TECNICAS_MODERNAS_DE_BIOLOGIA_MOLECULAR

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REVIEW ARTICLE / ARTÍCULO DE REVISIÓN
TÉCNICAS MODERNAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR PARA
IDENTIFICACIÓN DE INSECTOS
MODERN TECHNIQUES OF MOLECULAR BIOLOGY FOR INSECT
IDENTIFICATION
Chávez Llerena, David Antonio1; Huamán Suarez, Brian Jesús1
1Escuela Profesional de Biología, Facultad Ciencias Naturales y
Matemáticas, Universidad Nacional Federico Villarreal, Av Rio de Chepén
s/n, El Agustino, Lima-Perú
Resumen
La biología molecular es la parte de la biología que estudia los seres vivos y los
fenómenos vitales con arreglo a las propiedades de su estructura molecular.
Está dedicada al estudio de los mecanismos moleculares y genéticos
implicados en los procesos biológicos fundamentales en el desarrollo y
fisiología de los organismos vivos. Las técnicas moleculares permiten el estudio
de genoma completo o secuencias específicas de ADN cortas o largas con el
fin de detectar y analizar secuencias de interés para la investigación en las
ciencias agronómicas, forenses, diagnóstico clínico e investigación básica,
traslacional y aplicada; cada una de ellas se caracteriza por la confiabilidad y
rapidez en la obtención del resultado, robustez, especificidad, sensibilidad y
flexibilidad, comparado con métodos fenotípicos. El objetivo de este artículo fue
presentar las técnicas con fundamento en biología molecular, que han aportado
al desarrollo de la identificación de insectos. Se presentan 5 técnicas de
Biología molecular que han aportado a la investigación: extracción de ADN,
PCR, RAPD, RFLP e ISSR. La amplificación por reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) es un método simple pero poderoso, para amplificar
fragmentos de ADN mediante la incubación sucesiva a diferentes temperaturas.
El uso de los métodos de PCR y ISSR arrojará los mejores resultados de
identificación de especies, debido a su rapidez, su confiabilidad y bajo costo.
Se empleó la técnica RAPD la cual permite evidenciar polimorfismos de ADN
con relativa facilidad aún en insectos pequeños o partes de los mismos como
en este estudio, así mismo esta técnica revela diferencias en poblaciones con
ausencia de variabilidad alozímica.
Palabras clave: Biología molecular, insectos, ADN, RAPD, RFLP
Abstract
Molecular biology is the part of biology that studies living beings and vital
phenomena according to the properties of their molecular structure. It is
dedicated to the study of the molecular and genetic mechanisms involved in the
fundamental biological processes in the development and physiology of living
organisms. Molecular techniques allow the study of the complete genome or
specific short or long DNA sequences in order to detect and analyze sequences
of interest for research in agronomic, forensic, clinical diagnosis and basic,
translational and applied research; each of them is characterized by reliability
and speed in obtaining the result, robustness, specificity, sensitivity and
flexibility, compared to phenotypic methods. The objective of this article was to
present the techniques based on molecular biology, which have contributed to
the development of insect identification. 5 molecular biology techniques that
have contributed to the research are presented: DNA extraction, PCR, RAPD,
RFLP and ISSR. Amplification by polymerase chain reaction (PCR) is a simple
but powerful method to amplify DNA fragments by successive incubation at
different temperatures. The use of PCR and ISSR methods will yield the best
species identification results, due to their speed, reliability and low cost. The
RAPD technique was used, which allows to show DNA polymorphisms with
relative ease even in small insects or parts of them as in this study, likewise this
technique reveals differences in populations with absence of allozyme
variability.
Keywords: Molecular biology, insects, DNA, RAPD, RFLP
Introducción
El origen de la biología molecular se remonta a principios de los años cuarenta.
En ese tiempo, los bioquímicos habían descubierto muchas reacciones
químicas intracelulares fundamentales y habían comprendido la importancia de
reacciones específicas y de ciertas moléculas para definir numerosas
propiedades celulares. Sin embargo, el desarrollo de la biología molecular que
aguarda a quienes han estudiado mediante el estudio de "células cerebrales"
como los virus bacterianos y bacterianos (organismos procariotas), que aportan
información sobre procesos biológicos básicos más rápidamente que las
células animales (organismos eucariotas). El cumplimiento de la uniformidad
básica de los procesos vitales fue un factor importante en este rápido
desarrollo. Es decir, si creo que los principios biológicos fundamentales que
rigen la actividad de los organismos procariotas; también se puede aplicar a
organismos eucariotas, solo variando los detalles (Diez & Lopez, 1993). Este
cumplimiento fue posteriormente ratificado por los resultados experimentales.
Las bacterias y los virus permitirán a los científicos identificar el ácido nucleico,
ácido desoxirribonucleico, ADN, como la molécula que contiene la mayor parte
de la información genética en una célula y que, a través de otro ácido nucleico -
ARN, ácido ribonucleico, controla gran parte de las funciones celulares,
regulando la síntesis de otras moléculas, proteínas. Tras este descubrimiento,
el nuevo campo de la genética molecular avanzó rápidamente durante las
siguientes décadas (Tabla 1), brindando nueva información.
Tabla 1. Hitos históricos en el desarrollo de la biología molecular.
Metodología
El siguiente estudio se realizó mediante la búsqueda y síntesis de información
de diversas fuentes como Researchgate, Google Académico, Scielo, entre
otros; acerca de las diversas técnicas moleculares usadas para la identificación
de diferentes insectos. Los artículos empleados para el desarrollo de este
trabajo van desde el año 1998 hasta el 2017, luego se redactó y transcribió lo
más importante de cada artículo, con el fin de averiguar cuales son las técnicas
más utilizadas y que órdenes de insectos son los más empleados para la
aplicación de las técnicas de biología molecular.
Resultados
TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR
El dogma central de la Biología establece que el ADN es la molécula que
contiene la información genética de un organismo que se auto perpetúa
mediante el proceso de replicación. Esta información se expresa mediante 2
procesos consecutivos, la transcripción que produce ARN, y posterior
traducción donde se sintetiza la proteína que finalmente ejecuta la función.
Todos los organismos heredan la información genética que especifica su
estructura y función a partir de sus padres. Del mismo modo, todas las células
se originan de células preexistentes. Así, el material genético debe ser
replicado y transmitido desde los padres a la progenie celular en cada división.
El cómo la información genética es replicada y transmitida desde una célula a
otra, o desde un organismo a otro, representa una temática central para la
Biología Molecular. En consecuencia, la dilucidación de los mecanismos de
transmisión genética y la identificación del ADN como material genético fueron
descubrimientos que conformaron los cimientos de nuestra comprensión de la
biología a nivel molecular.
En principio se denomina así a todas las técnicas de laboratorio que se usan
para aislar ADN o extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado,
cortarlo y pegarlo, amplificar una región en una enorme cantidad de moléculas
(clonación de fragmentos en bacterias u otros vectores como virus , PCR, etc.
TIPOS DE TÉCNICAS MOLECULARES
Las técnicas de biología molecular sirven para analizar ácidos nucleicos y para
detectar, e identificar tanto microorganismos, como diferentes genotipos dentro
de una misma especie y genes de resistencia al tratamiento farmacológico.
Todas estas técnicas necesitan un paso previo de extracción de ADN o ARN.
Una vez extraído debe purificarse de forma adecuada para evitar la presencia
en la muestra de inhibidores o sustancias que contaminen y que impidan la
correcta realización de la técnica posterior.Con los avances en la biología molecular se han desarrollado múltiples equipos
que realizan la extracción de ADN de la muestra de forma totalmente
automatizada en un corto periodo de tiempo, lo cual supone una gran ventaja
en este primer paso del proceso.
Las técnicas de biología molecular se deben realizar en muestras de ADN
totalmente puros, para obtener resultados correctos, evitando tanto falsos
positivos como negativos. Los métodos de purificación del ADN pueden
basarse en diferentes acciones: extracción/precipitación, ultrafiltración,
cromatografía, centrifugación y separación por afinidad. El uso de un tipo u otro
dependerá de la muestra obtenida, la cantidad de ésta, el tipo de ácido nucleico
y la técnica posterior con la que se va a trabajar.
Las técnicas permiten el estudio de un genoma completo o secuencias
específicas de ADN de secuencias largas o cortas con el fin de detectar y
analizar secuencias de interés para la investigación en las ciencias
agronómicas, forenses, diagnóstico clínico e investigación básica, traslacional y
aplicada.
● Extracción/precipitación: tiene lugar un primer paso en el que se extraen
contaminantes como fenol y cloroformo de la muestra de ácidos
nucleicos extraídos, y un segundo paso en el que se precipitan los
ácidos nucleicos con isopropanol o etanol. Es un método laborioso y que
utiliza productos tóxicos. El fenol y el cloroformo actúan como
inhibidores de la reacción de la PCR, por lo que si se utiliza este método
es necesario eliminar restos de estos productos para que la posterior
reacción de PCR sea correcta (10).
● Ultrafiltración: se utiliza una membrana que actúa de filtro sobre la que
se coloca la muestra de ácidos nucleicos extraídos y se somete a
centrifugación. De esta forma, los ácidos nucleicos libres de sustancias
contaminantes quedan retenidos en la membrana y posteriormente se
recuperan añadiendo agua o un tampón específico.
● Ultracentrifugación: por diferencia de densidad se separan las partículas,
las más densas sedimentan y las menos densas flotan. Para favorecer
este proceso se lleva a cabo la centrifugación.
● Cromatografía: se utiliza una matriz con poros hidrofílicos que dejará
pasar las moléculas más pequeñas. Las moléculas grandes quedarán
eludidas en el volumen vacío por orden decreciente.
● Electroforesis: se basa en la separación de los ácidos nucleicos
mediante gel de poliacrilamida. Las moléculas más pequeñas se
moverán a mayor velocidad y las más grandes más despacio. Cuando
las moléculas de ADN son muy grandes, se usan geles de agarosa (9).
En función del tamaño de las moléculas, se pueden usar diferentes
concentraciones de agarosa o poliacrilamida en el gel.
Cada método presentado en esta revisión, se caracteriza por la confiabilidad y
rapidez en la obtención del resultado, robustez, especificidad, sensibilidad y
flexibilidad.
1. Extracción de ADN
La primera técnica que todas las demás necesitan es la extracción del ADN, y
para ello es necesario purificarlo desde cualquier tejido aunque usualmente se
hace a partir de sangre. Se basa en una serie de lavados de la muestra y
agregado de proteínas que eliminan las proteínas del medio, detergentes para
eliminar las membranas plasmáticas y luego ir purificando el ADN de esa
mezcla de ARN proteínas y restos celulares o también consiste en la
separación y purificación del ADN con el fin de poder estudiarlo, analizarlo o
manipularlo.
Es una técnica que determina la secuencia completa de ADN en el genoma de
una persona; consiste en determinar el orden de las bases Adenina, Citosina,
Guanina y Timina en un fragmento de ADN. Con esta técnica se logra obtener
secuencias hasta 500 bases aproximadamente, estas son ensambladas a un
genoma de referencia que secuencia un genoma completo. Este método ha
cambiado la manera de entender la genética basándose en la identificación de
las causas reales de la herencia, centrándose en estudios genéticos de
individuos con un fenotipo definido y enfermedades de herencia mendeliana
producida por genes conocidos; estas evalúan el fenotipo y la secuencia del
gen que puede estar afectado y presentan una sensibilidad muy alta para
detectar mutaciones.
Uno de los proyectos más famosos en la historia de la biología molecular, fue el
Proyecto genoma Humano (PGH), el cual propuso determinar la secuencia
completa (más de 3 000x10⁶ pares de bases) del genoma humano; el método
localiza con exactitud los 100.000 genes de ADN aproximadamente y el resto
de material hereditario de los seres humanos, responsables de las
instrucciones genéticas de todo lo que conforma a un ser humano desde el
punto de vista biológico.
Con el decursar del tiempo, la secuencia ha venido experimentado una serie de
modificaciones al método descrito inicialmente por Sanger, y generado otros
tipos de secuencia con la NGS y la pirosecuencia, muy empleadas en la
actualidad en investigación clínica y estudios epidemiológicos.
2. PCR (Reacción en cadena de la polimerasa)
La amplificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método
simple pero poderoso, inventado por K. B. Mullis y patentado inicialmente por la
compañía Cetus (California, USA), para amplificar fragmentos de ADN
mediante la incubación sucesiva a diferentes temperaturas. Por lo general, se
emplea una doble cadena de ADN que es desnaturalizada por calentamiento
(94-95°C), se permite el alineamiento de dos cebadores (iniciadores u
oligonucleótidos) complementarios en los extremos 3’ de cada cadena (a una
temperatura que depende de los cebadores) y finalmente se permite la
elongación de las cadenas a una temperatura de 72-74 °C. Todo este proceso
se conoce como un ciclo y estos pasos se repiten hasta obtener una
amplificación de los segmentos de ADN de al menos 1x105 veces y
potencialmente hasta 1x109 veces.
La sensibilidad de la técnica de PCR es muy alta, pero presenta algunos
inconvenientes como son el hecho de que exista la probabilidad relativamente
alta de obtener falsos positivos por contaminación y que no es una técnica
cuantitativa, sino semi-cuantitativa. Para resolver el primer problema se debe
de optimizar la secuencia de los cebadores, así como la temperatura precisa
para que estos se unan al ADN correctamente y realizar una adecuada
manipulación de los reactivos. Por otra parte, se han desarrollado
modificaciones de esta técnica, una de ellas es la PCR en tiempo real o
cuantitativo (QPCR), que es una variación de la original en la que podemos
conocer la cantidad exacta de ADN original y el que se está produciendo
durante cada ciclo.
En los últimos años se han venido desarrollando nuevas técnicas moleculares
de tipificación basadas en la RCP, que han dado un gran avance en la
evolución del estudio de las enfermedades infecciosas a través de estudios
epidemiológicos moleculares que tiene por objeto determinar la relación clonal
existente entre varios aislados de una misma especie, mediante técnicas de
tipificación que involucran la amplificación de genes o secuencias de ADN
polimórficas. Los métodos genotípicos amplifican regiones in vitro específicas
de ADN al emplear secuencias que delimitan la zona de amplificación; a partir
de una copia de la región a amplificar se adquieren millones de copias que
posibilitan su detección y reflejan la presencia de la región de ADN en la
muestra a analizar; para esta transformación actúan varias proteínas que
cooperan en la síntesis de nuevas hebras de ADN a partir de otra que funciona
como molde.
Esta técnica, ha tenido diferentes avances y aplicaciones, las cuales se
presentan en la Tabla 2.
Tabla 2. Características y aplicaciones de las diferentes clases de PCR.
3. RAPD (ADN polimórfico amplificado al azar)
Esta técnica se basa en la amplificación aleatoria de ADN polimórfico y es más
conocida por el acrónimo inglés RAPDs (Random Amplification of Polymorphic
DNA). Emplea marcadores moleculares para amplificar por PCR secuencias
cortas de ADN polimórfico, utilizando para ello un cebador de secuencia corta
(10-12 pares de bases). En microbiologíase utiliza para establecer relación
entre diferentes especies, por ejemplo entre bacterias y plantas, pero hasta
ahora no se ha estudiado en el diagnóstico de enfermedades infecciosas.
También conocida como polimorfismo de producto amplificado al azar, es una
técnica que emplea marcadores moleculares para amplificación por RCP de
secuencias cortas de ADN polimórfico empleando un cebador de secuencia
corta (10 a 12 pares de bases –pb). Al ser una técnica basada en la RCP,
necesita control sobre ciertos factores que pueden influir directamente en el
desempeño de la técnica como los DNTPs, Taq DNA polimerasa, temperatura
de hibridación, tiempo de extensión, ciclos y la integridad de la cadena molde.
La técnica RAPD presenta una serie de ventajas con respecto a otros
marcadores moleculares para el estudio poblacional de organismos muy
desconocidos genéticamente (Black, 1993):
● No requiere conocimiento previo de la secuencia de ADN,
● Es un método rápido, sencillo y con costos inferiores a los de otras
técnicas,
● Permite analizar un número elevado de muestras en un tiempo reducido,
● Se necesitan cantidades mínimas de ADN molde,
● No se utiliza radiactividad,
● Revela un elevado grado de polimorfismo debido al gran número de loci
que permite estudiar, muchos de los cuales se piensa que son no
codificantes (Williams et al., 1990).
No obstante, los RAPD tienen también algunos inconvenientes (Black, 1993).
En su mayor parte presentan una herencia dominante y, la principal objeción a
la que se enfrenta esta técnica, es el problema de la reproducibilidad, por lo
que se hace necesaria una estricta estandarización de las condiciones de
amplificación, así como llevar a cabo réplicas de todas las amplificaciones para
una completa fiabilidad.
4. ISSR (Marcadores Inter-Secuencias Simples Repetitivas)
Los microsatélites del tipo Inter secuencias simples repetidas (ISSR por sus
siglas en inglés Inter-Simple-Sequence-Repeat), son una variante de la técnica
RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA - ADN polimórfico amplificado al
azar), aunque probablemente son más rigurosos que ésta debido a la alta
temperatura de alineamiento utilizada (Robinson y Harris, 2000). La
amplificación ISSR es una técnica que puede diferenciar rápidamente
individuos relacionados estrechamente.
Involucra la amplificación por PCR del ADN usando un único iniciador
compuesto de una secuencia de microsatélite anclado al extremo 3 ó 5 por 2 -
4 nucleótidos arbitrarios y a menudo degenerados. La amplificación ISSR
puede revelar muchos más fragmentos por iniciador que los RAPDs (García,
2012).
La identificación de secuencias con motivos SSR se puede realizar a partir de
genotecas, completas o enriquecidas en secuencias microsatélite, como se ha
explicado en la Introducción. Sin embargo, debido al incremento de colecciones
de secuencias disponibles en muchas especies, la identificación de estas
repeticiones in silico a partir de bases de datos mediante ciertos programas y
aplicaciones informáticas (Repeat master, Sputnik, Tandem Repeat Finder, etc)
está cobrando especial importancia. Estas herramientas pueden detectar
distintos tipos de microsatélites:
A. Microsatélites perfectos: repeticiones en un número mínimo de unidades
sin interrupción y sin repeticiones adyacentes.
B. Microsatélites compuestos: dos o más repeticiones con un número
mínimo de unidades repetidas ininterrumpidas.
C. Microsatélites interrumpidos: repeticiones ininterrumpidas con un
número mínimo de repeticiones y separadas por un máximo de 4 pares
de bases.
Los ISSR pueden encontrarse tanto en secuencias codificantes como no
codificantes, pero el tipo de unidades repetidas y el número de repeticiones
puede variar. Por ejemplo, la selección en contra de mutaciones de cambio de
fase de lectura en regiones codificantes hace que los microsatélites más
frecuentes en estas zonas sean repeticiones de trinucleótidos. Las expansiones
de trinucleótidos representan un tipo especial de mutación en regiones
microsatélites relacionados con enfermedades humanas.
Los marcadores ISSR tienen la ventaja de generar grandes cantidades de
bandas, por lo cual pueden distinguir accesiones relacionadas estrechamente
de manera más confiable que otras técnicas y son menos caros que los RFLP
o RAPD (García, 2012).
5. PCR-RFLP (Técnica del polimorfismo de largo de fragmento)
La Técnica de Polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción, más
conocida como RFLP (del inglés: Restriction Fragment Length Polymorphism)
es una técnica de biología molecular que nos permite detectar fragmentos de
ADN de diferentes longitudes.
Se denomina también fragmentos de restricción de longitud polimórfica,
resultante de la variación de una secuencia de ADN reconocida por las
enzimas de restricción usadas para cortar secuencias de ADN en lugares
conocidos; son empleados principalmente como marcadores en mapas
genéticos. Es un método comúnmente empleado por su rapidez en la obtención
del resultado, bajo costo y especificidad; necesita ciertas condiciones para su
funcionamiento, consistentes en el uso de enzimas de restricción adecuadas,
condiciones de optimización y amplificación, y análisis de los productos
amplificados (fragmentos de restricción) a través de electroforesis
principalmente en gel de azarosa.
Dentro de las ventajas descritas se encuentra que para su desempeño necesita
un mínimo de instrumentos de laboratorio; se ha aplicado en diversos estudios
que han permitido establecer o identificar especies bacterianas propias de
humanos y animales (ejemplo: biovares de Brucella melitensis, la
discriminación entre especies patógenos de diferentes microorganismos
causantes de infecciones en humanos o presentes en algunos productos de
consumo humano y estudios metagenómicos (Fig. 1).
Figura 1. Esquema del procedimiento de RFLP.
TÉCNICAS MOLECULARES EN INSECTOS
Las investigaciones sobre la diversidad de los insectos con fines de
conservación son menos frecuentes, dado que éstos despiertan menor interés
que los vertebrados y además, existe la creencia bastante general de que
resultan perjudiciales para el hombre, cuando el número de especies de
insectos de importancia agronómica o médico-veterinaria es realmente escaso
(Samways, 1994). Los insectos, sin embargo, reúnen la mayor diversidad
genética del planeta y son componentes vitales de la mayoría de los
ecosistemas, reportando numerosos beneficios ecológicos (McArdle & Woiwod,
1998). En los ecosistemas de selvas tropicales juegan roles clave como
polinizadores, herbívoros y detritívoros, además de servir como fuente de
alimento para numerosos organismos (Malcolm, 1997).
Los pocos avances en la taxonomía tradicional, llevaron al uso de diversas
técnicas moleculares para la identificación de especies en general. En el caso
de la entomología, la biología molecular es usada mayormente para evaluar los
riesgos patógenos, la composición, la estructura genética, identificación de los
mismos y otros aspectos.
En Dípteros
A nivel molecular, este orden es el que posee más información tiene en este
aspecto, debido a que es importante a la hora de estimar el intervalo post
mortem y por la dificultad que se puede tener al clasificar las larvas de estos
individuos. (Vera, 2008).
Benecke, en 1998, extrajo ADN de adultos y juveniles de Diptera, por medio de
una digestión con proteinasa K, seguida de una extracción con
Fenol-Cloroformo. Trabajó con ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD).
Tomó larvas de Lucilia sp. y las comparó con adultos de Calliphora
erythrocephala de otro caso y un adulto de Silphidae. Como conclusión se
obtuvo que este método es una herramienta útil cuando no se puede utilizar
otro medio, o cuando el caso es urgente y no se dispone del tiempo suficiente
para cultivar las larvas hasta el estadio de adulto. El problema con este
método, es que las bandas que se obtienen son de diferentes tamaños y no es
reproducible. (Fig 2)
Fig 2. Una rápida disminución de la temperatura que comenzó seis días antes de la
desinfección y alcanzósu máximo el día antes del cadáver (caso 1) se encontró puede explicar
la aparición inusual de dos especies de mosca azul que deberían haber sido muertas por el
piretro. (A) supuesta hora de la muerte (concluyó de cartas en buzón, etc.), (B) cadáver
encontrado, (C) desinfección (2 días), (D) primera inspección entomológica.
Wells & Sperling en 2001, analizaron ADN mitocondrial en individuos de
Chrysomyinae, estudiando una secuencia de 2.3Kb (de Drosophila yakuba)
correspondiente a COI y COII (Gen citrocromo oxidasa I y II), y la región de
RNA de transferencia de la leucina (tRNA-leu) en un individuo de cada una de
las especies escogidas. Usaron el kit QIAamp tissue columns para la
extracción, realizaron una Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y
análisis bioinformáticos, y concluyeron que esta metodología es útil para
identificar especímenes asociados a cuerpos muertos en cualquier parte de
Estados Unidos o Canadá, con la posible excepción de algunas especies raras.
Stevens y Wall en 2001, estudiaron la relación genética entre individuos de la
familia Calliphoridae de interés forense, usando la subunidad 28S del RNA
ribosomal. Tomaron músculo torácico de adultos y realizaron la extracción por
el método de bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) (Tabla 3).
Obtuvieron que dentro de las sub-familias Luciliinae y Chrysomyinae, la
identificación a nivel de especie se logra en la mayoría de los casos usando un
fragmento corto de la secuencia, y en todos los casos usando la secuencia
completa. Calliphora sp. y Cynomya sp. requieren la secuencia completa para
su identificación.
Tabla 3. Detalles de la muestra: identidad, origen y números de acceso a la secuencia de ARNr
28S
Rosero et al, 2002, presentaron una revisión sistemática con el objetivo de
recopilar y presentar una actualización sobre el uso de marcadores
moleculares empleados en especies del grupo Verrucarum. Los resultados
muestran el empleo de los genes que codifica para el ARN ribosomal 18S y
para el citocromo oxidasa subunidad I como los más efectivos para observar
las relaciones filogenéticas entre especies del grupo Verrucarum; el uso del gen
citocromo b como carácter taxonómico alternativo para identificar
correctamente los flebótomos y, el uso de secuencias espaciadoras de la
transcripción interna del ARN ribosomal y el gen citocromo b para determinar la
variación genética intra e interespecífica de las poblaciones. Esta revisión
contribuyó a estudios filogenéticos de vectores de importancia en salud pública.
Junqueira et al. 2004, hicieron una secuenciación del ADN mitocondrial
(mtDNA) completo en Chrysomya chloropyga. Para la purificación del mtDNA
utilizan un gradiente de cloruro de cesio. Lo que encontraron es que
Chrysomya chloropyga posee una región duplicada con un tRNA completo,
siendo el primer díptero con 23 tRNA y no los 22 descritos para artrópodos. Los
mismos autores realizaron este mismo análisis en otros géneros de la familia
Calliphoridae y no encontraron el mismo patrón, pero caracterizando otro
Chrysomya si encontraron la región duplicada. De esta forma determinan que
esta región se puede utilizar como marcador molecular para esta especie
especialmente a la larva, que es difícil de identificar por medio de claves
morfológicas.
He et al. 2007, trabajaron con 5 especies de Dípteros de importancia forense
utilizando Inter Secuencias Simples Repetidas (ISSR) y Región Amplificada
Caracterizada por una Secuencia (SCAR). Realizaron la extracción por el
método de Fenol-Cloroformo. (Fig 2). Encontraron que los ISSR prometen
mucho en la identificación molecular de especies, ya que es rápido, confiable,
conveniente y con una alta exactitud. Sin embargo, ISSR es útil solo si se
compara con una muestra de referencia. Este método trabaja bien en larvas.
Fig 3. Amplificación de ADN genético en cinco especies de moscas necrófagas utilizando
imprimación (CA) 6GT. 1, 2: Lucilia sericata, adulta; 3, 4: L. sericata, segundo estadio larva; 5,
6: L. sericata, larva de tercer estadio; 7, 8: Aldrichina grahami, adulto; 9, 10: Chrysomya
megacephala, adulto; 11, 12: C. megacephala, larva de tercer estadio; 13, 14: Musca
domestica, adulto; 15, 16: Parasarcophaga crassipalpis, adulto.
Alessandrini et al. 2007, utilizaron el kit QIAamp DNA mini kit para la extracción
de ADN en larvas, pupas y adultos. Amplificaron las secuencias de COI y COII
(900pb aproximadamente), y al realizar el análisis obtuvieron la identificación
de 7 especies de Dípteros, además concluyen que en Dípteros es más exacto
identificar especies con fragmentos de COI y COII que solo con fragmentos de
COI.
En Coleópteros
Lanteri et al 2002, estudiaron al Aramigus Horn (Coleoptera, Curculionidae),
género distribuido en Argentina, Uruguay y sur de Brasil que reúne ocho
especies, una de las cuales, A. tessellatus Say, fue introducida en Chile,
México y USA, y reviste importancia agronómica. Aramigus tessellatus es una
especie compleja, sin autapomorfías a nivel morfológico, en la cual se
discriminaron seis morfotipos sobre la base de caracteres morfométricos
externos, de la espermateca y del conducto espermatecal (Fig 4).
Fig 4. Cladogramas de Aramigus (Coleoptera: Curculionidae) basados en caracteres
morfológicos (izquierda) y secuencias de ADNmt (gen COI) (derecha). Las unidades terminales
corresponden a haplotipos mitocondriales. La especie compleja A. tessellatus (indicada con
fondo gris), incluye 24 haplotipos diferentes. Los valores en las ramas expresan medidas de
soporte de los grupos: por encima, soporte de Bremer; por debajo, porcentajes de "bootstrap".
(Modificado de Normark & Lanteri, 1998).
El estudio de Aramigus mediante secuencias de ADN mitocondrial (gen COI)
permitió justificar el monofiletismo del complejo de A. tessellatus y distinguir
dentro del mismo varios linajes, bisexuales y partenogenéticos (estos últimos
generalmente poliploides), y numerosos haplotipos mitocondriales. Las
restantes especies del género presentan menor diversidad genética, ya que
incluyen entre uno y cuatro haplotipos mitocondriales diferentes y una
distribución geográfica más restringida. (Lanteri et al, 2002).
Gijón et al, 2016, dijeron que el uso de herramientas moleculares es de suma
importancia para la acertada identificación de los insectos. Para ello utilizaron
el gen mitocondrial de la citocromo C oxidasa subunidad I (COI), el cual se ha
reportado tanto para la identificación de coleópteros como otros insectos, sin
embargo el paso crucial para el éxito de la PCR es la extracción de ADN. Los
resultados de PCR indicaron que utilizar el macerado de los insectos es una
forma rápida, fácil y de utilidad para llevar a cabo la reacción en cadena de la
polimerasa e identificar a los descortezadores (Coleoptera: Curculionidae:
Scolytinae) (Fig 5).
Fig 5. Visualización de los productos de PCR: A) Marcador molecular 1Kb, B) Abdomen dilución
2:25 C) Abdomen dilución 2:25, D) Abdomen, E) Cabeza dilución 2:25, F) Abdomen & G)
Negativo.
En Hymenoptera
Asimismo, Lanteri et al 2002, revelaron que entre los parasitoides de huevos de
Curculionidae se encuentran los microhimenópteros de la familia Mymaridae.
Dos especies de dicha familia, Anaphes sordidatus y Anaphes sp., se usaron
para el control de Listronotus oregonensis, conocido en USA como “gorgojo de
la zanahoria”. Estas especies parasitan el 52% de los huevos de L.
oregonensis, ejerciendo un control muy importante. Se identificaron tres
biotipos de Anaphes sp. y dos de Anaphes sordidatus mediante la técnica de
RAPD. Las relaciones genealógicas entre los cinco biotipos estudiados
mostraron una correlación positiva con la distancia geográfica (Fig 6).
Fig 6. Cladograma de dos especies de Anaphes (Hymenoptera: Mymaridae). La unidades
terminales corresponden a diferentes biotipos, identificados mediante la técnica de RAPD, con
diferente distribución geográfica (Modificado de Landry et al. 1993).
Dado que A. sordidatus es una especie gregaria, la cópula ocurriría
frecuentemente entre individuos cercanos (emergidosdel mismo huevo o de
huevos de la misma postura) y esta intensa endocría sería la causante de su
menor heterogeneidad genética y de su distribución geográfica más restringida.
En el caso de Anaphes sp. habría una mayor variabilidad, pues de cada huevo
de L. oregonensis emerge un solo individuo del parasitoide, que deberá
cruzarse necesariamente con individuos surgidos a partir de otras posturas
(Lanteri et al, 2002).
España et al, 2008, propusieron identificar a nivel molecular especies crípticas
de Trichogramma de importancia agrícola en México. Se identificó a las
especies crípticas T. pretiosum, T. fuentesi y T. exiguum, así como a las no
crípticas T. atopovirilia y T. pintoi. Se construyó una clave dicotómica de
identificación, basada en el tamaño del espaciador transcrito interno 2 (ITS2)
del ADN ribosomal amplificado por PCR, y el polimorfismo en la longitud de los
fragmentos de restricción entre las especies. Las regiones ITS2 fueron
secuenciadas y comparadas con secuencias de GenBank, se calcularon los
porcentajes de similitud y divergencia entre las especies. Esta herramienta
molecular puede resolver la identificación de especies crípticas presentes
(Cuadro 1).
Cuadro 1: Claves de acceso de secuencias del ITS2 de Trichogramma obtenidas en GenBank,
comparadas con las secuencias obtenidas durante este estudio.
En Hemiptera
Vergel et al 2002, analizaron molecularmente insectos del género Rhodnius,
pertenecientes al hábitat doméstico y silvestre para determinar la posibilidad de
reinfestación de las viviendas por parte de la población silvestre y así orientar
apropiadamente los programas de control y vigilancia epidemiológica. Se
generaron dendrogramas utilizando programas de cómputo, los cuales, junto
con los valores calculados de Fst (0,2421) y Nm (1,05), sugieren que no existe
flujo genético entre las dos poblaciones, es decir, que se trata de dos
poblaciones aisladas.
Sin embargo, se encontraron 4 individuos que fueron colectados dentro de las
casas pero se caracterizaron como pertenecientes a la población silvestre
mediante rDNA-PCR y adicionalmente se agruparon en el cluster de la
población silvestre; esto indicaría un posible movimiento de individuos
silvestres hacia áreas domiciliarias, por lo tanto se recomienda monitorear
periódicamente las viviendas para evitar una posible reinfestación (Fig 7).
Fig 7. Dendrograma generado para poblaciones silvestre y domiciliada de Rhodnius en
Colombia. Los valores en el eje e indican el coeficiente de disimilitud y los del eje x los
individuos analizados. Las líneas gruesas corresponden a insectos encontrados dentro de las
casas que agrupan a la población silvestre.
En Lepidoptera
Marín et al, 2009 realizaron una caracterización molecular de trece especies de
Euptychiina comunes en el norte de la cordillera central de los Andes
Colombianos empleando secuencias de ADN mitocondrial de la región 3’ del
gen Cyt b, el ARNtSer y el extremo 3’ de ND1. En las secuencias del fragmento
secuenciado se evidenciaron grados de variación que permitieron diferenciar
todas las especies. El fragmento secuenciado se presenta como una nueva
herramienta para mejorar y complementar los estudios taxonómicos en grupos
como este, donde se incluyen especies morfológicamente similares. La región
propuesta combina varios genes con diferentes grados de variación
nucleotídica aportando información útil en la identificación de especies (Tabla
4).
Tabla 4. Número de nucleótidos de cada fragmento. Citocromo oxidasa subunidad b (Cyt b),
espaciador intergénico 5 (Sp5), ARN de transferencia para serina UCN (ARNtser) y NADH
deshidrogenasa subunidad uno (ND1).
Chávez et al, 2017, evaluaron cinco métodos de extracción de ADN (CTAB,
Hidrocloruro de Guanidina, STE, Buffer de lisis y kit Qiagen) a partir del insecto
plaga Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae), con el objetivo
Identificar molecularmente los biotipos de S. frugiperda mediante diferentes
metodologías de extracción de DNA.
Los resultados mostraron que con el método del kit de Qiagen, CTAB y Buffer
de lysis, se obtuvo una mejor calidad amplificable del fragmento de 569 pb del
gen COI del insecto, en comparación con los otros dos métodos evaluados.
Fig 8. PCR del gen mitocondrial COI de Spodoptera frugiperda con los primers JM76-JM77.
a) CTAB; b) Qiagen destilada; c) Buffer STE; d) Buffer de lysis; e) Buffer de H. Guanidina.
Discusión
La extracción del ADN es el paso más crucial en todo el proceso relacionado
con la biología molecular. Se suelen utilizar kits comercializados que incluyen el
protocolo específico para la extracción. Los métodos de extracción de ADN se
caracterizan por la lisis de la célula, la inactivación de las enzimas nucleasas
celulares y la separación de los ácidos nucleicos de los demás restos celulares.
Pueden ser de diferentes tipos: rotura mecánica (trituración, lisis hipotónica),
por tratamiento químico (detergentes, agentes caotrópicos, reducción con
tioles) o por digestión enzimática (proteinasa K).
PCR, o la reacción en cadena de la polimerasa, es una técnica de laboratorio
utilizada para amplificar secuencias de ADN (crear copias). El método utiliza
secuencias cortas de ADN llamados cebadores para seleccionar la parte del
genoma a amplificar. La amplificación del ADN nos permite estudiar la molécula
del ADN en detalle en el laboratorio.
En investigación, la técnica RAPD, se emplea en análisis genéticos que
permitan el establecimiento de similitudes entre comunidades de la misma
especie (ejemplo: bacterias y plantas), un ejemplo de ello, es el estudio de la
relación entre la resistencia al arsénico en flora bacteriana proveniente de
muestras de suelo, estudio realizado en India y publicado en Molecular
Phylogenetics and Evolution en 2016.
El método rápido de obtención de ADN libera el uso de reactivos destinados
para este fin y un ahorro considerable de tiempo y recursos, los cuales se
pueden aprovechar avanzando en el procedimiento del protocolo para el
diagnóstico de plagas cuarentenarias (Ortega, 2008; Herrera, 2008), por otro
lado Powers y Harris, 1993; Powers, 2004 reportan un método similar de
obtención de ADN en el diagnóstico de nematodos.
Conclusiones
El uso de los métodos de PCR y ISSR arrojará los mejores resultados de
identificación de especies, debido a su rapidez, su confiabilidad y bajo costo.
Se empleó la técnica RAPDs la cual permite evidenciar polimorfismos de ADN
con relativa facilidad aún en insectos pequeños o partes de los mismos como
en este estudio, así mismo esta técnica revela diferencias en poblaciones con
ausencia de variabilidad alozímica (Black 1993). La secuencia más estudiada y
más eficiente es la de citocromo oxidasa, permite la identificación al nivel de
género y se tiene una amplia base de datos que permite su comparación. Las
modernas técnicas moleculares constituyen herramientas de gran utilidad para
estudiar la independencia y/o historia de conexión entre poblaciones, y para
revelar patrones de migración. Los datos resultantes, en conjunción con
información ecológica y biogeográfica, serán fundamentales en el momento de
hacer predicciones sobre la persistencia de las especies, y de adoptar medidas
para su preservación.
La información que proveen los estudios moleculares permite reconocer
especies, subespecies, biotipos y linajes que son indistinguibles utilizando sólo
datos morfológicos. De este modo, el conocimiento de la biodiversidad se ve
acrecentado. Los insectos cumplen papeles importantes en el funcionamiento
ecológico de los ecosistemas. El estudio de la diversidad genética de al menos
algunas de las especies “target” o indicadoras, permitirá evaluar posibles
declinaciones y riesgos de extinción, y adoptar las medidas más convenientes.
Los marcadores moleculares son de capital importante para monitorear la
diversidad genética de las especies benéficas, por ejemplo, los
microhimenópteros que se utilizan en el control biológico de plagas.
Agradecimientos: A la Mg. Blga. Victoria Ysabel Murrugarra Bringas y al Mg.
Blgo. AlfonsoLizarraga Travaglini por su paciencia y actitud al enseñar el curso
de Entomología este ciclo.
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