndula del fruto la sustancia pegajosa resbala poco a poco desde su origen hasta cubrir parte de la superficie del fruto. Al principio, esto se da en frutos menores de 3,5 mm longitud, no se extiende más allá de la base del cáliz; en la flor solo se destaca por su aspecto brillante mientras que en frutos mayores es evidente la presencia de esta resina, la cual decrece en cantidad en frutos 4 maduros. El tejido glandular está formado por una sola capa de células las cuales, a medida que el fruto se desarrolla, se dividen anticlinalmente e incrementan su tamaño en sentido radial. Probablemente, el papel que desempeña la resina sea el de repelente de insectos que eventualmente pudieran destruir la pulpa del fruto (Valencia, 1985). El fruto de uchuva es capaz de acumular grandes cantidades de agua y sacarosa hasta su estado de madurez de consumo (color amarillo-anaranjado), lo que implica un suministro hídrico hasta el último momento antes de la cosecha, en detrimento de la calidad y longevidad en poscosecha (Fischer y Martínez, 1999). Los frutos de uchuva son ricos en azucares (11 a 20 g de carbohidratos digeribles en 100 g de peso fresco); los frutos maduros contienen entre 13 y 15 °Brix y los frutos pintones entre 9 y 13 °Brix. Igualmente almacenan un buen contenido de ácidos, 1,6 a 2,0 % de acidez en frutos maduros (Herrera, 2000). El mayor porcentaje de azucares lo constituye la sacarosa, con un contenido de unas 2,5 veces mayor que el de glucosa y fructosa. En la figura 3 se puede apreciar que, de acuerdo con la composición química, el cáliz se asemeja más a un fruto; sin embargo, según su anatomía es muy parecido a un órgano foliar (Fischer et al., 1997). El fruto tiene extraordinarias propiedades nutricionales y medicinales, su exquisito sabor y aroma atraen a los consumidores, favoreciendo la conquista de Figura 2. Aguaymanto. Fuente: Álvarez (2010). 5 nuevos mercados (Galvis et al., 2005), especialmente su alto contenido de provitamina A (1,000-5,000 U.I., principalmente beta-caroteno) y ácido ascórbico (11-42 mg/100 g peso fresco), y algunas vitaminas del complejo B (tiamina, niacina y vitamina B12); además se destaca por sus altos contenidos de proteína cruda (2,2 g), fósforo (39 mg) y hierro (1,1 mg), pero con un bajo nivel de calcio (14 mg/100 g peso fresco) (Fischer y Miranda, 2012). También por su alto contenido de antioxidantes, ácidos grasos poliinsaturados y fitoesteroles. Zárate y Polania (1974) realizaron el análisis fitoquímico de esta especie. En la semilla reportaron la presencia de aceites tipo semisecante principalmente aceite linoléico, en una proporción del 15,75% comparable con el rendimiento de otras especies usadas industrialmente. Las semillas, que son abundantes, alcanzan un promedio de 5,29% en peso en relación al fruto. Contiene de 150 y 300 semillas aplanadas de forma lenticular. Fuente: Fischer y Ludders, (1997). Figura 3. Distribución porcentual de los carbohidratos sacarosa, fructosa, glucosa y almidón en frutos maduros (izquierda) y cáliz (derecha) de la uchuva (Physalis peruviana). 6 2.3 Cambios fisiológicos del aguaymanto 2.3.1 Tasa de respiración En algunos frutos, el inicio de la maduración se acompaña por un aumento en la intensidad respiratoria y en la producción de etileno, el cual llega a su valor máximo cuando el fruto está completamente maduro, es decir, cuando ha alcanzado su madurez de consumo; a partir de este momento su intensidad respiratoria disminuye, y corresponde al periodo de senescencia. Los frutos que presentan este comportamiento se denominan climatéricos; los frutos no climatéricos no presentan aumento de la respiración. Los frutos de aguaymanto presentan perfil respiratorio climatérico durante la maduración, con producción de etileno. (Fischer et al., 2005). 2.3.2 Cambios de color La cascara y la pulpa de la uchuva se colorean simultaneamente. Castañeda y Paredes (2003) observaron que el fruto de aguaymanto presenta coloración verde-intensa durante los primeros 35 días después de la antesis; a partir de este día comienza a cambiar hacia el color amarillo; alrededor del día 63 la corteza y la pulpa presentan coloración amarilla característica de la madurez de consumo, como consecuencia de la degradación de la clorofila por acción de las enzimas clorofilazas, que en medio acido aumentan su actividad. A su vez, esto hace que sean más visibles los carotenos, los cuales estaban enmascarados, ya que son sintetizados durante el desarrollo del fruto (Agusti, 2000). En el día84 la coloración se torna naranja, lo cual indica que el fruto esta sobremaduro. La figura 4 muestra los cambios de color del fruto y del cáliz. 7 La maduración de muchos frutos se caracteriza por el ablandamiento de la pulpa. Este ablandamiento se debe a diferentes factores, entre ellos, la acción de las enzimas hidrolasas en la pared de la célula que actúan sobre la pectina (Galvis, 2003); el etileno puede promover la actividad de estas. En el caso de la uchuva, las enzimas responsables de la solubilización de la pectina pertenecen al grupo de las glicosidasas mientras la actividad de la poligalacturonasa durante el ablandamiento del fruto fue baja (Trinchero et al., 1999). 2.3.3 Cambios químicos La uchuva en estado verde presenta altos niveles de almidón (Fischer, 1995), el cual se hidroliza durante la maduración. La primera consecuencia de la hidrolisis del almidón es el aumento de los sólidos solubles. Estos están expresados en °Brix, aumentan durante todo el periodo de desarrollo del fruto, alcanzan su máximo valor en el grado de madurez fisiológica, a partir de este día ocurre una disminución progresiva en el contenido de los sólidos solubles. Durante la maduración del fruto el pH aumenta como consecuencia de la reducción de los niveles de ácidos orgánicos; este comportamiento es propio de los frutos. Fuente: Fischer et al., (2005). Figura 4. Tabla de color del fruto y cáliz de uchuva. 8 Los azucares de la uchuva son sacarosa, glucosa y fructosa, los cuales aumentan durante el periodo de maduración del fruto, hasta el día 77 después de plena floración como consecuencia de la hidrolisis del almidón. Los principales ácidos orgánicos en el fruto de uchuva (cítrico, málico y oxálico) disminuyen durante el periodo de maduración, debido a la actividad de las deshidrogenasas; estos ácidos se utilizan en el proceso respiratorio y/o se emplean en el metabolismo secundario del fruto. El contenido del ácido ascórbico (vitamina C) en la uchuva es alto y, a diferencia de otros frutos, aumenta durante la maduración (Fischer y Martinez, 1999). 2.3.4 Índice de madurez El índice de madurez es la identificación del momento de madurez para realizar la cosecha de los frutos. Los "índices de madurez" indican, por cambios perceptibles, que el fruto ha llegado en su desarrollo a la "madurez fisiológica" que le permitirá alcanzar madurez de consumo una vez se separe de la planta. (Almanza y Espinosa, 1995). Hobson (1993) define el término maduración fisiológica como el "proceso en el cual se alcanza y finaliza el máximo estado de desarrollo del fruto". Siguiendo esta afirmación, es importante tener en cuenta que la uchuva exhibe un comportamiento atípico, debido a que, permaneciendo el fruto en la planta aun después de haber alcanzado su madurez fisiológica, continua aumentando su peso fresco y tamaño. La madurez comercial se refiere a las exigencias de calidad de un mercado en particular, las cuales dependen del uso que se dé al fruto y del tiempo que dure su comercialización. La madurez de consumo corresponde al estado en la vida del fruto en el cual presenta las mejores características organolépticas para ser consumido en fresco o para ser procesado (Fischer et al, 2014). Es usual que se presenten cálices verdes en frutos completamente maduros, lo cual es consecuencia de las condiciones climáticas (temperatura, radiación, nubosidad). Existe también el caso contrario, es decir, cálices amarillos y frutos totalmente verdes; se ha supuesto que los ácaros pueden jugar un papel importante en este síntoma. (Fischer, 2005). 9 NTC (1999), menciona que los valores mínimos del índice de madurez se presentan en la tabla 2 de acuerdo con la figura 4. Para su comercialización se sabe que el grado de madurez debe permitir la manipulación, transporte de los frutos y su uso en la industria. Tabla 2. Contenido mínimo de solidos solubles totales expresado en grados ° Brix, contenido máximo de acidez expresado en ácido cítrico e índice de madurez mínimo expresado en ° Brix/porcentaje de ácido cítrico. Fase de maduración °Brix % Ácido cítrico (máximo) Índice de madurez (mínimo) Color de cáscara del fruto 0 9,4 2,69 3,5 Verde 1 11,4 2,70 4,2 Verde amarillo 2 13,2 2,56 5,2 Amarillo naranja 3 14,1 2,34 6,0 Naranja claro 4 14,5 2,03 7,1 Naranja 5 14,8 1,83 8,1 Naranja oscuro 6 15,1 1,68 9,0 Naranja roja Según Fischer y Martínez (1999) en un estudio de calidad y madurez de la uchuva mencionan: a. Contenido de los sólidos solubles totales El contenido de los sólidos solubles totales, diluidos en el jugo del fruto, los cuales están constituidos por 80 a 95 % de azucares, aumenta uniformemente hasta el estado 3 y 4 (figura 5), en esta fase los frutos cambian su color de naranja claro hasta naranja. Debido a que la concentración de azucares alcanza con la madurez del fruto, su punto de culminación, se puede considerar en las fases 3 y 4, en las cuales se presenta también el contenido más alto de β- caroteno, con la madurez fisiológica. Existe un descenso de la concentración de los sólidos solubles totales a partir de la fase 4 de la maduración ya que una gran parte del azúcar se está utilizando en la respiración, sin embargo, al final del crecimiento del fruto ocurre, todavía, una translocación alta de sacarosa al fruto. (Fischer y Lüdders, 1997). Fuente: NTC (1999). 10 b. Contenido de la acidez total titulable Con el aumento de la maduración se observa un descenso uniforme del contenido de acidez total titulable (Figura 5). La disminución de los ácidos en el fruto indican generalmente que se están utilizando forzadamente como substrato de respiración, debido a que los ácidos en comparación con los carbohidratos, contienen por cada átomo de C y de H, más átomos de O y así, la liberación de CO2 es mayor que la toma de O2. En razón a que las uchuvas alcanzan en 20 días después del cuajamiento, el máximo de la acumulación de almidón (Fischer y Lüdders, 1997), se puede concluir que, a partir de ese momento, se presenta una disminución del contenido de los ácidos, porque los valores picos de la acumulación del almidón y ácidos, coinciden en los frutos. Además con el aumento del volumen del fruto se disminuye el contenido porcentual de la acidez, debido al efecto de la dilución. Fuente: (Fischer y Martinez, 1999). Figura 5. Tendencia y ecuación de regresión estimada para el contenido de solidos solubles totales y la acidez total titulable del fruto de la uchuva durante su maduración. 11 En la uchuva la mayor proporción de los ácidos la constituye el ácido cítrico, con un 85%. En un análisis de 100g de fruto fresco, Fisher et al., (1999) encontraron 2,3g de ácido cítrico, mientras el ácido málico fue de 0,25g y el ácido tartárico, con 0,17g, es decir que está en un nivel mucho menor. (Fischer y Martinez, 1999). c. Relación sólidos solubles totales / acidez total titulable Según Fischer y Martinez (1999) aseguran que la relación sólidos solubles totales/acidez total titulable (SST/ATT) aumenta proporcionalmente y linealmente de acuerdo con el crecimiento del fruto, mostrando el mayor coeficiente de determinación (R2=0,98) en asociación con las fases de maduración (Figura 6). Una relación lineal similar reporto Gallo (1996) en maracuyá y piña, frutos en los cuales la relación azúcar/acidez sirve como índice de madurez para la industria de procesamiento. Fuente: (Fischer y Martinez, 1999). Figura 6. Tendencia y ecuación de regresión estimada para el contenido de β-caroteno y la relación índice madurez del fruto de la uchuva durante su maduración. 12 2.4 Problemas en el manejo del fruto de aguaymantoEn la uchuva, la falta de nitrógeno es el elemento que más influye en la disminución de la producción y su deficiencia se manifiesta en las hojas con un color verde pálido y venas rojizas, mientras se forma un menor número y longitud de ramas, disminuyendo la cantidad y el tamaño de los frutos (Fischer y Angulo, 1999). El rajado del fruto está influenciado por los nutrientes calcio y boro, Cooman et al., (2005) encontraron que la ausencia de uno de los dos elementos en la fertilización aumenta el agrietamiento en un 3%, y la ausencia de los dos elementos en forma simultánea incrementa esta adversidad en un 6%. Los mismos autores encontraron que la falta del boro en la solución nutritiva disminuyó el contenido de sólidos solubles en los frutos, y en aquellos deficientes en nitrógeno y fosforo aumentó la acidez titulable. Torres et al., (2013) reportan que plantas con deficiencia de calcio (muchas veces en aquellas que crecen en suelos de textura liviana) manifiestan en algunos frutos, sobre todo en la parte superior de la planta, cálices deformes que no cubren la totalidad del fruto, con manchas necróticas en su ápice, similares a los que muestra el tomate por deficiencia de calcio. 2.5 Composición fisicoquímica y nutricional del aguaymanto Flórez et al., (2000) señala que sus propiedades fisicoquímicas son bien interesantes para el procesador que plantea elaborar derivados. Su contenido °Brix que significa la cantidad de sólidos solubles en la pulpa, expresado en porcentaje de sacarosa van de 13 a 15 %, el porcentaje de acidez alcanza un valor de 1,3 a 1,6 % de ácido cítrico y el valor de pH de la pulpa de uchuva esta alrededor de 3,4 a 3,7, impide el fácil crecimiento de microorganismos patógenos, este valor favorece la natural gelificación del producto. Restrepo et al., (2009), menciona, la uchuva es un fruto cuyo atributo peculiar es el sabor agridulce, contiene valores destacables de nutrientes como vitamina A, fibra, proteína, potasio, fósforo, hierro y zinc. Fischer et al., (2005), mencionan que la composición química de la uchuva constituye una fuente importante de vitaminas A, B y C; por su alto contenido de provitamina A, se clasifica como un fruto carotenógeno. Es una fuente excelente de vitamina C (30 mg 13 en 100g del fruto fresco) y del complejo vitamina B. Los contenidos de fósforo, hierro y fibra también son altos, por el contrario, los de calcio son bajos. Tabla 3. Reportes de la composición fisicoquímica de Aguaymanto (Physalis peruviana L). 2.6 Utilización del fruto de aguaymanto Los frutos de aguaymanto que son comestibles y de sabor agradable contienen un aceite, por lo que son usados como vermífugo; generalmente se les da a los niños 10 a 15 frutos diarios en ayunas por espacio de 8 días y luego un purgante. El fruto también contiene ácido cítrico, de ahí sus propiedades diuréticas. Se dice que los frutos son narcóticos y en forma de jarabe son utilizados contra la tos ferina de los niños. El valor nutricional de la uchuva es muy alto, ya que este fruto es una excelente fuente de provitamina A y vitamina C, también presenta cantidades importantes de vitaminas del complejo B, tales como tiamina, niacina y vitamina B12. Según el National Research Council, el jugo de la uchuva madura tiene altos contenidos de pectinaza, lo que disminuye los costos en la elaboración de mermeladas y otros preparativos similares (Fischer et al. ,2005). Parámetro fisicoquímico Mendoza et al. (2012) Marin et al. (2010) Marquez et al. (2009) Restrepo et al. (2009) Actividad de agua 0,998 0,988 - - Acidez Ac. Cítrico (%) 2 2,05 2,4 2,1 ° Brix 13 14,3 12,5 13,8 Densidad (g/ml) 1,1031 1,038 - - pH 3,72 3,39 3,56 3,39 Fuente: Mendoza et al. (2012) 14 Tabla 4. Reportes de la composición nutricional de Aguaymanto (Physalis peruviana L). Parámetro Nutricional Rango Humedad 79,8 – 85,5 % Proteínas 0,3 - 1,5 g Grasa 0,15 – 0,5 g Carbohidratos 11,0 – 19,6 g Fibra 0,4 – 4,9 g Cenizas 0,7 – 1,0 g Carotenoides 16 mg Tiamina 0,1 – 0,18 mg Riboflavina 0,03 – 0,18 mg Niacina 0,8 - 1,7 mg Vitamina C 20 – 43 mg Potasio 210 – 467 mg Magnesio 7 - 19 mg Calcio 2 – 28 mg Fosforo 27 – 55,3 mg Hierro 0,3 – 1,2 mg Zinc 0,28 – 0,40 mg 2.7 Fermentación alcohólica 2.7.1 Bioquímica de la fermentación alcohólica Mesas y Alegre (1999) indican que la fermentación alcohólica se define como el proceso bioquímico por medio del cual las levaduras transforman los azúcares del mosto en etanol y dióxido de carbono. Nielsen et al., (2003) La fermentación alcohólica, es un proceso anaeróbico realizado por levaduras y algunas clases de bacterias. Los procesos catabólicos inician luego de que los azúcares son transformados en glucosa-6-fosfato (G6P) Fuente: Montoya (2013). 15 o fructosa-6-fosfato (F6P). A partir de allí se desarrolla la glucólisis y el metabolismo del piruvato. Luego de la glicolisis, en las levaduras, el piruvato se descarboxila a aldehído para la generación de etanol, sin la intervención de Acetil-CoA. El etanol es el producto principal del metabolismo fermentativo de las levaduras, sin embargo se generan metabolitos secundarios. 2.7.2 Criterios generales para elaborar bebidas alcohólicas fermentadas Gonzales (2011) señala, para hacer una bebida alcohólica fermentada de frutas, a diferencia de hacer vino de uva, deberán considerarse ciertos atributos para elegir la materia prima más adecuada. El fruto debe ser jugoso, para obtener un buen rendimiento, debe ser dulce para producir alcohol, acidez justa para asegurar el desarrollo de la levadura y aromático para conservar su atractivo aun en la dilución. En el proceso de fermentación, el jugo y la pulpa de la fruta se mantienen unidos por las pectinas, sustancias responsables de la gelificación en jarabes y jaleas. Si se agregan enzimas degradadoras de las pectinas, estas sustancias se degradan. Entonces una parte del jugo puede separarse, mientras que la pulpa remanente se puede prensar con mayor facilidad. Négre y Francot (1980). La metodología del vino de frutas es la misma que la empleada en la elaboración del vino tradicional, usando el procedimiento de la vinificación en blanco; donde solo el mosto es fermentado, desprovisto de otras partes como cascara, pepas, etc. Es una vinificación más delicada que los vinos tintos, siendo un producto de mayor costo. A continuación se señalan los procesos para la obtención de una bebida alcohólica fermentada: a. Selección La operación de selección, se realiza retirando los producto que no cumplan con las exigencias comerciales, separado los frutos que presentan daños biológicos (ataque de insecto y enfermedades), fisiológicas (decoloración en la fruta o en el capacho), físicos (quemaduras, manchas por pesticidas, fruto deshidratado) y mecánicos (cortaduras, rajaduras, magulladuras o capacho quebrado). Esta operación se realiza manualmente (Fischer et al., 2005). 16 b. Clasificación La clasificación de los frutos con cáliz se realiza por tamaño, calidades o grados de madurez. Los frutos y el cáliz no deben tener hongos, lesiones, magulladuras, ataque de insectos ni deformaciones ocasionados por virus, ácaros o por otros factores. (Fischer et al., 2005). c. Obtención del mosto Négre y Francot (1980) mencionan; que este proceso tiene como finalidad aplastar la uva y liberar el jugo azucarado, contenido en el interior del grano y luego prensar. El estrujado permite airear la vendimia, para un rápido desarrollo de las levaduras y comienzo de la fermentación. Este mosto (solo jugo) se utiliza siempre cuando se busca un vino incoloro. Vogel (2003) menciona, con respecto a vinos tintos, se estruja pero ya no se prensa, ya que el alcohol que se forma en la fermentación diluye los pigmentos presentes, con lo queel vino tinto adquiere su intenso color propio. d. Acondicionamiento del mosto La dilución del mosto, se da cuando este es muy denso, para evitar la saturación del medio y permitir el proceso aerobio de las levaduras al inicio de la fermentación. (Hatta, 2011). La corrección de la cantidad de azúcar, se tiene que realizar ya que de este depende el grado alcohólico final del vino. La cantidad de azúcar disminuye con la dilución por lo tanto es necesario añadir una concentración de azúcar. (Hatta, 2011). Este enriquecimiento se da por varias razones, ya que el cuerpo del vino depende de su contenido de alcohol, el vino con poco alcohol sabe flojo e insulso, pero no a vino, por ello se debe enriquecer como mínimo hasta alcanzar un contenido de alcohol de 9-10 % para obtener mejor sabor. También por la capacidad de conservación, ya que el alcohol tiene la propiedad de inhibir el desarrollo de microorganismos nocivos o de destruirlos del todo, por ello el vino con poco alcohol se conservan mal. Lo mismo se dice de los vinos de baja acidez o incluso neutros del todo, en los que faltan así mismo los ácidos protectores. (Vogel, 2003). 17 El pH del mosto debe estar dentro de 3,5 a 4,0 ya que permite seleccionar la flora del mosto, desarrollándose solo las levaduras fermentativas e inhibiéndose los microorganismos indeseables. (Hatta, 2011). El contenido del ácido determina de forma decisiva que el sabor de un vino sea agradable. Los vinos de uva exhiben grados de acidez comprendidos entre 0,4 a 1,2 % rango ideal para un proceso fermentativo (Vogel, 2003). e. Adición de levaduras Para la utilización de la levadura seca se tiene que seguir los siguientes pasos; disolver la levadura en un poco de agua hervida entibiada (30°C) con un poco de azúcar, dejándola reposar por 15 minutos. Para la preparación del pie de cuba, se realiza con una cantidad mínima del mosto a fermentar (aproximadamente el 5% del total), en el cual se siembra la levadura activa, dejándolo reposar en un sitio abrigado (25-30°C) hasta que se vea producción de gas (burbujeo). (Hatta, 2011). De la misma manera Vogel (2003) afirma, para que la levadura puede desarrollar su acción óptima, hay que adaptarla previamente (estárter), luego se vierte en el depósito en el que se va a producir la fermentación principal. 2.8 Factores que influyen en la fermentación alcohólica Existen factores físicos y químicos que inciden positiva o negativamente en la fermentación alcohólica, ya sea actuando sobre el desarrollo de la levadura o el proceso fermentativo (Navarre, 1994). 2.8.1 Temperatura A mayor temperatura la fermentación alcohólica transcurre más rápidamente, sin embargo es menos pura. Se produce menos etanol y más cantidad de compuestos secundarios que a menudo no conllevan a la mejora de la calidad del vino. Por otro lado las levaduras tienen a los 30ºC su temperatura óptima de desarrollo. Por encima de los 35ºC la actividad decrece rápidamente y en torno al 45ºC mueren. Por debajo de 10ºC la mayor parte de las levaduras silvestres son inactivas (Navarre, 1994). 18 Madrid (1991) y Alvarez (1991), la temperatura ideal para la fermentación y reproducción de levaduras oscila entre 22 a 27°C y se reproducen con mayor rapidez cuando la temperatura es 25°C. A temperaturas mayores de 30°C pierden la capacidad para desdoblar los azucares y a 40°C dejan de crecer y reproducirse. En una fermentación alcohólica no se deben superar valores de 32°C ya que se corren riesgos como: inactivación de las levaduras, perdida de alcohol por evaporación con merma de grado alcohólico e iniciación de fermentaciones indeseables. Suárez (1997), cuando se fermenta a temperaturas bajas, el proceso es lento pero el grado alcohólico alcanzado es mayor que a temperaturas elevadas y tiende a frenar la pérdida por volatilización de una fracción importante de compuestos aromáticos. Merchan y Castillo (1999) mencionan que en el crecimiento de microorganismos a 25 °C, la levadura se desarrolla a 25,5 % más que a 30 °C. El consumo de solidos solubles, sacarosa y grado alcohólico a 25 °C es de 42,8 %, 71,0 % y 7,3 °GL mientras que a 30 °C es 36,8 %, 63,8 % y 6,0 °GL. Ward (1991) indica que los mostos blancos se inoculan y fermentan generalmente entre 10 y 15ºC. La menor temperatura de fermentación da lugar a vinos más frescos, el riesgo de infección bacteriana y la producción de ácidos volátiles es reducida. Un aspecto interesante del uso de bajas temperaturas en la vinificación es el hecho de que se reduce el crecimiento de bacterias del ácido láctico y del ácido acético y por lo tanto se hace más fácil el control de la fermentación alcohólica. Sin embargo la temperatura óptima de la S. cerevisiae es de 25 °C. La temperatura a la que se lleva a cabo la fermentación alcohólica afecta: (i) al crecimiento de las levaduras y por tanto a la duración de la fermentación, (ii) a la contribución que las diferentes especies de levaduras tienen en la fermentación y (iii) al metabolismo de las levaduras, que es el que determina la composición química y organoléptica del vino (Fleet y Heard, 1993). Entre 15 y 35°C se sabe que disminuye la duración de la fase de latencia y aumenta la velocidad de fermentación al incrementar la temperatura, aumentando también la velocidad de consumo de azúcar y nitrógeno, además al modificarse el metabolismo de las levaduras, también varía la composición del vino final. Así, las temperaturas más elevadas favorecen una mayor producción 19 de la mayoría de los productos de la fermentación gliceropirúvica a costa de una menor producción de etanol. Aún así, los compuestos cuya formación está más influenciada por la temperatura son los alcoholes superiores, los ácidos grasos de cadena corta y sus ésteres, ya que tienen su máximo de producción a los 20°C. (Ribéreau-Gayon et al., 2000). Por tanto, las bajas temperaturas de fermentación están justificadas cuando se desea una concentración elevada de estos compuestos, como es el caso de las vinificaciones en blanco. La temperatura de fermentación también afecta a la dinámica poblacional de las levaduras que llevan a cabo el proceso. Varios autores han mencionado que especies como Kloeckeraapiculata o Candida stellata pueden mantener altos niveles de población (107-108 ufc/ml) a lo largo de fermentaciones a bajas temperaturas (10-15°C), llegando en algunos casos a poder reemplazar a Saccharomyces como especie dominante (Sharf y Margalith, 1983; Fleet y Heard, 1988). 2.8.2 pH Aleixandre (1998), el crecimiento de la levadura y la velocidad de fermentación no se ve afectado por la variación del pH entre 3,5 y 6,0 en el medio, pero a valores de 3,05 a 3,5 se logra alcanzar un mayor rendimiento de acuerdo a la formación del producto y crecimiento de la levadura. Ramirez y Pedroza (2001), en la levadura Saccharomyces Cerevisiae, el crecimiento se da más rápido que en las bacterias a bajos valores de pH, evitando la contaminación. Si se utiliza sacarosa como fuente de carbono, el sistema es más sensible al pH que al utilizar glucosa, ya que la inversión de la sacarosa se acelera a pH bajos. De Rosa (1998) menciona que el pH es una característica de importancia, por diferentes motivos. Organolépticamente el pH influye fuertemente sobre la sensación de acidez, dado que depende más de la concentración hidrogeniónica (fuerza acida) que de la cantidad de ácidos contenidos. Sobre la formación de fosfato férrico y por consiguiente quiebra fosfática, tiene fuerte influencia el pH, y el rango óptimo para el pleno desarrollo de este fenómeno se sitúa sobre el valor 20 de 3,3. A valores sensiblemente inferiores o superiores el enturbiamiento no aparece. Con respecto a la acidez, el contenido de componentes para la generación de ácidos no solo debe soportar la fase inicial de crecimientode las levaduras, sino que tiene que ser suficiente para mantener toda la fase de reproducción y mantenimiento de las células. Posible razón por la que se generaron los sobresaltos de acidez en un proceso de fermentación (Acosta, 2012). 2.8.3 Ácidos orgánicos El ácido acético es el principal ácido volátil del vino, su formación se debe a la acción de las levaduras durante la fermentación alcohólica, pero también se debe a ataques bacterianos por parte de bacterias acéticas o lácticas. Las características organolépticas negativas de este ácido, lo convierten en un producto poco deseable, y en concentraciones elevadas se considera un defecto del vino (coloquialmente conocido como vino picado). La producción de ácido acético por Saccharomyces suele variar entre 100-200 mg/l, dependiendo de la cepa utilizada, la temperatura de fermentación y la composición del mosto. De hecho, está descrito que la producción de ácido acético depende principalmente de la concentración de azúcar en el medio, y que es independiente de la cantidad que sea fermentada, es decir, que cuanto mayor sea la concentración de glucosa en el medio, mayor será la producción de ácido acético (Ribéreau-Gayon et al., 2000). Los ácidos orgánicos, por tanto, al ser los principales responsables de la acidez total del vino, tienen una demostrada contribución a las características organolépticas finales del vino, así como a la estabilidad biológica y fisicoquímica posterior del mismo. Además, los ácidos orgánicos son importantes para las levaduras porque pueden (Jennings, 1995): ser utilizados como fuente de carbono contribuir al potencial osmótico intracelular contribuir al equilibrio de cargas intracelular intervenir en el control del pH intracelular 21 Según un estudio en la obtención de hidromiel se vio que la miel tiene un buen aporte de minerales, con un importante contenido de calcio y potasio; y se ha demostrado que la presencia de ciertos minerales en el mosto reacciona con los ácidos, generando sales, que en cierta medida amortiguan el desarrollo de la acidez (Cramer et al., 2002). 2.8.4 Grado alcohólico Mercedes (2006) menciona que el etanol es claramente inhibitorio para las levaduras. El crecimiento de las células se detiene a concentraciones relativamente bajas de etanol y la fermentación a concentraciones relativamente altas de etanol. La disminución de velocidad de producción de etanol está relacionada con la disminución en el número de células viables. La inhibición del desarrollo celular por el etanol es no competitiva y puede ser descrita por una función lineal o exponencial de la concentración de etanol. Las cepas altamente tolerantes son aquellas que almacenan menos lípidos comparadas con otras. La membrana citoplasmática es sensible al contacto con etanol, ya que el etanol es anfipático. La composición lipídica de la membrana citoplasmática puede ser importante para la tolerancia al etanol. Según Acosta (2012), menciona que en la producción de hidromiel se obtuvo un grado alcohólico promedio de 9%, con un buen desarrollo de producción luego del quinto día de proceso. Resultados que no se detallan, mostraron como transcurridos 19 e incluso 25 días de proceso, no se generó una cantidad de etanol significativamente mayor como para incrementar el tiempo de proceso por encima de los 15 días establecidos inicialmente. 2.8.5 Aireación Lopez y Guell (1995), la velocidad de fermentación depende de las condiciones de aireación, desarrollando la fermentación más rápida cuando las levaduras están mejor aireadas. La utilización del oxígeno solo tiene lugar al comienzo de la fermentación. Una vez iniciada esta, no necesita oxigenación o de lo contrario se desviaría el proceso alcohólico y comenzaría la metabolización de los azucares por vía respiratoria, produciendo mayor cantidad de células. La 22 fermentación con agitación es ligeramente más rápida que la fermentación sin agitación. A pesar de ello los niveles finales de etanol y azúcar obtenidos son similares en ambas condiciones de operación, observándose un ligero aumento en el grado alcohólico y el azúcar residual en la fermentación sin agitación. 2.8.6 Otros factores Aleixandre (1998), indica que el dióxido de azufre (SO2) influye positivamente en la fermentación alcohólica, puesto que se une al acetaldehído impidiendo que éste participe en reacciones de pardeamiento. Inhibe algunas de las reacciones indeseables de oxidación, así como algunos microorganismos tales como las bacterias del ácido láctico, acético y algunas levaduras que, de estar presentes, podrían provocar características anormales en los vinos. Asimismo actúa como estimulante de la actividad de las levaduras vínicas y tiene como consecuencia la aceleración de la velocidad de fermentación. Por un lado la acumulación de los propios productos de la fermentación alcohólica pueden ralentizarla. Por otro lado, esos mismos compuestos junto a otros presentes en el mosto de forma natural (taninos) o artificial (pesticidas, SO2, etc.) pueden actuar como inhibidores del crecimiento de las levaduras. (Navarre, 1994). 2.8.7 Los nutrientes Por un lado están los azúcares, que son fuente de carbono y de energía para las levaduras y que deben encontrarse en concentración superior a 20 g/L para que la fermentación alcohólica, transcurra a su velocidad máxima. Por otro están las sustancias nitrogenadas, las sales y los factores de crecimiento (vitaminas) que normalmente se hallan en el mosto en concentración suficiente para el desarrollo de las levaduras. Sin embargo en casos de vendimias atacadas de podredumbre en las que los mohos han consumido parte de estos nutrientes, puede ser necesario adicionar al mosto complejos vitamínicos y sales de amonio. (Navarre, 1994). 23 2.9 Las levaduras Son hongos unicelulares pertenecientes en su mayor parte al grupo de los Ascomicetos, es decir, al grupo de hongos capaces de formar esporas contenidas en el interior de un asca. Entre las diversas características bioquímicas utilizadas en la clasificación de las levaduras podemos citar (Quesada y Cenis, 1995; Suárez, 1997): El tipo de azúcares que pueden fermentar. El rendimiento en alcohol, las hay que para producir 1 grado de alcohol consumen de 17 a 18 g de azúcar, otras en cambio con menor rendimiento metabolizan de 21 a 22 g. Su poder alcohológeno, o grado máximo de alcohol que pueden alcanzar, algunas detienen su actividad a los 5% Vol mientras que otras llegan a 17 o 18% Vol. Productos secundarios de la fermentación. Resistencia al anhídrido sulfuroso. Capacidad para asimilar diferentes sustancias nitrogenadas. Los ácidos grasos son los principales componentes de los fosfolípidos de las membranas de las células (Swan y Watson, 1997). La membrana plasmática es el primer elemento de contacto entre la célula y su entorno, por lo que se considera que juega un papel esencial en la respuesta adaptativa de S. cerevisiae. Así, pequeñas alteraciones en la membrana pueden originar cambios importantes en las actividades de muchas funciones esenciales dependientes de la membrana, como el transporte, la permeabilidad de los iones, etc. que pueden afectar a la viabilidad, capacidad de fermentación y tolerancia al etanol de las levaduras. El oxígeno tiene una gran influencia en la composición de ácidos grasos, debido a que la ausencia de oxígeno como ocurre en condiciones de anaerobiosis, impide la síntesis de ácidos grasos insaturados y esteroles. Así, la inhibición de la biosíntesis de estos compuestos, trae como consecuencia, una clara disminución del crecimiento celular, la viabilidad y la actividad fermentativa (Torija, 2002). 24 2.9.1 Clasificación de las levaduras Las levaduras pertenecen al reino fungi y dentro de él a la división eumicota que agrupa alos denominados hongos verdaderos. Dentro de esta división las levaduras se incluyen en dos de las cinco subdivisiones de los eumicetos, la ascomycotina representada por las levaduras capaces de producir ascosporas, llamadas por ello esporógenas, y la deuteromycotina representada por las levaduras incapaces de formar esporas llamadas por ello asporógenas o no esporógenas. Los géneros de levaduras esporógenas, englobados todos ellos en la familia Saccharomycetaceae, se distribuyen en tres subfamilias. (Mesas y Alegre, 1999) 2.9.2 Especies de mayor relevancia enológica Manteniendo la distinción hecha entre levaduras esporógenas y asporógenas (Navarre, 1994), a continuación se detallan algunas de las especies con mayor relevancia enológica. Entre las levaduras esporógenas denominadas frecuentemente de segunda fase por aparecer en un estado avanzado de la fermentación alcohólica y producir gran cantidad de etanol destacan: Saccharomyces cerevisiae (S. ellipsoideus) es una de las más importantes en enología ya que es la responsable de la fermentación de la mayor parte de los azúcares del mosto. Su poder alcohológeno es elevado (17º GL) y es bastante resistente al SO2 (250 mg/L). Saccharomyces bayanus (S. oviformis), semejante a la anterior resiste también 250 mg de SO2/L, pero su poder alcohológeno es mayor pudiendo superar los 18º GL. Es la levadura típica de las etapas finales de la fermentación y a menudo la responsable de refermentaciones de vinos embotellados. Saccharomyces acidifaciens (S. baillii), con un poder alcohológeno de tan solo 10º GL, su principal característica es su elevada resistencia al SO2 (250 a 400 mg/L) lo que le permite iniciar la fermentación en mostos muy sulfitados, comportándose en estos casos como levadura de primera fase. Torulaspora rosei (S. rosei) tiene un poder alcohológeno de 8 a 14º GL y su principal característica es su capacidad para fermentar lentamente los azúcares con lo que los niveles de acidez volátil producidos son menores. 25 Entre las levaduras asporógenas, generalmente de primera fase, que se caracterizan por aparecer al principio de la fermentación alcohólica y producir gran cantidad de compuestos secundarios enriquecedores del sabor y aroma del vino, destacan: Kloeckera apiculata, es la forma imperfecta o haploide de Hanseniaspora uvarum. Junto con S.cerevisiae es la levadura más frecuentemente encontrada en los mostos. Su poder alcohológeno es muy bajo (4-5º) y también lo es su rendimiento en alcohol (21 a 22 g de azúcar/1º de alcohol). Produce mucha acidez volátil por lo que no es deseable en las fermentaciones. Se la elimina fácilmente con el sulfitado dada su baja resistencia al SO2. Candida stellata (Torulopsis stellata, T. bacillaris) tiene un poder alcohológeno de 10 a 11º GL y se caracteriza fundamentalmente por aparecer con más frecuencia en mostos de uvas atacadas de podredumbre. 2.9.3 Utilización de las levaduras en vinificación Se pueden emplear o bien levaduras autóctonas, preparando lo que se ha dado en llamar un pie de cuba, o bien levaduras comerciales. En el primer caso se parte de una fracción pequeña de la propia vendimia, en el segundo caso se suele recurrir al empleo de las denominadas levaduras secas activas. Bajo el aspecto de polvos secos, que a menudo deben ser rehidratados en agua tibia antes de su utilización, las levaduras secas activas son levaduras deshidratadas generalmente pertenecientes a las especies S. cerevisiae y S. bayanus. En ocasiones la conjunción de un sulfitado excesivo y bajas temperaturas retardan el inicio de la fermentación (Mesas y Alegre,1999). La inoculación con levaduras secas activas, favorece un inicio más rápido de fermentación (normalmente se reduce la fase de latencia) y un consumo total de los azúcares fermentables, reduciendo los posibles problemas de refermentación. Además permite un mayor control microbiológico, lo que no es posible en fermentaciones espontáneas (Longo et al., 1992). Mercedes (2006) menciona que la fermentación puede ser conducida como un proceso natural o por el uso de un cultivo puro. En el primer caso las levaduras 26 presentes en el jugo de fruta inician y completan la fermentación. En el caso de usar cultivos selectos de S. cerevisiae, las cuales se inoculan en número entre 106 a 107 UFC/mL, éstas son especialmente tolerantes a altas concentraciones de azúcar, etanol y SO2.Torija et al., (2003), el uso de cultivos puros da como resultado una fermentación más limpia, rápida y predecible; y se reducen los riesgos de contaminación. Dickinson et al., (2003), la levadura Saccharomyces cerevisiaes es la especie de mayor uso en la industria vinícola, se describe como un anaerobio facultativo, crece en condiciones aeróbicos y anaeróbicos, es la glucosa su fuente de carbón preferido. Cuando se emplea fuentes de carbono diferentes a la glucosa se requiere una gluconeogénesis, esto reduce el rendimiento del proceso, que en condiciones normales de consumo de glucosa se estima entre 85 y 90% de la conversión de sustrato. 2.10 Productos secundarios de la fermentación Peynaud (1989) señala, durante la fermentación alcohólica además de etanol y dióxido de carbono se produce cierta cantidad de otros compuestos, que en gran medida contribuyen al sabor y aroma final del vino Los más significativos son los siguientes: Glicerol.- Cuantitativamente es el segundo componente mayoritario del vino después del etanol. Se encuentra en cantidades de 6 a 10 g/L y a él se atribuyen los caracteres de suavidad y aterciopelado del vino. Se genera a partir de la fosfodihidroxiacetona por reducción y defosforilación de la misma. Acetaldehido.- Aparece durante la fermentación alcohólica por descarboxilación del ácido pirúvico, aunque también puede proceder de la oxidación del etanol. En exceso provoca en el vino la denominada maderización o gusto oxidado. Acido succínico.- Presente siempre en el vino, transmite a éste el típico sabor entre salado y amargo que caracteriza a las bebidas fermentadas. Procede de la carboxilación del ácido pirúvico y posteriores reacciones redox. 27 Ácido láctico.- Procede de la hidrogenación del pirúvico, aunque puede tener su origen en intervenciones bacterianas. Acetoína, diacetilo y 2-3 butanodiol.- Son los metabolitos del ciclo diacetilo- acetoínico. Siempre presentes en el vino, en exceso transmiten sabores lácteos y amargos no deseables. Tienen su origen en la condensación y descarboxilación de dos moléculas de ácido pirúvico. Otros compuestos.- Con origen en los azúcares se forman diversos ácidos cuantitativamente minoritarios como cítrico, propiónico, fumárico y fórmico. Con origen en las sustancias nitrogenadas se forman alcoholes superiores como isoamílico e isopropílico que proceden de la desaminación y descarboxilación de los aminoácidos. Por combinación entre ácidos y alcoholes se generan ésteres con fuerte repercusión en el buqué final del vino, siendo el acetato de etilo el que tiene una repercusión mayor. 2.11 Característica de una bebida alcohólica fermentada Bernal de Ramirez (1993) señala, que el contenido alcohólico de los vinos de frutas tiene que hallarse entre un 8 y un 20% v/v.; la mayoría tendrá un contenido alcohólico de 12 a 15% v/v. Arthey y Ashurt (1999) señalan que en la fermentación de alcohólica de frutas es frecuente que en este proceso sea necesario ajustar la acidez del zumo mediante la adición de ácidos utilizados en la industria alimentaria o, más comúnmente, por neutralización del exceso de acidez, con carbonato cálcico. 28 Tabla 5. Requisitos físico químicos del vino. Requisitos fisicoquímicos Mínimo Máximo Grado alcohólico volumétrico a 20/20 °C (% vol) 10,0 - Extracto seco total a 100°C (g/L) Para vinos blancos rosados: 16,0Para vinos tintos: 21,0 - Acidez volátil, como ácido acético (g/L) - 1,2 Sulfatos, como sulfato de potasio (g/L) - 1,0 Para los vinos endulzados: 1,5 Para los vinos dulces naturales: 2,0 Cloruros, cloruros de sodio (g/L) - Vinos tintos: 400 Vinos blancos y rosados:250 Acidez cítrica (g/L) - 1,0 Acidez total, como acidez tartárica (g/L) 3,0 7,0 Anhídrido sulfuroso total Vinos blancos y rosados que contengan como máximo 4g/L de sustancias reductoras:200,0 Vinos blancos y rosados que contengan más de 4g/L de sustancias reductoras:300,0 Excepcionalmente en algunos vinos blancos dulces: 400,0 Fuente: NTP (2011). 29 Tabla 6. Requisitos físico químicos del vino de frutas. Requisitos fisicoquímicos NTE (1987) NTC (2000) Mínimo Máximo Mínimo Máximo Alcohol, fracción volumétrica 20°C 5,0 % 18% 6 % - Acidez total expresado en acido tartárico - - 3,5 g/L 10 g/L Acidez volátil, ácido acético - 1,5 g/L - 1,2 g/L Acidez volátil, como ácido málico 4,0 g/L 16,0 g/L - - Metanol de alcohol anhidro - 0,5 cm3/100cm3 - 1 mg/cm3 Cenizas 1,4 meq/L - - - Anhídrido sulfuroso total - 0,32 g/L - 0,35 g/L Anhídrido sulfuroso libre - 0,04 g/L - Extracto seco - - 10,0 g/L - pH - - 2,8 4,0 Fuente: NTE (1987) y NTC (2000). 30 2.12 Clarificación Négre y Francot (1980), para realizar una clarificación debe haber una previa filtración. La filtración consiste en hacer pasar el vino turbio a través de obstáculos con numerosos y muy pequeños orificios. Las partículas más gruesas son detenidas, si son más pequeñas también pueden serlo por la fuerza de adhesión que las mantiene pegadas contra la pared, lo que se conoce con el nombre de adsorción. Los más usados en la industria son los filtros de mangas, generalmente de tejido de algodón o de cáñamo. La velocidad de filtración, como la limpieza del vino filtrado, depende sobre todo de la naturaleza del enturbiamiento del vino, del encolado de la pasta y de la técnica de la filtración. Si el vino está muy turbio, el encolado se hace poco a poco gracias a las partículas que se amontonan en el tejido, pero hay que filtrar de nuevo las primeras porciones del líquido que pasan turbias. Aleixandre y Alvarez (2003), mencionan que la observación de la limpidez se puede hacer a simple vista con una iluminación adecuada, pero esto no es suficiente para determinar enturbiamientos ligeros. Lo recomendable es determinar la turbidez con un nefelómetro o en su defecto con una escala de turbidez. Tabla 7. Criterios de turbidez para un vino clarificado. Tipos de vino Turbidez Unidad nefelométrica de turbidez (NTU) Vino brillante 0,48 -1,40 Vino limpio 1,40 - 2,80 Vino velado 2,80 - 6 Vino sucio 6 – 19 Vino turbio >16 Fuente: Aleixandre y Alvarez (2003). Aleixandre y Alvarez (2003) indican que los clarificantes minerales son compuestos arcillosos que derivan por hidrolisis de los silicatos primarios, con el agua dan dispersiones coloidales. Son coloides electronegativos y por lo tanto coagulantes por los prótidos naturales o agregados al vino. 31 2.12.1 Bentonita Aleixandre y Alvarez (2003.) Es una de las arcillas más ricas en silicio. Se hinchan en agua, dando dispersiones coloidales liófobas de signo negativo. Tiene notables propiedades adsorbentes, con fuerte atracción para las partículas electropositivas, y en la clarificación dan depósitos muy abundantes, relativamente sueltos y esponjosos. Tabla 8. Ventajas y desventajas del uso de bentonita. 2.13 Enfermedades en vinos Las alteraciones del vino pueden tener su origen en factores físicoquímicos, en cuyo caso suelen denominarse quiebras, o pueden tener su origen en la acción de microorganismos en cuyo caso hablamos de enfermedades (Peynaud, 1989 y Navarre, 1994). Éstas a su vez pueden ser aerobias o anaerobias. Ventajas Desventajas Elimina del vino los prótidos naturales que son los que pueden comprometer su estabilidad fisicoquímica. Puede provocar una notable disminución del color y de sustancias sapinicas. Capacidad de absorción de las polifenoloxidasas, las elimina parcialmente. Ocasiones importantes pérdidas aromáticas porque fija estos compuestos. Elimina la fracción coloidal de la materia colorante. Posible enriquecimiento del vino en hierro y sodio. Dificulta la quiebra blanca y cúprica. Produce una breve disminución de la acidez fija del vino y una pequeña elevación del pH. La bentonita clarifica mejor con acidez total elevada y una temperatura ideal de 20 °C. Fuente: Aleixandre y Alvarez (2003). 32 2.13.1 Enfermedades aerobias Pueden ser debidas a levaduras que provocan la enfermedad denominada la flor o pueden ser debidas a bacterias acéticas, en cuyo caso provocan la enfermedad denominada picado acético. a. La flor: Se produce en vinos de baja graduación alcohólica (9% Vol), que estén almacenados en recipientes parcialmente vacíos, como consecuencia del contacto del vino con el aire. Se caracteriza por la aparición en la superficie del vino de un velo blanquecino que es debido a la proliferación de la levadura elíptica Candida mycoderma. Esta levadura provoca la oxidación del etanol y de los ácidos orgánicos generando CO2, agua y acetaldehído, por lo que los vinos se vuelven aguados y maderizados. b. El picado acético: Es una de las enfermedades más graves ya que conduce al avinagramiento del vino. Se caracteriza por la aparición en la superficie del vino de un velo gris-rosado que es debido a la proliferación de bacterias acéticas, siendo la más común Acetobacter aceti. Las bacterias acéticas oxidan el etanol generando ácido acético, acetaldehido y agua. A su vez el ácido acético puede combinarse con el etanol dando acetato de etilo que es el verdadero responsable del olor a picado. Los vinos atacados por esta enfermedad van perdiendo grado alcohólico, color y van ganando acidez volátil, haciéndose inconsumibles a partir de aproximadamente 1 g de ácido acético/L. Ambas enfermedades pueden ser prevenidas practicando el correcto relleno de los envases, manteniendo una higiene rigurosa en la bodega y sulfitando convenientemente mostos y vinos. 2.13.2 Enfermedades anaerobias Se distinguen de las anteriores en que los microorganismos responsables no se desarrollan en la superficie del vino sino en el interior del mismo, en ausencia de oxígeno, también porque no se produce la oxidación del etanol sino utilización de otros compuestos como azúcares residuales, ácidos 33 orgánicos y glicerol. Pueden también ser causadas por levaduras o por bacterias, en este caso bacterias lácticas. a. Causadas por levaduras: Pueden ser las propias levaduras de la vinificación, por ejemplo S. cerevisiae y S. bayanus, las cuales pueden provocar refermentaciones de los azúcares residuales en el vino embotellado. Se genera así una turbidez que deprecia la calidad del vino. Pueden ser levaduras de contaminación por ejemplo especies del género Pichia, capaces de utilizar los azúcares residuales para generar acidez volátil, o por ejemplo especies del género Brettanomyces que producen acetamida a partir de azúcares dando el denominado "sabor a ratón". b. Causadas por bacterias: Las bacterias responsables de las enfermedades anaeróbicas del vino son las bacterias lácticas consideradas perjudiciales entre las que predominan los bacilos heterofermentativos. Según el tipo de sustrato utilizado y el tipo de producto generado se pueden diferenciar cuatro enfermedades: el picado láctico, la vuelta, el amargo y la grasa. b.1 El picado láctico: Se produce como consecuencia de la utilización de los azúcares residuales de un vino por todo tipo de bacterias lácticas del vino (perjudiciales o útiles) para generar ácido láctico, acético y manitol lo que transmite alvino un sabor agridulce. Los vinos en los que se ha parado accidentalmente la fermentación alcohólica son más propensos a este tipo de enfermedad. b.2 La vuelta: Consiste en la utilización del ácido tartárico por las denominadas bacterias perjudiciales (principalmente bacilos) para dar ácido láctico, ácido acético y CO2. El vino pierde acidez total, concretamente acidez fija, y gana en acidez volátil, depreciándose notablemente su calidad. b.3 Enfermedad del amargo: Típica de vinos tintos viejos embotellados, se caracteriza por la aparición en ellos de un sabor amargo que es debido a la transformación del glicerol en acroleína por las bacterias 34 lácticas y posterior combinación de la acroleína con los polifenoles del vino. b.4 La grasa: El vino atacado de esta enfermedad presenta un aspecto ahilado y aceitoso, que es debido a la presencia en el mismo de polisacáridos. Estas moléculas producidas principalmente por especies del género Leuconostoc forman entramados que espesan el vino dándole el aspecto gelatinoso que le caracteriza. La mejor forma de prevenir las enfermedades anaeróbicas, es el empleo correcto de las técnicas enológicas como son el sulfitado, las filtraciones, evitar los azúcares residuales y las temperaturas elevadas durante la conservación del vino, y la vigilancia constante de una higiene rigurosa. 2.14 Definiciones generales relacionadas con el producto obtenido Según NTP (2008), una bebida alcohólica es producto apto para el consumo humano, obtenido por procesos de fermentación principalmente alcohólica de la materia prima agrícola que sirve como base, utilizando levadura del genero Saccharomyces, sometida o no a destilación naturales susceptibles de ser añejadas, que pueden presentarse en mezclas de bebidas alcohólicas y pueden estar adicionales de ingredientes y aditivos permitido por el organismo de control correspondiente, y con una graduación alcohólica mayor de 0,5 a 55% Alc. Vol. Se clasifica en: bebidas alcohólicas fermentadas, bebidas alcohólicas destiladas, bebidas alcohólicas preparadas y licores. 2.14.1 Bebidas alcohólicas fermentadas: producto destinado al consumo humano resultante de la fermentación principalmente alcohólica de materia primas de origen agrícola. Se les puede adicionar ingredientes y aditivos permitido por el organismo de control correspondiente. 2.14.2 Bebidas alcohólicas destiladas: producto obtenido por destilación de mostos fermentados elaborado a partir de materias primas agrícola en las que la totalidad o una parte de sus azucares fermentables, hayan sufrido como principal fermentación, la alcohólica, siempre y cuando el destilado no haya 35 sido rectificado totalmente, por lo que el producto deberá contener las sustancias secundarias de cada bebida, estas bebidas son susceptibles de ser añejadas. Saborizadas o adicionadas de ingredientes y aditivos permitido por el organismo de control correspondiente. 2.14.3 Bebidas alcohólicas preparadas: productos a base de bebidas alcohólicas destiladas, fermentadas, macerados, licores o mezclas de ellos y que pueden adicionarse con otros ingredientes y aditivos permitido por el organismo correspondiente. 2.14.4 Licor: bebida alcohólica que se obtiene por destilación de bebidas fermentadas o mostos fermentados, por mezcla de alcohol etílico rectificado o aguardiente con sustancias de origen vegetal o con extractos obtenido por infusiones, percolaciones o maceraciones de los citados productos o con sus sustancias aromatizantes; edulcorados o no, a la eventualmente se le puede añadir ingredientes y aditivos permitidos por el organismo de control correspondiente. En su denominación, por lo general se hace referencia, a la materia prima que le otorga sus características de aroma y sabor, por ejemplo: licor de cacao, licor de menta, entre otros, también se puede denominar por un nombre específico. 2.15 Clasificación de los vinos Según la NTP (2011) mencionan que la clasificación de los vinos puede darse por su color, contenido de azucares reductores y técnica de elaboración. A continuación mencionamos su clasificación por el contenido de azucares reductores: a. Seco.- cuando el vino contiene un máximo de 4 g/L de azúcar. b. Semi-seco.- cuando el contenido de azúcar en el vino es mayor que lo especificado en el punto anterior, hasta un máximo de 90 g/L. c. Dulce.- cuando el vino tiene un contenido de azúcar mayor de 90 g/L En la industria el proceso fermentativo alcanza un rendimiento del 87-93%, sin embargo el rendimiento experimental a nivel laboratorio varía entre 90 y 95% del teórico (Boudarel, 1984). 36 III. MATERIALES Y METODOS Este trabajo se realizó en el laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ingeniería en Industrias Alimentarias de la Universidad Nacional del Centro del Perú y en las instalaciones de la Fábrica de Licores Nelcas E.I.R.L. 3.1 Materiales 3.1.1 Materia prima La materia prima utilizada para la elaboración de la bebida alcohólica fermentada, fue el aguaymanto (Physalis peruviana L) proveniente de la sierra peruana distrito de Pariahuanca, provincia de Huancayo, departamento de Junín. 3.1.2 Insumos - Metabisulfito de sodio - Ácido cítrico comercial - Levadura deshidratada: Saccharomyces cerevisiae cepa CH 158 SIHA - Azúcar blanca refinada - Clarificante: Bentonita PLUSGRAN® GEL - Agua tratada 3.1.3 Equipos - Balanza analítica de precisión, capacidad 1000 g, marca AdventurerTM Ohaus. - Extractor de zumos, 120V, velocidad de 1500 RPM, marca WaringR Commercial Blender. - Refractómetro portátil, con escala 0- 70 °Brix. - Incubadora, escala 5 - 100°C, marca Binder. - Espectrofotómetro, marca Thermo Genesys 10S Vis. - Centrifuga velocidad fija, 8 tubos, 2 a 15 ml, 3400 RPM. - Microscopio Nikon Eclipse E100. - Cámara de Neubauer. - Nefelómetro Thermo Electron Coportation, escala de 0-1000 NTU, Orion AQ2010. - Potenciómetro digital, rango: 0,0 a 14,0 pH, marca Hanna Instruments. - Balanza comercial, escala 0-10 kg marca Berkeel. 37 - Termómetro de vidrio, escala 0-110 °C. - Cocina eléctrica, 220V, 300V, marca General Electric. - Incubador Binder Modelo C 170, temperatura 180 °C. - Picnómetro graduado 25 ml - Equipo de destilación. - Envases de vidrio de 4L de capacidad. - Vernier de acero 0,05mm grado de precisión, marca Mitutoyo Brasil 530- 104BR. - Materiales de laboratorio para análisis físicoquímicos, con materiales de vidrio y reactivos. - Menajes diversos 3.2 Métodos de análisis 3.2.1 Análisis fisicoquímico de la materia prima a. Diámetro del fruto: Se midió en milímetros, utilizando un vernier recomendado por Fischer, et al (2005). b. Peso del fruto: Se midió en gramos, utilizando una balanza digital calibrada recomendado por Fischer, et al (2005). c. Solidos solubles: Se determinó utilizando el refractómetro manual siguiendo el método operativo descrito por Négre-Francot (1980). d. Acidez total: Se pudo determinar cuantitativamente mediante titulación neutralizando los ácidos presentes en la fruta, con soda (NaOH) cuyo punto final se determinó mediante un cambio de color influenciado por un indicador (fenoftaleina) descrito por Artica (2012). e. Densidad: Método realizado por Négre-Francot (1980). f. pH: Se determinó en forma directa mediante el uso de un potenciómetro descrito por Artica (2012). g. Índice de madurez: Relación del contenido de solidos solubles sobre la acidez total titulable, el valor es adimensional según NTC 4580 (1999). 38 3.2.2 Análisis físicoquímico de la bebida alcohólica fermentada a. Acidez volátil: Método realizado por titulación de NaOH 0,1, expresado en ácido acético. (Malpica y Shirai 2013). b. Azucares reductores: Utilizando el ácido 3,5 dinitrosalicílico (DNS) para calcular la concentración de azucares reductores con ayuda del
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